JP2019531696A - 植物薬についての、機序に基づく質管理 - Google Patents

Abstract

本発明は、薬草組成物のバッチの質を評価する方法であって、１つまたは複数の生物学的分析法に、該薬草組成物のテストバッチを供する段階、および、該テストバッチから得られた結果を、既知インビボ効果を有する薬草組成物の既知バッチの結果と比較する段階を含む、方法に関連する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2016年6月22日に出願された米国特許仮出願第62/353,313号に対する、米国特許法第119条（e）の下における優先権を主張する。

連邦支援の研究または開発についての言及
本発明は、米国国立衛生研究所（NIH）により付与された助成金第CA154295号の下での米国政府の支援を受けてなされた。本発明においては米国政府が一定の権利を有する。

発明の背景
生薬および植物薬は世界中の人々に何世紀もの間使用されてきた。今日、薬草から単離された薬草組成物、薬草抽出物、および薬草化合物は様々な疾患および障害の治療において重要な役割を担っており、アスピリンなどの今日最も一般的に使用される薬剤の多くが薬草療法として使われ始めたものである。

疾患の治療に植物薬を確実に使うためには、厳密な品質管理が重要となる。より容易に管理および製剤化できる合成医薬組成物とは異なり、植物薬は生物学的に由来する植物体から得られる。各々の植物には遺伝的変異、生育条件、栽植および収穫のタイミング、ならびに植物薬が調製されたときの植物体の齢による様々な濃度の色々な化合物が含有され得る。

この変動のため、同じ植物薬の異なるバッチが、個々の植物の多様性によってならびに調製法における変動によって異なるインビボ活性を有し得ることが一般に認められる。多様なインビボ活性に関わらず、ある生薬の異なるバッチが、クロマトグラフィーおよび質量分析などの標準的な化学分析法では非常に類似した化学的プロファイルをなおも共有し得ることもしばしば認められる。これらの化学分析法によっては検出できない少量の不純物または組成の変動が植物薬の全体的な活性に対して劇的な影響を与え得る可能性がある。したがって、薬草組成物の特定のバッチが所望のインビボ活性を有するかどうかを単に化学分析法だけによって判定することは難しい。

PHY906は、1,800年前に中国の文献において最初に説明され、消化管症状を治療するために使用されてきたオウゴントウ（Huang Qin Tang）薬草混合物に基づく薬草混合物抽出物である。PHY906は4種類の薬草：コガネバナ（Scutellaria baicalensis）(S)、ウラルカンゾウ（Glycyrrhiza uralensis）(G)、シャクヤク（Paeonia lactiflora）(P)、およびナツメ（Ziziphus jujuba）(Z)からなる。PHY906は現在cGMP（現行の医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理規制）に従って製造されている。臨床試験においては、PHY906はがんに対する化学療法の治療指数を高めることが示されている。

したがって当技術分野においては、単に化学分析だけには頼らない、植物薬および他の薬草組成物の質および潜在的有効性を判定する方法に対するまだ満たされていないニーズがある。本発明はこの満たされていないニーズを満たすものである。

本発明は、薬草組成物のテストバッチの質および潜在的インビボ活性を評価する方法であって、
該方法が、
（a）シグナル伝達活性反応アッセイ法；および
（b）遺伝子発現アッセイ法
より選択される１つまたは複数の生物学的分析法に、該薬草組成物のテストバッチを供する段階；
ならびに、その後、該生物学的分析法の該テストバッチの結果を、既知レベルのインビボ活性を有する薬草組成物の既知バッチから得られた結果と比較する段階
を含み；
該テストバッチの結果と該既知バッチの結果との差異を測定することによって、該薬草組成物のテストバッチの質および潜在的インビボ活性の評価が提供される、方法を含む。

ある態様において、薬草組成物は、コガネバナ(S)の薬草抽出物、ウラルカンゾウ(G)の薬草抽出物、シャクヤク(P)の薬草抽出物、およびナツメ(Z)の薬草抽出物からなる群より選択される１つまたは複数の組成物、それらの任意の画分、ならびに、該薬草抽出物中またはそれらの画分中に存在する任意の活性化学物質を含む。他の態様において薬草組成物はPHY906であり、PHY906は、コガネバナ(S)の薬草抽出物、ウラルカンゾウ(G)の薬草抽出物、シャクヤク(P)の薬草抽出物、およびナツメ(Z)の薬草抽出物を3：2：2：2（S:G:P:Z）の比率で含む。

ある態様においてシグナル伝達活性反応アッセイ法は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法および酵素アッセイ法からなる群より選択される１つまたは複数のアッセイ法を含む。

ある態様においてシグナル伝達活性反応アッセイ法は、炎症酵素、細胞成長酵素および細胞分化酵素、ならびに内分泌酵素およびホルモン酵素より選択される１つまたは複数の酵素に対するシグナル伝達活性反応の測定を含む。他の態様において１つまたは複数の酵素は、TNFa-NFkB、TLR2-NFkB、TLR4-NFkB、IL6-stat3、IFNg-stat1/1、INFa-state1/2、DEX-GR、COX-2、iNOS、NRF2、TGFb-Smad2/3、TPA-AP1、CREB、wnt3a-Lef/b-cat、VD3-VDR、ERα、ERβ、DHT-AR、およびアルドステロン-MRからなる群より選択される。

ある態様において遺伝子発現アッセイ法は、HepG2細胞を薬草組成物で24時間処理する段階、産生されたmRNAを抽出する段階、および、qRT-PCR分析によって該mRNAを定量化する段階を含む。

