JP2019531332A - Ｔｒｅｍ２切断モジュレーター及びその使用 - Google Patents

Ｔｒｅｍ２切断モジュレーター及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）のエクトドメイン内に結合部位を有する結合分子に関し、ここでこの結合分子は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する。前記結合分子は、神経変性障害などの、神経障害の治療及び／又は予防に特に有用である。また神経障害の治療及び／又は予防における使用のための医薬組成物も、本発明により包含され、ここでこの医薬組成物は、本発明の結合分子を含有する。本発明の結合分子を使用することにより治療及び／又は予防され得る神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ＦＴＬＤ−様症候群、パーキンソン病、那須ハコラ病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、免疫−媒介型神経障害、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。

Description

本発明は、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）のエクトドメイン内に結合部位を有する結合分子に関し、ここでこの結合分子は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する。該結合分子は、神経変性障害などの神経障害の治療及び／又は予防に特に有用である。同じく、神経障害の治療及び／又は予防において使用するための医薬組成物も、本発明により包含され、ここでこの医薬組成物は、本発明の結合分子を含有している。本発明の結合分子の使用により治療及び／又は予防され得る神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ＦＴＬＤ−様症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、硬化性白質脳症を伴う嚢胞性脂肪膜性骨異形成症（ＰＬＯＳＬ；那須ハコラ病としても公知）、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、シャルコー・マリー・ツース病又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。
神経変性は、主にニューロンに影響を及ぼす任意の病的状態に該当し、且つ特定の機能的解剖学的システムにおけるニューロンの特定のサブセットの機能及び生存に影響を及ぼす不均一な臨床的及び病理学的発現を伴う神経障害の大きい群を表す(1)。脳に常在する免疫細胞の炎症及び活性化は、数多くの神経障害に共通の顕著な特徴であり、且つ特に神経変性障害における小神経膠細胞症の極めて重要な役割が、長期間認められている(2,3)。
疾患発症機序におけるミクログリア機能の中心的役割は、現在、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）における配列バリアントの同定により更に裏付けられている。ホモ接合性ＴＲＥＭ２バリアントは、ＰＬＯＳＬ／那須ハコラ病(4)又はＦＴＤ−様認知症(5)を引き起こすのに対し、ヘテロ接合性ＴＲＥＭ２バリアントは、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病、ＦＴＬＤ−様症候群、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などのいくつかの神経障害及び神経変性障害のリスクの増大に関連している(5-11)（同じく、Ulrich, 2016, ACS Chem. Neurosci. 7: 420-427参照)。脳内では、ＴＲＥＭ２は、ミクログリアにおいて独占的に発現され、例えば、細胞デブリの貪食に機能的に必要とされる(12,13)。ＴＲＥＭ２は、そこでその生物学的機能を発揮し得る(14)細胞膜へシャトルされる１型膜タンパク質である。ＴＲＥＭ２は、制限的膜内切断（ＲＩＰ）を受ける(15,16)（例えば図１Ａ参照）。ＲＩＰは、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７（ディスインテグリンドメイン及びメタロプロテイナーゼドメインを持つタンパク質）及び恐らくＭＭＰ（マトリクスメタロプロテイナーゼ）を含むメタロプロテイナーゼによる、完全長ＴＲＥＭ２のシェディングにより、細胞表面上で開始される。シェディングは、可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）の分泌を生じ、これはヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）中に検出することができる(15,17-19)。膜が保持したＣ末端断片（ＣＴＦ）は、引き続き、γ−セクレターゼによる膜内切断によりクリアランスされる（例えば、Kleinbergerら, (15), 図１Ａ参照）(16,20)。
ＴＲＥＭ２のいくつかの変異が、機能的に調べられている。ｐ．Ｔ６６Ｍ及びｐ．Ｙ３８ＣなどのＩｇ−様ドメイン内の変異は、ＴＲＥＭ２のミスフォールディング及び小胞体内の未熟タンパク質の保持を生じる(15、21)。結果的に、減少した細胞表面ＴＲＥＭ２が認められ、シェディングは劇的に減少する。これにあわせて、ホモ接合体ＴＲＥＭ２ ｐ．Ｔ６６Ｍ変異を有する患者は、血清及びＣＳＦ中のｓＴＲＥＭ２が劇的に低下するか、又は検出不可能なことさえある(15、18)。
低下した細胞表面ＴＲＥＭ２は、減少した貪食活性を生じる(15)。アミロイドプラーク病理に対するＴＲＥＭ２機能喪失の作用に関する矛盾する結果が、最初に報告されたが(22、23)、これは現時点では、ＴＲＥＭ２の喪失は、綿毛状のアミロイドプラークの蓄積に繋がることは明らかであり、これはプラークハロウ(hallow)の貪食クリアランスの欠如又はアミロイドプラーク成長防止の低下を示唆しているように見える(24、25)。低下した貪食性プラーク分解の裏付けとして、最近、貪食を介したアミロイドプラークの免疫治療的クリアランスは、ＴＲＥＭ２の非存在下で減少されることが示された(26)。これまで機能的に調べられてきた変異は、ＴＲＥＭ２のＩｇ−様ドメイン内に位置する(例えば、Kleinbergerら、(15)、図１Ａ参照）。このドメインのミスフォールディング、保持及び結果的に低下したシェディングは、このようなＴＲＥＭ２バリアントの共通のリードアウトであるように見える。最近の遺伝子研究は、先に説明されたコーディングバリアント（ｐ．Ｈ１５７Ｙ；(9、27、28))は、漢民族におけるＡＤと有意に関連していることを指摘した(29)。興味深いことに、このバリアント（ｐ．Ｈ１５７Ｙ）は、スタルク(stalk)領域内のＩｇ−様ドメインの外側に位置する（例えば、Kleinbergerら、(15)、図１Ａ参照)。
