JP2019531753A - 膵β細胞における細胞増殖を増加させるための方法、治療方法、及び組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法、及び不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について、対象を治療する方法に関する。組成物もまた開示される。前記組成物は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β(TGFβ)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む。【選択図】図1A
Description
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、2016年10月26日に出願された米国仮特許出願第62/413,071号の優先権を主張する。
発明の分野
本明細書に開示されるのは、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるための方法、低下したまたは不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について、対象を治療する方法、及びそのような方法を行うための組成物である。
本明細書に開示されるのは、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるための方法、低下したまたは不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について、対象を治療する方法、及びそのような方法を行うための組成物である。
発明の背景
β細胞量の減少は、糖尿病の主な原因である。1型糖尿病(「T1D」)では、患者のβ細胞量は、その患者の免疫系が自分のβ細胞を攻撃して破壊するために減少され、これは、その人を生存のために外因的に投与されたインスリンに依存するような状態にする。2型糖尿病(「T2D」)と診断された人々にとって、β細胞量は、その疾患の発症前に比較的低くなる傾向があり、β細胞量の減少は、インスリン抵抗性によって引き起こされるグルコース毒性のために、前記疾患の発症後に加速される。したがって、β細胞の増殖の誘導は、T1Dを有する人々においてβ細胞量を正常に、また、T2Dを有する人々においてβ細胞量を正常より上に回復させるために望ましいであろう。
β細胞量の減少は、糖尿病の主な原因である。1型糖尿病(「T1D」)では、患者のβ細胞量は、その患者の免疫系が自分のβ細胞を攻撃して破壊するために減少され、これは、その人を生存のために外因的に投与されたインスリンに依存するような状態にする。2型糖尿病(「T2D」)と診断された人々にとって、β細胞量は、その疾患の発症前に比較的低くなる傾向があり、β細胞量の減少は、インスリン抵抗性によって引き起こされるグルコース毒性のために、前記疾患の発症後に加速される。したがって、β細胞の増殖の誘導は、T1Dを有する人々においてβ細胞量を正常に、また、T2Dを有する人々においてβ細胞量を正常より上に回復させるために望ましいであろう。
本発明者らは、以前に、酵素である二重特異性チロシン調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)の小分子阻害剤を用いて、ヒトβ細胞の増殖を誘導した。ハルミン、INDY、GNF4877、及び5−ヨードツベリシジン(5−IT)は、1日当たり1.5%〜3%の範囲でヒトβ細胞の増殖を誘導する。この増殖率は、生命の最初の年の間に起こる、ヒトβ細胞における最も高い増殖率と一致し、これは、かなりのβ細胞の増殖が起こるヒト発生の唯一の段階である。
残念なことに、ヒトβ細胞の増殖率が1.5%〜3%であるのは、T1D及びT2Dの患者を治療するための実用的な治療にとって明らかに不十分である。本発明者らは、治療上合理的な期間内に、β細胞量を増加させるためには、β細胞の増殖率は、これまで達成できなかった1日あたりの率である、少なくとも1日当たり約5%である必要があると仮定する。
1つの態様において、本発明は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法に関する。この方法は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、膵β細胞の集団を、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β(「TGFβ」)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させることを含む。
別の態様において、本発明は、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について、対象を治療する方法に関する。この方法は、不十分なレベルのインスリン分泌について対象を治療するために、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の治療を必要とする対象に、対象における膵β細胞量を増加させるのに有効な条件下で、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を投与することを含む。
本発明のさらなる態様は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β(「TGFβ」)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む組成物に関する。
本発明は、残存する膵β細胞の再生を誘導するために、小分子薬の使用を通じて、インスリン分泌の低下または欠乏レベル(例えば、メタボリックシンドローム、T1D、及びT2D)に関連する状態の治療のための代替戦略を提供し、それによって、適切なインスリン分泌を回復させる(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Advances and Challenges in Human Beta Cell Proliferation for Diabetes,”Nature Rev.Endocrinology 11:201−212(2015);Cozar−Castellano et al.,“Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma Protein Phosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin−dependent Kinase−4 and Cyclin D1,”Diabetes 53:149−59(2004);Fiaschi−Taesch et al.,“Developing A Human Pancreatic Beta Cell G1/S Molecule Atlas,”Diabetes 62:2450−59(2013);Fiaschi−Taesch et al.,“Cytoplasmic−Nuclear TrafficKing of G1/S Cell Cycle Molecules and Adult Human Beta Cell Replication:A Revised Model of Human Beta Cell G1/S Control,”Diabetes 62:2460−70(2013);及びWang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))。本願の実施例(下記)は、DYRK1A及びTGFβSFシグナル伝達の薬理学的または遺伝的な阻害の組み合わせが、ヒトβ細胞の増殖の著しいかつ以前には達成不可能な「率」を誘発することを実証している。
発明の詳細な説明
本発明は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるための方法、低下したまたは不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法、及びそのような方法を実施するための組成物に関する。
本発明は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるための方法、低下したまたは不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法、及びそのような方法を実施するための組成物に関する。
本発明の1つの態様は、膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法に関する。この方法は、膵β細胞の集団において、細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、膵β細胞の集団を二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β(「TGFβ」)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させることを含む。
この方法は、エクスビボまたはインビボで実施され得る。エクスビボで実施される場合、膵β細胞の集団は、1つの実施形態によれば、膵臓からβ細胞を得て、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞において、インビトロまたはエクスビボ培養に適した液体培地中で細胞を培養することによって提供され得る。例えば、限定されるものではないが、適切で非限定的な培地は、InvitrogenからのRPMI1640のような市販の利用可能な培地に基づき得る。
必要に応じて、細胞が膵β細胞の表現型を有するかどうかを決定するための方法は、当技術分野において公知であり、限定されるものではないが、前記細胞をグルコースと共にインキュベートすること、及び前記細胞におけるインスリン発現が増加または誘導されるかどうかを試験することを含む。他の方法は、β細胞特異的転写因子が発現されるかどうかを試験すること、RNA定量的PCRの助けを借りてβ細胞特異的遺伝子産物を検出すること、糖尿病マウスにおける候補細胞の移植、ならびに前記移植後のその後の生理学的応答の試験及び電子顕微鏡で細胞を分析することを含む。
1つの実施形態によれば、前記方法は、エクスビボで行われ、培養された膵β細胞を、培養された膵β細胞の集団において細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β(「TGFβ」)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。
別の実施形態によれば、前記方法は、インビボで行われ、対象、例えば、ヒト対象における膵β細胞の集団を、対象の膵β細胞における細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β(「TGFβ」)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を投与することにより、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β(「TGFβ」)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。
膵β細胞の集団をDYRK1A阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させることは、DYRK1A阻害剤及び/またはTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の一方または両方を含む組成物を用いて、順次または同時に行われ得る。
DYRK1A阻害剤は、当技術分野において公知であり、限定されるものではないが、以下の表1に記載のものが挙げられる。
本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるDYRK1A阻害剤は、DYRK1Aの小分子阻害剤であり得る。特定の実施形態において、本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるDYRK1A阻害剤は、ハルミン、INDY、ロイセチン、5−ヨードツベルシジン(「5−IT」)、及びGNF4877から選択される。
TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤には、BMPファミリーの受容体、アクチビン及びインヒビン受容体、ならびに関連受容体の小分子及び他の(例えば、中和モノクロ−ナル抗体、合成/組換えペプチド阻害剤、及びsiRNA)阻害剤が含まれる。
TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤もまた、当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、SB431542、SB505124、A−83−01、デコリン、可溶性TGF−β受容体、レルデリムマブ、メテリムマブ、AP−12009、フォリスタチン、FLRG、GAST−1、GDF8プロペプチド、MYO−029、Noggin、コルディン、Cer/Dan、エクトジン、及びスクレロスチン(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Tsuchida et al.,“Inhibitors of the TGF−beta Superfamily and their Clinical Applications,”Mini Rev.Med.Chem.6(11):1255−61(2006)を参照のこと)を含む。
TGF−βシグナル伝達の他の阻害剤は、限定されるものではないが、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5ナフチリジン、[3−(ピリジン−2−イル)−4−(4−キノイル)]−1H−ピラゾール、3−(6−メチルピリジン−2−イル)−4−(4−キノリル)−1−フェニルチオカルバモイル−1H−ピラゾール、SB−431542、SM16、SB−505124、及び2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン(ALK5阻害剤II)(全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,298,825号を参照のこと)を含む。
TGF−βシグナル伝達のさらなる型の阻害剤としては、例えば、GDF8及びGDF11の阻害剤が挙げられる(例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、PCT公開番号WO2000/043781及び米国特許第6,368,597号を参照のこと)。
TGF−βシグナル伝達の阻害剤は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Callahan et al.,J.Med.Chem.45:999−1001(2002);Sawyer et al.,J.Med.Chem.46:3953−3956(2003);Gellibert et al.,J.Med.Chem.47:4494−4506(2004);Tojo et al.,Cancer Sci.96:791−800(2005);Valdimarsdottir et al.,APMIS 113:773−389(2005);Petersen et al.,Kidney International 73:705−715(2008);Yingling et al.,Nature Rev.Drug Disc.3:1011−1022(2004);Byfield et al.,Mol.Pharmacol.65:744−752(2004);Dumont et al.,Cancer Cell 3:531−536(2003);PCT公開第WO 2002/094833号;PCT公開第WO 2004/026865号;PCT公開第WO 2004/067530号;PCT公開第WO 2009/032667号;PCT公開第WO 2004/013135号;PCT公開第WO 2003/097639号;PCT公開第WO 2007/048857号;PCT公開第WO 2007/018818号;PCT公開第WO 2006/018967号;PCT公開第WO 2005/039570号;PCT公開第WO 2000/031135号;PCT公開第WO 1999/058128号;米国特許第6,509,318号;米国特許第6,090,383号;米国特許第6,419,928号;米国特許第9,927,738号;米国特許第7,223,766号;米国特許第6,476,031号;米国特許第6,419,928号;米国特許第7,030,125号;米国特許第6,943,191号;米国特許出願公開第2005/0245520号;米国特許出願公開第2004/0147574号;米国特許出願公開第2007/0066632号;米国特許出願公開第2003/0028905号;米国特許出願公開第2005/0032835号;米国特許出願公開第2008/0108656号;米国特許出願公開第2004/015781号;米国特許出願公開第2004/0204431号;米国特許出願公開第2006/0003929号;米国特許出願公開第2007/0155722号;米国特許出願公開第2004/0138188号;及び米国特許出願公開第2009/0036382号に記載されている。
TGF−βシグナル伝達の例示的な阻害剤は、限定されるものではないが、AP−12009(TGF−β受容体II型アンチセンスオリゴヌクレオチド)、レルデリムマブ(CAT152、TGF−β受容体II型に対する抗体)、GC−1008(ヒトTGF−βの全アイソフォームに対する抗体)、ID11(マウスTGF−βの全アイソフォームに対する抗体)、可溶性TGF−β、可溶性TGF−βレセプターII型、ジヒドロピロロイミダゾール類似体(例えば、SKF−104365)、トリアリールイミダゾール類似体(例えば、SB−202620(4−(4−(4−フルオロフェニル)−5−(ピリジン−4−イル)−1H−イミダゾール2−イル)安息香酸))、及びSB−203580(4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルフィニルフェニル)−5−(4−ピリジル)−1H−イミダゾール)、RL−0061425、1,5−ナフチリジンアミノチアゾール、及びピラゾール誘導体(例えば、4−(6−メチル−ピリジン−2−イル)−5−(1,5−ナフチリジン−2−イル)−1,3−チアゾール−2−アミン、及び2−[3−(6−メチル−ピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル]−1,5−ナフチリジン)、SB−431542(4−(5−ベンゾール[1,3]ジオキソール−5−イル−4−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)−ベンズアミド)、GW788388(4−(4−(3−(ピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)ピリジン−2−イル)−N−(テトラヒドロ−2H−ピラン−4−イル)ベンズアミド)、A−83−01(3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド、デコリン、レフティ1、レフティ2、フォリスタチン、ノギン、コルディン、ケルベロス、グレムリン、インヒビン、BIO(6−ブロモ−インジルビン−3'−オキシム)、Smadタンパク質(例えば、Smad6、Smad7)、及びシスタチンCを含む。