ある態様において遺伝子発現アッセイ法は、炎症、抗酸化、成長および分化、代謝、ならびに細胞間相互作用より選択される作用を有するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子の測定を含む。他の態様において、１つまたは複数の遺伝子は、ICAM、IRF5、AKR1C1、HO1、GCLC、GCLM、アキシン2、GDF15、IGFBP3、OKL38、PIM1、SERTAD、SOS1、BHMT2、CPT1A、SLC7A11、CD24、EMP2、およびKRT23からなる群より選択される。

ある態様において、１つまたは複数の生物学的分析法によって、薬草組成物の活性バッチと薬草組成物の不活性バッチが化学的組成分析法よりも良好に識別される。他の態様において化学的組成分析法はLC-MS（液体クロマトグラフィー−質量分析法）を含む。

ある態様においては、テストバッチの結果が既知バッチの結果の約90％〜約110％の間である場合に、該テストバッチが、該既知バッチと十分に類似した質と、潜在的インビボ活性とを有すると判定される。

ある態様においては、薬草組成物のテストバッチの質がLC-MSによってさらに分析される。

本発明は、
（a）シグナル伝達活性反応アッセイ法；および
（b）遺伝子発現アッセイ法
より選択される１つまたは複数の生物学的分析法に、薬草組成物を供し、
該生物学的分析法の結果を、既知レベルのインビボ活性を有するPHY906の既知バッチから得られた結果と比較すること
によって、PHY906のテストバッチの質および潜在的インビボ有効性を評価する段階
を含む、がんを有する対象を治療する方法であって、
該テストバッチの結果と該既知バッチの結果の差異を測定することによって、該薬草組成物のテストバッチの質および潜在的インビボ活性の評価が提供され、
かつ、該生物学的分析法において該PHY906のテストバッチが該PHY906の既知バッチと類似した活性を示す場合、該PHY906のテストバッチが該対象に投与される、方法をさらに提供する。

本発明の特定の態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解される。本発明を例証する目的のために、図面においては特定の態様が示される。しかし、本発明は図面において示される態様の正確な取り合わせおよび手段には限定されないことは理解されるべきである。
図1A〜1Dは、PHY906の異なるバッチおよびF（市販のオウゴントウ抽出物混合物）の間におけるインビボ活性と化学的類似性の比較を例証する。表される結果は、化学分析と生物学的効果との間に相関がないことを示す。図1Aは、PHY906の異なるバッチおよびFの、CPT11の抗腫瘍活性および結腸腫瘍を有するBDF1マウスの体重減少の抑制に対する効果について報告するものである。図1Bは、LC-MSによって検出されたPHY906の化学的類似性分析について報告する。図1Cは、PHY906の異なるバッチおよびFの間の化学的類似性を報告する表であり、「1」は同一の化学的プロファイルを表し、「0」は重なる部分のない、完全に異なる化学的プロファイルを表す。図1Dは、図1Cの情報を化学的プロファイルに基づくクラスター解析として報告するものである。 図2A〜2Cは、PHY906の異なるバッチおよびFの間のシグナル伝達活性反応分析について報告するものである。表される結果は、伝達活性反応と生物学的活性の間の密接な相関を示す。図2Aは、PHY906の異なるバッチおよびFの、異なるルシフェラーゼレポーター細胞株および酵素アッセイ法を用いたシグナル伝達活性反応に対する効果について報告する。図2Bは、PHY906の異なるバッチおよびFについてのシグナル伝達活性反応の相関解析を報告する表であり、「1」は同一のシグナル伝達活性を表し、「0」は完全に相違するシグナル伝達活性を表す。図2Cは、図2Bにおける情報をシグナル伝達活性反応に基づくクラスター解析として報告するものである。 図3A〜3Cは、PHY906の異なるバッチおよびFの間の遺伝子発現解析について報告するものである。表される結果は、遺伝子発現と生物学的活性の間の密接な相関を示す。図3Aは、PHY906の異なるバッチおよびFの、選択的遺伝子発現に対する効果について報告するものである。PHY906またはFでHepG2細胞を24時間処理し、qRT-PCR分析のためにmRNAを抽出した。図3Bは、PHY906およびFについての遺伝子発現の相関解析を報告する表であり、「1」は同一の遺伝子発現を表し、「0」は完全に相違する遺伝子発現を表す。図3Cは、図3Bにおける情報を遺伝子発現に基づくクラスター解析として報告するものである。

発明の詳細な説明
本発明はある局面において、ほとんど同一の化学分析プロファイルを有する薬草組成物が非常に多様なインビボ活性を有し得るという、予期せぬ発見に関連する。本発明は、化学分析プロファイルよりもシグナル伝達活性反応アッセイ法および遺伝子発現アッセイ法を含む生物学的アッセイ法の方が、薬草組成物の潜在的インビボ活性についてのより優れた予測因子であるという、予期せぬ発見にさらに関連する。

ある態様において、本発明は、１つまたは複数の生物学的分析法に薬草組成物を供する段階を含む、薬草組成物のバッチの質を評価する方法に関連する。ある態様においては、薬草組成物は、コガネバナ(S)の薬草抽出物、ウラルカンゾウ(G)の薬草抽出物、シャクヤク(P)の薬草抽出物、およびナツメ(Z)の薬草抽出物からなる群より選択される１つまたは複数の組成物、それらの任意の画分、ならびに、該薬草抽出物中またはそれらの画分中に存在する任意の活性化学物質を含む。

定義
本明細書において使用されるように、以下の用語の各々は本節における、それに関連した意味を有するものとする。

特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては本明細書において説明されるものと同様および同等の、任意の方法および材料を使用することができるが、例示的な方法および材料について説明される。

一般に、本明細書において使用される命名法ならびに薬理学、天然物化学、および有機化学における検査法は、当技術分野において周知のものであり、一般に採用されるものである。

本明細書において使用されるように、「1つの（a）」および「1つの（an）」という冠詞は、該冠詞の文法上の対象の１つまたは複数（即ち少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は１つの要素または複数の要素を意味する。