神経変性障害などの神経障害は、一般に、非定型的タンパク質の集成及び／又は誘導された進行性細胞死を含む、いくつかの特徴を有する(30、31)。神経変性は、神経回路の多くの異なるレベルで認めることができ、これは分子欠損及び系統的欠損に繋がる。神経変性障害の激増及び／又は進行を低下することを目的とする、特定の治療的アプローチが存在する。しかし残念なことに、神経変性障害は依然治癒不可能であり、神経細胞の進行性の変性及び／又は死を生じている。
従って本発明の基礎となる技術的問題点は、神経変性障害を含む神経障害の治療及び／又は予防のための手段及び方法を提供することである。
この技術的問題点は、本明細書に記載され、且つ請求項で特徴付けられた実施態様の提供により、解決される。
従って本発明は、ＴＲＥＭ２のエクトドメイン内に結合部位を有する結合分子に関し、ここでこの結合分子は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する。
本明細書において以下に及び添付された実施例において記載したように、そこでＴＲＥＭ２シェディングが起こる正確な切断部位は、驚くべきことに同定されている。特に本発明の状況において、ＴＲＥＭ２エクトドメインの切断は、例えば配列番号：１又は４に示されたような、ＴＲＥＭ２のアミノ酸配列の１５７位のヒスチジン（Ｈｉｓ１５７）に対しＣ末端側で起こることが分かっている。本発明の結合分子は、この位置でのＴＲＥＭ２エクトドメインの切断をブロックする。従って、本明細書に提供される結合分子は、表面−結合型ＴＲＥＭ２を安定化するか又はその量を増加し、これによりミクログリア細胞の活性を保持し且つ刺激する。従って、本明細書に提供される結合分子は、アミロイドプラークの蓄積及び負の作用の防止に効果的に寄与することができ；こうして、アルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害を含む、様々な神経障害の治療及び／又は予防のための新規アプローチを提供する。
ＴＲＥＭ２内で同定された切断部位（すなわち、Ｈｉｓ１５７）は、正にＡＤ関連したＴＲＥＭ２バリアントｐ．Ｈ１５７Ｙが配置される部位である。神経変性疾患の発達に対するＴＲＥＭ２変異の寄与は、先行技術において説明されている。しかし、それによりｐ．Ｈ１５７ＹがＡＤ又は他の神経変性障害の原因となる機序は、全く不明である。添付された実施例は、驚くべきことに、変異体バリアントｐ．Ｈ１５７Ｙは、より高いＴＲＥＭ２シェディングに繋がることを明らかにしており、これはｐ．Ｔ６６Ｍ及びｐ．Ｙ３８ＣなどのＩｇ−様ドメイン内の変異について認められる低下したシェディングとは相反する知見である(15)。同じく添付された実施例により明らかにされるように、ＴＲＥＭ２ ｐ．Ｈ１５７Ｙの増強されたシェディングは、減少した細胞表面完全長ＴＲＥＭ２へ、及び低下した貪食活性へ繋がる。従って予想外に、Ｉｇ−様ドメイン又はスタルク領域内に位置した変異は、完全に異なる細胞の機序を介して、ＴＲＥＭ２依存性貪食活性に影響を及ぼす。従って、先行技術におけるｐ．Ｈ１５７ＹバリアントなどのＴＲＥＭ２変異の存在の説明は、正にこの位置でＴＲＥＭ２切断が起こることを全く示唆していない。
抗−ＴＲＥＭ２抗体などの、ＴＲＥＭ２へ特異的に結合するいくつかの分子が、先行技術において公知である。しかし、ＴＲＥＭ２エクトドメインシェディング（すなわち、切断）を阻害することができる結合分子を説明する公に入手可能なデータは存在しない。添付された実施例は、驚くべきことに、ＴＲＥＭ２エクトドメインシェディング（すなわち、ＴＲＥＭ２切断）は、ＴＲＥＭ２のＨｉｓ１５７で生じることを明らかにしている。従って切断酵素（例えば、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７又はマトリクスメタロプロテイナーゼ）は、ＴＲＥＭ２を切断するためにこのアミノ酸へのアクセスを有さなければならない。従って添付された実施例は、Ｈｉｓ１５７をブロックする結合分子は、ＴＲＥＭ２の切断をうまく阻害することができることを指摘している。切断酵素のＨｉｓ１５７へのアクセスは、Ｈｉｓ１５７へ直接結合することにより、ブロックされ得る。加えて又は代わりに、切断酵素のＨｉｓ１５７へのアクセスは、Ｈｉｓ１５７に密に近接して（例えば、最大１０のアミノ酸距離を有する）配置されているアミノ酸への結合により、立体的にブロックされ得る。例えば、Ｈｉｓ１５７に密に近接して配置されているアミノ酸に結合する抗体又は小型分子は、切断酵素のＨｉｓ１５７へのアクセスを立体的にブロックし、これによりこの位置でのＴＲＥＭ２切断を阻害する。
従って本発明は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する（好ましくは妨害する）結合分子を提供する。より詳細には、本発明の状況において、ＴＲＥＭ２エクトドメインの切断（すなわち、シェディング）は、本発明の結合分子により阻害される。
本明細書において提供される結合分子は、ＴＲＥＭ２のエクトドメイン内に、結合部位を有する。本明細書における用語「結合部位」は、本明細書に提供された結合分子により認識される（すなわち、結合される）ＴＲＥＭ２の部分を指す。本発明の結合分子が抗体である場合、この結合部位は、該抗体のエピトープに対応している。本明細書に提供される結合分子の結合部位は、各切断酵素（例えば、ＡＤＡＭ１０）の切断部位内の任意の位置にあることができる。ＡＤＡＭ１０の切断部位のＴＲＥＭ２の膜貫通ドメインまでの距離は、１０〜３０のアミノ酸である。添付された実施例は、ＴＲＥＭ２内のＡＤＡＭ１０の切断部位は、位置Ｈｉｓ１５７（すなわち、ヒトＴＲＥＭ２の膜貫通ドメインから１８番目のアミノ酸）であることを明らかにしている。更に余り好ましくない切断部位は、位置Ｌｅｕ１６３、Ｌｅｕ１６４及びＧｌｕ１６５（すなわち、ヒトＴＲＥＭ２の膜貫通ドメインから１０〜１２番目のアミノ酸）に認められている。従って、ＡＤＡＭ１０の最小の切断部位は、ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２のアミノ酸配列の１４５−１７４位からなるアミノ酸配列内に配置されると予想することができる。従ってＡＤＡＭ１０の最小切断部位は、アミノ酸部分配列GESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTS（配列番号：１６）内であると予想することができる。従って本発明の結合分子は、ＴＲＥＭ２の、例えばヒト又はマウスＴＲＥＭ２の、１４５−１７４位内の任意のアミノ酸で、ＴＲＥＭ２に結合することができる。
しかしスタルク領域内のいずれかでのＴＲＥＭ２の結合は、ＴＲＥＭ２の切断酵素との相互作用の阻害に繋がることができ、結果的にＴＲＥＭ２切断を阻害することができる。ＴＲＥＭ２のスタルク領域は、ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２のアミノ酸１１３−１７４位（例えば、配列番号：１に示される）、又はマウスの膜結合型ＴＲＥＭ２のアミノ酸１１３−１７１位（例えば、配列番号：４に示される）に配置される。従って本発明の結合分子は、ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１１３−１７４位のアミノ酸部分配列内のどこか、及び／又はマウスの膜結合型ＴＲＥＭ２の１１３−１７１位のアミノ酸部分配列内のどこかで、ヒトＴＲＥＭ２に結合することができる。
