JP2019532663A - 工学的に操作されたシステインキャップの分配 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年11月7日に出願された米国仮出願番号第62/418,572号の利益を主張しており、この仮出願は、すべての目的のためにその全体が本明細書中に援用される。
選択されたアミノ酸がシステインに変異されているモノクローナル抗体(mAb)(すなわち、工学的に操作されたシステインmAbまたはecmAb)は、ecmAbを含むコンジュゲートが、薬物対抗体比(DAR)の均一性、有利な薬物動態、安定性および溶解性を含む、有利な特性を有するので、コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲートまたはADC)での使用に特に好適である。システイン変異は、鎖間または鎖内ジスルフィド結合を一般に形成しない抗体のアミノ酸配列の位置にあり、変異体mAbを生成する細胞内の発現機構は、システイン残基を不対システインととらえる。したがって、工学的に操作されたシステインは、非コードシステイン分子とジスルフィドが混ざった形態で、一般に発現される(すなわち、工学的に操作されたシステインは、キャップ剤、例えばシステイン(cys−キャップ)、ホモシステイン(hcy−キャップ)、システイニルグリシン(cysgly−キャップ)またはグルタチオン(gsh−キャップ)により「キャップ」されて、工学的に操作されたシステインキャップ(EC−キャップ)を形成する)。
本発明は、とりわけ、少なくとも1つのキャップされたシステイン残基を有するタンパク質分子を含む宿主細胞を培養し、宿主細胞の培養物をシスチンと接触させ、これにより、システインキャップをタンパク質分子から除去することによる、タンパク質分子からシステインキャップを除去する方法を提供する。一実施形態では、宿主細胞の培養物を、溶存酸素(DO)とさらに接触させる。さらなる実施形態では、宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるのと同時に、またはその後に、宿主細胞の培養物を0%〜50%DOの設定点でDOの第1の操作と接触させ、宿主細胞の培養物をDOの第1の操作と接触させた後に、宿主細胞の培養物を、20%〜100%DOの設定点でDOの第2の操作と接触させる。一実施形態では、宿主細胞の培養物は、0.5〜8時間、DOの第1の操作と接触させる。一実施形態では、宿主細胞の培養物は、0.5〜8時間、DOの第2の操作と接触させる。一実施形態では、DOの第1の操作は、0%DOの設定点にある。一実施形態では、DOの第2の操作は、100%DOの設定点にある。
I.総説
本発明は、細胞培養物中のタンパク質から、様々な種(例えば、システイン、ホモシステイン、システイニルグリシンおよび/またはグルタチオン)の工学的に操作されたシステインキャップ(EC−キャップ)を除去し、これによって、次に、タンパク質の工学的に操作されたシステインを、一致する所望のキャップ種(例えば、システイン、ホモシステイン、システイニルグリシンおよびグルタチオンのうちの1種)により再キャップする方法をとりわけ提供する。一実施形態では、本方法は、工学的に操作されたシステイン残基のキャップを解除し、cys−キャップによりこの残基を再キャップするのに十分な条件下で、ecmAbを含む細胞培養物をシスチン溶液と接触させるステップを含む。シスチン溶液を細胞培養物に添加することは、抗体を採取した後にシスチン溶液を添加するより好ましくあり得、なぜなら、これは、中間mAb物質中のEC−キャップの潜在的な不均質性に対処するものであり、EC−キャップ分配が、細胞培養プロセスのレベルで制御されることを確実にするからである。一部の実施形態では、溶存酸素(DO)レベルは、細胞培養物中で操作され、キャップ解除/再キャッププロセスをさらに増強する。本発明の方法は、とりわけ、icIEF全体の一致、ならびに他の電荷をベースとするアッセイ、プロファイルと、mAbおよびADCを調製する現在の製造実践の単純化とを実現する。
本明細書において使用される場合、用語「抗体」とは、無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異的抗体、多重特異的抗体(例えば、二重特異的抗体)、および所望の生物活性(すなわち、標的抗原に対する特異的結合)を示し、かつ少なくとも1つの生来の鎖間ジスルフィド結合を有する抗体フラグメントを幅広く指す。例示的な断片には、例えば、Fab、ミニ抗体などが含まれる。無傷抗体は、典型的には、4つのポリペプチド鎖(2つの重鎖および2つの軽鎖)で構成され、各ポリペプチドは、主に2つの領域:可変領域および定常領域を有する。可変領域は、標的抗原に特異的に結合して、これと相互作用する。可変領域は、特定の抗原上の特異的結合部位を認識してこれに結合する相補性決定領域(CDR)を含む。定常領域は、免疫系により認識されて、これと相互作用することができる(例えば、Janewayら、2001年、Immuno. Biology、第5版、Garland Publishing、New Yorkを参照されたい)。4つのポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合を介して、互いに共有結合により連結している。抗体は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgDおよびIgA)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)または部分クラスのものであり得る。抗体は、任意の好適な種に由来することができる。一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはネズミ起源のものである。モノクローナル抗体は、例えば、ヒト、ヒト化またはキメラであり得る。文脈に応じて、用語「抗体」とは、単一の抗体分子、または抗体溶液中などの抗体分子の集合体を指すことができる。