TGF−βシグナル伝達の阻害剤はまた、TGF−β受容体I型を阻害する分子も含む。TGF−β受容体I型の阻害剤は、限定されるものではないが、可溶性TGF−β受容体I型、AP−11014(TGF−β受容体I型アンチセンスオリゴヌクレオチド)、メテリムマブ(CAT152、TGF−β受容体I型抗体)、LY550410、LY580276(3−(4−フルオロフェニル)−5,6−ジヒドロ−2−(6−メチルピリジン−2−イル)−4H−ピロロ[1,2−b]ピラゾール)、LY364947(4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−キノリン)、LY2109761、LY573636(N−((5−ブロモ−2−チエニル)スルホニル)−2,4−ジクロロベンズアミド)、SB−505124(2−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジン)、SD−208(2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)−4−[(4−ピリジル)アミノ]プテリジン)、SD−093、KI2689、SM16、FKBP12タンパク質、及び3−(4−(2−(6−メチルピリジン−2−イル)H−イミダゾ[1,2−a]ピリジン−3−イル)キノリン−7−イルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−1−アミンを含む。
TGF−β受容体I型の阻害剤は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Byfield and Roberts,Trends Cell Biol.14:107−111(2004);Sawyer et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.14:3581−3584(2004);Sawyer et al.,J.Med.Chem.46:3953−3956(2003);Byfield et al.,Mol.Pharmacol.65:744−752(2004);Gellibert et al.,J.Med.Chem.47:4494−4506(2004);Yingling et al.,Nature Rev.Drug Disc.3:1011−1022(2004);Dumont et al.,Cancer Cell 3:531−536(2003);Tojo et al.,Cancer Sci.96:791−800(2005);PCT公開第WO 2004/026871号;PCT公開第WO 2004/021989号;PCT公開第WO 2004/026307号;PCT公開第WO 2000/012497号;米国特許第5,731,424号;米国特許第5,731,144号;米国特許第7,151,169号;米国特許出願公開第2004/00038856号、米国特許出願公開第2005/0245508号に記載されている。
1つの実施形態において、本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、TGFβスーパーファミリーリガンド、受容体、及び/または下流シグナル伝達分子(例えば、SMAD)、または核標的(例えば、クロマチン修飾複合体及び転写因子)を妨害する化合物を含む。図1A〜1Bを参照のこと。
1つの実施形態において、TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、例えば、TGFβリガンドを中和する抗血清であり得る。
別の実施形態において、TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、TGFβ/TGFβ受容体結合の阻害剤、アクチビンまたはインヒビン/アクチビン受容体結合の阻害剤、及び骨形態形成タンパク質(「BMP」)/BMP受容体結合の阻害剤からなる群より選択される。
具体的な実施形態において、TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、LY364947及びGW788388からなる群より選択されるTGFβ/TGFβ受容体結合の阻害剤である。
別の特定の実施形態において、本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、SB431542及びAlk5阻害剤IIからなる群より選択される、アクチビンまたはインヒビン/アクチビン受容体結合の阻害剤である。アクチビンまたはインヒビン/アクチビン受容体結合のさらなる例示的な阻害剤は、SB−505124、BYM388、フォリスタチン、フォリスタチン関連タンパク質(FSRP)、フォリスタチンドメイン(すなわち、Fs2、Fs12、Fs123)、A−83−01、Cripto、GW788388、BAMBI、及びSotaterceptからなる群から選択され得る(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Byfield et al.,“SB−505124 is a Selective Inhibitor of Transforming Growth Factor−Beta Type I Receptors ALK4,ALK5,and ALK7,”Mol.Pharmacol.65(3):744−52(2004);Lach−Trifilieffa et al.,“An Antibody Blocking Activin Type II Receptors Induces Strong Skeletal Muscle Hypertrophy and Protects from Atrophy,”Mol.Cell.Biol.34(4):606−18(2014);Zhang et al.,“Inhibition of Activin Signaling Induces Pancreatic Epithelial Cell Expansion and Diminishes Terminal Differentiation of Pancreatic β−Cells,”Diabetes 53(8):2024−33(2004);Harrington et al.,“Structural Basis for the Inhibition of Activin Signalling by Follistatin,”EMBO J.25(5):1035−45(2006);Tojo et al.,“The ALK−5 Inhibitor A−83−01 Inhibits Smad Signaling and Epithelial−to−Mesenchymal Transition by Transforming Growth Factor−Beta,”Cancer Sci.96(11):790−800(2005);Yan et al.,“Human BAMBI Cooperates with Smad7 to Inhibit Transforming Growth Factor−Beta Signaling,”J.Biol.Chem.284(44):30097−104(2009);Tan et al.,“Targeted Inhibition of Activin Receptor−Like Kinase 5 Signaling Attenuates Cardiac Dysfunction Following Myocardial Infarction,”Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.298(5):H1415−25(2010);及びGokoffski et al.,“Activin and GDF11 Collaborate in Feedback Control of Neuroepithelial Stem Cell Proliferation and Fate,”Develop.138(19):4131−42(2011)を参照のこと)。
別の特定の実施形態において、本発明のこの方法及び他の方法を実施するのに使用されるTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、BMP/BMP受容体結合の阻害剤である。BMP/BMP受容体結合の例示的な阻害剤は、LDN193189である。さらなる例示的なBMP阻害剤は、ノギン、スクレロスチン、コルディン、CTGF、フォリスタチン、グレムリン、インヒビン、DMH1、DMH2、ドルソモルフィン、K02288、LDN212854、DM3189、BMP−3、及びBAMBIからなる群から選択され得る(全体が参照により本明細書に組み込まれる、PCT公開第WO2014/018691 A1号、及びMohedas et al.,“Development of an ALK2−Biased BMP Type I Receptor Kinase Inhibitor,”ACS Chem.Biol.8(6):1291−302(2013);Yan et al.,“Human BAMBI Cooperates with Smad7 to Inhibit Transforming Growth Factor−Beta Signaling,”J.Biol.Chem.284(44):30097−104(2009)を参照のこと)。
別の実施形態によれば、TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤はSMADシグナル伝達経路阻害剤である。例示的なSMADシグナル伝達経路阻害剤は、限定されるものではないが、SMAD3 siRNA、SMAD2/3 siRNA、PD169316、SB203580、SB202474、Smad3の特異的阻害剤(SIS3)、HSc025、及びSB525334からなる群から選択され得る(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Qureshi et al.,“Smad Signaling Pathway is a Pivotal Component of Tissue Inhibitor of Metalloproteinases−3 Regulation by Transforming Growth Factor Beta in Human Chondrocytes,”BBA Mol.Cell Res.1783(9):1605−12(2008);Hasegawa et al.,“A Novel Inhibitor of Smad−Dependent Transcriptional Activation Suppresses Tissue Fibrosis in Mouse Models of Systemic Sclerosis,”Arthritis Rheum.60(11):3465−75(2009);及びRamdas et al.,“Canonical Transforming Growth Factor−β Signaling Regulates Disintegrin Metalloprotease Expression in Experimental Renal Fibrosis via miR−29,”Am.J.Pathol.183(6):1885−96(2013)を参照のこと)。
さらなる例示的なSMADシグナル伝達経路阻害剤は、限定されるものではないが、miR−100、LDN193189、SMAD結合ペプチドアプタマ−(例えば、Trx−FoxH1、Trx−Le1、Trx−CBP、Trx−SARA)、ピルフェニドン、及びLDN193189を含む(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Fu et al.,“MicroRNA−100 Inhibits Bone Morphogenetic Protein−Induced Osteoblast Differentiation by Targeting Smad,”Eur.Rev.Med.Pharmacol.Sci.20(18):3911−19(2016);Boergermann et al.,“Dorsomorphin and LDN−193189 Inhibit BMP−Mediated Smad,p38 and Akt signalling in C2C12 Cells,”Int.J.Biochem.Cell Biol.42(11):1802−7(2010);Cui et al.,“Selective Inhibition of TGF−Responsive Genes by Smad−Interacting Peptide Aptamers from FoxH1,Lef1 and CBP,”Oncogene 24:3864−74(2005);Zhao et al.,“Inhibition of Transforming Growth Factor−Beta1−Induced Signaling and Epithelial−to−Mesenchymal Transition by the Smad−Binding Peptide Aptamer Trx−SARA,”Mol.Biol.Cell 17:3819−31(2006);Li et al.,“Oral Pirfenidone Protects Against Fibrosis by Inhibiting Fibroblast Proliferation and TGF−β Signaling in a Murine Colitis Model,”Biochem.Pharmacol.117:57−67(2016);及びCook et al.,“BMP Signaling Balances Murine Myeloid Potential Through SMAD−Independent p38MAPK and NOTCH Pathways,”Blood 124(3):393−402(2014)を参照のこと)。
別の特定の実施形態において、TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、Trithorax複合体の阻害剤である。例示的なTrithorax複合体阻害剤は、限定されるものではないが、WDR5−0103、MI−1、MI−2、MI−2−2、MLS001171971−01、ML227、MCP−1、RBB5 siRNA、及びMLL1 siRNAを含む(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Senisterra et al.,“Small−Molecule Inhibition of MLL Activity by Disruption of its Interaction with WDR5,”Biochem.J.449(1):151−9(2013);Cierpicki et al.,“Challenges and Opportunities in Targeting the Menin−MLL Interaction,”Future Med.Chem.6(4):447−62(2014);Lee et al.,“Roles of DPY30 in the Proliferation and Motility of Gastric Cancer Cells,”PLOS One 10(7):e0131863(2015);及びZhou et al.,“Combined Modulation of Polycomb and Trithorax Genes Rejuvenates β Cell Replication,”J.Clin.Invest.123(11):4849−4858(2013)を参照のこと)。
別の実施形態において、TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、ポリコーム抑制複合体2(「PRC2」)の阻害剤または活性化剤である。例示的なPRC2阻害剤には、GSK926、EPZ005687、GSK126、GSK343、E11、UNC1999、EPZ6438、コンステレーション化合物3、EZH2 siRNA、及び3−デアザネプラノシンAが含まれる(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Verma et al.,“Identification of Potent,Selective,Cell−Active Inhibitors of the Histone Lysine Methyltransferase EZH2,”ACS Med.Chem.Lett.3:1091−6(2012);Xu et al.,“Targeting EZH2 and PRC2 Dependence as Novel Anticancer Therapy,”Exp.Hematol.43:698−712(2015);Knutson et al.,“A Selective Inhibitor of EZH2 Blocks H3K27 Methylation and Kills Mutant Lymphoma Cells,”Nat.Chem.Biol.8:890−6(2012);Qi et al.,“Selective Inhibition of Ezh2 by a Small Molecule Inhibitor Blocks Tumor Cells Proliferation,”Proc.Natl Acad.Sci.USA 109:21360−65(2012);McCabe et al.,“EZH2 Inhibition as a Therapeutic Strategy for Lymphoma with EZH2−Activating Mutations,”Nature 492:108−12(2012);Nasveschuk et al.,“Discovery and Optimization of Tetramethylpiperidinyl Benzamides as Inhibitors of EZH2,”ACS Med.Chem.Lett.5:378−83(2014);Brooun et al.,“Polycomb Repressive Complex 2 Structure with Inhibitor Reveals a Mechanism of Activation and Drug Resistance,”Nature Comm.7:11384(2016);Fiskus et al.,“Histone Deacetylase Inhibitors Deplete Enhancer of Zeste 2 and Associated Polycomb Repressive Complex 2 Proteins in Human Acute Leukemia Cells,”Mol.Cancer Ther.5(12):3096−104(2006);及びFiskus et al.,“Combined Epigenetic Therapy with the Histone Methyltransferase EZH2 Inhibitor 3−Deazaneplanocin A and the Histone Deacetylase Inhibitor Panobinostat Against Human AML Cells,”Blood 114(13):2733−43(2009)を参照のこと)。1つの実施形態において、PRC2の活性化は、PRCメンバー、例えば、EZH2(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Chen et al.,“Polycomb Protein Ezh2 Regulates Pancreatic Beta−Cell Ink4a/ARf Expression and Regeneration in Diabetes Mellitus,“Genes Dev.23(8):975−985(2009)及びWang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))、BMI1(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Dhawan et al.,“Bmi−1 Regulates the Ink4a/Arf Locus to Control Pancreatic β−Cell Proliferation,”Genes Dev.23(8):906−911(2009))、及びYY1(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))の遺伝的過剰発現によって達成される。