例えば本発明の結合分子は、例えば配列番号：１−６のいずれか一つに示されたような、ＴＲＥＭ２の１４８−１６６位のアミノ酸のいずれか一つに結合してよい。本発明の状況において、膜結合型ＴＲＥＭ２の切断は、本明細書に提供される結合分子により阻害される。従ってこの結合分子は、例えば配列番号：１又は４に示されたような、膜結合型ＴＲＥＭ２の１４８−１６６位のアミノ酸のいずれか一つに結合してよい。好ましくは、本明細書に提供される結合分子は、ヒトＴＲＥＭ２の切断（すなわち、シェディング）を阻害する。従ってこの結合分子は、例えば配列番号：１−３に示されたような、ヒトＴＲＥＭ２の１４８−１６６位のアミノ酸のいずれか一つへ結合してよい。更により好ましくは、本発明の結合分子は、膜結合型ヒトＴＲＥＭ２の切断を阻害する。従って、本発明の結合分子は、例えば配列番号：１に示されたような、ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１４８−１６６位のアミノ酸のいずれか一つに結合してよい。従って本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関し、ここでこの結合部位は、以下からなる群から選択されるヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の少なくとも一つの位置を含む：
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１４８位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１４８）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１４９位のセリン（Ｓｅｒ１４９）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５０位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ１５０）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５１位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５１）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５２位のアスパラギン酸（Ａｓｐ１５２）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５３位のアラニン（Ａｌａ１５３）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５４位のヒスチジン（Ｈｉｓ１５４）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５５位のバリン（Ｖａｌ１５５）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５６位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５６）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５７位のヒスチジン（Ｈｉｓ１５７）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５８位のセリン（Ｓｅｒ１５８）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１５９位のイソロイシン（Ｉｌｅ１５９）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１６０位のセリン（Ｓｅｒ１６０）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１６１位のアルギニン（Ａｒｇ１６１）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１６２位のセリン（Ｓｅｒ１６２）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１６３位のロイシン（Ｌｅｕ１６３）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１６４位のロイシン（Ｌｅｕ１６４）；
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１６５位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１６５）；及び
ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の１６６位のグリシン（Ｇｌｙ１６６）。
本発明の状況において、非−ヒト動物のＴＲＥＭ２の切断を阻害する結合分子を設計することが望ましいことがある。かかる結合分子は、例えば、前臨床動物試験における使用を認めることができる。例えば本発明の結合分子は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、フェレット及び／又はサルのＴＲＥＭ２へ結合する（及び切断を阻害する）ことができる。本発明の優先される態様において、本明細書に提供される結合分子は、マウスのＴＲＥＭ２に結合し且つ切断を阻害する。かかる結合分子は、例えば配列番号：４又は５に示されたような、マウスＴＲＥＭ２の１４８−１６６位のアミノ酸のいずれか一つへ結合してよい。本発明の結合分子は、膜結合型マウスＴＲＥＭ２の切断を阻害することは、本明細書においてより優先される。従って、本発明の結合分子は、例えば配列番号：４に示されたような、マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１４８−１６６位のアミノ酸のいずれか一つに結合してよい。従って本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合部位は、以下からなる群から選択されるマウス膜結合型ＴＲＥＭ２の少なくとも一つの位置を含む：
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１４８位のセリン（Ｓｅｒ１４８）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１４９位のセリン（Ｓｅｒ１４９）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５０位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ１５０）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５１位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５１）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５２位のグリシン（Ｇｌｙ１５２）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５３位のアラニン