JP2019531742A - 治療に適したtalエフェクターヌクレアーゼ(talen)改変同種異系細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、免疫療法、分子生物学および組み換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、少なくとも、5'から3'方向に、自己切断ペプチド、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む挿入を有する改変ヒトT細胞受容体アルファ遺伝子を、そのゲノム中に含むTALEN改変ヒト初代細胞に関し、該細胞は、TCR陽性対照細胞と比較して内因性アルファベータT細胞受容体の検出不能な細胞表面発現を有し、かつ病理学的細胞を標的とする受容体を発現し、がんを含む疾患を処置するための該細胞の使用に関する。本発明はさらに、そのようなTALEN改変細胞を産生するための方法に関し、かつそのような操作されたヒト初代細胞または代替のおよび/もしくは追加のレアカット(rare-cutting)エンドヌクレアーゼを用いて得られる他の遺伝子改変ヒト初代細胞を検出するための手段に関する。
T細胞養子免疫療法は、がん処置のための有望な手法である。この戦略は遺伝的に改変されている、患者自身から通常得られる、単離されたヒトT細胞を利用して特定の腫瘍関連抗原に対するその特異性を増強する。遺伝子改変は、キメラ抗原受容体のまたは外因性T細胞受容体の発現、がん細胞による細胞溶解活性の阻害を防ぐための、特定の細胞表面タンパク質の不活性化、細胞を薬物に対して感受性または耐性にする遺伝子改変を含みうる。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、
(c) ギャップ
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較した挿入であって、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較した挿入であって、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、終結配列を含む外因性ポリヌクレオチドを含む、挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
CARはキメラ抗原受容体を意味し、組み換えTCRであってよい。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較した挿入であって、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)、終結配列、それらの組み合わせを含む、挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較した挿入であって、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチド、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、終結配列を含む、挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較した挿入であって、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチド、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、終結配列を含む、挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較した挿入であって、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチド、サイトカインをコードする配列、終結配列を含む、挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
本明細書で「サイトカイン」は、免疫細胞の機能(活性、移動する能力、接着する能力、腫瘍環境に抵抗する能力)に影響を与える任意の因子を包含する。
を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する(配列中で下線を引いた配列は相同性アームを表し、斜体で太字の配列は自己切断ペプチド、好ましくは2Aペプチドを表し、斜体の配列は終結配列(BGHポリA)を表す)。
SEQ ID NO:3の
および第2のTALENサブユニット:
またはSEQ ID NO:4を含む、上記態様のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を提供する。
に結合することを条件とし、第2のTALENサブユニットは、SEQ ID NO:4と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%〜80%の同一性を有する配列を含み、ただし該第2のTALENサブユニットが該第2のTALEN認識ドメインに、好ましくは
に結合することを条件とし、かつただしオフターゲット結合の頻度が検出未満であることを条件とする。
のTALEN結合ドメインの下流に位置する外因性ポリヌクレオチド配列を含む、上記態様のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を提供する。
の2Aペプチド、さらにより好ましくは配列
の2Aペプチドから選択される自己切断ペプチドである、上記態様のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を提供する。
の2Aペプチドをコードする配列、キメラ抗原受容体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、ポリアデニル化シグナルの転写終結配列、任意でTALEN結合ドメインを含む、上記態様のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を提供する。
ポリアデニル化シグナルの転写終結配列を含む。
より好ましくは、外因性ポリヌクレオチド配列は、CD22に特異的なCAR、およびゲノムTRACコード配列とインフレームの配列
ポリアデニル化シグナルの転写終結配列を含む。
本発明は、上記態様のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または上記態様に記載のヒト細胞の集団および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
(a) 野生型TRAC遺伝子に存在するレアカットエンドヌクレアーゼ用の認識ドメイン上流のヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、非コード配列、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のレアカットエンドヌクレアーゼ認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、野生型TRAC遺伝子と比較したエンドヌクレアーゼ改変ゲノムTRAC遺伝子を含むエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための手段を提供する。
(a) ヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、好ましくは以下の配列
を含むTALEN用の認識ドメイン、または
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインもしくは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップもしくは挿入であって、挿入が、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含み、かつ手段が該TALEN改変ゲノムTRAC遺伝子に特異的に結合する、上記態様に記載の手段を提供する。
(a) ヒト細胞に、
(i) 操作されたヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;または操作されたヌクレアーゼタンパク質;任意で該エンドヌクレアーゼをガイドする核酸(操作されたヌクレアーゼがヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の認識配列の位置で切断を生じ、切断が適切な対照(例えば操作されていない免疫T細胞)と比較して、検出不能なレベルまでαβ-TCRの細胞表面発現の阻害をもたらす)、
(ii) CARをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む第2の核酸配列、
(iii) 任意でプローブ
を導入する段階
を含み、
該外因性ポリヌクレオチドの配列が、相同組み換え(HR)により該切断部位で該ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入され、かつさらに非改変対照細胞と比較した場合に、該遺伝子改変細胞が内因性TCRの細胞表面発現を低減させる。
本発明による細胞および対照細胞を提供する段階、
ヌクレアーゼの混合物を用いてDNAおよびRNAを除去する段階、
ゲノムDNA (gDNA)を抽出する段階、
フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとともにgDNAをインキュベートする段階、
45秒を超える、好ましくは60秒を超える、より好ましくは90秒を超えるアニーリング/伸長時間でPCRを実施する段階
を含む、上記態様のいずれか1つに記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を産生するための方法を提供する。
対照細胞は、操作されていないT細胞であってよい。
初代細胞を提供する段階、
エンドヌクレアーゼをコードするmRNAおよび/またはゲノムDNA中の切断部位に対する特異性を付与するガイド(エンドヌクレアーゼそれ自体および/またはポリヌクレオチドであってよい)を導入する段階であって、該切断部位がTRAC遺伝子のKOおよび検出不能なレベルのアルファベータTCR細胞表面発現をもたらす、段階、