別の実施形態では、接触は、DYRK1A阻害剤ハルミン及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤LY364947と行われる。あるいは、接触は、DYRK1A阻害剤ハルミン及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤LDN193189と行われる。
1つの実施形態によれば、「膵β細胞」は、初代ヒト膵β細胞である。初代ヒト膵β細胞は、死体の細胞であってもよい。1つの実施形態において、「膵β細胞」は、幹細胞由来である(例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2016/0175363号及び米国特許第9,394,523号を参照のこと)。
本発明のこの方法及び他の方法を実施する1つの実施形態において、接触は、β細胞死またはDNA損傷を誘導しない。
さらに、接触は、β細胞の分化を誘導し、また、グルコースで刺激されたインスリン分泌を増加させ得る。β細胞の脱分化は、β細胞がグルコースを感知することまたはインスリンを分泌することができないことに寄与することが知られている(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Talchai et al.,“Pancreatic β Cell Dedifferentiation as a Mechanism of Diabetic β Cell Failure,”Cell 150:1223−34(2012)及びCinti et al.,“Evidence of Beta Cell Dedifferentiation in Human Type 2 Diabetes,”J.Clin.Endocrinol.Metab.101:1044−54(2016))。したがって、1つの実施形態において、接触は、β細胞の分化を誘導する。
別の実施形態において、前記方法は、細胞の生存を増強するために実施される。例えば、前記方法は、未処理の細胞集団と比較して、処理された細胞集団の細胞の生存を増強するために実施され得る。あるいは、前記方法は、未処理の細胞集団と比較して、処理された細胞集団の細胞死またはアポトーシスを減少させるために実施され得る。
別の態様において、本発明は、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態について、対象を治療する方法に関する。この方法は、不十分なレベルのインスリン分泌に対して対象を治療するために、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の治療を必要とする対象に、前記対象の膵β細胞量を増加させるのに有効な条件下で、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を投与することを含む。
本明細書では、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態とは、不十分なインスリン分泌に関連する状態を有する対象が高血糖になるように対象が血中の正常なグルコースレベルを維持するのに必要とされる血漿インスリンレベルよりも、低い血漿インスリンレベルを産生する状態のことを意味する。このような状態において、罹患した対象の膵β細胞は、血中の正常または適切な濃度のグルコース(すなわち、正常血糖)の存在を維持するのには不十分なレベルのインスリンを分泌する。
1つの実施形態において、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の1つは、インスリン抵抗性である。インスリン抵抗性は、対象の細胞がインスリンの血糖低下作用に対してそれほど敏感でなくなる状態である。筋肉細胞及び脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、グルコース取り込み(したがって、グリコーゲン及びトリグリセリドとしてのグルコースの局所的な貯蔵)を減少させるが、肝細胞におけるインスリン抵抗性は、グリコーゲン合成及び貯蔵の減少、ならびにグルコース産生及び血中への放出の抑制の失敗をもたらす。インスリン抵抗性は、通常、インスリンのグルコース低下作用の減少のことをいう。しかしながら、インスリンの他の機能もまた影響を受ける可能性がある。例えば、脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、脂質についてのインスリンの通常の効果を減少させ、そして循環する脂質の摂取の減少及び貯蔵されたトリグリセリドの加水分解の増加をもたらす。これらの細胞内に貯蔵された脂質の動員の増加は、血漿中の遊離脂肪酸を上昇させる。血中脂肪酸濃度の上昇、筋肉内グルコース取り込みの低下、及び肝臓内グルコース産生の増加はすべて、血中グルコースレベルの上昇に寄与する。インスリン抵抗性が存在する場合、より多くのインスリンが膵臓から分泌される必要がある。この代償的増加が起こらなければ、血糖濃度が上昇し、T2Dが起こる。
別の実施形態によれば、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の1つは、糖尿病である。糖尿病は、2つの広い種類の疾患、すなわちI型(「T1D」または「1型」)及びII型(「T2D」または「2型」)に分類することができる。用語「糖尿病」はまた、本明細書では、T1D、T2D、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病、ステロイド性糖尿病、及びいくつかの形態の単遺伝子性糖尿病を含む、患者が高い血糖値を有する一群の代謝疾患のことをいう。
別の実施形態において、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態は、メタボリックシンドロームである。メタボリックシンドロームは、一般に、II型糖尿病及びアテローム性動脈硬化性血管疾患の発症リスクの増加に関連する異常の群を定義するために使用される。関連する状態及び症状には、限定されるものではないが、空腹時高血糖(II型糖尿病または空腹時血糖障害、耐糖能障害、またはインスリン抵抗性)、高血圧、主に腰の周りの脂肪沈着を伴う太りすぎを意味する中枢性肥満(内臓、男性型、またはリンゴ型の肥満としても知られる)、HDLコレステロールの減少及びトリグリセリドの上昇を含む。
不十分なレベルのインスリン分泌と関連し得る他の状態には、限定されるものではないが、高尿酸血症、非アルコール性脂肪肝疾患に進行する脂肪肝(特に、同時肥満症)、多嚢胞性卵巣症候群(女性)、及び黒色表皮腫を含む。
関連障害もまた本発明のこの態様にしたって治療され得、そのような障害は、限定されるものではないが、正常範囲外の血中または血漿グルコースレベルに関連する任意の疾患、好ましくは高血糖症を含む。したがって、用語「関連障害」は、耐糖能異常(「IGT」)、空腹時血糖異常(「IFG」)、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、食後高血糖、及び過体重/肥満を含む。そのような関連障害はまた、異常な血中及び/または血漿インスリンレベルによっても特徴付けられ得る。
別の実施形態によれば、本発明のこの方法は、β細胞不全に関連する症状を有する対象を治療するために実施される。そのような状態は、限定されるものではないが、膵炎、嚢胞性線維症、膵切除術、及びグルココルチコイド治療を含む。
本発明のこの方法を実施する際に、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、対象における膵β細胞量を増加させるのに有効な条件下で、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態に対して対象を治療するために投与される。
1つの実施形態によれば、DYRK1A阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、対象における膵β細胞量を増加させるために投与され、それにより対象におけるインスリン分泌レベルが増加する。
1つの実施形態によれば、DYRK1A阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、別々の医薬組成物、またはDYRK1A阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の両方を含む単一の医薬組成物として製剤化される。1つの実施形態によれば、このような医薬組成物(複数可)は、治療有効量のDYRK1A阻害剤及び/またはTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む。
したがって、1つの実施形態によれば、本発明のこの方法は、DYRK1A阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の組み合わせまたは併用療法または併用治療を施すことによって実施され得る。用語「組み合わせ」または「併用療法」または「併用治療」は、少なくとも2つの化合物を対象に同時投与して生物学的効果、この場合は、相乗効果を引き起こす治療を意味する。併用療法では、少なくとも2つの薬物は、一緒にまたは別々に、同時にまたは順次に投与され得る。下記の実施例に記載されるように、対象の状態を改善するために、薬物が対象において相乗効果を生じる限り、同時投与は必要とされない。また、少なくとも2つの薬物は、異なる経路及びプロトコルを通して投与され得る。結果として、それらは一緒に製剤化され得るが、組み合わせの薬物もまた別々に製剤化され得る。
本発明のこの方法を実施する際に、対象への化合物の投与は、治療上有効な量の化合物(複数可)(すなわち、DYRK1A阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤)を含む医薬組成物の投与を含み得、これは、対象における述べられた状態及び/または障害を治療するのに有効な化合物の量を意味する。このような量は一般に、当業者の知識の範囲内にある多くの要因にしたがって変わる。これらは、限定されるものではないが、特定の対象、ならびにその年齢、体重、身長、一般的な健康状態、及び病歴(使用される特定の化合物、ならびにそれが製剤化されている担体、及びそれに対して選択された投与経路、治療の長さまたは期間、及び治療されている状態の性質と重症度)を含む。
投与は、典型的には、本明細書に記載の化合物(すなわち、DYRK1A阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤)の剤形を意味する薬学的に許容される剤形の投与を含み、例えば、錠剤、糖衣錠、散剤、エリキシル剤、シロップ剤、懸濁剤を含む液体製剤、スプレー剤、吸入剤錠剤、ロゼンジ剤、乳剤、液剤、顆粒剤、カプセル剤、及び坐剤、ならびにリポソーム製剤を含む注射用の液体製剤を含む。技術及び製剤は、一般に、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,17th editionに見出され得る。
本発明のこの方法を実施する際に、薬物(すなわち、DYRK1A阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤)は、任意の適切な量で任意の適切な担体物質中に含まれてもよい。薬物は、組成物の全重量の99重量%までの量で存在してもよい。前記組成物は、経口投与、非経口投与(例えば、静脈内投与、筋肉内投与)、直腸投与、皮膚投与、経鼻投与、経膣投与、吸入投与、皮膚投与(パッチ投与)、または眼投与経路に適した剤形で提供され得る。したがって、前記組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ヒドロゲルを含むゲル剤、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、プラスター剤、ドレンチ剤、浸透圧送達装置、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント、スプレー、またはエアロゾルの形態であり得る。
医薬組成物は、従来の製薬実務にしたがって製剤化され得る(例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams & Wilkins,2000及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988−1999,Marcel Dekker,New Yorkを参照のこと)。
本発明による医薬組成物は、投与後実質的に即時に、または投与後の任意の所定の時間もしくは期間に活性薬物を放出するように製剤化され得る。
制御放出製剤には、(i)長期間にわたって、実質的に一定濃度の薬物(複数可)を体内に作り出す製剤、(ii)所定の遅延時間の後、長期間にわたって、実質的に一定の濃度の薬物(複数可)を体内に作り出す製剤、(iii)活性薬物物質の血漿レベルの変動に関連する付随的な望ましくない副作用は最小に、体内で比較的一定の有効薬物レベルを維持することによって、所定の期間中薬物(複数可)作用を持続する製剤、(iv)例えば、罹患した組織または臓器に隣接してまたはその中に、制御された放出組成物を空間的に配置することによって、薬物(複数可)作用を局在化させる製剤、及び(v)特定の標的細胞型に薬物を送達するために、担体または化学誘導体を使用することによって、薬物(複数可)作用を標的とする製剤を含む。
徐放性製剤の形態での薬物の投与は、薬物が(i)狭い治療指数(すなわち、有害な副作用または毒性反応をもたらす血漿濃度と、治療効果をもたらす血漿濃度との差が小さいこと;一般に、治療指数(「TI」)は、半致死量(LD50) 対 半有効量(ED50)の比として定義される)、(ii)胃腸管における狭い吸収ウィンドウ、または(iii)治療レベルで血漿レベルを維持するために、1日の間に頻繁な投薬が必要とされるような非常に短い生物学的半減期を有する場合に、特に好ましい。
放出速度が問題の薬物の代謝速度を上回る制御放出を得るために、多くの戦略のいずれかが追求され得る。制御放出は、例えば、様々な種類の制御放出組成物及びコーティングを含む、様々な製剤パラメータ及び成分を適切に選択することによって得られ得る。したがって、前記薬物は、適切な賦形剤と共に、投与時に薬物を制御された方法で放出する医薬組成物(単一または複数の単位の錠剤またはカプセル組成物、油性溶液、懸濁液、乳剤、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、及びリポソーム)に製剤化される。
したがって、本発明のこの態様による投与は、経口で、局所に、経皮で、非経口で、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内注入で、腔内または膀胱内注入で、眼内に、動脈内に、病変内に、または粘膜への塗布で行われ得る。化合物は、単独でまたは適切な医薬担体と一緒に投与され得、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤または乳剤などの固体または液体形態であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに、ヒト及び下等動物の細胞と接触して使用するのに適していることを意味し、それは合理的な利益/リスク比に相応である。
対象は、哺乳動物対象であり得る。1つの実施形態において、対象は、ヒト対象である。適切なヒト対象は、限定されるものではないが、インスリン欠乏症を有する小児、成人、及び高齢の対象を含む。
他の実施形態において、対象は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、ウマ、マウス、イヌ、ウサギなどであり得る。
1つの実施形態において、投与ステップは、対象における増殖性膵β細胞の数を、少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、またはそれ以上増加させ得る。
別の実施形態では、投与ステップは、対象中の増殖性β細胞の数を、1日当たり少なくとも約1%、約2%、約3%、またはそれ以上増加させ得る。
いくつかの実施形態において、投与は、対象の膵β細胞におけるグルコースで刺激されたインスリン分泌を増加させる。
本発明のこの態様及び他の態様の1つの実施形態において、化合物(すなわち、上記のDYRK1A阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤)の指定は、化合物自体、ならびにその任意の薬学的に許容される塩、水和物、異性体、ラセミ体、エステル、またはエーテルを示すことを意味する。化合物の指定は、それ自体具体的に指定されている化合物、ならびにその任意の薬学的に許容される塩を指定することを意味する。
本発明の文脈内では、「治療する」とは、予防的または治療的な処置を意味する。治療という用語は、特に、矯正、変化率の減少、またはグルコース恒常性障害の減少を意味する。血中グルコースレベルは、一日を通して変動する。血糖値は、通常朝、一日の最初の食事の前に低めであり、及び食事の後に数時間上昇する。したがって、治療という用語は、正常なグルコースレベルに達するために、対象の状態及び時間帯に応じて、血糖レベルを増減することによる血糖レベルの制御を含む。治療という用語は、より具体的には、糖尿病または関連障害を有する対象における血糖値の一時的または持続的な低下を含む。用語「治療」または「治療すること」はまた、(例えば、膵β細胞による)インスリン放出の改善を意味する。