本発明は、とりわけ、ecmAbから工学的に操作されたシステインキャップ(EC−キャップ)を除去する方法、およびecmAb上の所望のキャップ種を再形成する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、工学的に操作されたシステイン残基のキャップを解除し、システインによりこの残基を再キャップするのに十分な条件下で、ecmAbを含む細胞培養物をシスチン溶液と接触させるステップを含む。
一部の実施形態では、ecmAbは、宿主細胞の培養物から生成して、採取する。図1は、抗体の工学的に操作されたシステイン残基上のEC−キャップの様々な例を示している。いずれの細胞培養物でも、工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体は、図1に示されているEC−キャップ種のいずれか、またはすべてによりキャップされてもよい。本発明の方法を使用して、細胞培養物中のecmAbのEC−キャップ間の一致を生じさせることができる、例えば、EC−キャップを除去し、工学的に操作されたシステイン残基をcys−キャップにより再キャップすることができる。一部のこのような態様では、工学的に操作されたシステイン残基は、抗体の重鎖の239位(Kabatら、「Sequences of proteins of immunological interest」、第5版、出版番号91−3242、U.S. Dept. Health & Human Services、NIH、Bethesda、M.D.、1991年により記載されている、EUインデックスに従う番号付け)に存在する。細胞培養物は、CHO細胞を含む、哺乳動物細胞株のいずれかを含むことができる。細胞培養に使用される培地は、RPMIを含む任意の培地であり得る。一部の実施形態では、培地は、シスチンを低濃度ですでに含有する。しかし、培地中の低量のシスチンは、ecmAbからEC−キャップを除去して再キャップするには一般に十分ではない。
抗体上のキャップのない工学的に操作されたシステイン残基は、イメージング剤(発色団およびフルオロフォアなど)、診断剤(MRI造影試薬および放射性同位体など)、安定剤(ポリエチレン(polyetheylene)グリコールポリマーなど)および治療剤を含む様々な官能基を導入するための有用な手段として働く。コンジュゲートプロセス中に、ecmAbの様々なEC−キャップが除去され、キャップのないシステイン残基をもたらす。キャップのないシステイン残基を有する抗体は、機能剤にコンジュゲートして、抗体−機能剤−コンジュゲートを形成することができる。機能剤(例えば、薬物、検出剤、安定剤)は、工学的に操作されたシステイン残基の部位において、抗体にコンジュゲートされる(共有結合による付着)。機能剤は、リンカーを介して間接的に、または機能剤上のチオール反応性基を介して直接、付着され得る。
抗体あたりの薬物−リンカー分子の数平均(または平均薬物負荷)は、標的細胞に送達され得る薬物の量の主要決定因子となるので、ADC組成物の重要な特徴である。平均薬物負荷は、工学的に操作されたシステイン残基にコンジュゲートされる薬物、ならびに意図される工学的に操作されたシステイン残基以外の部位にコンジュゲートされる薬物および組成物における未コンジュゲート抗体の量を含む。抗体あたり約2つの薬物となる平均薬物負荷を目標とする場合、2つの工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体(例えば、各重鎖上の1つの部位または各軽鎖上の1つの部位)を使用して、ADC組成物を調製することができる。抗体あたり約4つの薬物となる平均薬物負荷を目標とする場合、4つの工学的に操作されたシステイン残基を有する抗体(例えば、各重鎖上の2つの部位もしくは各軽鎖上の2つの部位、または重鎖上の1つの部位と軽鎖上の1つの部位)を使用して、ADC組成物を調製することができる。当業者は、他のレベルの薬物負荷(例えば、2つ未満の薬物負荷レベルおよび4つより多い薬物負荷レベルを含む)が、特定の抗体または特定の薬物に応じて、治療的に有用となり得ることを理解している。薬物コンジュゲートのための部位は、重鎖中の1つより多い部位もしくは2つより多い部位において、工学的に操作されたシステインを位置付けることにより、または軽鎖中の上記部位で工学的に操作されたシステインを位置付けることにより、またはそれらの両方で抗体中に導入することができる。