少なくとも自己切断ペプチドまたはIRES、CARをコードする遺伝子、KOとなるべき遺伝子との配列相同性を含むポリヌクレオチドを導入する段階であって、TRAC遺伝子のKIによるKOおよびTCR陰性CAR陽性細胞の産生をもたらす、段階、
得られたTCR陰性CAR陽性細胞を精製する段階、
本発明による得られたTCR陰性CAR陽性細胞および対照細胞を提供する段階、
ヌクレアーゼの混合物を用いてDNAおよびRNAを除去する段階、
ゲノムDNA (gDNA)を抽出する段階、
フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとともにgDNAをインキュベートする段階、
45秒を超える、好ましくは60秒を超える、より好ましくは90秒を超えるアニーリング/伸長時間でPCRを実施する段階、
エンドヌクレアーゼ特異的なオンサイトおよびオフサイト切断を検出する段階。
ゲノムDNA中の切断部位に対する特異性を付与するエンドヌクレアーゼをコードするmRNA (エンドヌクレアーゼそれ自体および/またはポリヌクレオチドであってよい)を導入する段階であって、該切断部位がTRAC遺伝子のKOおよび検出不能なレベルのアルファベータTCR細胞表面発現をもたらす、段階は、ゲノムDNA中の切断部位に対する特異性を付与するTALENをコードするmRNA (エンドヌクレアーゼそれ自体および/またはポリヌクレオチドであってよい)を導入する段階であって、該切断部位がTRAC遺伝子のKOおよび検出不能なレベルのアルファベータTCR細胞表面発現をもたらす、段階である。
エンドヌクレアーゼをコードするmRNAおよび/またはゲノムDNA中の切断部位に対する特異性を付与するガイド(エンドヌクレアーゼそれ自体および/またはポリヌクレオチドであってよい)を導入する段階であって、該切断部位がTRAC遺伝子のKOおよび検出不能なレベルのアルファベータTCR細胞表面発現をもたらす、段階は、
該エンドヌクレアーゼをコードするmRNAおよび/またはゲノムDNA中の切断部位に対する特異性を付与するガイド(エンドヌクレアーゼそれ自体および/またはポリヌクレオチドであってよい)を導入する段階であって、該切断部位が該遺伝子のKOおよび該遺伝子によってコードされる産物の検出不能なレベルの発現をもたらす、段階
に一般化される。
本発明による細胞、対照細胞を提供する段階、
ベンゾナーゼを用いてDNAおよびRNAを除去する段階、
ゲノムDNA (gDNA)を抽出する段階、
フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとともにgDNAをインキュベートする段階、
2だけ増えたアニーリング/伸長時間でPCRを実施する段階
を含む、上記態様のいずれか1つに記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための方法を提供する。
本発明による細胞、対照細胞を提供する段階、
ベンゾナーゼのような、ヌクレアーゼの混合物を用いてDNAおよびRNAを除去する段階、
ゲノムDNA (gDNA)を抽出する段階、
300 nMのフォワードプライマー、900 nMのリバースプライマーおよび220 nMのプローブとともにgDNA 20〜30 ngをインキュベートする段階、
2だけ増えた、好ましくは45秒を超えるアニーリング/伸長時間でPCRを実施する段階
を含む、上記態様のいずれか1つに記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための方法を提供する。
本発明による細胞、対照細胞を提供する段階、
ベンゾナーゼを用いてDNAおよびRNAを除去する段階、
ゲノムDNA (gDNA)を抽出する段階、
SEQ ID NO:5のフォワードプライマー、SEQ ID NO:6のリバースプライマーおよびSEQ ID NO:7のプローブとともにgDNAをインキュベートする段階、
2だけ増えたアニーリング/伸長時間でPCRを実施する段階
を含む、上記態様のいずれか1つに記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための方法を提供する。
本発明は、腫瘍微小環境(TME)によって影響される内因性T細胞プロモーターの制御下で外因性の遺伝属性/回路を統合することにより、CAR T細胞(TCRneg, CAR+)療法の治療結果を改善するのに有用である。非限定的な例として、アルギニン、システイン、トリプトファンおよび酸素欠乏ならびに細胞外アシドーシス(乳酸蓄積)を含むTMEの特徴は、特定の内因性遺伝子を上方制御することが知られている。本発明によれば、内因性遺伝子の上方制御を「ハイジャック」し、関連する外因性コード配列を再発現させて、ある種の腫瘍微小環境におけるCAR T細胞の抗腫瘍活性を改善することができる。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) レアカットエンドヌクレアーゼ用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のレアカットエンドヌクレアーゼ認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
をさらに含む、エンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を提供する。
TCRはT細胞受容体を意味する。TRACはT細胞受容体アルファ定常領域を意味する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
へのTALEN結合を含む。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) 以下の配列
を含むTALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で以下の配列
を含む第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) 以下の配列
を含むTALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較した挿入であって、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、挿入、
(c') 任意で以下の配列
を含む第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) 以下の配列
を含むTALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較した挿入であって、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするコード配列、終結配列を含む外因性ポリヌクレオチドを含む、挿入、
(c') 任意で以下の配列
を含む第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) 以下の配列
を含むTALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較した挿入であって、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチド、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、終結配列を含む、挿入、
(c') 任意で以下の配列
を含む第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
配列中で下線を引いた配列は相同組み換えに用いられうる内因性ゲノムTRAC遺伝子の配列であり、太字で斜体の配列は自己切断ペプチドをコードする配列に対応し、斜体の配列はポリA配列のような終結シグナルに対応し、コード配列は、タンパク質をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームに対応し、該タンパク質は、例えばキメラ抗原受容体(CAR)であってよい;
、(またはSEQ ID NO:9)、
(CD22 B-B7 QR3)
(CD22 A-D4 QR3)
、(またはSEQ ID NO:11);
(CD123 K43 QR3)
。
細胞とは、任意の真核生細胞、任意の初代細胞または細胞株を意図する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) 半TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意でもう一方の半TALEN用の認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
である以下の配列: SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12の1つを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
第1のTALEN結合ドメインがttgtcccacagATATCに結合することを条件として、SEQ ID NO:3と少なくとも100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%〜80%の同一性を有する配列を有する、第1の半TALEN、および
第2の半TALENが
に結合し、かつ該TALENのオフターゲット切断の頻度が検出未満であることを条件として、SEQ ID NO:4と少なくとも100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%〜80%の同一性を有する配列を有する、第2の半TALEN
を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
のTALEN結合ドメインの下流に位置する外因性ポリヌクレオチド配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
の2Aペプチド、さらにより好ましくは配列
の2Aペプチドから選択されるゲノムTRACコード配列とインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