本明細書において使用されるように、「がん」という用語は異常細胞の急速かつ制御されない成長を特徴とする疾患として定義付けられる。がん細胞は局所的に広がることが可能であり、または血流およびリンパ系によって身体の他の部分にまで広がることが可能である。様々ながんの例は非限定的に骨がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵がん、結腸直腸がん、腎がん、肝がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん等を含む。

ある局面においては、対象に関して「共投与される」および「共投与」という用語は、本発明の化合物および／または組成物を、本明細書において企図される疾患または障害を同じく治療または予防し得る化合物および／または組成物と共に対象に投与する段階を指す。ある態様においては、共投与される化合物および／または組成物は、別々に投与されるか、または単一の治療アプローチの部分として任意の組み合わせで投与される。共投与される化合物および／または組成物は、様々な固体、ゲル、および液体の製剤形態下での固体および液体の混合物として、そして溶液として任意の組み合わせにおいて処方することができる。

本明細書において使用されるように、「抽出物」という用語は、薬草または他の植物材料などの天然に存在する供給源に由来する化合物または薬物の濃縮された調製物または溶液を指す。抽出物は薬草を溶液中において浸漬する段階、または薬草を乾燥させて粉末に破砕し、該粉末を溶液中にて溶解する段階を含む、多くの工程によって調製することができる。ある抽出物は、ある量の所望の化合物を溶液中にて溶解した後に溶剤の部分を取り除くことによってさらに濃縮することができる。ある抽出物はまた、濾過または遠心分離を行って、溶液から固体の物質を取り除くこともできる。

本明細書において使用されるように、「オウゴントウ」という用語は、グリシリザ・ウラレンシス・フィッシュ（Glycyrrhiza uralensis Fisch）(G)、ペオニア・ラクティフローラ・ポール（Paeonia lactiflora Pall）(P)、スクテラリア・バイカレンシス・ジョージ（Scutellaria baicalensis Georgi）(S)、およびジジフス・ジュジュバ・ミル（Ziziphus jujuba Mill）(Z)を含む薬草組成物を指す。オウゴントウは、PHY906およびFを含む多くの異なる製剤中に存在し得る。

本明細書において使用されるように、「阻害する」という句は、測定可能な量での分子、反応、相互作用、遺伝子および／またはタンパク質の発現、安定性、作用、または活性を減少させること、または完全に予防することを意味する。阻害剤は、例えば、刺激物に結合する、部分的または完全に刺激をブロックする、タンパク質または遺伝子の安定性、発現、作用、および活性を減少させる、予防する、活性化を遅延させる、不活性化させる、脱感作する、またはダウンレギュレートする、化合物、例えばアンタゴニストである。

本明細書において使用されるように、「PHY906」という用語は、グリシリザ・ウラレンシス・フィッシュ(G)、ペオニア・ラクティフローラ・ポール(P)、スクテラリア・バイカレンシス・ジョージ(S)、およびジジフス・ジュジュバ・ミル(Z)を含む特定の薬草組成物を指す。PHY906は例えば、標準的な操作工程下で調製された、S、G、P、およびZを3：2：2：2の比率で含む特定の組成物を指し得る。

本明細書において使用されるように、それへの投与が企図される「対象」、「患者」、または「個体」という用語は、非限定的にヒト（即ち任意の年齢層の男性もしくは女性、例えば小児の対象(例えば幼児、子ども、青年)もしくは成人の対象（例えば若年成人、中年成人あるいは老人）)および／もしくは他の霊長類（例えばカニクイザル、アカゲザル）；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、および／もしくはイヌなどの商業的に関連のある哺乳動物を含む哺乳動物；ならびに／またはニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよび／もしくは七面鳥などの商業的に関連のあるトリを含む鳥類を含む。

本明細書において使用されるように、「治療的に有効な量」という用語は、患者に投与された場合にその疾患または障害の症状を治療、最小化、および／または寛解する本発明の化合物の量である。「治療的に有効な量」を構成する本発明の化合物の量は、該化合物、該疾患の状態およびその重篤度、治療される患者の年齢等によって変化する。治療的に有効な量は当業者自身の知識および本開示を考慮して当業者によってルーチン的に決定されることが可能である。

本明細書において使用されるように、「治療」または「治療する」という用語は、がん、がんの症状またはがんを発達させる可能性を治す、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、矯正する、寛解する、改善する、または影響を与える目的での、治療的作用物質、即ち、本発明内の有用な化合物の（単独もしくは別の薬学的作用物質との組み合わせにおける）対象への適用もしくは投与、または、治療的作用物質の（例えば診断もしくはエクスビボにおける適用のための）がん、がんの症状もしくはがんを発達させる可能性を有する対象から単離された組織もしくは細胞株への適用もしくは投与と定義付けられる。そのような治療は、薬理ゲノミクスの分野から得られる知見に基づいて特別にオーダーメイドされることまたは特異的に改変されることが可能である。

範囲： 本開示を通して、本発明の様々な局面をある範囲形式において示すことができる。範囲形式における説明は単に利便性および簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する変更不可能な限定であると解釈すべきでないことは理解されるべきである。したがって、ある範囲についての説明は該範囲内にある全ての可能な部分範囲および個々の数値を具体的に開示したものと考えられるべきである。例えば、1〜6などの範囲の説明は1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等のような部分範囲、ならびに該範囲内の個々の、および部分的な数、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したものと考えられるべきである。これは該範囲の幅には関わらず適用される。