（Ａｌａ１５３）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５４位のグルタミン（Ｇｌｎ１５４）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５５位のバリン（Ｖａｌ１５５）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５６位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５６）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５７位のヒスチジン（Ｈｉｓ１５７）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５８位のセリン（Ｓｅｒ１５８）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１５９位のトレオニン（Ｔｈｒ１５９）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１６０位のセリン（Ｓｅｒ１６０）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１６１位のアルギニン（Ａｒｇ１６１）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１６２位のアスパラギン（Ａｓｎ１６２）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１６３位のグルタミン（Ｇｌｎ１６３）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１６４位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１６４）；
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１６５位のトレオニン（Ｔｈｒ１６５）；及び
マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の１６６位のセリン（Ｓｅｒ１６６）。
ヒト療法において使用されるべき前臨床試験のための同じ結合分子を使用するために、本発明の結合分子は、膜結合型ヒトＴＲＥＭ２及び膜結合型マウスＴＲＥＭ２において同じアミノ酸に結合することが望ましい。従って本明細書に提供される結合分子は、例えば各々配列番号：１及び４に示されたような、ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２及びマウス膜結合型ＴＲＥＭ２の位置１４９−１５１、１５３、１５５−１５８、１６０、１６１、及び１６６のアミノ酸のいずれか一つに結合してよい。
しかし前述のように、本明細書に提供される結合分子は、ＴＲＥＭ２の１４８−１６６位でアミノ酸のいずれか一つに結合してよい。好ましくは、これらの結合分子は、ＴＲＥＭ２の１５３−１６６位で、より好ましくは１５３−１６２位で、アミノ酸のいずれか一つに結合する。前述のように、本発明の結合分子は、ヒト又はマウスＴＲＥＭ２に、好ましくは膜結合型ヒト又はマウスＴＲＥＭ２に、及び最も好ましくは膜結合型ヒトＴＲＥＭ２に、結合し且つその切断を阻害することが優先される。
本明細書に提供される結合分子は、ＴＲＥＭ２内の立体構造の結合部位に又は線状の結合部位に結合することができる。結合分子が抗体である場合、これらの結合部位は、各々、立体構造エピトープ及び線状エピトープと称される。立体構造の結合部位は、ＴＲＥＭ２のアミノ酸配列の不連続部分で構成される。そのような結合部位は、３Ｄ構造表面特徴を基に、すなわちＴＲＥＭ２の三次元構造を基に、結合分子と相互作用する。
対照的に、線状の結合部位は、ＴＲＥＭ２のアミノ酸配列の一次構造を基に結合分子と相互作用する。従って線状の結合部位は、ＴＲＥＭ２の連続アミノ酸配列により構成される。例えば、ＴＲＥＭ２内の本明細書に提供される結合分子の結合部位は、ＴＲＥＭ２の位置１４８−１５７又は１５７−１６６、好ましくは１４９−１５８又は１５６−１６５、より好ましくは１５０−１５９又は１５５−１６４、更により好ましくは１５１−１６５又は１５４−１６３、更により好ましくは１５２−１６１又は１５３−１６２、及び更により好ましくは１５３−１６２のアミノ酸からなるポリペプチドのいずれか一つを含むか又はこれと重複することができる。例えば結合部位は、ＴＲＥＭ２の位置１５２−１５６又は１５８−１６２のアミノ酸からなるポリペプチドを含むか又はこれと重複してよい。しかし、３〜５個のアミノ酸のより小さい結合部位もまた、本明細書に提供される結合分子により使用されてよい。例えば、ＴＲＥＭ２内の本明細書に提供される結合分子の結合部位は、位置１４８−１５０又は１６４−１６６、好ましくは１４９−１５１又は１６３−１６５、より好ましくは１５０−１５２又は１６２−１６４、更により好ましくは１５１−１５３又は１６１−１６３、更により好ましくは１５２−１５４又は１６０−１６２、更により好ましくは１５３−１５５又は１５９−１６１、更により好ましくは１５４−１５６又は１５８−１６０、更により好ましくは１５５−１５７及び／又は１５７−１５９、並びに更により好ましくは１５６−１５８のアミノ酸からなるポリペプチドのいずれか一つを含むか又はこれと重複してよい。前述のように、本発明の結合分子は、ヒト又はマウスＴＲＥＭ２に、好ましくは膜結合型ヒト又はマウスＴＲＥＭ２に、及び最も好ましくは膜結合型ヒトＴＲＥＭ２に結合し且つ切断を阻害することが、優先される。
前述のように、本発明の状況において、驚くべきことに、ＴＲＥＭ２は、Ｈｉｓ１５７で特異的に切断されることが同定されている。従って、本発明の結合分子は、Ｈｉｓ１５７に直接結合するか、又は位置Ｈｉｓ１５７での切断を立体的に阻害するかのいずれかである。従って、ＴＲＥＭ２切断の阻害に繋がる好ましい結合部位は、位置Ｈｉｓ１５７の切断部位の周りに中心がある。ＴＲＥＭ２の切断酵素（例えば、ＡＤＡＭ又はマトリクスメタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ）との相互作用を阻害するＴＲＥＭ２のスタルク領域における結合分子の（例えば、抗体、ナノボディ又は小型分子の）任意の結合は、本発明の状況において使用することができる。ＴＲＥＭ２のスタルク領域は、ヒトＴＲＥＭ２の１１３−１７４位（例えば、配列番号：１に示される）；又は、マウスＴＲＥＭ２の１１３−１７１位（例えば、配列番号：４に示される）に配置される。本発明の一態様において、本明細書に提供される結合分子の結合部位は、配列番号：７−１５、２１及び２２のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれか一つを含むか又はこれと重複する。好ましくは、この結合部位は、配列番号：７のアミノ酸配列内である。