の、2Aペプチドをコードする配列、キメラ抗原受容体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、ポリアデニル化シグナルの転写終結配列、任意でTALEN結合ドメインを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
、ポリアデニル化シグナルの転写終結配列を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
(a) 野生型TRAC遺伝子に存在するレアカットエンドヌクレアーゼ用の認識ドメイン上流のヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、非コード配列、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカインをコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のレアカットエンドヌクレアーゼ認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、野生型TRAC遺伝子と比較したエンドヌクレアーゼ改変ゲノムTRAC遺伝子を含むエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための手段。
を含むTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための、請求項30記載の手段。
(a) ヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) (半?) TALEN用の認識ドメイン、好ましくは以下の配列
を含む(半?) TALEN用の認識ドメイン、または
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインもしくは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップもしくは挿入であって、挿入が、非コード配列、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップもしくは挿入、
(c') 任意で第2の(半?) TALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含み、かつ手段が該TALEN改変ゲノムTRAC遺伝子に特異的に結合する、請求項30または31記載の手段。
不活性化ゲノムTCRA遺伝子を含み、
CARをコードする外因性配列が、レンチウイルスベクターまたはAAVベクターを用いてゲノムTCRA遺伝子に組み込まれ、かつゲノム破壊が、CRISPR/CAS9、CRISPR/Cpf1 メガヌクレアーゼ、MegaTAL、ZFN、TALEN、それらの組み合わせから選択されるエンドヌクレアーゼを用いて行われた、
請求項1〜15のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
(a) ヒト細胞に、
(i) 操作されたヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列または操作されたヌクレアーゼタンパク質(操作されたヌクレアーゼがヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の認識配列の位置で切断を生じ、切断が検出不能なレベルまでαβ-TCRの細胞表面発現の阻害をもたらす)、
(ii) CARをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む第2の核酸配列、
(iii) 任意でプローブ
を導入する段階
を含み、
該外因性ポリヌクレオチドの配列が該切断部位で該ヒトゲノムTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入され; かつさらに非改変対照細胞と比較した場合に、該遺伝子改変細胞が内因性TCRの細胞表面発現を低減させる、方法。
5'から3'方向に
を認識しかつAAATCT内で切断するジンクフィンガー、以下の配列:
のいずれか1つに相補的な配列を認識するCrispr/Cas 9、MegaTAL、野生型ヒトTCRアルファ定常領域の残基番号93〜208内の認識配列を認識かつ切断するメガヌクレアーゼ
であり、組み換えメガヌクレアーゼが第1サブユニットおよび第2サブユニットを含み、該第1サブユニットが該認識配列の第1の認識半部位に結合し、第1の超可変(HVR1)領域を含み、かつ該第2サブユニットが該認識配列の第2の認識半部位に結合し、第2の超可変(HVR2)領域を含む、請求項37〜39記載の方法。
(内因性TCRアルファ遺伝子内に本明細書において記載されるCARのいずれか1つをコードする挿入を含む)上記のように初代CAR陽性(CAR+) TCR陰性(TCR-)免疫細胞の集団を提供する段階、
該CAR+TCR-初代免疫細胞に、
該免疫細胞集団の治療可能性を改善する少なくとも1つの分子をコードするように内因性遺伝子座に組み込まれる外因性ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸;
該選択された内因性遺伝子座を特異的に標的とする少なくとも1つの配列特異的試薬
を導入する段階
を含み、
該外因性ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が、該遺伝子座に存在する内因性プロモーターの転写制御下で外因性コード配列を形成するように、標的とされる遺伝子組み込みによって該内因性遺伝子座に挿入される。
第56項〜第67項のいずれか一項記載のTCR-CAR-操作初代免疫CAR+TCR-細胞の集団を調製する段階;
任意で、該操作された初代免疫CAR+TCR-細胞を精製または選別する段階;
該患者への該細胞の注入時または注入後に該操作された初代免疫CAR+TCR-細胞の集団を活性化する段階
を含む。
に特異的なTALENおよび/またはCD38、CS-1、CLL-1、CD70のようなT細胞抗原をコードするゲノム配列、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG 3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、SERCA3、IL27RA、STAT1、STAT3、ILT2 ILT4、SEMA7A、SHARPIN、STAT1、PEA15、RICTOR、JAK2、AURKA、DNMT3、miRNA31、MT1A、MT2A、PTGER2、miR101、mir26A、mir21を生成する遺伝子から選択される分子(または免疫チェックポイント)をコードするゲノム配列から選択される別のゲノム配列に特異的な別のTALENを一過性に発現した。PD1、PDL1、CTLA-4、TIM3、LAG3、TNFαまたはIFNγは、本発明の細胞中へ操作される好ましい遺伝子であってよい。
を有する。特定の態様において、操作されたTRAC遺伝子は、以下の配列
のいずれか1つを含みうる。
と、もしくは
と少なくとも93,75 %、87.5%、81.25%、75%、68.75%、62.5%、56.25%、5%、43.75%、37.5%、31.25%、25%、18.75%、12.5%、6.25%の同一性を有する配列に結合するTALENを用いて得られる、上記のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供し、ただし該TALENがTRAC遺伝子を切断しTCRアルファ遺伝子の不活性化、TCRアルファベータの検出不能な細胞表面発現を誘導し、該TALENに対するオフターゲット部位がガイド配列(guide-seq)法を用いて検出未満であることを条件とする)。
のいずれか1つの下流および以下の配列
のいずれか1つの上流に位置する外因性ポリヌクレオチド配列を含む、上記のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
の2Aペプチド、さらにより好ましくは配列
の2Aペプチドから選択されるゲノムTRACコード配列とインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列を含む、上記のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
の、2Aペプチドをコードする配列、キメラ抗原受容体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、転写終結配列(ポリアデニル化シグナルの転写終結配列)、任意でTALEN結合ドメインを含む、上記のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を提供する。
本発明によるTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞は、終結配列または終結因子配列を含むTRAC遺伝子への挿入を含み、好ましくは本発明によるTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞は5'から3'方向に、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、好ましくはCARおよび終結配列を含む挿入を含みうる。