いくつかの好適な抗体が、本発明の方法に使用することができる。本発明の方法に使用される抗体は、特徴的な抗原に関連する疾患および状態のためのin vitroまたはin vivo診断、in vivoイメージングおよび治療を含む、いくつかの用途に有用である。5種のヒト抗体のクラス(IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgE)、およびこれらのクラス内の様々な部分クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)は、単一抗体分子における免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、ならびに鎖長および配列の差異などの構造的差異に基づいて認識される。抗体のこれらのクラスおよび部分クラスは、抗体のアイソタイプと呼ばれる。
工学的に操作されたシステインの部位は、得られたADCの特性に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質の構造中に完全に隠れた工学的に操作されたシステインは、溶媒への接近が不良となるため、コンジュゲートするのに困難となり得る一方、抗体の外表面上の工学的に操作されたシステインは、血漿中での物質への長期曝露のために、安定性の損なわれたADCをもたらすことがある。同様に、高度に表面曝露した工学的に操作されたシステインを有するecmAbから調製されたADCは、薬物の疎水性に対して感受性が高くなり得る一方、一層保護された位置における工学的に操作されたシステインは、溶液中の他の物質への接近が制限されるので、薬物の特性にはそれほど感受性は高くなり得ない。工学的に操作されたシステイン残基の位置を使用して、特定のADCに対して所望のエフェクター機能をモジュレートすることもできる。例えば、エフェクター機能結合性ドメインにおける工学的に操作されたシステイン残基への薬物−リンカーのコンジュゲートを使用して、エフェクター機能媒介性受容体への結合が遮断され得る。
本明細書に記載されている方法は、抗体に関して例示されているが、発現また生成の間に、チオールによりキャップされる、工学的に操作されたまたは生来の不対システイン(タンパク質内に鎖間または鎖内結合を一般に形成しないシステイン)を有する任意のタンパク質に対して首尾よく用いられ得ることは、当業者により理解されよう。本明細書に記載されている方法はまた、タンパク質の一部として、遊離チオールを含有する任意のタンパク質に対して首尾よく用いることができる。この方法が特に有用であるタンパク質は、不対システインを含む他に、鎖間ジスルフィド結合、特に、タンパク質のアンフォールディングを直ちにもたらすことなく切断され得る結合を形成する、生来のシステインを含むタンパク質である。非抗体タンパク質に言及する場合、鎖間ジスルフィド結合という用語は、隣接するポリペプチド鎖上の2つのシステイン残基間の共有結合を指す。非抗体タンパク質の候補としては、溶媒に曝露されているジスルフィド結合であって、生来のフォールディングされた立体構造でのその安定性がキャップされているチオールの立体構造に匹敵する、ジスルフィド結合を含有するものを含むものが挙げられる。工学的に操作されたシステインタンパク質とは、本明細書で使用する場合、タンパク質における選択されたアミノ酸がシステインに変異したものである。例示的なタンパク質はまた、Fc融合タンパク質、例えば、所望の標的に対する特異性をもたらすタンパク質に共有結合により連結される抗体のFc領域を含有するタンパク質を含む。
(実施例1)
細胞培養物の調製
この検討では、工業的に関連するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を使用した。この細胞株は、ジヒドロ葉酸マイナス(dhfr−)CHO宿主(Urlaub G、Chasin LA、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を欠損しているチャイニーズハムスターの細胞変異体を単離。Proc Natl Acad Sci USA 77巻:4216〜4220頁、1980年)から誘導され、FC領域(すなわち、S239C)の各々に挿入された工学的に操作されたシステイン残基を有する組換えmAbを分泌するよう遺伝子操作されたものであった。細胞は、工業的標準品である化学的に明確な基本培地を使用する、振とう用フラスコ中で培養して維持した。この振とう用フラスコでの培養条件は、37℃、5%CO2、および19mmのスローで125RPMとした。細胞培養物の容量は、3Lのバイオリアクター中で生成期を開始する3〜4日前にスケールアップした。
細胞培養の10日目に工学的に操作されたシステイン残基のキャップ解除および再キャップ
10日目に、100mMのシスチン溶液50mLを細胞培養物に加え、最終的な添加濃度を4mMにした。この細胞培養物をこの条件で2時間、インキュベートした。シスチン添加の2時間後、DOを2時間、0%まで低減させて、次に、DOをさらに2時間、100%まで増加させた。EC−キャップ分配に及ぼす影響を評価するため、各操作前後で試料を採取した。
細胞培養持続期間の全体にわたる、工学的に操作されたシステイン残基のキャップ解除および再キャップ
この実施例では、100mMのシスチン溶液25mLを、培養6日目から始めて、毎日、培養物に加えた。EC−キャップ分配に及ぼすシスチンの毎日の添加の影響を評価するために、試料を培養6日目〜10日目に採取した。培養6日目におけるシスチン添加の影響は、培養7日目に評価した。図4に例示されている通り、培養7日目〜10日目まで毎日、シスチンを添加した条件の場合、−cys ecmAb(システインキャップした再キャップecmAb)は90%を超えた。この−cys ecmAbは、対照条件の場合、培養14日目の後だけ90%を超えた。