添付された実施例に示されたように、プロテアーゼＡＤＡＭ１０は、位置Ｈｉｓ１５７とＳｅｒ１５８の間で、ＴＲＥＭ２を切断する。従って本発明の状況において、本明細書に提供される結合分子の結合部位が、Ｈｉｓ１５７及び／又はＳｅｒ１５８を含むことは、特に好ましい。添付された実施例に示されたように、ＡＤに関連したＴＲＥＭ２バリアントｐ．Ｈ１５７Ｙは、ＴＲＥＭ２の増強されたシェディングに繋がり、このことは、Ｈｉｓ１５７は、ＴＲＥＭ２切断の調節において重要な役割を果たすことを示唆している。従って本発明の状況において、本明細書に提供される結合分子の結合部位は、ＴＲＥＭ２の、特にヒト又はマウス膜結合型ＴＲＥＭ２のＨｉｓ１５７を含むことが、最も好ましい。従って、本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合部位は、ＴＲＥＭ２の１５７位にヒスチジンを含む。
本明細書に提供される結合分子は、切断酵素のＴＲＥＭ２へのアクセスを阻害することにより、ＴＲＥＭ２切断を阻害する。ＴＲＥＭ２の切断を定量するために使用することができる、当該技術分野において公知のいくつかのアッセイが存在する。これらの方法は、本明細書に提供される結合分子によるＴＲＥＭ２切断の阻害をアッセイ（すなわち、定量）するために、本発明の状況において使用してよい。例えば、ＴＲＥＭ２切断の阻害は、当該技術分野において公知であり、且つ例えばKleinbergerらの論文(15)に説明されたような、以下のアッセイを使用し、試験（特に定量）することができる：
１）ヒト及び／又はマウスＴＲＥＭ２発現細胞の膜画分又はタンパク質溶解液の免疫ブロッティング。ＴＲＥＭ２切断の効率は、より高い分子量（“成熟”）バンドを分析することにより、試験することができる(例えば、Kleinbergerら(15)及び１Ｃ参照）、
２）ヒト及び／又はマウスＴＲＥＭ２発現細胞由来の上清の免疫ブロッティング（例えば、論文(15)、図１Ｂ、１Ｃ及び４Ｂ参照）、
３）ヒト及び／又はマウスＴＲＥＭ２発現細胞由来の上清中の可溶性ＴＲＥＭ２のＥＬＩＳＡ−ベースの定量（例えば、論文(15)、図１Ｂ、４Ｃ及び７Ａ参照）、
４）表面ビオチン化アッセイによる膜−結合型（すなわち、細胞表面−露出された）ＴＲＥＭ２の定量（例えば、Kleinbergerら(15)、図２Ｆ参照）、
５）フローサイトメトリーによる、ヒト及び／又はマウス細胞株及び初代細胞上の膜−結合型（すなわち、細胞表面−露出された）ＴＲＥＭ２の定量、
６）細胞−ベースのＥＬＩＳＡ技術による、ヒト及び／又はマウス細胞株並びに初代細胞上の膜−結合型（すなわち、細胞表面−露出された）ＴＲＥＭ２の定量、
７）表面免疫細胞化学による、ヒト及び／又はマウス細胞株並びに初代細胞上の細胞表面（すなわち、膜）−露出されたＴＲＥＭ２の定量（例えば、論文(16)参照）、
８）ヒト及び／又はマウスの組織及び／又は生体液（例えば、脳、肝臓、脾臓、血清、血漿、脳脊髄液及び／又は尿由来）からの可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）のＥＬＩＳＡ−ベースの定量、
９）ヒト及び／又はマウス起源由来の組織及び／又は生体液（例えば、脳、肝臓、脾臓、血清、血漿、脳脊髄液及び／又は尿由来）からのＴＲＥＭ２の免疫ブロッティング。
前述の方法のいずれか一つを、本発明の状況において、特定の結合分子が、ＴＲＥＭ２切断を阻害するかどうかを試験するために、使用することができる。従って本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関し、ここでＴＲＥＭ２切断の阻害は、免疫ブロッティング、可溶性ＴＲＥＭ２のＥＬＩＳＡ−ベースの定量、表面ビオチン化アッセイによる表面−結合型ＴＲＥＭ２の定量、フローサイトメトリーによる表面−結合型ＴＲＥＭ２の定量、表面免疫細胞化学による表面−結合型ＴＲＥＭ２の定量及び／又は細胞−ベースのＥＬＩＳＡ技術による表面−結合型ＴＲＥＭ２の定量によりアッセイされる。
結合分子によるＴＲＥＭ２の切断の阻害は、膜結合型ＴＲＥＭ２の量と相関している。従って、膜結合型ＴＲＥＭ２の量は、結合分子の非存在下での膜結合型ＴＲＥＭ２の量と比べ、結合分子存在下で増加される。例として、例えば前述のアッセイのいずれか一つにより、特に免疫ブロッティング又はフローサイトメトリーにより、アッセイされた際に、該結合分子の存在下での、膜結合型ＴＲＥＭ２の量は、結合分子の非存在下での膜結合型ＴＲＥＭ２の量の少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも１２０％、より好ましくは少なくとも１５０％、更により好ましくは少なくとも２００％、及び更により好ましくは少なくとも２５０％である場合に、該結合分子はＴＲＥＭ２の切断を阻害する結合分子と見なされてよい。そのようなアッセイにおいて、ＴＲＥＭ２切断酵素を含む細胞が使用されてよい。
従って例えば、前述のアッセイのいずれか一つにより、特に免疫ブロッティング又はフローサイトメトリーにより、アッセイされた際に、該結合分子の存在下で、膜結合型ＴＲＥＭ２の量は、結合分子の非存在下での膜結合型ＴＲＥＭ２の量よりも、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも１００％、及び更により好ましくは少なくとも１５０％より多い場合に、該結合分子はＴＲＥＭ２の切断を阻害する結合分子と見なされてよい。言及したように、先に言及したアッセイのいずれか一つ、特にｓＴＲＥＭ２の免疫ブロッティング又はＥＬＩＳＡベースの定量は、本明細書に提供される結合分子のＴＲＥＭ２切断の阻害の定量に使用することができる。そのようなアッセイにおいて、ＴＲＥＭ２切断酵素を含む細胞が、使用されてよい。
本明細書において、用語「膜結合型ＴＲＥＭ２」（「膜−結合したＴＲＥＭ２」とも称される）は、そのエクトドメインを含む、完全長ＴＲＥＭ２タンパク質が、グリコシル化され、且つ膜へ、特にミクログリア細胞の細胞膜へ結合されていることを意味する。
結合分子によるＴＲＥＭ２の切断の阻害の程度は、結合分子の存在下での可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）の量と、結合分子の非存在下でのｓＴＲＥＭ２の量とを比べ、負の相関がある。例として、例えば前述のアッセイのいずれか一つにより、特にｓＴＲＥＭ２のＥＬＩＳＡ−ベースの定量により、アッセイされた際に、該結合分子の存在下で、ｓＴＲＥＭ２の量は、結合分子の非存在下でのｓＴＲＥＭ２の量の０〜９０％、好ましくは０〜８０％、より好ましくは０〜７０％、更により好ましくは０〜６０％、更により好ましくは０〜５０％、及び更により好ましくは０〜２０％である場合に、該結合分子はＴＲＥＭ２の切断を阻害する結合分子と見なされてよい。
添付された実施例は、抗体クローン１４Ｄ３は、ＴＲＥＭ２切断を、約７０％だけ減少するのに対し、成熟ＴＲＥＭ２のレベルを最大５倍まで増加することを示している。従って、未処置細胞（すなわち、本発明の結合分子を含まない細胞）と比べ、この結合分子は、ＴＲＥＭ２切断を、少なくとも６０％又は最も好ましくは約７０％だけ減少することは、好ましい。前述のように、ＴＲＥＭ２切断の量は、ＥＬＩＳＡによりアッセイされてよく、これは定量のために、ウェスタンブロットが生じる定量よりもより強固なアッセイである。