特定の態様において、本発明は、少なくとも1つのさらなる内因性ゲノム遺伝子がエンドヌクレアーゼ不活性化され、好ましくはTALEN不活性化され、該内因性ゲノム遺伝子が、TCRの内因性ゲノムベータサブユニット遺伝子、内因性ゲノムサイトカイン誘導性SH2含有(CISH)遺伝子、アデノシンA2a受容体(ADORA)ゲノム遺伝子、内因性ゲノムCD276遺伝子、内因性ゲノムVセットドメイン含有T細胞活性化阻害物質1(VTCN1)遺伝子、内因性ゲノムBおよびTリンパ球関連(BTLA)遺伝子、内因性ゲノム細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA4)遺伝子、内因性ゲノムインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO l)遺伝子、内因性ゲノムキラー細胞免疫グロブリン様受容体, 3ドメイン, 長い細胞質尾部1(KIR3DL1)遺伝子、内因性ゲノムリンパ球活性化遺伝子3(LAG3)遺伝子、内因性ゲノムプログラム細胞死1(PD-1)遺伝子、内因性ゲノムA型肝炎ウイルス細胞受容体2(HAVCR2)遺伝子、T細胞活性化内因性ゲノムVドメイン免疫グロブリンサプレッサー(VISTA)遺伝子、内因性ゲノムナチュラルキラー細胞受容体2B4(CD244)遺伝子、内因性ゲノムヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(HPRT)遺伝子、内因性ゲノムアデノ随伴ウイルス組み込み部位(AAVS l)、ならびに内因性ゲノムケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(遺伝子/偽遺伝子)(CCR5)遺伝子、それらの組み合わせからなる群より選択される、上記のいずれか1つに記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を提供する。
(a) 発現が、解糖を増加させるためのSERCA3、miR101およびmir26A、解糖予備能を動員するためのBCATのような、解糖および/もしくはカルシウムシグナル伝達の低減に関与する因子; ならびに/または
(b) 発現がIL27RA、STAT1、STAT3のような、免疫チェックポイントタンパク質(例えばTIM3、CEACAM、LAG3、TIGIT)を上方制御する因子; ならびに/または
(c) 発現がILT2もしくはILT4のような、HLA-Gとの相互作用を媒介する因子; ならびに/または
(d) 発現がTreg増殖を低減させるためのSEMA7A、SHARPIN、アポトーシスを低下させるためのSTAT1、IL-2分泌を増加させるためのPEA15およびCD8記憶分化に有利に働くためのRICTORのようなT細胞増殖の下方制御に関与する因子; ならびに/または
(e) 発現がmir21のような、T細胞活性化の下方制御に関与するポリヌクレオチド配列; ならびに/または
(f) 発現がJAK2およびAURKAのような、サイトカインに応答するシグナル伝達経路に関与するポリヌクレオチド配列; ならびに/または
(g) 発現がDNMT3、miRNA31、MT1A、MT2A、PTGER2のような、T細胞枯渇に関与するポリヌクレオチド配列
から選択される少なくとも1つのさらなる因子の発現のレベル。
本発明は、TALEN、Crispr/cas 9、メガヌクレアーゼ、TAL-ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼから選択されるエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性初代ヒト細胞を検出するための手段または縮重された手段(degenerated means)を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) レアカットエンドヌクレアーゼ用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のレアカットエンドヌクレアーゼ認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
をさらに含む、エンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性初代ヒト細胞を検出するための手段を提供する。
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、好ましくは
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含むギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞を同定するための手段を提供する。
に結合するTALENを用いて同定された既知の真正オンサイトに基づいてデザインされうる。この好ましい局面の下で、第1の半TALEN部分が
に結合し、第2のものが
に結合し、かつdsDNA切断が
内で行われる。
に結合する、好ましくは
に結合する、および
に結合するプローブによって、ヒト初代細胞におけるオンサイトのTRAC特異的TALEN誘導事象を検出するための上記に記載の手段を提供する。
の下流のTRAC遺伝子中の配列に相補的な配列を含む。
に結合するTALENを用いた本発明のオフサイト切断において、
を含む配列に相補的な配列および/または配列
の下流のTRAC遺伝子中の配列に相補的な配列を含む手段またはプローブは、TALENに適合されたガイド配列分析を用いた検出レベルに満たない。
(a) ヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) TALEN用の認識ドメイン、好ましくは以下の配列
を含むTALEN用の認識ドメイン、または
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインもしくは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップもしくは挿入であって、非コード配列、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む該挿入、
(c') 任意で第2のTALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含み、かつ手段がエンドヌクレアーゼ改変ゲノムTRAC遺伝子におよび/またはオフサイトに結合する、上記のいずれか1つに記載の手段を提供する。
の少なくとも10塩基に結合するTRACエクソン1特異的TALENを提供する。
(a) ヒト初代細胞に、
(i) 操作されたヌクレアーゼがヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の認識配列の位置で切断を生じる、操作されたヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列または操作されたヌクレアーゼタンパク質、および
(b) 外因性ポリヌクレオチドを含む第2の核酸配列
を導入する段階
を含み、
該外因性ポリヌクレオチドの配列が該切断部位で該ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入され、かつさらに該遺伝子改変初代細胞が非改変対照初代細胞と比較した場合に、内因性TCRの細胞表面発現を低減させる。
(a) 野生型ヒトTCRアルファ定常領域の残基番号93〜208内の認識ドメインまたは配列を認識かつ切断するメガヌクレアーゼ用の認識ドメイン上流のヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) 野生型ヒトTCRアルファ定常領域の残基番号93〜208内の、メガヌクレアーゼ用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、
非コード配列、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む該挿入、
(c') 任意で野生型ヒトTCRアルファ定常領域の残基番号93〜208内の、第2のメガヌクレアーゼ認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
をさらに含む、ヒト細胞またはヒト細胞の集団を提供する。
(a) ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子の5'領域;
(b) PAM、(b') 外因性ポリヌクレオチド; および
(c) ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子の3'領域
を含む改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子を、そのゲノム中に含むCrispr/cas 9改変細胞を検出するための手段を提供する。
1.1 参考文献および定義
本明細書において言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書において引用されている、交付済み特許、許可された出願、公開された外国出願、およびGenBankデータベース配列を含む参考文献は、あたかも各々が具体的かつ個別的に参照により組み入れられることを示すのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において用いられる場合、「キメラ抗原受容体」または「CAR」は、抗原に対する特異性を免疫エフェクター細胞(例えば、ヒトT細胞)に付与または移植する操作された受容体をいう。キメラ抗原受容体は、典型的には、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分、およびT細胞活性化に必要なシグナルを伝達する1つまたは複数の刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、特定のエピトープまたは抗原(例えば、がん細胞もしくは他の疾患原因細胞または粒子の表面上に選択的に存在するエピトープまたは抗原)に対する特異性を提供する、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片(scFv)の形態であってよい。細胞外リガンド結合ドメインは、関心対象の任意の抗原またはエピトープに特異的であることができる。
特定の態様において、TRAC遺伝子に挿入された外因性ポリヌクレオチドによってコードされるCARはscfvを含む。本発明のscfvは、リンカー配列を介して付着させることができる。