本明細書においては以下の略語が使用される。
cGMP 現行の医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理規制
F オウゴントウの市販製剤
G グリシリザ・ウラレンシス・フィッシュ、甘草としても知られる
HQT オウゴントウ
P ペオニア・ラクティフローラ・ポール、ボタンとしても知られる
PCR ポリメラーゼ連鎖反応法
qRT-PCR 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法
S スクテラリア・バイカレンシス・ジョージ、
コガネヤナギまたはスクテ（scute）としても知られる
STAR シグナル伝達活性反応
Z ジジフス・ジュジュバ・ミル、紅棗またはサネブトナツメとしても知られる

質判定法
本発明は、薬草組成物のバッチの質および潜在的インビボ有効性を評価する方法であって、
該方法が、
（a）シグナル伝達活性反応アッセイ法；および
（b）遺伝子発現アッセイ法
より選択される１つまたは複数の生物学的分析法に、薬草組成物を供する段階；
ならびに、その後、該生物学的分析法の結果を、既知レベルのインビボ活性を有する薬草組成物のバッチから得られた結果と比較する段階
を含み、
テストバッチの結果と既知バッチの結果との差異を測定することによって、該薬草組成物のテストバッチの質および潜在的インビボ活性の評価が提供される、方法を含む。

ある態様において薬草組成物は、コガネバナ(S)の薬草抽出物、ウラルカンゾウ(G)の薬草抽出物、シャクヤク(P)の薬草抽出物、およびナツメ(Z)の薬草抽出物からなる群より選択される１つまたは複数の組成物、それらの任意の画分、ならびに、該薬草抽出物中またはそれらの画分中に存在する任意の活性化学物質を含む。他の態様において薬草組成物はPHY906であり、PHY906は、コガネバナ(S)の薬草抽出物、ウラルカンゾウ(G)の薬草抽出物、シャクヤク(P)の薬草抽出物、およびナツメ(Z)の薬草抽出物を3：2：2：2（S：G：P：Z）の比率で含む。他の態様において薬草組成物は、任意の他の植物源もしくは薬草源に由来する組成物もしくは抽出物、それらの任意の画分、または、植物源中もしくは薬草源中もしくはそれらの画分中に存在する任意の活性化学物質を含み得る。

ある態様において薬草組成物のテストバッチの質および潜在的有効性は、１つまたは複数のルシフェラーゼレポーターアッセイ法および／または酵素アッセイ法より選択されるシグナル伝達活性反応アッセイ法によって判定できる。他の態様においては、シグナル伝達活性反応アッセイ法によって、TNFa-NFkB、TLR2-NFkB、TLR4-NFkB、IL6-stat3、IFNg-stat1/1、INFa-state1/2、DEX-GR、COX-2、iNOS、NRF2、TGFb-Smad2/3、TPA-AP1、CREB、wnt3a-Lef/b-cat、VD3-VDR、ERα、ERβ、DHT-AR、およびアルドステロン-MRからなる群より選択される１つまたは複数の酵素が測定される。

ある態様において薬草組成物のテストバッチの質および潜在的有効性は、遺伝子発現アッセイ法によって判定することができ、該アッセイ法は、HepG2細胞を該薬草組成物によって約24時間処理する段階、産生されたmRNAを抽出する段階、およびqRT-PCR分析によって該mRNAを定量化する段階を含む。他の態様においては、炎症、抗酸化、成長および分化、代謝、ならびに細胞間相互作用より選択される作用に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子について遺伝子発現が測定される。なおも他の態様においては、ICAM、IRF5、AKR1C1、HO1、GCLC、GCLM、アキシン2、GDF15、IGFBP3、OKL38、PIM1、SERTAD、SOS1、BHMT2、CPT1A、SLC7A11、CD24、EMP2、およびKRT23からなる群より選択される、１つまたは複数の遺伝子について遺伝子発現が測定される。

ある態様においては、本発明の生物学的分析法によって、薬草組成物の不活性バッチから薬草組成物の活性バッチが化学的組成分析法よりも正確に識別される。ある態様においては、本発明の生物学的アッセイ法の結果による方が、標準の化学分析法によるよりも薬草組成物の活性バッチが互いにより強く相関している。ある態様において本発明の方法によって、化学分析プロファイルを90％より高い類似性で共有する場合でさえも、薬草組成物の活性バッチが薬草組成物の不活性バッチと識別されることができる。他の態様において本生物学的分析法では、薬草組成物の不活性バッチから薬草組成物の活性バッチが化学的組成分析法よりも良好に区別される。他の態様においては、テストバッチの結果が既知バッチの結果の約85％〜約115％の間である場合に、該テストバッチは、十分に類似した質および潜在的インビボ活性を有すると考えられる。他の態様においては、テストバッチの結果が既知バッチの結果の約90％〜約110％の間である場合に、該テストバッチは十分に類似した質および潜在的インビボ活性を有すると考えられる。他の態様においては、テストバッチの結果が既知バッチの結果の約95％〜約105％の間である場合に、該テストバッチは十分に類似した質および潜在的インビボ活性を有すると考えられる。

ある態様においては、本発明の方法は、LC-MSによって薬草組成物のバッチを分析する段階をさらに含む。

ある態様において本発明の方法は、任意の薬草組成物または植物組成物のバッチの質および／または潜在的インビボ有効性を判定するために使用することができる。

治療法
本発明は、
（a）シグナル伝達活性反応アッセイ法；および
（b）遺伝子発現アッセイ法
より選択される１つまたは複数の生物学的分析法に、薬草組成物を供し、
該生物学的分析法の結果を、既知レベルのインビボ活性を有するPHY906の既知バッチから得られた結果と比較すること
によって、PHY906のテストバッチの質および潜在的インビボ有効性を評価する段階
を含む、がんを有する対象を治療する方法であって、
かつ、該生物学的分析法において該PHY906のテストバッチが該PHY906の既知バッチと類似した活性を示す場合、該PHY906のテストバッチが該対象に投与される、方法も提供する。