本明細書で使用される場合、語句「血糖値の制御」とは、異常値(すなわち、正常なグルコース恒常性を有する対応する対象に対して、既知の基準値、中央値、または平均値より下または上である値)を有する対象における、血中または血漿中グルコースレベルの正常化または調節のことをいう。
本発明の別の態様は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)阻害剤及びトランスフォーミング成長因子β(「TGFβ」)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む組成物に関する。
DYRK1A阻害剤及びトランスフォーミング増殖因子β(「TGFβ」)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤は、上記に記載されている。
1つの実施形態において、前記組成物は、担体を含む。前記担体は、上記のように薬学的に許容される担体であり得る。
実施例1〜6の材料及び方法
化学物質: 薬物源は、以下の通りであった:INDY(4997、Tocris Biosciences)、BrdU基質(RPN20、GE Healthcare)、ハルミン(286044、Sigma)、ロイセチン−41(Adipogen、AG−MR−C0023−M005)、LY364947(Selleckchem、S2805)、Alk5阻害剤II(Cayman Chemical Co、446859−33−2)、GW788388(Selleckchem、S2750)、A83−01(Tocris、2939)、SB431542(Selleckchem、S1067)、K02288(Selleckchem、S7359)、LDN193189(Selleckchem 2618)。
化学物質: 薬物源は、以下の通りであった:INDY(4997、Tocris Biosciences)、BrdU基質(RPN20、GE Healthcare)、ハルミン(286044、Sigma)、ロイセチン−41(Adipogen、AG−MR−C0023−M005)、LY364947(Selleckchem、S2805)、Alk5阻害剤II(Cayman Chemical Co、446859−33−2)、GW788388(Selleckchem、S2750)、A83−01(Tocris、2939)、SB431542(Selleckchem、S1067)、K02288(Selleckchem、S7359)、LDN193189(Selleckchem 2618)。
ヒト膵島: 正常及び2型糖尿病の成人の死体膵臓ドナー由来の膵島は、NIH/NIDDK支援統合膵島分布プログラム及びアルバータ糖尿病研究所から入手した。実施した実験に応じて、膵島をインタクトの膵島として使用するか、または最初にAccutase(Sigma,St.Louis,MO)を用いてカバーガラス上に分散させた。
ヒトβ細胞のFACSソーティング(表2): ヒト膵島を分散させ、前述の通り、β細胞をアデノウイルスで標識した(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。簡単に説明すると、収集する72時間前に、両方とも明るい緑色蛍光タンパク質ZsGreen(Clontech,Mountain View,CA)の上流にある、RIP1プロモーターの438塩基に連結した177塩基のhCMV IE−1プロモーターClaI−SpeIフラグメントを含むRIP1−miniCMV構築物によって駆動されるアデノウイルスを用いて、分散したヒト膵島細胞を蛍光活性化サイトメトリーソーティング(FACSAria II)のために形質導入した。選別された細胞をインスリンで免疫標識することによって、qRT−PCRによって及びRNAseqによって、β細胞画分が92%を超える純度であることを確認した。
アデノウイルス及び形質導入: アデノウイルスを前述の通り調製した(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Fiaschi−Taesch et al.,“Developing A Human Pancreatic Beta Cell G1/S Molecule Atlas,”Diabetes 62:2450−59(2013);Fiaschi−Taesch et al.,“Cytoplasmic−Nuclear Trafficking of G1/S Cell Cycle Molecules and Adult Human Beta Cell Replication:A Revised Model of Human Beta Cell G1/S Control,”Diabetes 62:2460−70(2013);Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017);及びCozar−Castellano et al.,“Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma Protein Phosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin−Dependent Kinase−4 and Cyclin D1,”Diabetes 53:149−59(2004))。特に明記しない限り、すべての形質導入は、150moiを用いて1時間行い、研究は、72時間後に行った。Ad.DYRK1A及びAd.shDYRK1Aの配列及び検証は、以前に報告されている(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))。ヒトSMAD6またはSMAD7をコードするアデノウイルスは、Harvard PlasmIDデータベースから入手したSMAD6及びSMAD7をコードするcDNAを用いて、記載のように調製した。SMAD2、3、及び4をサイレンシングするために使用されるアデノウイルスは、表2に示される配列を使用した。
qPCR: RNAを単離し、定量的RT−PCRを前述の通り実施した(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))。分散した膵島における遺伝子発現を、ABI 7500システムで実施したリアルタイムPCRによって解析した。プライマーは、以前に報告されている通りである(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))。
RNA配列決定: FACSで精製したβ細胞からのRNA(表3)を、RNeasy Microキット(Qiagen)を用いて直ちに調製した。
各実験のFACSからのRNA収量は、300〜500ngであり、RNA完全性数は、9.5〜10.0であり、選別されたβ細胞由来のポリA+ mRNAをオリゴdT磁気ビーズで精製した。次いで、β細胞由来のポリA+ RNAを94℃で二価カチオンの存在下で断片化した。断片化したRNAを二本鎖cDNAに変換した。cDNAの末端を平滑化した後、3'末端をアデニル化した。最後に、Illumina提供のユニバーサルアダプターをcDNA断片に連結した。AmpPureビーズを用いて、アダプター連結DNAをサイズ選択して、平均250bpのインサートサイズを得て、15サイクルのPCRによって増幅した。次いで、AmpPureビーズを用いてPCR DNAを精製し、最終的なseqライブラリーのシークエンシングの準備を整えた。seqライブラリーのインサートサイズ及びDNA濃度は、それぞれAgilent Bioanalyzer及びQubitで測定した。10個のバーコード化されたRNA配列ライブラリーのプールを、適切な濃度で、Illuminaフローセルの8レーンのうちの2つに載せ、ブリッジ増幅して、約2500万〜3500万の生クラスターを得た。次いで、前記フローセル上のDNAリードを、100bpペアエンドレシピを用いて、HiSEq 2000上で配列決定した。RNAが全膵島においてより豊富であったためRibozero濃縮RNAを用いたことを除いて、ハルミン、10μg/ml、プラス0.1%DMSO中に希釈されたLY364947、またはビヒクル(DMSO 0.1%)単独で処理した全ヒト膵島(表4)について、同様のプロトコルを用いた。
免疫細胞化学及び抗血清: 免疫細胞化学を4%パラホルムアルデヒド固定(15分)で行い、記載されているように、Accutase分散ヒト膵島をカバースリップ上にプレートした(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015);Fiaschi−Taesch et al.,“Developing A Human Pancreatic Beta Cell G1/S Molecule Atlas,”Diabetes 62:2450−59(2013);Fiaschi−Taesch et al.,“Cytoplasmic−Nuclear Trafficking of G1/S Cell Cycle Molecules and Adult Human Beta Cell Replication:A Revised Model of Human Beta Cell G1/S Control,”Diabetes 62:2460−70(2013);Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017);及びCozar−Castellano et al.,“Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma Protein Phosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin−Dependent Kinase−4 and Cyclin D1,”Diabetes 53:149−59(2004))。一次抗血清は、BrdU(ab6326、Abcam)、Ki67(RM−9106−s1、Thermo Scientific、及びMIB1、DAKO)、p−ヒストン−3(06−570、Millipore)、インスリン(A0564、DAKO)、p−γH2AX(MA1−2022、Thermo Scientific)、NKX6.1(F55A10−c、University of Iowa)、PDX1(07−696、Millipore)、MAFA(Ab26405、Abcam)、Glucagon(2760s、Cell Signaling)、Somatostatin(Sc−20999、Santa Cruz)、Pancreatic Polypeptide(A0619、DAKO)及びCK19(Ab52625、Abcam)であった。種特異的マウスAlexa Fluor 488(A−11029、Life Technologies)、ラットAlexa Fluor 594(A−11007、Life Technologies)、ラビットAlexa Fluor 488(A11037、Life Technologies)、またはモルモットAlexa Fluor 488(A−11073、Life Technologies)二次抗血清を適切に選択した。TUNEL標識化を記載されているように行った(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015);Fiaschi−Taesch et al.,“Developing A Human Pancreatic Beta Cell G1/S Molecule Atlas,”Diabetes 62:2450−59(2013);Fiaschi−Taesch et al.,“Cytoplasmic−Nuclear Trafficking of G1/S Cell Cycle Molecules and Adult Human Beta Cell Replication:A Revised Model of Human Beta Cell G1/S Control,”Diabetes 62:2460−70(2013);Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017);及びCozar−Castellano et al.,“Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma Protein Phosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin−Dependent Kinase−4 and Cyclin D1,”Diabetes 53:149−59(2004))。
イムノブロット: イムノブロットを、以前に詳細に記載されているように、全ヒト膵島で実施した(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Meier et al.,“Beta Cell Replication is the Primary Mechanism Subserving the Postnatal Expansion of Beta Cell Mass in Humans,”Diabetes 57:1584−94(2008);Kassem et al.,“Beta−Cell Proliferation and Apoptosis in the Developing Normal Human Pancreas and in Hyperinsulinism of Infancy,”Diabetes 49:1325−1333(2000);Wang et al.,“Advances and Challenges in Human Beta Cell Proliferation for Diabetes,”Nature Rev.Endocrinology 11:201−212(2015);及びFiaschi−Taesch et al.,“Developing A Human Pancreatic Beta Cell G1/S Molecule Atlas,”Diabetes 62:2450−59(2013))。用いた一次抗血清は、SMAD2/3(Cell Signaling、8685p)、p−SMAD3(Abcam、ab52903)、SMAD4(Sc−7966、Santa Cruz)、SMAD1/5/9(ab66737、Abcam)、p15INK4(Abcam、ab53034)、p16INK4a(Sc−468、Santa Cruz)、p21CIP(556430、BD)、p57CIP2(2557s、Cell Signaling)及びGAPDH(Sc―25778、Santa Cruz)であった。
グルコースで刺激されたインスリン分泌: GSISを、前述の通り実施した(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015);Fiaschi−Taesch et al.,“Developing A Human Pancreatic Beta Cell G1/S Molecule Atlas,”Diabetes 62:2450−59(2013);Fiaschi−Taesch et al.,“Cytoplasmic−Nuclear Trafficking of G1/S Cell Cycle Molecules and Adult Human Beta Cell Replication:A Revised Model of Human Beta Cell G1/S Control,”Diabetes 62:2460−70(2013);Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017);及びCozar−Castellano et al.,“Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma Protein Phosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin−Dependent Kinase−4 and Cyclin D1,”Diabetes 53:149−59(2004))。簡単に説明すると、全ヒト膵島を低グルコース(2.8mM)または高グルコース(16.8mM)中で30分間培養し、培地を採取してインスリン(Mercodia)についてアッセイした。結果は、低グルコース濃度と比較した高グルコース中の培地インスリン濃度の倍率変化として表される。
クロマチン免疫沈降アッセイ: ChIPは、前述の通り製造元のプロトコルにしたがって、EZ−ChIPキット(Millipore)を用いて行った(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。ヒトの死体の膵島は、前述の通り分散された。示された各図について、最低3つの別々の膵島調製物を使用した。SMAD2/3、SMAD4、KDM6A、及びMEN1の各免疫沈降について、実験当たり2×106細胞を回収した。免疫沈降したDNAをABI 7500リアルタイム定量的PCR検出システム(Life Technologies)を用いて定量した。以下の抗体を用いた:抗SMAD2/3(Cell Signaling #8685)、抗SMAD4(R&D Systems #AF2097)、抗KDM6A(Abcam #ab84190)、及び抗MEN1(Bethyl Laboratories Inc. #A300−105A)。データは、インプットコントロールに対して正規化されたChIP読み取り値、及び濃縮倍率をそれぞれのIgGで割ったものとして示されている。エラーバーは、平均±SEMを示す。CDKN1Cのためのプライマーセットは、前述の通りである(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。CDKN1Aのプライマーセットは、表5に示す通りであった。
マウス膵臓の研究: 雄C57BL/6Nマウス(12週齢)に、7日間毎日腹腔内注射によって、ビヒクル(食塩水)、10mg kg−1のハルミンHCl、30mg kg−1のGW788388、またはハルミンとGW788388の組み合わせを投与した。マウスを7日目に屠殺し、膵臓を採取し、10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン包埋し、切片にした。以前に報告されたように、切片をKi−67及びインスリンについて染色した(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))。膵臓当たり最低2,000個のβ細胞が計数された。研究者に対して、グループの割り当ては盲検化された。
ヒト膵島移植の研究: 成人ヒト膵臓臓器提供者由来の500個のヒト膵島等価物を、以下に詳細に記載されるように、NOD−SCIDマウスの腎被膜下に移植した(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))。マウスを7日間回復させ、次いで、ビヒクル(食塩水)、10mg kg−1のハルミンHCl、30mg kg−1のGW788388、またはハルミンとGW788388の組み合わせで、7日間毎日腹腔内注射した。マウスを7日目に屠殺し、腎臓移植片を採取し、10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン包埋し、切片にした。以前に報告されたように、切片をKi−67及びインスリンについて染色した(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))。