細胞外ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含むことができる。本明細書において用いられる用語「ヒンジ領域」は一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴまたはポリペプチドを意味する。特に、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに対してより高い柔軟性および接近可能性を提供するために用いられる。ヒンジ領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは10〜50個のアミノ酸を含みうる。ヒンジ領域は、CD8もしくはCD4の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部のような、天然に存在する分子の全部もしくは一部に由来しうる。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であってよく、または完全に合成のヒンジ配列であってよい。好ましい態様において、ヒンジドメインは、それぞれヒトCD8アルファ鎖、FcRIIIα受容体またはIgG1の一部を含む。
本発明において、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、WO2016120216に記載されているものなどのモノクローナル抗体によって認識されうるモノクローナル抗体エピトープを含みうる。好ましい態様?において、本発明のCARは「QR3」、「QR2」、「QR1」、「Q」、「R」、「R2」または「R3」CARであり、参照により本明細書に組み入れられるWO2016120216A1に記載されているようにQはQ ben10抗体によって認識されるエピトープであり、Rはリツキシマブによって認識されるエピトープである。
本発明によるCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合に続く細胞内シグナル伝達を担い、免疫細胞の活性化および免疫応答(標的細胞に対する細胞溶解活性)を引き起こす。言い換えれば、シグナル伝達ドメインは、CARが発現されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化に関与している。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であってよい。したがって、用語「シグナル伝達ドメイン」は、エフェクターシグナル機能を伝達し、細胞に特殊な機能を果たすように指令するタンパク質の部分をいう。
TRAC遺伝子中の挿入は、WO2014039523 A1に記載されているものである多鎖CARをコードする配列を含みうる。
本明細書において用いられる場合、「外因性T細胞受容体(TCR)」または「組み換えTCR」は、その配列が、内因性TCRを発現しない免疫エフェクター細胞(例えば、ヒトT細胞)のゲノムに導入されるTCRをいう。免疫エフェクター細胞における外因性TCRの発現は、特異的かつ既知のエピトープまたは抗原(例えば、がん細胞もしくは他の疾患原因細胞または粒子の表面上に選択的に存在するエピトープまたは抗原)に対する特異性を付与することができる。そのような外因性T細胞受容体は、アルファおよびベータ鎖を含むことができ、あるいは、ガンマおよびデルタ鎖を含みうる。本発明において有用な外因性TCRは、本明細書において列挙されるもののような任意の関心対象の抗原またはエピトープに対する特異性を有しうる。
本明細書において用いられる場合、用語「T細胞受容体アルファ遺伝子」は、Genome Data Viewer Map ViewerLocationにおけるTRA由来の染色体14: 14q11.2上のヒトTCRアルファ遺伝子をいう。
1つの局面において、本明細書において記載されるのは、TCR遺伝子の発現が調節される、細胞(例えば、リンパ系細胞、幹細胞(例えば、iPSC、胚性幹細胞、MSCもしくはHSC)または前駆細胞を含むヒト細胞のような真核細胞)である。
タグは、マーカーまたは標識として用いられ、オンサイトに(場合によりオフサイトに)組み込まれかつ検出されうる、非コード配列またはコード配列を含む配列であるように意図される。
本発明のTRAC欠損ヒト細胞は、さらなるゲノム改変、例えば不活性化T細胞受容体ベータ遺伝子、ならびに不活性化PD1、CD52および/またはCTLA4遺伝子を含みうる。
本明細書において記載の薬学的に許容される媒体(または担体)および任意の細胞または細胞集団を含む薬学的組成物、ならびに対象における障害(例えば、がん)の処置のためのエクスビボ治療において細胞および薬学的組成物を使用する方法も提供される。
いくつかの局面において、本発明の操作されたヒト細胞は、治療のため、例えば養子細胞移入、免疫療法のために使用され得る。他の態様において、T細胞移植に使用するための細胞は、関心対象の別の遺伝子改変を含む。1つの局面において、T細胞は、がんマーカーに特異的な挿入されたキメラ抗原受容体(CAR)を含む。さらなる局面において、挿入されたCARは、悪性B細胞を含む、B細胞に特徴的なCD22マーカーに特異的である。
2.1 本発明の原理
本発明は、一部、異なる操作されたヌクレアーゼが、ヒトTCRアルファ遺伝子内で見出される認識配列、および使用されるヌクレアーゼに依存して、オフサイト配列を認識および切断するという発見に基づいている。(オフサイトおよびオンサイトの)切断される配列は、使用されるヌクレアーゼに特異的であり、安定な医薬品としての最終生成物の信頼性を増減させるオフターゲット部位の頻度および数に関連する。医薬品は宿主内で安定的でなければならず、かつ一定圧力を付与する免疫系に抗さなければならないという事実から、これが提供されることが特に重要である。
好ましくは、ゲノムTRAC内の挿入物は、以下の配列を含む:
または
または
または
ここで、下線部の配列はゲノムTRACの配列(相同アーム)であり、太字斜体の配列は2Aペプチドをコードする配列であり、斜体はポリA終結配列(BGHポリA)に対応する配列である。
特定の態様において、本発明は、TALENまたはコンパクトTALENを用いて実施され得る。
1つの態様において、外因性配列によってコードされるポリペプチドは、IRESを含む。
本発明は、ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内で見いだされる認識配列を認識および切断する操作されたTALENヌクレアーゼを用いて遺伝的に改変された細胞を作製する方法を提供する。
を認識および切断する操作されたTALENヌクレアーゼを用いて遺伝的に改変された細胞を作製する方法を提供する。
を認識および切断する操作されたTALENヌクレアーゼを用いて遺伝的に改変された細胞を作製する方法を提供する。
を認識および切断する操作されたTALENヌクレアーゼを用いて遺伝的に改変された細胞を作製する方法を提供する。
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を認識および切断する操作されたTALENヌクレアーゼを用いて遺伝的に改変された細胞を作製する方法を提供する。
を認識および切断する操作されたTALENヌクレアーゼを用いて遺伝的に改変された細胞を作製する方法を提供する。
を認識および切断する操作されたTALENヌクレアーゼを用いて遺伝的に改変された細胞を作製する方法を提供する。
を認識および切断する操作されたTALENヌクレアーゼを用いて遺伝的に改変された細胞を作製する方法を提供する。
を認識および切断する操作されたTALENヌクレアーゼを用いて遺伝的に改変された細胞を作製する方法を提供する。
本発明の操作されたTALENヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、または好ましくは、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に送達され得る。そのような核酸は、DNA(例えば、環状もしくは直鎖状プラスミドDNAもしくはPCR産物)またはRNAもしくはRNAの組み合わせであってよい。
本発明の遺伝的に改変された細胞がヒトT細胞またはそれ由来の細胞である場合、そのような細胞は、ヌクレアーゼおよび/または外因性核酸配列の導入前に活性化を必要とし得る。例えば、T細胞は、細胞を活性化するのに十分な期間、可溶性であるまたは支持体(すなわち、ビーズ)に結合された抗CD3および抗CD28抗体と接触させられ得る。
本発明の遺伝的に改変された細胞はさらに、その誘導が細胞死を誘発し、インビトロまたはインビボでのその細胞の選択的破壊を可能にする1つまたは複数の誘導性自殺遺伝子を発現するよう改変され得る。いくつかの例において、自殺遺伝子は、細胞毒性ポリペプチド、無毒性のプロドラッグを細胞毒性の薬物に変換する能力を有するポリペプチド、および/または細胞内の細胞毒性遺伝子経路を活性化するポリペプチドをコードし得る。すなわち、自殺遺伝子は、それ自身によりまたは他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす生成物をコードする核酸である。そのような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。さらなる例は、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼおよび5-フルオロシトシンを強毒性の化合物である5-フルオロウラシルに変換することができる細菌遺伝子シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子である。自殺遺伝子はまた、非限定的な例として、カスパーゼ-9、カスパーゼ-8またはシトシンデアミナーゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの例において、カスパーゼ-9は、特定の二量体化化学誘導因子(CID)を用いて活性化され得る。自殺遺伝子はまた、細胞に治療的および/または細胞毒性モノクローナル抗体に対する感受性を与える、細胞表面上で発現されるポリペプチドをコードし得る。さらなる例において、自殺遺伝子は、抗CD20 mAbリツキシマブによって認識される抗原性モチーフおよび自殺遺伝子を発現する細胞の選択を可能にするエピトープを含む組み換え抗原性ポリペプチドをコードし得る。例えば、2つのリツキシマブ結合エピトープおよびQBEndIO結合エピトープを含む、WO2013153391に記載されるRQR8ポリペプチドを参照のこと。そのような遺伝子の場合、リツキシマブは、必要とされる場合、細胞枯渇を誘導するよう対象に投与され得る。
(a)ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5’領域、
(b)TALEN用の認識ドメイン、