ある態様において本発明の治療法は、任意の公知の植物組成物または薬草組成物または植物薬または生薬に適応できる。他の態様において本発明の治療法は、他の疾患または障害の治療に適応できる。

キット
本発明は、薬草組成物のバッチの質を判定するためおよび潜在的インビボ活性を測定するためのキットにも関連する。ある態様において該キットは、シグナル伝達活性反応アッセイ法および遺伝子発現アッセイ法より選択される１つまたは複数の生物学的アッセイ法材料を含む。他の態様において該キットは、本発明のアッセイ法を用いて薬草組成物のバッチの質を判定するためおよび潜在的インビボ活性を測定するための指示書をさらに含む。

ルーチン実験を用いるだけで、当業者には本明細書において説明される特定の工程、態様、請求項、および実施例に対する数多の同等物が認識されるかまたは確認され得る。そのような同等物は本発明の範囲内にあり、本明細書に添付される請求項に含まれるものと考えられる。例えば、非限定的に反応時間、反応サイズ／容量、および実験試薬を含む反応条件における、当技術分野において認識される代替物による、およびルーチン実験だけを用いる、改変が本出願の範囲内にあることは理解されるべきである。

本明細書においてどこの値および範囲が提供されようとも、範囲形式における説明は単に利便性および簡潔さのためにすぎず、本発明の範囲に対する変更不可能な限定として解釈すべきでないことは理解されるべきである。したがって、これらの値および範囲に包含される全ての値および範囲は本発明の範囲内に包含されることが意図される。さらに、これらの範囲内に収まる全ての値、および値の範囲の上限または下限もまた、本出願によって企図される。ある範囲の説明は、該範囲内にある全ての可能な部分範囲および個々の数値、ならびに適切であれば、範囲内にある数値の一部分の整数を具体的に開示したものと考えられるべきである。例えば、1〜6などのある範囲の説明は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等などの部分範囲、ならびに該範囲内にある個々の数、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したものと考えられるべきである。これは範囲の幅に関わらず適用される。

以下の実施例は、本発明の局面をさらに例証する。しかし、それらは本明細書において記載される本発明の教示または開示を決して限定するものではない。

本発明はここで以下の実施例に関連して説明される。これらの実施例は例証の目的でのみ提供され、本発明はこれらの実施例に限定されるものと決して解釈されるべきではなく、本明細書において提供される教示の結果として明らかとなる任意および全ての変形をも包含するものと解釈されるべきである。

材料および方法
薬草抽出物の調製
PHY906は、各々3：2：2：2の比率の4種類の薬草のスクテラリア・バイカレンシス・ジョージ(S)、ペオニア・ラクティフローラ・ポール(P)、グリシリザ・ウラレンシス・フィッシュ(G)、およびジジフス・ジュジュバ・ミル(Z)の従来的な温水抽出物から構成され、標準的な操作工程下で調製される。この抽出物には複数の生物学的および薬理学的特性を有する複数の植物化学物質の複合混合物が含まれる。この時点で、混合物全体から関連性のある生物学的に活性な植物化学物質のサブセットを同定することは不可能である。このため、PHY906産物を特徴決定するために高レベルの化学的および生物学的測定基準が使用された。

PHY906の生の材料は、台湾の薬草製造業者Sun Ten Pharmaceuticalsによって採用されるためのPHYTOCEUTICA（商標）によって設定された厳格な規格を満たすよう事前に選択される。

乾燥PHY906（100 mg）を1 mLの80℃の温水に溶解した。混合物を1分間ボルテックスし、80℃のウォーターバスに入れて、10分ごとに1分間のボルテックスを行いながらさらに30分間置いた。サンプルをその後周囲温度のウォーターバス内で5分間冷却し、10,000 rpmで10分間遠心分離機（Eppendorf Model 5810R, 米国）にかけ、その結果生じる上清をフィルター滅菌（0.2μm）した。それに続くLC/MS分析のために、この薄茶色の抽出物の20μLアリコートを980μLの水で希釈した。抽出および希釈後の最終ノミナル濃度は、水1 mL当たりPHY906粉末抽出物2 mg（乾燥重量）であった。生物学的実験のために、100 mg/mLのノミナル濃度溶液ストックを適切なバッファーまたは培地において必要とされる最終濃度にまで希釈した。

PHY906抽出物は75％を上回る1000 amu未満の低分子量植物化学物質化合物、タンパク質、核酸、複合糖質を含む10％の高分子成分、および5％の水から構成される。さらに、製造における噴霧乾燥段階中に10重量％の賦形剤の不溶性セルロースが加えられる。重金属（Pb、Hg、Cd、As）濃度は全て0.5 ppm未満であり、水銀およびカドミウムは0.03 ppm未満であり、原子吸光測定法によって検出される。LC-MSまたはGC-MSにより殺虫剤（BHC、DDT、PCNB）濃度は0.2 ppm未満である。総細菌数は260 cfu/gであり、大腸菌（E Coli.）およびサルモネラ（Salmonella）属細菌は検出されない。水含量（5％）および不溶性デンプン賦形剤（10％）を除く、90重量％を超えるPHY906を再抽出することができる。最終PHY906液体抽出物（100 mg/ml）は室温にて18時間安定であり、適切に保存されたバルク乾燥抽出物（真空包装、遮光および4℃）は3年超安定であると考えられる。PHY906についてのより詳細な情報は以下において認められる：Lam W, Bussom S, Guan F, Jiang Z, Zhang W, Gullen EA, Liu SH, Cheng YC, 2010, “The Four-Herb Chinese Medicine PHY906 Reduces Chemotherapy-Induced Gastrointestinal Toxicity”, Sci. Transl. Med. 2(45):45ra59。