統計: 統計は、図面の簡単な説明に記載されているように、スチューデントの対応のない両側t検定を用いて、または一元配置分散分析によって行った。0.05未満のP値は、有意とみなした。
実施例1 DYRK1A阻害剤とTGFβSF阻害剤の組み合わせは、前例のない相乗的なヒトβ細胞増殖を誘導する
表2にまとめた、FACSでソーティングしたヒトβ細胞からの遺伝子発現プロファイル(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))は、TGFβSFのメンバーの存在量の点で注目に値した。さらに、ヒト膵島のハルミン治療は、TGFβSFメンバーに顕著な変化をもたらした(表3)。ヒトインスリノーマ細胞増殖におけるSMADシグナル伝達の卓越性からのこれらの観察からの推論(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))及び他の者によって記載されたTGFβシグナル伝達阻害の有益な効果(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Mukherjee et al.,“FSTL3 Deletion Reveals Roles for TGFbeta Family Ligands in Glucose and Fat Homeostasis in Adults.”Proc.Natl.Acad.Sci.104:1348−53(2007);Brown and Schneyer,“Emerging Roles for the TGFb Superfamily in Pancreatic Beta Cell Homeostasis,”Trends Endocrinol.Metab.21:441−448(2010);El−Gohary et al.,“A Smad Signaling Network Regulates Islet Proliferation,”Diabetes 63:224−36(2014);Xiao et al.,“Transient Suppression of Transforming Growth Factor Beta Receptor Signaling Facilitates Human Islet Transplantation,”Endocrinology 157:1348−56(2016);Xiao et al.,“M2 Macrophages Promote Beta Cell Proliferation by Upregulation of SMAD7,”Proc.Natl.Acad.Sci.111:E1211−20(2014);Smart et al.,“Conditional Expression of Smad7 in Pancreatic Beta Cells Disrupts TGF−beta Signaling and Induces Reversible Diabetes Mellitus,”PLoS Biology 4:e39(2006);Zhou et al.,“Combined Modulation of Polycomb and Trithorax Genes Rejuvenates Beta Cell Replication,”J.Clin.Invest.123:4849−58(2013);及びDhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016))、多数のヒト死体膵島調製物におけるヒトβ細胞増殖に対する広範囲の薬理学的TGFβSF阻害剤の効果を調べた(図1A〜1B)。ビヒクル単独(DMSO)は、効果がなく、インスリン陽性細胞のKi67標識を用いて評価したところ、ハルミンは、その通常の2%標識指数を示した。以前に報告されたように、広範囲のTGFβ受容体、BMP受容体、及びアクチビン受容体の阻害剤は、ヒトβ細胞増殖にほとんど影響を及ぼさなかった(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Dhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016))。対照的に、TGFβ、アクチビン、またはBMP受容体を標的とするかどうかにかかわらず、試験されたすべてのTGFβSF受容体阻害剤は、ハルミンと組み合わせて使用される場合、ヒトβ細胞におけるKi67標識指数の劇的な増加を誘導した。増殖率(標識指数)は、平均5〜8%の範囲であった。しかしながら、大きなエラーバーは、時折ヒト膵島調製物にみられるさらに高い増殖率を反映しており、時には、15〜20%もの高いKi67標識指数を達成する。
表2にまとめた、FACSでソーティングしたヒトβ細胞からの遺伝子発現プロファイル(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))は、TGFβSFのメンバーの存在量の点で注目に値した。さらに、ヒト膵島のハルミン治療は、TGFβSFメンバーに顕著な変化をもたらした(表3)。ヒトインスリノーマ細胞増殖におけるSMADシグナル伝達の卓越性からのこれらの観察からの推論(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))及び他の者によって記載されたTGFβシグナル伝達阻害の有益な効果(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Mukherjee et al.,“FSTL3 Deletion Reveals Roles for TGFbeta Family Ligands in Glucose and Fat Homeostasis in Adults.”Proc.Natl.Acad.Sci.104:1348−53(2007);Brown and Schneyer,“Emerging Roles for the TGFb Superfamily in Pancreatic Beta Cell Homeostasis,”Trends Endocrinol.Metab.21:441−448(2010);El−Gohary et al.,“A Smad Signaling Network Regulates Islet Proliferation,”Diabetes 63:224−36(2014);Xiao et al.,“Transient Suppression of Transforming Growth Factor Beta Receptor Signaling Facilitates Human Islet Transplantation,”Endocrinology 157:1348−56(2016);Xiao et al.,“M2 Macrophages Promote Beta Cell Proliferation by Upregulation of SMAD7,”Proc.Natl.Acad.Sci.111:E1211−20(2014);Smart et al.,“Conditional Expression of Smad7 in Pancreatic Beta Cells Disrupts TGF−beta Signaling and Induces Reversible Diabetes Mellitus,”PLoS Biology 4:e39(2006);Zhou et al.,“Combined Modulation of Polycomb and Trithorax Genes Rejuvenates Beta Cell Replication,”J.Clin.Invest.123:4849−58(2013);及びDhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016))、多数のヒト死体膵島調製物におけるヒトβ細胞増殖に対する広範囲の薬理学的TGFβSF阻害剤の効果を調べた(図1A〜1B)。ビヒクル単独(DMSO)は、効果がなく、インスリン陽性細胞のKi67標識を用いて評価したところ、ハルミンは、その通常の2%標識指数を示した。以前に報告されたように、広範囲のTGFβ受容体、BMP受容体、及びアクチビン受容体の阻害剤は、ヒトβ細胞増殖にほとんど影響を及ぼさなかった(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Dhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016))。対照的に、TGFβ、アクチビン、またはBMP受容体を標的とするかどうかにかかわらず、試験されたすべてのTGFβSF受容体阻害剤は、ハルミンと組み合わせて使用される場合、ヒトβ細胞におけるKi67標識指数の劇的な増加を誘導した。増殖率(標識指数)は、平均5〜8%の範囲であった。しかしながら、大きなエラーバーは、時折ヒト膵島調製物にみられるさらに高い増殖率を反映しており、時には、15〜20%もの高いKi67標識指数を達成する。
有益な効果は、ハルミンに限定されなかったが、INDY及びロイセチン−41を含む追加のDYRK1A阻害剤にまで及んだ(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Tahtouh et al.,“Selectivity,Co−Crystal Structures and Neuroprotective Properties of Leucettines,a Family of Protein Kinase Inhibitors Derived from the Marine Sponge Alkaloid Leucettamine B,”J.Med.Chem.55:9312−30(2012))(図2A〜図2B)。さらに、用量反応試験において、前記組み合わせは、薬理学的相乗作用についての正式な基準を満たした(図2C)。さらに、注目すべき相乗効果は、2つの追加の増殖測定:BrdU取り込み及びリン酸化−ヒストン−3免疫標識で観察することができた(図2D〜2G)。
前記組み合わせの分裂促進効果は、β細胞に特異的であることは観察されなかった:増殖は、アルファ、デルタ、PP、及び管細胞においても観察された(図3A〜3B)。TUNELアッセイ及びγH2AX免疫標識によってそれぞれ評価したところ、β細胞死またはDNA損傷に関して有害作用は観察されなかった(図3C〜3E)。
実施例2−ハルミン−TGFβSFの組み合わせは、正常及び2型糖尿病膵島におけるヒトβ細胞分化のマーカーを増強する
分裂促進経路の活性化がβ細胞の脱分化をもたらし得ることを懸念して、β細胞分化の一連のマーカーの遺伝子発現を調べた(図4A〜4B)。ハルミン単独について観察されたように(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))、ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせは、脱分化を誘導することができなかっただけでなく、その逆も起こった:INS(インスリン)、PDX1、NKX6.1、MAFA、MAFB、SLC2A2、及びPCSK1などの重要なβ細胞マーカーの遺伝子発現(図4A〜4B)は、qPCRによりすべての膵島について評価したところ、ハルミン−TGFβSF阻害剤併用治療ですべて増加した。ISL1、SLC2A1、NeuroD、NKX2.2、及びPCSK2の遺伝子発現は、すべて基準値と同じままであった(図4A〜4B)。PAX4だけ減少したが、その意義は不明である。これらの結果は、分散ヒト膵島調製物における免疫細胞化学によって確認し、PDX1、NKX6.1、及びMAFAがすべてヒトβ細胞において特異的に増加したことを明らかにした(図4C)。これらの観察と一致して、グルコースで刺激されたインスリン分泌は正常であり、ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせで処理されたヒト膵島においては強調されたかもしれない(図4D)。
分裂促進経路の活性化がβ細胞の脱分化をもたらし得ることを懸念して、β細胞分化の一連のマーカーの遺伝子発現を調べた(図4A〜4B)。ハルミン単独について観察されたように(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))、ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせは、脱分化を誘導することができなかっただけでなく、その逆も起こった:INS(インスリン)、PDX1、NKX6.1、MAFA、MAFB、SLC2A2、及びPCSK1などの重要なβ細胞マーカーの遺伝子発現(図4A〜4B)は、qPCRによりすべての膵島について評価したところ、ハルミン−TGFβSF阻害剤併用治療ですべて増加した。ISL1、SLC2A1、NeuroD、NKX2.2、及びPCSK2の遺伝子発現は、すべて基準値と同じままであった(図4A〜4B)。PAX4だけ減少したが、その意義は不明である。これらの結果は、分散ヒト膵島調製物における免疫細胞化学によって確認し、PDX1、NKX6.1、及びMAFAがすべてヒトβ細胞において特異的に増加したことを明らかにした(図4C)。これらの観察と一致して、グルコースで刺激されたインスリン分泌は正常であり、ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせで処理されたヒト膵島においては強調されたかもしれない(図4D)。
β細胞の脱分化は、マウス及びT2Dを有する人々由来の膵島で起こるので(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Talchai et al.,“Pancreatic Beta Cell Dedifferentiation as a Mechanism of Diabetic Beta Cell Failure,”Cell 150:1223−34(2012)、及びCinti et al.,“Evidence of Beta Cell Dedifferentiation in Human Type 2 Diabetes,”J.Clin.Endocrinol.Metab.101:1044−54(2016))、II型糖尿病のドナー由来の膵島における増殖を次に調べた(図4E)。注目すべきことに、ハルミン単独は、非糖尿病の膵島ドナーにおいて観察されたのと同程度に、Ki67免疫標識を増加させ、さらに、3つの異なるTGFβSF阻害剤と組み合わせたハルミンは、正常な膵島で観察されたものに匹敵するKi67標識の相乗的増加をもたらした(図1A〜B及び図2A〜G)。同様に驚くべきことに、複数のハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせは、重要なβ細胞マーカーであるPDX1、NKX6.1、及びMAFAの発現の顕著な増加をもたらした。これは、ヒトT2D膵島インスリン遺伝子発現の有意な増加と関連していた(図4F)。
実施例3−併用効果は、SMAD及びDYRK1Aシグナル伝達を必要とする
TGFβSFリガンドは、SMADシグナル伝達に影響を及ぼすが、他のシグナル伝達経路も動員し得る(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brown and Schneyer,“Emerging Roles for the TGFb Superfamily in Pancreatic Beta Cell Homeostasis,”Trends Endocrinol.Metab.21:441−448(2010);Stewart et al.,“Human Beta Cell Proliferation and Intracellular Signaling:Part 3,”Diabetes 54:1872−85(2015);Macias et al.,“Structural Determinants of Smad Function in TGF−Beta Signaling,”Trends Biochem.Sci.40:296−308(2015);及びGaarenstroom & Hill,“TGF−Beta Signaling to Chromatin:How Smads Regulate Transcription,”Seminars Cell Devel.Biol.32:107−118(2014))。ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせがSMADシグナル伝達に影響を与えるかどうかを確かめるために、ヒト膵島をハルミン単独または2つのTGFβSF阻害剤であるLYまたはALK5と組み合わせてインキュベートした(図5A)。ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせは、SMAD2/3の存在量を変えることなく、SMAD3リン酸化の減少をもたらし、また、全SMAD1/5/9の劇的な減少をもたらした(抗血清は、これら3つのSMADを区別できないことに注意)。おそらく最も興味深いことに、ハルミンだけでリン酸化SMAD3の減少、及び全SMAD1/5/9の減少をもたらした。ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせによって誘導される増殖において、SMADシグナル伝達の必要性を調べるために、R−SMAD2、3及び4を、ハルミンで処理したヒト膵島においてアデノウイルスでサイレンシングさせ(図5B〜5C)、これらの3つのR−SMADをサイレンシングすることは、ハルミンで誘導したヒトβ細胞の増殖をさらに増強することを観察した。逆に、I−SMAD6及び7を過剰発現させてもそれ自体では増殖に影響を及ぼさなかったが、ハルミンで誘導した増殖は著しく増強された。これらの結果をまとめると、3つの重要なポイントが明らかになる。第一に、ハルミンと組み合わせて投与した場合に、TGFβSF阻害剤によって生じる増殖は、すべてがSMADシグナル伝達を介して、または大部分がSMADシグナル伝達を介して媒介され、R−SMADのサイレンシングまたはI−SMADSの過剰発現は、併用において、TGFβSF阻害剤の代わりになり得る。第二に、ハルミン自体は、SMADシグナル伝達において、これまで認識されていない阻害効果を有する。第三に、複数のSMADファミリー(すなわち、標準的TGFβ受容体関連SMAD2、3及び4、ならびに標準的BMP受容体関連SMAD1、5、及び8/9の両方が、ハルミンを介した増殖を調節することができる。