(c)アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響する野生型TRAC遺伝子と比較してのギャップまたは挿入であって、挿入が、非コード配列、例えば停止コドン、IRES、コード配列、例えばTRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c’)任意で、第2のTALEN認識ドメイン、
(d)ゲノムTRAC遺伝子の3’領域、
を含む細胞)または本発明の遺伝的に改変された細胞の集団、ならびに薬学的担体、ならびに別の医薬、例えばdCK KO細胞のためのPNA、CD52 KOのためのアレムツズマブ、GR KO細胞のためのグルココルチコイドを含む薬学的組成物を提供する。
本発明の薬学的組成物は、養子免疫療法により標的とすることができる任意の疾患状態を処置するのに有用であり得る。本発明の物質(CARまたはTCRを発現する操作された初代ヒト細胞)を用いて処置され得る疾患は、同物質の細胞表面上で発現されるCARの標的を発現する細胞または組織によって特徴づけられることもあり、そうでないこともある。
本発明は、操作された細胞を検出する手段を提供する。本発明のそのような手段は、欠失、変異、挿入を起こした改変されたTCR遺伝子を認識および検出することができる任意の手段を含む。本発明のそのような手段は、TRAC遺伝子の欠失、変異、挿入、および存在する場合、オフサイトのそれらを起こした改変されたTCR遺伝子を認識および検出することができる任意の手段を含む。
(i)TRACが改変された細胞および適当な対照として使用される細胞のDNAを精製する段階、
(ii)該DNAを、本発明の改変されたTRAC遺伝子またはwt TRAC遺伝子を検出する手段と共にインキュベートし、混合物を得る段階、
(iii)該混合物をpcrに供する段階、
(iv)pcr産物を配列決定する段階
を含む、wt TRAC遺伝子または欠失、変異もしくは挿入を含む改変されたTRAC遺伝子を検出する方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「DNA結合親和性」または「結合親和性」という用語は、参照DNA分子(例えば、認識配列または任意配列)に対して非共有結合により結合するヌクレアーゼの傾向を意味する。結合親和性は、解離定数3/4によって測定される。本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼは、参照認識配列に対するそのヌクレアーゼのKdが参照ヌクレアーゼと比較して統計学的に有意な割合の変化により増加または減少している場合、「変更された」結合親和性を有する。本発明において、TALENは、以下の配列
または、5'から3'方向に、
(第1もしくは左側結合部位、第1もしくは左側認識ドメイン)
(第2もしくは右側結合部位 - 第2もしくは右側認識ドメイン)を含む
に優先的に結合し得る。
:第2の認識ドメインの上流(第1の認識ドメインの5’側)または下流のTRAC遺伝子の配列。
ここで(XXX)nはタグを含む組み込まれたポリヌクレオチドであり、タグは非コード配列、タンパク質、例えば自己切断ペプチド、CARをコードする配列であり得、Dは塩基を表し、連続するDはゲノムのwt TRAC遺伝子との相同部分を表す。
またはCostea PI, Lundeberg J, Akan P (2013) TagGD: FAST and Accurate Software for DNA Tag Generation and Demultiplexing. PLoS ONE 8(3): e57521. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057521に記載されるものの任意の一つを含み得る。
、その相補的配列の一つを含む本発明のTCR操作細胞を検出するための少なくとも1つの手段を提供し、この手段は、例えば、ペプチド2A配列のCAR配列に結合し、本発明にしたがうPCRを可能にする手段と組み合わされ得る。
およびそれらのいずれか一つの相補的配列の少なくとも1つを含む配列を含む操作された免疫細胞(細胞は様々なエンドヌクレアーゼCrispr/Cas9を用いて操作されたものである)を検出するための手段を提供する。
本発明のアルファベータTCR欠失細胞を検出するための本発明の任意の手段、プローブ、オリゴヌクレオチドの設計の枠組み
TRACエクソン1(大文字)
TRAC内の最も好ましい配列:
ttgtcccacagATATCCAG - TCRとインフレームの2A配列 - CAR配列 - pA - 右側相同部
別候補:
TRAC遺伝子座を破壊し、その転写制御下にCAR(例えば、CD22特異的m971 QR3またはCD123特異的K43 QR3)を配置する(TRAC-CAR)ために、TRAC遺伝子座の第1エクソンを標的とするTRAC TALENならびに自己切断性T2Aペプチドおよびそれに続くCAR cDNAをコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター修復マトリクスを調製した。PBMCを解凍し、TransactヒトTアクチベーターCD3/CD28ビーズを用いて活性化させた。それらの活性化から3日後、T細胞を、最短で4時間後にトランスフェクトされるよう継代した。次いでT細胞を、AgilePulseシステム(Harvard Apparatus)を用いた100万細胞あたり1μgのTRAC TALENをコードするmRNAの0.4 cmキュベットへの電気的移入によってトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、細胞を直ちに、4x106細胞/mLの濃度となるよう20 ng/ml IL-2および5% CTS(商標)免疫細胞SRを補充したX-Vivo-15培地に希釈し、5%CO2の存在下、37℃で、12ウェルプレート(ウェルあたり500μl)においてインキュベートした。
(すべてヒトT細胞受容体アルファ定常領域内の)ヒトTRAC遺伝子の認識配列を認識するよう操作された組み換えヌクレアーゼは、以前に、WO2017062451 Precision TRAC、WO2015057980またはWO2017106528で開示された。そのエンドヌクレアーゼの活性は、内因性TCRアルファベータの細胞外部分の失活、および最終的に、内因性アルファベータTCRの細胞表面の下方調節をもたらす。対応するZnフィンガーは、US2011158957で開示された。
初代T細胞を、1000 pmolのDSオリゴヌクレオチドと共にTRACエンドヌクレアーゼまたは何もなしのいずれかを用いて電気穿孔した。
・超音波によるDNAのせん断
・平滑な先端部を有するようにする末端修復
・(一方の側のみでライゲートすることができるように)一方の側が平滑であり、他方がオーバーハングを有するY字アダプターとのライゲーション
・DSオリゴと上記アダプターとの間での連続的なPCR:これらはオリゴの配列(隣接領域の一方の側を増幅する「プラス」増幅)またはオリゴの逆相補配列(隣接領域の他方の側を増幅する「マイナス」増幅)のいずれかを用いて行うことができる)
・その後、各PCR産物を両方の側(R1およびR2)で配列決定する。
TALENのアームは、以下の通りである(T0を含む)
・TRACの場合
ゲノムのv37.1上のこの部位の位置:
・オンサイトTRAC:4016436位(4106460上のスペーサーの中心)から始まるコンティグNT_026437.12
求められる生成物の構造は、以下のようなものであるべきであり、ここでDSオリゴヌクレオチドは大文字で、PCR後も残存すると考えられるプライマーは小文字で示され、未知のゲノム配列は
で表される:
・「プラス」PCRの場合、
・「マイナス」PCRの場合
最初に、読み取りを、予想されるプライマーの存在について試験した:
・マイナス_R2の読み取りについては、第1のTを含まない第2のプライマーの配列である配列
の存在を確認した
・プラス_R2の読み取りについては、第2のPCRプライマーの配列である配列
の存在を確認した。
・初期読み取り数
・(必要とされるオリゴについての)フィルター後の読み取り数
・短いトリミングされた配列を破棄した場合、トリミングされた読み取りの最終数
で表す。
T細胞におけるIL-15およびCARをコードするマトリクスのTALEN(登録商標)を通じた二重標的化組み込み
この実施例は、PD1およびCD25遺伝子を調節する内因性T細胞プロモーターの制御下にIL-15/可溶性IL-15受容体アルファヘテロ二量体(IL15/sIL15rα)発現カセットを組み込むことによりCAR T細胞療法の治療結果を改善する方法について記載する。両方の遺伝子ともCAR T細胞が腫瘍に接触した際に上方調節されることが公知であるので、腫瘍近辺でのみIL-IL15/sIL15rαを再発現するようそれらを乗っ取ることができる。この方法は、活性化誘導T細胞死(AICD)を減少させ、T細胞の生存を促進し、T細胞の抗腫瘍活性を強化し、T細胞アネルギーを好転させるその能力を維持しつつ、IL15/sIL15rαの全身分泌の潜在的副作用を減少させる。
(a)ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5’領域、
(b)半TALEN用の認識ドメイン、
(c)アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響する野生型TRAC遺伝子と比較してのギャップまたは挿入であって、挿入が、非コード配列、例えば停止コドン、IRES、コード配列、例えばTRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c’)任意で、a)もう一方の半TALEN用の認識ドメイン、
(d)ゲノムTRAC遺伝子の3’領域、