インビボマウスモデル
マウス結腸がんColon38細胞（0.1 ml リン酸緩衝生理食塩水、PBS中に細胞1〜2×106個）を4〜6週齢のメスBDF1マウス（Charles River Laboratories）に皮下移植した。10〜14日後に150〜300 mm³サイズの腫瘍を有するマウスを選択した。特に指示されない限り、各治療群は5個体のマウスからなった。マウスの腫瘍サイズ、体重および死亡率を毎日モニタリングした。長さ×幅(2)×π/6の公式を用いて腫瘍量を評価した。特に指示されない限り、各治療群は5個体のマウスからなった。PHY906（バッチナンバー6、10、11、および市販のオウゴントウであるF）を経口（p.o.）にて（1日2回(b.i.d)、500 mg/kg、およそ10:00 amと3:00 pmに）4日間与えた一方、CPT-11（360 mg/kg）を第1日に腹腔内（i.p.）投与した。第1日にはCPT-11の投与の30分前にPHY906が与えられた。対照群においては、マウスはいずれかの担体、i.p.投与についてのPBSか、経口投与についての水を投与された。データは二元配置ANOVA（GraphPad Prism 6）によって解析された。++（P<0.001）、+（P<0.05）および-（P>0.05）の場合に、統計学的に有意な差であると考えられた。

PHY906の代謝産物の化学的プロファイルについてのLC-MS分析
Agilent 1200シリーズHPLCと接続したAB SCIEX 4000 QTRAP質量分析計でLC-MS分析を行った。Alltima（商標）HP HPLCカラム（5 mm、4.6×250 mm）において分離を行った。移動相はアセトニトリル（A）および0.1％のギ酸を含む水（B）であり、グラジエント溶出は：0分間、5％ A；10分間、20％ A；20分間、25％ A；40分間、30％ A；45分間、35％ A；55分間、45％ A；60分間、70％ A；62分間、90％ A；67分間、90％ A；68分間、5％ A；および75分間、5％ Aであった。流速は1.0 mL/分であり、カラム温度は30℃に設定された。以下のイオン化パラメーターを用いてスキャン速度4000 amu/秒のESI負イオンモード質量分析を行った：CAD：高；TEM：550.00℃；GS1：55.00；GS2：50.00；ihe：ON；IS：-4250.00；DP：-40.00；CES：0.00；CE：-5.00。検出についての質量範囲は120〜800 amuであった。MZmineソフトウェアに組み込まれたカスタムプログラムを用いてピークを比較し、クラスター解析を行った。

相関係数を決定するためのアルゴリズム
相関係数を決定するためにGraphpad Prism 6ソフトウェアを使用した。表の各々の行「if input」は異なる遺伝子または異なるシグナル経路を表す。各列は異なるバッチを表す。遺伝子発現またはIC50またはAC50の値がインプットされた。相関解析のためにソフトウェアの「列解析」機能を選択した。各列のペアの相関解析を行い、ガウス分布を有するサンプルプールを推測した。ピアソン係数をも計算した。

Minitab 17ソフトウェアを用いてクラスター解析を行った。表の各行「if input」は異なる遺伝子または異なるシグナル経路を表す。各列は異なるバッチを表す。遺伝子発現またはIC50またはAC50の値がインプットされた。クラスター変数機能を選択した。クラスター解析には完全連結法および距離測度相関を選択した。

STARプラットフォーム
以下の表に挙げられるような、異なるシグナル経路についてのルシフェラーゼレポーター細胞株。

細胞を、ハーフエリア96ウェルマイクロプレートに40μl培地中細胞20000個／ウェルで播種し、37℃、5％CO₂のインキュベーターにて一晩インキュベートした。750μg/ml〜83μg/mlの異なる用量のPHY906水抽出物を細胞に加え、37℃、5％CO₂のインキュベーターにてインキュベートした。細胞を溶解するために、6時間において培地を除去した後、10μlの溶解バッファー（Tris-HCl 25mM、pH7.8、DTT 2 mM、CDTA 2 mM、グリセロール10％、Triton X-100 1％）を使用し、発光マイクロプレートリーダーを用いて発光を測定するために40μlのルシフェラーゼ反応バッファー（Tris-HCl 20mM、pH7.8、NaHCO₃ 1 mM、MgSO₄ 2.5 mM、DTT 10 mM、コエンザイムA リチウム 60μM、ルシフェリンカリウム 225μM、ATP 250μ）を加えた。用量反応曲線に基づいてIC50（対照の50％を阻害するために必要とされる濃度）またはEC50（最大活性化の50％に達するために必要とされる濃度）を決定した。

Cox-2活性アッセイ法
製造業者の指示書に従って、Cox-2（Cayman Chemical）酵素反応を行った。反応を止めるためには4倍量のアセトニトリル-メタノール（2：1）を使用した。遠心分離後、LC-MSによって上清のプロスタノイド産物を定量化した。ZORBAX SB-C18カラム（100×2.1 mm、Agilent）を30℃で用いてクロマトグラフ分離を行った。移動相は0.05％（v/v）ギ酸（A）およびメタノール（B）：0.01〜5.0分間、60〜60％ B（v/v）；5.0〜5.5分間、60〜80％ B；5.5〜35分間、80〜80％ B；35〜35.5分間、80〜60％ B；35.5〜40分間、60〜60％ Bの線形グラジエントで構成された。移動相流速は0.3 mL/分であった。全ての質量分析実験はAPI 4000 Q-Traq質量分析計において行われた。直交Turbo-Vイオン源インジェクターを550℃まで加熱し、移動相を分けずにHPLCに接続させた。イオン源ガス（GS1、GS2）、カーテンガス（CUR）およびコリジョンガス（CAD）として超高純度窒素（N₂）を使用し、それらの流速は各々55、50、35、および高であった。負イオン化における複数の反応モニタリング（MRM）実験を行い、アラキドン酸およびPGE2の各々についてm/z：303→259、351.1→315におけるイオン化を検出した。コリジョンエネルギーはアラキドン酸およびPGE2の各々について-20、-26Vに設定した。データ取得はanalyst1.4.2ソフトウェアによって制御された。