TGFβSFリガンドは、SMADシグナル伝達に影響を及ぼすが、他のシグナル伝達経路も動員し得る(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brown and Schneyer,“Emerging Roles for the TGFb Superfamily in Pancreatic Beta Cell Homeostasis,”Trends Endocrinol.Metab.21:441−448(2010);Stewart et al.,“Human Beta Cell Proliferation and Intracellular Signaling:Part 3,”Diabetes 54:1872−85(2015);Macias et al.,“Structural Determinants of Smad Function in TGF−Beta Signaling,”Trends Biochem.Sci.40:296−308(2015);及びGaarenstroom & Hill,“TGF−Beta Signaling to Chromatin:How Smads Regulate Transcription,”Seminars Cell Devel.Biol.32:107−118(2014))。ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせがSMADシグナル伝達に影響を与えるかどうかを確かめるために、ヒト膵島をハルミン単独または2つのTGFβSF阻害剤であるLYまたはALK5と組み合わせてインキュベートした(図5A)。ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせは、SMAD2/3の存在量を変えることなく、SMAD3リン酸化の減少をもたらし、また、全SMAD1/5/9の劇的な減少をもたらした(抗血清は、これら3つのSMADを区別できないことに注意)。おそらく最も興味深いことに、ハルミンだけでリン酸化SMAD3の減少、及び全SMAD1/5/9の減少をもたらした。ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせによって誘導される増殖において、SMADシグナル伝達の必要性を調べるために、R−SMAD2、3及び4を、ハルミンで処理したヒト膵島においてアデノウイルスでサイレンシングさせ(図5B〜5C)、これらの3つのR−SMADをサイレンシングすることは、ハルミンで誘導したヒトβ細胞の増殖をさらに増強することを観察した。逆に、I−SMAD6及び7を過剰発現させてもそれ自体では増殖に影響を及ぼさなかったが、ハルミンで誘導した増殖は著しく増強された。これらの結果をまとめると、3つの重要なポイントが明らかになる。第一に、ハルミンと組み合わせて投与した場合に、TGFβSF阻害剤によって生じる増殖は、すべてがSMADシグナル伝達を介して、または大部分がSMADシグナル伝達を介して媒介され、R−SMADのサイレンシングまたはI−SMADSの過剰発現は、併用において、TGFβSF阻害剤の代わりになり得る。第二に、ハルミン自体は、SMADシグナル伝達において、これまで認識されていない阻害効果を有する。第三に、複数のSMADファミリー(すなわち、標準的TGFβ受容体関連SMAD2、3及び4、ならびに標準的BMP受容体関連SMAD1、5、及び8/9の両方が、ハルミンを介した増殖を調節することができる。
ハルミン類似体は、それらの分裂促進効果のすべてとまではいかなくても、その大部分をDYRK1Aの阻害を介して誘導する(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Med.21:383−388(2015);Shen et al.,“Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation,”Nature Comm.6:8372(2015);及びDirice et al.,“Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation,”Diabetes 65:1660−71(2016))。ハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせに由来する相乗的な増殖におけるDYRK1Aについて、推定要件を探るために、DYRK1A単独のまたはTGFβSF阻害と組み合わせた、アデノウイルスの過剰な発現及びサイレンシングを使用した(図5E〜5G)。これらの実験は、DYRK1Aの過剰発現がハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせの増殖効果を阻止することができ、逆に、DYRK1Aの喪失がTGFβ阻害剤のGW及びLYによって誘導される増殖を著しく強調することを明らかにする。まとめると、図5A〜5Gの結果は、ヒトβ細胞増殖に対するハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせの強調された効果の、全部ではないにしても大多数が、DYRK1A及びSMADシグナル伝達の両方の複合的な中断に起因することを示している。それらはまた、ハルミンがR−SMADシグナル伝達を減少させるために、予期せぬ直接的または間接的な影響を及ぼし得ることを明らかにしている。
実施例4−ハルミン−TGFβSF阻害剤の相乗効果は、サイクリン/CDK及びCDK阻害剤に対する補完的効果を反映する
ハルミン及びハルミン−TGFβ阻害剤(及びDYRK1A及びSMADそれぞれ)は、細胞周期活性化剤及び細胞周期阻害剤を介した細胞周期進入を最終的に調整しなければならないという理由から、細胞周期活性化剤及び阻害剤の遺伝子発現は、ビヒクル、ハルミン、TGFβ阻害剤、またはハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせで処理した全膵島において調べた(図6A〜6B)。前述の通り、ハルミン単独(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))は、多数の細胞周期活性化因子(例えば、CDK1、CCNA1、CCNE2及びCDC25A)の発現を誘導した。対照的に、TGFβ阻害単独では、ほとんど効果がなかった。特に、ハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせは、これらまたは他のサイクリンまたはcdkのさらなる活性化を誘導せず、前記ハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせは、ハルミン単独と同等であった。
ハルミン及びハルミン−TGFβ阻害剤(及びDYRK1A及びSMADそれぞれ)は、細胞周期活性化剤及び細胞周期阻害剤を介した細胞周期進入を最終的に調整しなければならないという理由から、細胞周期活性化剤及び阻害剤の遺伝子発現は、ビヒクル、ハルミン、TGFβ阻害剤、またはハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせで処理した全膵島において調べた(図6A〜6B)。前述の通り、ハルミン単独(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015))は、多数の細胞周期活性化因子(例えば、CDK1、CCNA1、CCNE2及びCDC25A)の発現を誘導した。対照的に、TGFβ阻害単独では、ほとんど効果がなかった。特に、ハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせは、これらまたは他のサイクリンまたはcdkのさらなる活性化を誘導せず、前記ハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせは、ハルミン単独と同等であった。
一方、細胞周期阻害剤は、異なる挙動をした(図6B〜6C)。CDKN1C(p57KIP2をコードする)が約50%減少したことを除けば、ハルミン単独では、細胞周期阻害剤の発現に中程度で限定的な影響しか及ぼさなかった。TGFβ阻害は、CDKN2B(p15INK4bをコードする)、CDKN1A(p21CIPをコードする)、及びCDKN1C/p57KIP2の発現を低下させた。驚くべきことに、ハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせは、3つの重要な細胞周期阻害剤であるCDKN2B、CDKN1A、及びCDKN1Cの著しい減少を誘導した。
TGFβ阻害に応答したCDKN1A、CDKN1C、及びCDKN2Bの減少の根底にある機序を探るために、R−SMAD2、3及び4のアデノウイルスを用いたサイレンシング、またはI−SMAD6及び7の過剰発現の、ヒト膵島におけるCDKN1A、CDKN1C及びCDKN2Bの発現に対する影響を調べた。R−SMADをサイレンシングするかまたはI−SMADを過剰発現させると、CDKN1A及びCDKN1Cの発現は減少した(図6D〜6E)が、CDKN2Bの発現にはほとんど効果がなかった。CDKN1A及び/またはCDKN1Cの減少が、ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせにおけるTGFβSF阻害の相乗効果の根底にあり得るかどうかを決定するために、CDKN1A及びCDKN1Cは、単独でまたはハルミン治療と組み合わせて、ヒト膵島においてサイレンシングされた(図6F)。以前に報告されたように(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017)、及びAvrahami et al.,“Targeting the Cell Cycle Inhibitor p57Kip2 Promotes Adult Human Beta Cell Replication,”J.Clin.Invest.124:670−674(2014))、CDKN1Cのサイレンシングは、ヒトβ細胞増殖のわずかな増加をもたらし、CDKN1Aのサイレンシングは効果がなかった。対照的に、ハルミンの存在下では、CDKN1AまたはCDKN1Cのいずれかまたは両方のサイレンシングは、強力なヒトβ細胞の増殖をもたらした。最後に、CDKN1A、CDKN1C及びCDKN2Bがヒトβ細胞において細胞周期阻害剤として本当に機能するかどうかを決定するために、これらは、ハルミン及びTGFβ阻害剤LY364947で処理されたヒト膵島において過剰発現された。各細胞周期阻害剤は、ハルミン−TGFβ阻害剤で処理されたヒトβ細胞における増殖を劇的に減少させて、「速度」をゼロに近づけた。
まとめると、これらの観察結果は、増殖に対するハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせの相乗効果のメカニズムを示唆し、ハルミンは、DKRK1A阻害及び核NFAT保持を介して(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015);Heit et al.,“Calcineurin/NFAT Signaling Regulates Pancreatic β−Cell Growth and Function,”Nature 443:345−349(2006);Goodyer et al.,“Neonatal Beta Cell Development in Mice and Humans is Regulated by Calcineurin/NFaT,”Developmental Cell 23:21−34(2012);及びDemozay et al.,“Specific Glucose−Induced Control of Insulin Receptor−Supstrate−2 Expression is Mediated by Ca2+−Dependent Calcineurin−NFAT Signaling in Primary Pancreatic Islet β−Cells,”Diabetes 60:2892−2902(2011))、主に細胞周期遺伝子を相補的に活性化し、SMADシグナル伝達の減弱を介するTGFβ阻害は、CDKN2B、CDKN1A、及びCDKN1Cの発現を減少させ、これらはそれぞれヒトβ細胞において細胞周期阻害剤として通常機能する。CDKN2B、CDKN1A、及びCDKN1CにおけるこのTGFβ阻害剤を介した減少は、サイクリン及びCDKにおけるハルミン誘導性の、DYRK1A−NFaTを介した増加を補完し、ハルミン処理またはTGFβ阻害単独による場合よりも大きな細胞周期活性化を可能にする。
実施例5−細胞周期阻害剤に対するR−SMAD及びTrithorax複合体の直接効果
R−SMADは、遺伝子をトランス活性化または抑制し得、Trithoraxメンバーを含む複合体においてそうする可能性があり(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhou et al.,“Combined Modulation of Polycomb and Trithorax Genes Rejuvenates Beta Cell Replication,”J.Clin.Invest.123:4849−58(2013);Dhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016);Stewart et al.,“Human Beta Cell Proliferation and Intracellular Signaling:Part 3,”Diabetes 54:1872−85(2015);Macias et al.,“Structural Determinants of Smad Function in TGF−Beta Signaling,”Trends Biochem.Sci.40:296−308(2015);及びGaarenstroom & Hill,“TGF−Beta Signaling to Chromatin:How Smads Regulate Transcription,”Seminars Cell Devel.Biol.32:107−118(2014))、どちらもヒトインスリノーマにおけるβ細胞増殖に関与している(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。したがって、R−SMADS 2、3、及び/または4が、ヒト膵島においてCDKN1A及び/またはCDKN1C遺伝子の調節領域と関連するかどうかを次に調べた(図7A〜7F)。実際、SMAD2/3及び4は、CDKN1A及びCDKN1Cのプロモーター及びエンハンサー領域と会合し(図7Cの黒いバー)、これらの会合は、ハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせでの処理によって減少する。注目すべきことに、TrithoraxメンバーであるMEN1及びH3K4メチラーゼもまた、CDKN1A及びCDKN1Cの両方のこれらの同じ領域に結合することが観察され、この会合はまた、ハルミン−TGFβ阻害剤処理によって劇的に減少した。最後に、H3K27デメチラーゼ、KDM6Aはまた、FACSでソーティングされたヒトβ細胞におけるCDKN1Cプロモーターに特異的に結合するTrithoraxメンバーである(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。KDM6Aは、ヒト膵島のCDKN1Aプロモーター上でMEN1と共局在し、この会合は、ハルミン−TGFβ阻害剤処理によって減少する(図7C)。逆説的に、MEN1の結果とは対照的に、KDM6Aは、ヒト膵島のCDKN1C遺伝子座と関連しているが、この関連は、ハルミン−TGFβ阻害剤治療では減少するよりむしろ増強されるように思われる。まとめると、これらの観察は、R−SMAD、MEN1、及びKDM6Aが実際にヒトβ細胞のCDKN1A及びCDKN1Cの調節領域に直接結合し、Trithoraxメンバーによっても占められる遺伝子座で、そうであることを明らかにしている。重要なことに、これらの関連は、ハルミン−TGFβ阻害剤治療によって妨害される。これらの観察は、これらの遺伝子座でのTrithoraxを介したオープンクロマチン状態と協調したTGFβSFを介したSMADシグナル伝達の影響下で、SMAD−Trithorax相互作用が基礎的状況下で、β細胞においてCDKN1A及びCDKN1Cの発現を維持するモデルを示唆する(図7E〜7F)。ハルミン−TGFβ阻害剤処理により、これらの複合体は、解離し、CDKN1A及びCDKN1C遺伝子座におけるSMADトランス活性化クロマチン圧縮の喪失を可能にする。
R−SMADは、遺伝子をトランス活性化または抑制し得、Trithoraxメンバーを含む複合体においてそうする可能性があり(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhou et al.,“Combined Modulation of Polycomb and Trithorax Genes Rejuvenates Beta Cell Replication,”J.Clin.Invest.123:4849−58(2013);Dhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016);Stewart et al.,“Human Beta Cell Proliferation and Intracellular Signaling:Part 3,”Diabetes 54:1872−85(2015);Macias et al.,“Structural Determinants of Smad Function in TGF−Beta Signaling,”Trends Biochem.Sci.40:296−308(2015);及びGaarenstroom & Hill,“TGF−Beta Signaling to Chromatin:How Smads Regulate Transcription,”Seminars Cell Devel.Biol.32:107−118(2014))、どちらもヒトインスリノーマにおけるβ細胞増殖に関与している(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。したがって、R−SMADS 2、3、及び/または4が、ヒト膵島においてCDKN1A及び/またはCDKN1C遺伝子の調節領域と関連するかどうかを次に調べた(図7A〜7F)。実際、SMAD2/3及び4は、CDKN1A及びCDKN1Cのプロモーター及びエンハンサー領域と会合し(図7Cの黒いバー)、これらの会合は、ハルミン−TGFβ阻害剤の組み合わせでの処理によって減少する。注目すべきことに、TrithoraxメンバーであるMEN1及びH3K4メチラーゼもまた、CDKN1A及びCDKN1Cの両方のこれらの同じ領域に結合することが観察され、この会合はまた、ハルミン−TGFβ阻害剤処理によって劇的に減少した。最後に、H3K27デメチラーゼ、KDM6Aはまた、FACSでソーティングされたヒトβ細胞におけるCDKN1Cプロモーターに特異的に結合するTrithoraxメンバーである(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。KDM6Aは、ヒト膵島のCDKN1Aプロモーター上でMEN1と共局在し、この会合は、ハルミン−TGFβ阻害剤処理によって減少する(図7C)。逆説的に、MEN1の結果とは対照的に、KDM6Aは、ヒト膵島のCDKN1C遺伝子座と関連しているが、この関連は、ハルミン−TGFβ阻害剤治療では減少するよりむしろ増強されるように思われる。まとめると、これらの観察は、R−SMAD、MEN1、及びKDM6Aが実際にヒトβ細胞のCDKN1A及びCDKN1Cの調節領域に直接結合し、Trithoraxメンバーによっても占められる遺伝子座で、そうであることを明らかにしている。重要なことに、これらの関連は、ハルミン−TGFβ阻害剤治療によって妨害される。これらの観察は、これらの遺伝子座でのTrithoraxを介したオープンクロマチン状態と協調したTGFβSFを介したSMADシグナル伝達の影響下で、SMAD−Trithorax相互作用が基礎的状況下で、β細胞においてCDKN1A及びCDKN1Cの発現を維持するモデルを示唆する(図7E〜7F)。ハルミン−TGFβ阻害剤処理により、これらの複合体は、解離し、CDKN1A及びCDKN1C遺伝子座におけるSMADトランス活性化クロマチン圧縮の喪失を可能にする。