を含み、さらに、別の不活性化されたゲノム遺伝子、例えば、以下のコード遺伝子:インターロイキン3、インターロイキン2、ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド4、インターロイキン21、糖タンパク質49A、核受容体サブファミリー4、グループA、メンバー3、白血球免疫グロブリン様受容体、サブファミリーB、メンバー4、CD200抗原、サイクリン依存性キナーゼ阻害物質1A(P21)、グランザイムC、核受容体サブファミリー4、グループA、メンバー2、サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体8、ラジニン、細胞レチノイン酸結合タンパク質II、グランザイムB、T-ボックス21、プログラム細胞死1、プレクストリン、チェックポイントキナーゼ1、SLAMファミリーメンバー7、ジンクフィンガーおよびBTBドメイン含有32、IgおよびITIMドメイン含有T細胞免疫受容体、リンパ球活性化遺伝子3、グランザイムA、WEE 1ホモログ1(分裂酵母(S. pombe))、インターロイキン12受容体、ベータ2、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5、初期エンドソーム抗原1およびdenticlelessホモログ(ショウジョウバエ(Drosophila))をコードする遺伝子、のいずれか一つを含む細胞、を包含する。
(a)ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5’領域、
(b)半TALEN用の認識ドメイン、
(c)アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響する野生型TRAC遺伝子と比較してのギャップまたは挿入であって、挿入が、非コード配列、例えば停止コドン、IRES、コード配列、例えばTRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c’)任意で、a)もう一方の半TALEN用の認識ドメイン、
(d)ゲノムTRAC遺伝子の3’領域、
を含み、別の不活性化されたゲノム遺伝子、例えば、以下のコード遺伝子:CXCL13、NFRSF1B、RGS2、TIGIT、CD27、NFRSF9、SLA、NF19A、NPP5F、XCL2、HLA-DMA、FAM3C、QCRC1、WARS、EIF3L、KCNK5、TMBIM6、CD200、C3H7A、SH2D1A、ATP1B3、YO7A、THADA、PARK7、EGR2、FDFT1、CRTAMおよびIFI16、のいずれか一つをさらに含む。
Claims (56)
- ゲノムTCR遺伝子(TRAC遺伝子)の定常領域が、
TALENにより生成されかつ内因性アルファベータTCRの細胞表面発現に影響を与える遺伝子改変
を含み、該ゲノムTRAC遺伝子が5'から3'方向に、
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) 半TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意でもう一方の半TALEN用の認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。 - ヒト初代細胞が、ヒト初代T細胞、またはヒトリンパ系初代細胞、またはヒト初代幹細胞、またはヒト初代前駆細胞である、請求項1記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
- ヒト初代細胞が、ヒト初代T細胞またはヒト初代T細胞の集団である、請求項1〜2のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
- ヒトT初代細胞またはその集団が、ヒト初代CD8 T細胞、ヒト初代CD4 T細胞、それらの組み合わせを含むかまたはそれからなる、請求項1〜3のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
- CAR配列が、抗CD22 CAR配列、抗CD123 CAR配列、抗CD30 CAR配列、抗HSP-70 CAR配列、抗o-アセチル-GD2 CAR配列、抗CS-1 CAR配列、抗CLL-1 CAR配列、抗CD38 CAR配列、抗5T4 CAR配列、抗MUC1 CAR配列、抗FAP CAR配列、抗HER2 CAR配列、抗CD79a CAR配列、抗CD79b CARを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
- ポリヌクレオチド配列が、以下の配列: SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12のうち1つを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
- 改変されていない対照細胞と比較して検出不能なレベルのMHC分子と、ベータ2ミクログロブリン分子のまたはCIITA分子の細胞表面発現に機能的に影響を与える欠失とをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
- 前記挿入が、TCRアルファをコードする遺伝子の不活性化および内因性αβ-TCRの検出不能な細胞表面発現を、全細胞の少なくとも96%において、全細胞の少なくとも97%において、全細胞の少なくとも98%において、全細胞の少なくとも99%において引き起こした、請求項1〜9のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
- SEQ ID NO:3と少なくとも100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%〜80%の同一性を有する配列を有する第1の半TALENであって、該第1のTALEN結合ドメインが
に結合することを条件とする、第1の半TALENと、
SEQ ID NO:4と少なくとも100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%〜80%の同一性を有する配列を有する第2の半TALENであって、該第2の半TALENが、
に結合し、かつ該TALENのオフターゲット切断の頻度が検出未満であることを条件とする、第2の半TALENと
を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。 - (CAR)が、細胞外リガンド結合ドメイン、モノクローナル抗体に特異的なエピトープ、膜貫通ドメイン、および1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
- 少なくとも1つの挿入が、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)を含む外因性ポリヌクレオチド配列、ポリアデニル化シグナルの転写終結配列、任意でTALEN結合ドメインを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
- キメラ抗原受容体(CAR)が、モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つの抗原、好ましくはモノクローナル抗体に特異的な2つの抗原を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
- 外因性ポリヌクレオチドが、RNAポリメラーゼの活性を停止させる転写終結シグナルを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
- CD52、dCK GR、TCRのベータサブユニット遺伝子(TCRB1またはTCRB2)、サイトカイン誘導性SH2含有(CISH)遺伝子、アデノシンA2a受容体(ADORA)遺伝子、CD276遺伝子、Vセットドメイン含有T細胞活性化阻害物質1(VTCN1)遺伝子、BおよびTリンパ球関連(BTLA)遺伝子、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA4)遺伝子、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO l)遺伝子、キラー細胞免疫グロブリン様受容体, 3ドメイン, 長い細胞質尾部1(KIR3DL1)遺伝子、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)遺伝子、プログラム細胞死1(PD-1)遺伝子、A型肝炎ウイルス細胞受容体2(HAVCR2)遺伝子、T細胞活性化Vドメイン免疫グロブリンサプレッサー(VISTA)遺伝子、ナチュラルキラー細胞受容体2B4(CD244)遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(HPRT)遺伝子、ならびにケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(遺伝子/偽遺伝子)(CCR5)遺伝子、CXCR4、それらの組み合わせからなる群より選択される内因性遺伝子
における少なくとも1つのさらなる破壊を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。 - 請求項1〜20のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を含む、ヒト細胞の集団。
- 請求項1〜20のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または請求項21記載のヒト細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
- 医薬として用いるための、請求項1〜20のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または請求項21記載のヒト細胞の集団または請求項22記載の薬学的組成物。
- がんの処置で用いるための、請求項1〜20のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または請求項21記載のヒト細胞の集団または請求項22記載の薬学的組成物。
- がん腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および白血病からなる群より選択されるがんの処置で用いるための、請求項1〜20のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または請求項21記載のヒト細胞の集団または請求項22記載の薬学的組成物。