添付された実施例は、ＡＤＡＭプロテアーゼは、位置Ｈｉｓ１５７でＴＲＥＭ２を切断（すなわち、シェディング）することを示している。しかし先行技術において、ＡＤＡＭプロテアーゼのインヒビターの投与後であっても、ＴＲＥＭ２切断は、ある程度生じることが示された(15)。これらのデータは、ＡＤＡＭプロテアーゼ以外のプロテアーゼもまた、ＴＲＥＭ２を切断することを示唆している。しかし、ＴＲＥＭ２を位置Ｈｉｓ１５７で（又はこの位置に密に近接した位置で）切断する任意のプロテアーゼによるＴＲＥＭ２の切断（すなわち、シェディング）は、本明細書に提供される結合分子により阻害されてよい。従って、本発明の状況においては、この切断酵素は、任意のメタロプロテイナーゼであってよい。例えば、該メタロプロテイナーゼは、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメイン−含有タンパク質（ＡＤＡＭ）又はマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）であってよい。従って、本発明の一態様において、結合分子は、切断酵素のＴＲＥＭ２への結合を干渉し、ここでこの切断酵素は、ＡＤＡＭ又はＭＭＰである。先行技術において、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７は、ＴＲＥＭ２シェディングに関与することは説明されている(15,16,32)。従って、本明細書のＡＤＡＭは、ＡＤＡＭ１０及び／又はＡＤＡＭ１７であってよい。本発明の状況においては、切断酵素は、ＡＤＡＭ１０であることが優先される。
ＴＲＥＭ２切断を阻害することにより、本明細書に提供される結合分子は、ミクログリア細胞の活性を、並びに／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の活性を保持及び／もしくは刺激する。好ましくは、本明細書に提供される結合分子は、ミクログリア細胞の活性を保持及び／又は刺激する。ミクログリア細胞の該活性は、貪食活性、遊走、カルシウムシグナル伝達、Ｓｙｋ活性化、及び／又は増殖であってよい。ＴＲＥＭ２はまた、ミクログリア細胞の炎症性サイトカイン産生及び生存を調節している。従って、ミクログリア細胞の該活性はまた、炎症性サイトカイン産生及び／又は生存の調節であってよい。好ましくは、本明細書に提供される結合分子は、ミクログリア細胞の貪食活性を、保持及び／又は安定化する。細胞の貪食活性を測定するために使用することができる当該技術分野において公知のいくつかのアッセイが、存在する。例えば、所定の結合分子が、細胞の貪食活性を保持及び／又は安定化するかどうかを試験するために、貪食は、Kleinbergerらの論文(15)、及びXiangらの論文(26)に説明されたように試験することができる。貪食活性の増加は、論文(33)に説明された方法を用いて、インビボにおいて試験することができる。所定の結合分子が、細胞のカルシウムシグナル伝達を保持及び／又は安定化するかどうかを試験するために、いくつかの手段及び方法が、当該技術分野において公知であり、且つ例えば論文(20)に説明されている。
本明細書において提供される結合分子は、抗体（ナノボディなど）又は小型分子であってよい。「小型分子」は、低分子量（＜９００ダルトン）を伴う、ペプチド、フォルダマー、プレテオミミック、及び有機合成から誘導された化合物を含む、任意の種類であってよい。小型分子は、生物学的プロセスを調節することを補助し、且つ一般に１０−１０ｍの桁のサイズを有する。多くの薬物は、小型分子である。
添付された実施例において、ＴＲＥＭ２スタルク領域の二次構造が、推定される。図４に示したように、ＴＲＥＭ２エクトドメインのＣ末端は、大きいアルファヘリックス構造を示している。従って、ＡＤＡＭ又はＭＭＰなどのメタロプロテイナーゼによるＴＲＥＭ２切断を阻害する小型分子を得るために、アルファ−ヘリックス−介在型タンパク質−タンパク質相互作用（ＴＲＥＭ２−ＡＤＡＭ；ＴＲＥＭ２−ＭＭＰ）を阻害する小型分子が設計されてよい。このような小型分子は、そのホット−スポット残基の空間配向を模倣することにより、アルファヘリックスのトポグラフィーにマッチする、拘束型アルファ−ヘリックスペプチド又はプロテオミミックのいずれかを設計することにより、小型分子を設計することができる。これらのアプローチは、当該技術分野において公知であり、且つ例えば論文(34)において、検証されている。設計された小型分子は、例えば有機合成により、作製されてよい。
タンパク質の「ホットスポット残基」は、タンパク質がそれらの機能を発揮することを助ける基本的な境界面残基である。タンパク質−タンパク質結合エネルギーの大半は、分子間タンパク質境界面：ホットスポットでの数個のアミノ酸のグループのみに関連している（例えば、Zerbe、2012, J Chem Inf Model., 52(8): 2236-2244参照）。タンパク質−タンパク質相互作用の状況において、用語「ホットスポット」は、アラニン走査変異誘発により決定される結合自由エネルギーへの大きな寄与をなす残基又は残基クラスターを指す。対照的に、医薬研究において、ホットスポットは、リガンド結合に関する高い性向を有する標的タンパク質上の部位であり、従って創薬に関して潜在的重要性がある。
従って、本明細書に提供される結合分子が小型分子である場合、そのホット−スポット残基の空間配向を模倣することにより、ＴＲＥＭ２のスタルク領域のアルファヘリックスのトポグラフィーにマッチする、拘束型アルファ−ヘリカルペプチド、フォルダマー又はプロテオミメティック(proteomimetic)であることができる。
本明細書において、用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、且つ少なくとも１つのアミノ酸鎖を包含する分子に関連しており、ここでこのアミノ酸残基は、ペプチド（アミド）結合により連結されている。用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」はまた、セレノシステインなどの、２０の遺伝子−コードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含む分子も包含している。ここで用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化及びなどの、改変を伴う分子も含む。このような改変は、当該技術分野において十分説明されている。
本明細書において、用語「プロテオミメティック」は、タンパク質(又はポリペプチド、又はオリゴペプチド、又はペプチド)の表面の領域の構造及び機能を模倣する任意の化合物を指す。
しかし前述のように、本発明の結合分子はまた、抗体であってもよい。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体はまた、ナノボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又は単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）などの、抗体断片であってもよい。抗体又は抗体断片は、ヒト化された抗体／抗体断片、完全ヒト抗体／抗体断片、マウス抗体／抗体断片、ラット抗体／抗体断片、ウサギ抗体／抗体断片、ハムスター抗体／抗体断片、ヤギ抗体／抗体断片、モルモット抗体／抗体断片、フェレット抗体／抗体断片、ネコ抗体／抗体断片、イヌ抗体／抗体断片、ニワトリ抗体／抗体断片、ヒツジ抗体／抗体断片、ウシ抗体／抗体断片、ウマ抗体／抗体断片、ラクダ抗体／抗体断片、又はサル抗体／抗体断片、例えば霊長類抗体／抗体断片などであってよい。抗体は、ヒト化された抗体／抗体断片、完全ヒト抗体／抗体断片、マウス抗体／抗体断片、ラット抗体／抗体断片、ウサギ抗体／抗体断片、ハムスター抗体／抗体断片、ヤギ抗体／抗体断片、モルモット抗体／抗体断片、フェレット抗体／抗体断片、ニワトリ抗体／抗体断片、ヒツジ抗体／抗体断片、又はサル抗体／抗体断片、例えば霊長類抗体／抗体断片などであることが、優先される。抗体は、ヒト化された抗体／抗体断片、完全ヒト抗体／抗体断片、マウス抗体／抗体断片、又はラット抗体／抗体断片であることが更により優先される。従って本明細書に提供される結合分子は、ヒト化されたナノボディなどの、ヒト化された抗体断片であってよい。本明細書に提供される結合分子は、更にキメラ抗体及び／又は二重特異性抗体であってよい。