iNOS活性アッセイ法
亜硝酸塩比色アッセイ法によってiNOS活性を測定した。pH 7.3の0.1 M 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）中における2 mM MgAc₂、0.2 mM NADPH、64μM テトラヒドロ-L-ビオプテリン、1 mg/ml BSA、40μM DTT、3μM HbO₂の混合物からなる50μlの反応物において1単位のiNOS酵素（Cayman Chemical）を使用した。薬草抽出物を加えたまたは加えていない100μl L-アルギニンをその後加え、この混合物を37℃で2時間インキュベートした。次に、100μlのグリース試薬（1％ スルファニルアミド、0.1％ N-(1-ナフチル)-エチレンジアミンジヒドロ、および10％ HCl）を加え、540 nmにおいて光学密度を測定した。

qRT-PCR法
HepG2細胞2×10⁵個をPHY906（バッチナンバー6、10、11、および市販のオウゴントウであるF）と接触させ、5％ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地において12ウェル組織培養プレートに播種し、37℃、5％ CO₂にて一晩インキュベートした。HepG2細胞をその後、最終濃度850μg/mlのPHY906-6、PHY906-10、PHY906-11、Fの水抽出物、または対照としての水で処理し、37℃、5％ CO₂にて24時間インキュベートした。RocheのハイピュアRNAアイソレーションキットを用いてHepG2細胞からmRNAを抽出した。ランダムプライマーおよび逆転写酵素MMLV（New England Biolabs, Ipswich, MA）を用いてcDNAを合成させた。iTaq（商標）SYBR（登録商標）Green SupermixおよびCFX96リアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を用いてqPCRアッセイ法を行った。内部対照としてアクチンを使用した。プライマーセットは表2において挙げられた。

実施例1：化学分析とインビボ活性との相関
化学的検出の標準操作プロトコールを、薬草組成物の異なるバッチのインビボでの有効性の予測におけるその正確さについて試験した。colon38腫瘍を有するBDF1マウスに薬草組成物をCPT11と共投与することによって、PHY906の異なるバッチおよびF（市販のオウゴントウ抽出物混合物）のインビボ活性を試験した。HQT/CPT11治療の抗腫瘍活性を測定し、さらに対象の体重に対する効果を判定した。HQT組成物のうち3つの、PHY906製剤を用いて作製されたPHY906-6、PHY906-10、およびPHY906-11は類似した抗腫瘍活性および体重減少抑制活性を共有することが認められたが、4つめのHQT組成物の市販HQTバッチであるFは、抗腫瘍活性がより低く、対象における体重減少を抑制しないことが認められた（図1A）。

HQTの4つのバッチをその後、WHOガイドラインに従ったLC-MSによって分析し、各組成物の化学的プロファイルを決定した。LC-MSスペクトルにおいて73個の特徴的なピークが検出され、その後の類似性解析に使用された（図1B）。MZmineソフトウェアに組み込まれたカスタムプログラムを用いてピークを比較し、クラスター解析を行った（図1C〜1D）。LC-MS分析の結果から、HQTの4つの全バッチは類似した化学的プロファイルを共有するが、バッチPHY906-10とバッチPHY906-11はバッチPHY906-6またはバッチFに対してよりも、互いに類似していること、およびバッチPHY906-6とバッチFはバッチPHY906-10またはバッチPHY906-11に対してよりも、互いに類似していることが示された。この結果は、PHY906-6、PHY906-10、およびPHY906-11が全て非常に類似した化学的プロファイルを共有し、Fが外れ値となると予測されるインビボの結果とは対照的である。

実施例2：シグナル伝達活性反応アッセイ法
薬草組成物のバッチの質を判定しかつ潜在的インビボ活性を測定するより正確な方法を見出すために、シグナル伝達活性反応（STAR）プラットフォームにおいて、HQTの4つのバッチ（F、PHY906-6、PHY906-10、およびPHY906-11）をスクリーニングした（図2A）。STARプラットフォームはTNFa-NFkB、TLR2-NFkB、TLR4-NFkB、IL6-stat3、IFNg-stat1/1、INFa-state1/2、DEX-GR、COX-2、iNOS、NRF2、TGFb-Smad2/3、TPA-AP1、CREB、wnt3a-Lef/b-cat、VD3-VDR、ERα、ERβ、DHT-AR、およびアルドステロン-MRを含む、機序に関する17種類のルシフェラーゼレポーター細胞株、およびHQTのインビボ活性に関連する2つの酵素アッセイ法を含んだ。PHY906の3つのバッチではルシフェラーゼレポーター細胞株および酵素アッセイ法において類似したIC50値が示される一方、バッチFでは示されないことが認められた（図2B〜2C）。STARプラットフォームアッセイ法の結果に基づく相関解析の結果から、PHY906のバッチが0.95またはそれより高い相関係数を互いに共有することが示された一方、バッチFではより低い相関係数値が示された。これらの結果からSTARプラットフォームの生物学的アッセイ法の結果が、HQT薬草組成物のバッチの潜在的インビボ活性について、LC-MS化学分析よりも優れた予測因子であることが示される。