- B細胞由来のがん、T細胞由来のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、黒色腫、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、およびホジキンリンパ腫からなる群より選択されるがんの処置で用いるための、請求項1〜20のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または請求項21記載のヒト細胞の集団または請求項22記載の薬学的組成物。
- B細胞由来のがんが、B系統急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ性白血病、およびB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、がんの処置で用いるための、請求項1〜20のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または請求項21記載のヒト細胞の集団または請求項22記載の薬学的組成物。
- AML、ALL、T細胞リンパ腫、CLLであるがんの処置で用いるための、請求項1〜20のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または請求項21記載のヒト細胞の集団または請求項22記載の薬学的組成物。
- 改変ヒトゲノムTRAC遺伝子が5'から3'方向に、
(a) 野生型TRAC遺伝子に存在するレアカットエンドヌクレアーゼ用の認識ドメイン上流のヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、非コード配列、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカインをコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のレアカットエンドヌクレアーゼ認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、野生型TRAC遺伝子と比較したエンドヌクレアーゼ改変ゲノムTRAC遺伝子を含むエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための手段。 - エンドヌクレアーゼが、CRISPR/Cas 9、CRISPR/Cpfl、TALEN、トランスポザーゼ、ZEN、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはMegaTALからなる群より選択され、かつ手段が、該ヌクレアーゼに特異的なエンドヌクレアーゼ改変TRACの配列におよび/または該ヌクレアーゼに特異的な該配列の上流に結合する、請求項29記載の手段。
- エンドヌクレアーゼがTALENである、請求項29または30記載の手段。
- エンドヌクレアーゼ結合ドメインもしくはエンドヌクレアーゼ認識ドメインの上流の改変ゲノムTRAC遺伝子中の配列におよび/またはタグをコードする配列に結合する、プローブ
を含むTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための、請求項31記載の手段。 - TALEN改変ゲノムTRAC遺伝子が、
(a) ヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) (半?) TALEN用の認識ドメイン、好ましくは以下の配列
を含む(半?) TALEN用の認識ドメイン、または
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインもしくは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップもしくは挿入であって、挿入が、非コード配列、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2の(半?) TALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含み、かつ手段が該TALEN改変ゲノムTRAC遺伝子に特異的に結合する、請求項31または32記載の手段。 - ポリメラーゼ連鎖反応(pcr)または潜在的なオフサイト改変により、好ましくはガイド配列により、エンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための、請求項31〜34のいずれか一項記載の手段。
- 請求項1〜20のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための、請求項31〜35のいずれか一項記載の手段。
- 不活性化ゲノムTCRA遺伝子を含み、
CARをコードする外因性配列が、レンチウイルスベクターまたはAAVベクターを用いてゲノムTCRA遺伝子に組み込まれ、かつゲノム破壊が、CRISPR/CAS9、CRISPR/Cpf1 メガヌクレアーゼ、MegaTAL、ZFN、TALEN、それらの組み合わせから選択されるエンドヌクレアーゼを用いて行われた、
請求項1〜16のいずれか一項記載のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。 - (a) ヒト細胞に、
(i) 操作されたヌクレアーゼがヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の認識配列の位置で切断を生じ、切断により検出不能なレベルまでαβ-TCRの細胞表面発現の阻害がもたらされる、操作されたヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列または操作されたヌクレアーゼタンパク質、
(ii) CARをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む第2の核酸配列、
(iii) 任意でプローブ
を導入する段階
を含み、
該外因性ポリヌクレオチドの配列が該切断部位で該ヒトゲノムTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入され; かつさらに非改変対照細胞と比較した場合に、該遺伝子改変細胞が内因性TCRの細胞表面発現を低減させる、
エンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を産生するための方法。 - エンドヌクレアーゼ誘導性オンサイトおよびオフサイトを、好ましくはpcrによっておよび/またはガイド配列によって検出する段階を含む、請求項38記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を産生するための方法。
- 操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casヌクレアーゼ、またはmegaTALヌクレアーゼである、請求項38〜39のいずれか一項記載の方法。
- 操作されたヌクレアーゼがTALENである、請求項38〜40記載の方法。
- 外因性ポリヌクレオチドが、自己切断ペプチドおよびキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、請求項38〜41記載の方法。
- キメラ抗原受容体が、細胞外リガンド結合ドメインおよび1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項38〜42のいずれか一項記載の方法。
- 外因性ポリヌクレオチドが、該外因性ポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列を含む、請求項38〜43のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも第2の核酸配列が、該第2の核酸配列を含む組み換えアデノ随伴ウイルス(AAV6)ベクターと細胞を接触させることにより該細胞に導入される、請求項38〜44のいずれか一項記載の方法。
- 組み換えAAVベクターが自己相補的AAVベクターである、請求項40〜45のいずれか一項記載の方法。
- 組み換えAAVベクターが少なくとも部分的にAAV6に由来する、請求項40〜46のいずれか一項記載の方法。
- 組み換えTALENが第1サブユニットおよび第2サブユニットを含み、該第1サブユニットが第1の認識半部位に結合し、かつ該第2サブユニットが第2の認識半部位に結合する、請求項40〜47のいずれか一項記載の方法。
- 組み換えTALENが、野生型ヒトTCRアルファ定常領域中の配列ttgtcccacagATATCを認識する、請求項40〜48のいずれか一項記載の方法。
- エンドヌクレアーゼが、
5'から3'方向に
を認識しかつAAATCT内で切断するジンクフィンガー;以下の配列:
のいずれか1つに相補的な配列を認識するCrispr/Cas 9;MegaTAL;野生型ヒトTCRアルファ定常領域の残基番号93〜208内の認識配列を認識かつ切断するメガヌクレアーゼ
であり、
組み換えメガヌクレアーゼが第1サブユニットおよび第2サブユニットを含み、該第1サブユニットが、該認識配列の第1の認識半部位に結合しかつ第1の超可変(HVR1)領域を含み、かつ該第2サブユニットが、該認識配列の第2の認識半部位に結合しかつ第2の超可変(HVR2)領域を含む、請求項38〜40のいずれか一項記載の方法。 - メガヌクレアーゼが、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、該リンカーが第1サブユニットおよび第2サブユニットを共有結合する、請求項50記載の方法。
- 請求項38〜51の方法のいずれか1つによって得られた細胞を検出するための手段。
- SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、それらの組み合わせ、または任意の縮重されたSEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、それらの組み合わせの配列から選択される、請求項52記載の手段。
- エンドヌクレアーゼによるオンサイトおよび/またはオフサイト切断を検出するための、請求項52記載の手段。
- SEQ ID NO:13〜22のいずれか1つ、それらの組み合わせを有するエンドヌクレアーゼによるオンサイトおよび/またはオフサイト切断を検出するための、請求項54記載の手段。
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