実施例6−ハルミン−TGFβ阻害剤処理は、インビボでマウス及びヒトβ細胞の増殖を増強する
インビボでハルミン及びTGFβ阻害剤の効果を評価するために、C57BL6Nマウスにビヒクル(DMSO)、ハルミン、GW788388、またはハルミンとGW788388の組み合わせを7日間腹腔内投与し、屠殺し、そしてインスリン及びKi67について評価した。図9Aは、ハルミン及びTGFβ阻害剤GW788388の両方がβ細胞の増殖を誘導したのに対し、ハルミン及びGW788388の組み合わせは相加的であったことを示す。次に、ヒトの死体の膵島をNOD−SCIDマウスに移植した。図9Bは、β細胞の増殖の対照の率は、成人ヒトβ細胞に典型的なものよりも高い(すなわち、0.1〜0.2%超)ものの、ハルミンはこの率を増加させ、GW788388は効果がなく、前記ハルミン−GW788388の組み合わせは、インビボでのヒト膵島に相乗効果を及ぼしたことを示す。
インビボでハルミン及びTGFβ阻害剤の効果を評価するために、C57BL6Nマウスにビヒクル(DMSO)、ハルミン、GW788388、またはハルミンとGW788388の組み合わせを7日間腹腔内投与し、屠殺し、そしてインスリン及びKi67について評価した。図9Aは、ハルミン及びTGFβ阻害剤GW788388の両方がβ細胞の増殖を誘導したのに対し、ハルミン及びGW788388の組み合わせは相加的であったことを示す。次に、ヒトの死体の膵島をNOD−SCIDマウスに移植した。図9Bは、β細胞の増殖の対照の率は、成人ヒトβ細胞に典型的なものよりも高い(すなわち、0.1〜0.2%超)ものの、ハルミンはこの率を増加させ、GW788388は効果がなく、前記ハルミン−GW788388の組み合わせは、インビボでのヒト膵島に相乗効果を及ぼしたことを示す。
実施例1〜6の考察
実施例1〜6は、様々な新規の、予期しない、そして重要な観察を提供する。第一に、それらは、2つのクラスの分子、つまりTGFβスーパーファミリー阻害剤と合わせたDYRK1A阻害剤の新規な組み合わせについて記載しており、これは、成熟した成人のヒトβ細胞において一日平均5〜8%の増殖「率」を確実に誘導することを意味し、これは、以前にはいかなるクラスの治療用分子でも観察されていなかった。これらの率は、生後1年での通常の生理的膵β細胞の複製を上回る(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gregg et al.,“Formation of a Human Beta Cell Population Within Pancreatic Islets is Set Early in Life,”J.Clin.Endocrinol.Metab.97:3197−3206(2012);Meier et al.,“Beta Cell Replication is the Primary Mechanism Subserving the Postnatal Expansion of Beta Cell Mass in Humans,”Diabetes 57:1584−94(2008);及びKassem et al.,“Beta−Cell Proliferation and Apoptosis in the Developing Normal Human Pancreas and in Hyperinsulinism of Infancy,”Diabetes 49:1325−1333(2000))。第二に、上記の実施例は、DYRK1A阻害剤−TGFβSF阻害剤の組み合わせが相乗的に挙動してヒトβ細胞の増殖を促進し、この相乗作用についての新規なメカニズム及びモデルを提供することを実証する(図8A)。第三に、上記の実施例は、ヒト増殖に対する有益な効果が、部分的には、クロマチン修飾、Trithoraxファミリーのエピジェネティック調節酵素の活性の調節により達成され、KDM6A及びおそらく追加のメンバーに対するTrithoraxβ細胞調節の関与を拡大する(図8B)。第四に、上記の実施例は、ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせによって生じたβ細胞増殖がβ細胞脱分化と関連しておらず、むしろ維持または増加したβ細胞分化を促進することを実証している。第五に、DYRK1A阻害剤−TGFβSF阻害剤の組み合わせの有益な効果は、T2D患者のβ細胞にも及ぶ。第六に、上記の例は、ロイセチン−41(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Tahtouh et al.,“Selectivity,Co−Crystal Structures and Neuroprotective Properties of Leucettines,a Family of Protein Kinase Inhibitors Derived from the Marine Sponge Alkaloid Leucettamine B,”J.Med.Chem.55:9312−30(2012))を、ヒトβ細胞増殖を活性化することができる小分子DYRK1A阻害剤の名前が増え続けているリストに加える。第七に、2つの異なるインビボモデルを用いた増殖の誘導が確認された。第八に、この観察は、TGFβのアクチビン、インヒビン、BMP、及び関連分子のような局所的に産生された内因性TGFβSFアゴニストが成人ヒトβ細胞における増殖の抑制において重要な役割を果たすこと、また、この阻害経路は治療目的のために操作され得ることを示唆する。最後に、DYRK1Aは、依然としてハルミン及び他のDYRK1A阻害剤の中心的な標的であるが、上記の例は、DYRK1A阻害剤もまた部分的にSMAD経路を介して作用し得ることを示唆する。
実施例1〜6は、様々な新規の、予期しない、そして重要な観察を提供する。第一に、それらは、2つのクラスの分子、つまりTGFβスーパーファミリー阻害剤と合わせたDYRK1A阻害剤の新規な組み合わせについて記載しており、これは、成熟した成人のヒトβ細胞において一日平均5〜8%の増殖「率」を確実に誘導することを意味し、これは、以前にはいかなるクラスの治療用分子でも観察されていなかった。これらの率は、生後1年での通常の生理的膵β細胞の複製を上回る(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gregg et al.,“Formation of a Human Beta Cell Population Within Pancreatic Islets is Set Early in Life,”J.Clin.Endocrinol.Metab.97:3197−3206(2012);Meier et al.,“Beta Cell Replication is the Primary Mechanism Subserving the Postnatal Expansion of Beta Cell Mass in Humans,”Diabetes 57:1584−94(2008);及びKassem et al.,“Beta−Cell Proliferation and Apoptosis in the Developing Normal Human Pancreas and in Hyperinsulinism of Infancy,”Diabetes 49:1325−1333(2000))。第二に、上記の実施例は、DYRK1A阻害剤−TGFβSF阻害剤の組み合わせが相乗的に挙動してヒトβ細胞の増殖を促進し、この相乗作用についての新規なメカニズム及びモデルを提供することを実証する(図8A)。第三に、上記の実施例は、ヒト増殖に対する有益な効果が、部分的には、クロマチン修飾、Trithoraxファミリーのエピジェネティック調節酵素の活性の調節により達成され、KDM6A及びおそらく追加のメンバーに対するTrithoraxβ細胞調節の関与を拡大する(図8B)。第四に、上記の実施例は、ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせによって生じたβ細胞増殖がβ細胞脱分化と関連しておらず、むしろ維持または増加したβ細胞分化を促進することを実証している。第五に、DYRK1A阻害剤−TGFβSF阻害剤の組み合わせの有益な効果は、T2D患者のβ細胞にも及ぶ。第六に、上記の例は、ロイセチン−41(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Tahtouh et al.,“Selectivity,Co−Crystal Structures and Neuroprotective Properties of Leucettines,a Family of Protein Kinase Inhibitors Derived from the Marine Sponge Alkaloid Leucettamine B,”J.Med.Chem.55:9312−30(2012))を、ヒトβ細胞増殖を活性化することができる小分子DYRK1A阻害剤の名前が増え続けているリストに加える。第七に、2つの異なるインビボモデルを用いた増殖の誘導が確認された。第八に、この観察は、TGFβのアクチビン、インヒビン、BMP、及び関連分子のような局所的に産生された内因性TGFβSFアゴニストが成人ヒトβ細胞における増殖の抑制において重要な役割を果たすこと、また、この阻害経路は治療目的のために操作され得ることを示唆する。最後に、DYRK1Aは、依然としてハルミン及び他のDYRK1A阻害剤の中心的な標的であるが、上記の例は、DYRK1A阻害剤もまた部分的にSMAD経路を介して作用し得ることを示唆する。
ハルミン、5−IT、INDY、GNF4877などのDYRK1A阻害剤は、ヒトβ細胞において複製を誘導することが示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015);Shen et al.,“Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation,”Nature Comm.6:8372,DOI:10−1038/ncomm9372 October(2015);Dirice et al.,“Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation,”Diabetes 65:1660−71(2016);Aamodt et al.,“Development of a Reliable Automated Screening System to Identify Small Molecules and Biologics That Promote Human Beta Cell Regeneration,”AJP Endo.Metab.311:E859−68(2016);及びWang et al.,“Single Cell Mass Cytometry Analysis of Human Endocrine Pancreas,”Cell Metabolism 24:616−26(2016))が、一般に、増殖「率」または標識指数は低く、1.5〜3%/日の範囲である。したがって、DYRK1A阻害が誘導したβ細胞の増殖は、重要な進歩であるが、T1D及びT2Dにおける治療用ヒトβ細胞の増殖に必要とされるものとして、より高い増殖速度が想定され得る。DYRK1A阻害剤−TGFβ阻害剤の組み合わせで得られた5〜8%の範囲の平均「率」(図1A〜B及び図2A〜G)は、この点に関して注目に値する。
TGFβ阻害剤及びSMAD阻害は、げっ歯類の膵島における増殖の活性化因子としてよく知られている(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Mukherjee et al.,“FSTL3 Deletion Reveals Roles for TGFbeta Family Ligands in Glucose and Fat Homeostasis in Adults.”Proc.Natl.Acad.Sci.104:1348−53(2007);Brown & Schneyer,“Emerging Roles for the TGFb Superfamily in Pancreatic Beta Cell Homeostasis,”Trends Endocrinol.Metab.21:441−448(2010);El−Gohary et al.,“A Smad Signaling Network Regulates Islet Proliferation,”Diabetes 63:224−36(2014);Xiao et al.,“Transient Suppression of Transforming Growth Factor Beta Receptor Signaling Facilitates Human Islet Transplantation,”Endocrinology 157:1348−56(2016);Xiao et al.,“M2 Macrophages Promote Beta Cell Proliferation by Upregulation of SMAD7,”Proc.Natl.Acad.Sci.111:E1211−20(2014);Smart et al.,“Conditional Expression of Smad7 in Pancreatic Beta Cells Disrupts TGF−beta Signaling and Induces Reversible Diabetes Mellitus,”PLoS Biology 4:e39(2006);Zhou et al.,“Combined Modulation of Polycomb and Trithorax Genes Rejuvenates Beta Cell Replication,”J.Clin.Invest.123:4849−58(2013);Dhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016);及びBrown et al.,“Effects of Activin A on Survival,Function and Gene Expression of Pancreatic Islets from Normal and Diabetic Human Donors,”Islets 6:5−6(2014))。例えば、内因性アクチビン阻害剤、フォリスタチン様3のノックアウトは、マウスの遺伝的モデルにおけるβ細胞の拡大をもたらす(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Mukherjee et al.,“FSTL3 Deletion Reveals Roles for TGFbeta Family Ligands in Glucose and Fat Homeostasis in Adults.”Proc.Natl.Acad.Sci.104:1348−53(2007))。他の者は、I−SMAD、SMAD7の自発的または誘導的なアップレギュレーションが、マウスにおけるβ細胞の増殖及び拡大に関連していることを報告している(全体が参照により本明細書に組み込まれる、El−Gohary et al.,“A Smad Signaling Network Regulates Islet Proliferation,”Diabetes 63:224−36(2014)及びSmart et al.,“Conditional Expression of Smad7 in Pancreatic Beta Cells Disrupts TGF−beta Signaling and Induces Reversible Diabetes Mellitus,”PLoS Biology 4:e39(2006))。さらに他の者は、マウス膵β細胞における増殖を活性化するために、小分子TGFβ受容体阻害剤を使用した(全体が参照により本明細書に組み込まれる、El−Gohary et al.,“A Smad Signaling Network Regulates Islet Proliferation,”Diabetes 63:224−36(2014)及びSmart et al.,“Conditional Expression of Smad7 in Pancreatic Beta Cells Disrupts TGF−beta Signaling and Induces Reversible Diabetes Mellitus,”PLoS Biology 4:e39(2006))。しかしながら、成人のヒト膵島で検査した場合、TGFβSF阻害剤に反応したβ細胞の増殖は、中程度または無視できる程度であり(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Dhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016))、ここで結果が確認された(図1A)。
本発明の主な進歩は、DYRK1A及びSMAD経路の両方の異常が明白であるヒトインスリノーマデータマイニングに由来する概念である、ハルミンと組み合わせてTGFβ阻害剤を使用することであった(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。さらに、上記の実施例は、ハルミンの存在下で、TGFβ、アクチビン、及びBMP受容体を含むTGFβスーパーファミリー受容体の様々なクラスのいずれかを阻害することが、すべてβ細胞の増殖を可能にするのに有効であることを示す。以前に報告されたように(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brown & Schneyer,“Emerging Roles for the TGFβ Superfamily in Pancreatic Beta Cell Homeostasis,”Trends Endocrinol.Metab.21:441−448(2010))、TGFβスーパーファミリーメンバー及びSMADシグナル伝達経路は、ヒトの膵島に豊富に存在する。これらは集合的に、おそらく、他の者によって示唆されているように、脱分化から保護するために、ヒトβ細胞の増殖を抑制する抑制性調節経路を構成すると推測される(全体が参照により本明細書に組み込まれる、El−Gohary et al.,“A Smad Signaling Network Regulates Islet Proliferation,”Diabetes 63:224−36(2014)及びSmart et al.,“Conditional Expression of Smad7 in Pancreatic Beta Cells Disrupts TGF−beta Signaling and Induces Reversible Diabetes Mellitus,”PLoS Biology 4:e39(2006))。