実施例3：遺伝子発現解析
遺伝子発現解析を用いてHQTの4つのバッチをさらに解析した。ICAM、IRF5、AKR1C1、HO1、GCLC、GCLM、アキシン2、GDF15、IGFBP3、OKL38、PIM1、SERTAD、SOS1、BHMT2、CPT1A、SLC7A11、CD24、EMP2、およびKRT23を含む、過去のインビボDNAアレイデータに関連する遺伝子およびPHY906の仮定の作用機序に関連する遺伝子のパネルに対してHQTバッチを試験した。HepG2肝がん細胞をHQT製剤のうち１つのバッチで24時間処理した。生じたmRNAをその後抽出し、qRT-PCRによって分析した（図3A）。PHY906-6、PHY906-10、およびPHY906-11が遺伝子発現パネルにおいて非常に類似した活性を共有する一方、Fはまたもや外れ値であることが認められた（図3B〜3C）。これらの結果から遺伝子発現解析が、あるHQT薬草組成物のバッチの潜在的インビボ活性について、LC-MS化学分析よりも優れた予測因子であることが示される。

本明細書において引用される各々および全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、本明細書によってその全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は特定の態様に関して開示されたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく本発明の他の態様および変形が他の当業者によって工夫され得ることは明らかである。添付の請求項は全てのそのような態様および同等の変形を含むものと解釈されることが意図される。

Claims (14)

1. 薬草組成物のテストバッチの質および潜在的インビボ活性を評価する方法であって、
   該方法が、
   （a）シグナル伝達活性反応アッセイ法；および
   （b）遺伝子発現アッセイ法
   より選択される１つまたは複数の生物学的分析法に、該薬草組成物のテストバッチを供する段階；
   ならびに、その後、該生物学的分析法の該テストバッチの結果を、既知レベルのインビボ活性を有する薬草組成物の既知バッチから得られた結果と比較する段階
   を含み；
   該テストバッチの結果と該既知バッチの結果との差異を測定することによって、該薬草組成物のテストバッチの質および潜在的インビボ活性の評価が提供される、方法。
2. 前記薬草組成物が、コガネバナ（Scutellaria baicalensis）(S)の薬草抽出物、ウラルカンゾウ（Glycyrrhiza uralensis）(G)の薬草抽出物、シャクヤク（Paeonia lactiflora）(P)の薬草抽出物、およびナツメ（Ziziphus jujuba）(Z)の薬草抽出物からなる群より選択される１つまたは複数の組成物、それらの任意の画分、ならびに、該薬草抽出物中またはそれらの画分中に存在する任意の活性化学物質を含む、請求項1に記載の方法。
3. 前記薬草組成物がPHY906であり、PHY906が、コガネバナ(S)の薬草抽出物、ウラルカンゾウ(G)の薬草抽出物、シャクヤク(P)の薬草抽出物、およびナツメ(Z)の薬草抽出物を3：2：2：2（S：G：P：Z）の比率で含む、請求項2に記載の方法。
4. 前記シグナル伝達活性反応アッセイ法が、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法および酵素アッセイ法からなる群より選択される１つまたは複数のアッセイ法を含む、請求項1に記載の方法。
5. 前記シグナル伝達活性反応アッセイ法が、炎症酵素、細胞成長酵素および細胞分化酵素、ならびに内分泌酵素およびホルモン酵素より選択される１つまたは複数の酵素に対するシグナル伝達活性反応の測定を含む、請求項1に記載の方法。
6. 前記１つまたは複数の酵素が、TNFa-NFkB、TLR2-NFkB、TLR4-NFkB、IL6-stat3、IFNg-stat1/1、INFa-state1/2、DEX-GR、COX2、iNOS、NRF2、TGFb-Smad2/3、TPA-AP1、CREB、wnt3a-Lef/b-cat、VD3-VDR、ERα、ERβ、DHT-AR、およびアルドステロン-MRからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
7. 前記遺伝子発現アッセイ法が、
   前記薬草組成物でHepG2細胞を24時間処理する段階、産生されたmRNAを抽出する段階、および、qRT-PCR分析によって該mRNAを定量化する段階
   を含む、請求項1に記載の方法。
8. 前記遺伝子発現アッセイ法が、炎症、抗酸化、成長および分化、代謝、ならびに細胞間相互作用より選択される作用を有するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子の測定を含む、請求項1に記載の方法。
9. 前記１つまたは複数の遺伝子が、ICAM、IRF5、AKR1C1、HO1、GCLC、GCLM、アキシン2、GDF15、IGFBP3、OKL38、PIM1、SERTAD、SOS1、BHMT2、CPT1A、SLC7A11、CD24、EMP2、およびKRT23からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
10. 前記１つまたは複数の生物学的分析法によって、前記薬草組成物の活性バッチと該薬草組成物の不活性バッチが化学的組成分析法よりも良好に識別される、請求項1に記載の方法。
11. 前記化学的組成分析法がLC-MS（液体クロマトグラフィー-質量分析）を含む、請求項10に記載の方法。
12. 前記テストバッチの結果が前記既知バッチの結果の約90〜約110％の間である場合に、該テストバッチが、該既知バッチと十分に類似した質と、潜在的インビボ活性とを有すると判定される、請求項1に記載の方法。
13. 前記薬草組成物のテストバッチの質がLC-MSによってさらに分析される、請求項1に記載の方法。
14. （a）シグナル伝達活性反応アッセイ法；および
    （b）遺伝子発現アッセイ法
    より選択される１つまたは複数の生物学的分析法に、薬草組成物を供し、
    該生物学的分析法の結果を、既知レベルのインビボ活性を有するPHY906の既知バッチから得られた結果と比較すること
    によって、PHY906のテストバッチの質および潜在的インビボ有効性を評価する段階
    を含む、がんを有する対象を治療する方法であって、
    該テストバッチの結果と該既知バッチの結果の差異を測定することによって、薬草組成物のテストバッチの質および潜在的インビボ活性の評価が提供され、
    かつ、該生物学的分析法において該PHY906のテストバッチが該PHY906の既知バッチと類似した活性を示す場合、該PHY906のテストバッチが該対象に投与される、方法。

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