Claims (23)
- タンパク質分子からシステインキャップを除去する方法であって、
少なくとも1つのキャップされたシステイン残基を有するタンパク質分子を含む宿主細胞を培養するステップ、および
前記宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるステップ
を含み、それによって、前記システインキャップが、前記タンパク質分子から除去される、方法。 - 前記宿主細胞の培養物を溶存酸素(DO)と接触させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるのと同時に、またはその後に、前記宿主細胞の培養物を0%〜50%DOの設定点でDOの第1の操作と接触させるステップ、
前記宿主細胞の培養物をDOの前記第1の操作と接触させた後に、前記宿主細胞の培養物を20%〜100%DOの設定点でDOの第2の操作と接触させるステップ
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記宿主細胞の培養物を前記第1の操作と接触させる前記ステップが、0.5〜8時間の持続期間にわたり行われる、請求項3に記載の方法。
- 前記宿主細胞の培養物を前記第1の操作と接触させる前記ステップが、2時間の持続期間にわたり行われる、請求項4に記載の方法。
- 前記宿主細胞の培養物を前記第2の操作と接触させる前記ステップが、0.5〜8時間の持続期間にわたり行われる、請求項3に記載の方法。
- 前記宿主細胞の培養物を前記第2の操作と接触させる前記ステップが、2時間の持続時間で行われる、請求項6に記載の方法。
- DOの前記第1の操作が、0%DOの設定点にある、請求項3に記載の方法。
- DOの前記第2の操作が、100%DOの設定点にある、請求項3に記載の方法。
- タンパク質が抗体である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記抗体を、抗体−薬物コンジュゲートを形成するのに十分な条件下で、薬物−リンカー化合物と組み合わせるステップをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記抗体が、少なくとも2つの工学的に操作されたシステイン残基を有する、請求項10に記載の方法。
- 前記工学的に操作されたシステイン残基が、前記抗体分子の重鎖定常領域中に存在する、請求項12に記載の方法。
- 前記工学的に操作されたシステイン残基が、前記抗体分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域中に存在する、請求項12に記載の方法。
- それによって、前記タンパク質分子がシステイン分子により再キャップされる、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記システインキャップが工学的に操作されたシステインキャップ(EC−キャップ)である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞の培養物を、宿主細胞培養の10日目にシスチンと接触させる、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞の培養物を、宿主細胞培養持続期間の全体にわたり、毎日、シスチンと接触させる、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主細胞の培養物を、宿主細胞培養持続期間の最終日にシスチンと接触させる、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記シスチンが、0.1mM〜5Mの間の濃度で添加される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記シスチンが4mMの濃度で添加される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- タンパク質分子からシステインキャップを除去し再形成する方法であって、
少なくとも1つのキャップされたシステイン残基を有するタンパク質分子を含む宿主細胞を培養するステップ、および
前記宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるステップ、
前記宿主細胞の培養物をシスチンと接触させるのと同時に、またはその後に、前記宿主細胞の培養物を0%〜50%の設定点でDOの第1の操作と接触させるステップ、
前記宿主細胞の培養物を0%〜50%の設定点でDOと接触させた後に、前記宿主細胞の培養物を20%〜100%の設定点でDOの第2の操作と接触させるステップ
を含み、これにより、前記システインキャップが前記タンパク質分子から除去され、タンパク質がシステイン分子により再キャップされる、方法。 - タンパク質分子からシステインキャップを除去する方法であって、
少なくとも1つのキャップされたシステイン残基を有するタンパク質分子を含む宿主細胞を培養するステップ、および
宿主細胞の培養物を対称ジスルフィドと接触させるステップ
を含み、それによって、前記システインキャップが、前記タンパク質分子から除去される、方法。
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