DYRK1A阻害剤/TGFβSF阻害剤の組み合わせは、単に相加的ではなく、明らかに相乗的であることが今や見出された(図1A〜B及び図2A〜G)。DYRK1A阻害剤は、サイクリンやcdkなどの細胞周期活性化剤を優先的に活性化するようであるが、TGFβSF阻害剤は、細胞周期阻害剤、特に、CDKN1A、CDKN1C、及びCDKN2Bの効果を優先的に抑制するようであり、少なくともCDKN1A及びCDKN1Cについては、SMADシグナル伝達及びTrithoraxクロマチンリモデリングによって介されると思われる(図8B)。CDKN2B及びCDKN2Aの関与は可能であるが、それらは、p14ARF、ANRILなどのさらなる細胞周期調節因子をコードする共通の遺伝子座から生じるために、実証することがより困難である。これらの問題、及びこの遺伝子座の異常にGCに富む性質は、この遺伝子座の個々のメンバーの選択的なサイレンシングを困難にする。
β細胞増殖の制御におけるエピジェネティック修飾遺伝子のTrithoraxファミリーの関与は予想外ではなく、標準的なTrithoraxメンバーであるMEN1は、多発性内分泌腫瘍1型症候群を有する人々から位置的にクローニングされ(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Chandrasekharappa et al.,“Positional Cloning of the Gene for Multiple Endocrine Neoplasia−Type 1,”Science 276:404−407(1997))、これには、インスリノーマ、及びMEN1が含まれ、その他のTrithoraxメンバーは、動物モデル及び細胞株において、β細胞の増殖及び量を調節することが示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Crabtree et al.,“A Mouse Model of Multiple Endocrine Neoplasia Type 1 Develops Multiple Endocrine Tumors,”PNAS 98:1118−23(2001);Crabtree et al.,“Of Mice and MEN1:Insulinomas in a Conditional Mouse Knockout,”Mol.Cell Biol.23:6075−6085(2003);Chen et al.,“PDGF Controls Age−Dependent Proliferation in Pancreatic Beta Cells,”Nature 478:349−55(2011);Chen et al.,“Polycomb Protein ezh2 Regulates Pancreatic Beta Cell Ink4a/Arf Expression and Regeneration in Diabetes Mellitus,”Genes and Development 23:975−985(2009);及びKarnick et al.,“Menin Regulates Pancreatic Islet Growth by Promoting Histone Methylation and Expression of Genes Encoding p27kip1 and p18Ink4c,”PNAS USA 102:14659−64(2005))。さらに、MEN1及びMLLなどの他のTrithoraxメンバーも、げっ歯類のβ細胞増殖及び細胞周期阻害剤に対するChIPに関与していることが示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhou et al.,“Combined Modulation of Polycomb and Trithorax Genes Rejuvenates Beta Cell Replication,”J.Clin.Invest.123:4849−58(2013)及びDhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016))。さらに、別のTrithoraxメンバーであるKDM6Aは、時折ヒトインスリノーマにおいて不活性化され、ヒトβ細胞において、KDM6Aをサイレンシングまたは薬理学的に阻害し、細胞周期阻害剤CDKN1Cの発現を遮断することが最近示された(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。本発明は、DYRK1A阻害剤/TGFβSF阻害剤の組み合わせが、MEN1及びKDM6AのCDKN1A及びCDKN1Cプロモーター及びエンハンサーへの正常な結合を破壊し、ヒトβ細胞における重要な細胞周期阻害剤CDKN1CのTrithorax調節の直接の証明を初めて提供することを示すことによって、これらの観察を拡張する。TGFβSF及びSMADの標的は、Trithoraxメンバーに限定されず、おそらくポリコーム抑制複合体(PRC)のメンバーのような他のエピジェネティック修飾遺伝子を含むと予測される。確かに、EZH2やBMI1などの正規のPRCメンバーは、げっ歯類のβ細胞増殖の年齢に関連した修飾因子としてよく知られており(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Chen et al.,“PDGF Controls Age−Dependent Proliferation in Pancreatic Beta Cells,”Nature 478:349−55(2011);Chen et al.,“Polycomb Protein ezh2 Regulates Pancreatic Beta Cell Ink4a/Arf Expression and Regeneration in Diabetes Mellitus,”Genes and Development 23:975−985(2009);及びKarnick et al.,“Menin Regulates Pancreatic Islet Growth by Promoting Histone Methylation and Expression of Genes Encoding p27kip1 and p18Ink4c,”PNAS USA 102:14659−64(2005))、多くの遺伝子に対するTrithorax作用に結合しそれに対抗する(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhou et al.,“Combined Modulation of Polycomb and Trithorax Genes Rejuvenates Beta Cell Replication,”J.Clin.Invest.123:4849−58(2013)及びDhawan et al.,“Inhibition of TGF−Beta Signaling Promotes Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Diabetes 65:1208−18(2016))。さらに、ヒトインスリノーマにおけるPRC突然変異及び誤発現の繰り返しの証拠があり(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))、CDKN1Cサイレンシングと組み合わせたEZH2の過剰発現は、ヒトβ細胞の増殖を促進することが報告されている(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“Insights Into Beta Cell Regeneration for Diabetes Via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas,”Nature Communications,8:767(2017))。
II型糖尿病は、マウス及びヒトβ細胞において、より原始的で機能性の低いインスリン枯渇神経内分泌細胞型への脱分化と関連している(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Talchai et al.,“Pancreatic Beta Cell Dedifferentiation as a Mechanism of Diabetic Beta Cell Failure,”Cell 150:1223−34(2012)及びCinti et al.,“Evidence of Beta Cell Dedifferentiation in Human Type 2 Diabetes,”J.Clin.Endocrinol.Metab.101:1044−54(2016))。ハルミンの場合と同様に、ハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせは、NKX6.1、PDX1、MAFA、MAFB、SLC2A2、及びPCSK2を含む、ヒトβ細胞の同一性、分化及び成熟のいくつかの重要なマーカーを増加させる。マウスβ細胞で実証されているように、これは、部分的には、結果として生じるNFaT核転座を伴うDYRK1A阻害、及びこのクラスの遺伝子を促進するための結合に関連すると推定されるが、実験的には確認されていない(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Heit et al.,“Calcineurin/NFAT Signaling Regulates Pancreatic β−Cell Growth and Function,”Nature 443:345−349(2006)及びGoodyer et al.,“Neonatal Beta Cell Development in Mice and Humans is Regulated by Calcineurin/NFaT,”Developmental Cell 23:21−34(2012))。治療的見地から、従来の知識は、β細胞の増殖を駆動する事象が必然的にβ細胞の脱分化及び機能不全をもたらすことを示唆しているため、この分化の誘導は、重要であり、意外なままである。増殖の誘導にもかかわらず、分化した分子表現型及びグルコースで刺激されたインスリン分泌がインタクトのままであるという事実(図4A〜F)は有望である。T2D膵島においてβ細胞の増殖を促進し、分化マーカーを増強するというハルミン−TGFβSF阻害剤の組み合わせの能力は、どちらも驚くべきことでもあり、歓迎すべきことでもある。それは、T2Dを有する患者の治療に有望である。
ハルミン及び関連化合物は、主にDYRK1Aの阻害を介して、増殖を促進するように主に作用することは明らかであると思われるが(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al.,“A High−Throughput Chemical Screen Reveals That Harmine−Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication,”Nature Medicine 21:383−388(2015);Shen et al.,“Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation,”Nature Comm.6:8372,DOI:10−1038/ncomm9372 October(2015);及びDirice et al.,“Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation,”Diabetes 65:1660−71(2016))、ハルミンがSMAD 1、5、8/9と同様にリン酸化SMAD3を減少させることを観察したことは驚くべきことであった。これは、DYRK1Aに対するその効果に加えて、ハルミン及び他のDYRK1A阻害剤が、まだ解明されていない方法でSMADシグナル伝達と相互作用する可能性があることを示唆する。
本明細書において好ましい実施形態を詳細に図示し説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなく、様々な変更、追加、置換などを行うことができることは当業者には明らかであり、したがって、これらは、以下の特許請求の範囲で定義されているように、本発明の範囲内にあるとみなされる。
Claims (37)
- 膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法であって、
膵β細胞の集団における細胞増殖を増加させるのに有効な条件下で、前記膵β細胞の集団を二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤及びトランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と接触させることを含む、前記方法。 - エクスビボで行われる、請求項1に記載の方法。
- インビボで行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、前記DYRK1A阻害剤及び前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の両方を含む組成物を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、前記集団における増殖性膵β細胞の数を少なくとも約5%増加させる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、前記集団における増殖性膵β細胞の数を少なくとも約7%増加させる、請求項1に記載の方法。
- 前記DYRK1A阻害剤が、ハルミン、INDY、ロイセチン、5−ヨードツベルシジン(5−IT)、及びGNF4877からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、TGFβ/TGFβ受容体結合の阻害剤、アクチビンまたはインヒビン/アクチビン受容体結合の阻害剤、及び骨形態形成タンパク質(BMP)/BMP受容体結合の阻害剤からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、LY364947及びGW788388からなる群より選択される、TGFβ/TGFβ受容体結合の阻害剤である、請求項8に記載の方法。
- 前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、SB431542及びAlk5阻害剤IIからなる群より選択される、アクチビンまたはインヒビン/アクチビン受容体結合の阻害剤である、請求項8に記載の方法。
- 前記接触が、ハルミン及びLY364947を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、ハルミン及びLDN193189を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、SMADシグナル伝達経路阻害剤である、請求項1に記載の方法。
- 前記膵β細胞が、初代ヒト膵β細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、β細胞死またはDNA損傷を誘発しない、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、β細胞の分化を誘導する、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、グルコースで刺激されたインスリン分泌を増加させる、請求項1に記載の方法。
- 不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法であって、
不十分なレベルのインスリン分泌について前記対象を治療するために、不十分なレベルのインスリン分泌に関連する状態の治療を必要とする前記対象に、前記対象における膵β細胞量を増加させるのに有効な条件下で、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤及びTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤を投与することを含む、前記方法。 - 前記対象が、I型糖尿病について治療される、請求項18に記載の方法。
- 前記対象が、II型糖尿病について治療される、請求項18に記載の方法。
- 前記投与が、経口で、経皮で、非経口で、皮下に、静脈内に、筋肉内に、または腹腔内に行われる、請求項18に記載の方法。
- 前記対象が、哺乳動物対象である、請求項18に記載の方法。
- 前記対象が、ヒト対象である、請求項22に記載の方法。
- 前記投与が、前記対象における増殖性膵β細胞の数を少なくとも約5%増加させる、請求項18に記載の方法。
- 前記投与が、前記対象における増殖性膵β細胞の数を少なくとも約7%増加させる、請求項18に記載の方法。
- 前記投与が、前記対象の膵β細胞におけるグルコースで刺激されたインスリン分泌を増加させる、請求項18に記載の方法。
- 前記DYRK1A阻害剤が、ハルミン、INDY、ロイセチン、5−ヨードツベルシジン(5−IT)、及びGNF477からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、TGFβ/TGFβ受容体結合の阻害剤、アクチビンまたはインヒビン/アクチビン受容体結合の阻害剤、及び骨形態形成タンパク質(BMP)/BMP受容体結合の阻害剤からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、LY364947及びGW788388からなる群より選択される、TGFβ/TGFβ受容体結合の阻害剤である、請求項28に記載の方法。
- 前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、SB431542及びAlk5阻害剤IIからなる群より選択される、アクチビンまたはインヒビン/アクチビン受容体結合の阻害剤である、請求項27に記載の方法。
- 前記投与が、前記DYRK1A阻害剤及び前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤の両方を含む組成物を投与することによって行われる、請求項18に記載の方法。
- 前記投与が、ハルミン及びLY364947を用いて行われる、請求項18に記載の方法。
- 前記接触が、ハルミン及びLDN193189を用いて行われる、請求項18に記載の方法。
- 前記TGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤が、SMADシグナル伝達経路阻害剤である、請求項18に記載の方法。
- 二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤と、
トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)スーパーファミリーシグナル伝達経路阻害剤と
を含む、組成物。 - 担体をさらに含む、請求項35に記載の組成物。
- 前記担体が、薬学的に許容される担体である、請求項35に記載の組成物。
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