添付された実施例において、ＴＲＥＭ２切断部位（例えば、配列番号：７のペプチド内のエピトープへ、例えばＨｉｓ１５７及び／又はＳｅｒ１５８を含むエピトープへ）結合する抗体が、調製されている。添付された実施例は、これらの抗体は、ＴＲＥＭ２切断を減少することを示している。ＴＲＥＭ２切断を能動的に阻害する全ての抗体のコンセンサス配列が、設計されている（図８参照）。本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関し、ここでこの結合分子は、該コンセンサス配列に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：３２の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：４２の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：３２と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：４２と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５２のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６２のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７２のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８２のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９２のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１０２のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５２と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６２と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７２と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８２と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９２と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１０２と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片も、本発明に包含される。
添付された実施例において明らかにされたように、ＴＲＥＭ２切断を阻害する最良の活性を示す抗体クローンは、抗体クローン１４Ｄ３である。従って、本発明の最も好ましい態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合分子は、抗体クローン１４Ｄ３に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：２３の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３３の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：２３と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３３と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４３のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５３のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６３のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７３のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８３のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９３のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８３と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９３と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。添付された実施例は、抗体クローン１４Ｄ３は、約７０％だけ、ＴＲＥＭ２切断を減少する一方で、成熟ＴＲＥＭ２のレベルを最大５倍増加することも示している。従って、未処置細胞（すなわち、先に規定した抗体を含まない細胞）と比べ、先に規定した抗体は、ＴＲＥＭ２切断を、少なくとも６０％又は最も好ましくは約７０％減少することは、好ましい。前述の抗体の抗体断片もまた、本発明に包含されている。
この最も好ましい本発明の態様はまた、本明細書に提供される結合分子にも関し、ここで該結合分子は抗体であり、且つここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：２３と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３３と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８３と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（１）及び（２）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは配列番号：２３の配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：３３の配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体のそれと同等である。未処置細胞（すなわち、先に規定した抗体を含まない細胞）と比べ、先に規定した抗体は、ＴＲＥＭ２切断を、少なくとも６０％又は最も好ましくは約７０％減少することが好ましい。前述の抗体の抗体断片もまた、本発明に包含されている。
添付された実施例は、抗体クローン１４Ｄ８は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する非常に高い活性を有することを示している。従って、特に好ましい本発明の態様は、本明細書に提供される結合分子に関し、ここでこの結合分子は、抗体クローン１４Ｄ８に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：２４の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３４の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：２４と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３４と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４４のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５４のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６４のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７４のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８４のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９４のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４４と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５４と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６４と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７４と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８４と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９４と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片も、本発明に包含される。
この特に好ましい本発明の態様はまた、本明細書に提供される結合分子にも関連し、ここで該結合分子は抗体であり、且つここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：２４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４４と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５４と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６４と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７４と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８４と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９４と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（１）及び（２）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、配列番号：２４の配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：３４の配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片もまた、本発明に包含されている。
本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合分子は、抗体クローン７Ａ１２に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：２５の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３５の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：２５と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３５と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５５のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６５のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７５のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８５のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９５のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４５と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５５と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６５と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７５と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８５と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９５と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片も、本発明に包含される。
本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合分子は、抗体クローン８Ａ１１に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：２６の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３６の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：２６と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３６と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４６のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５６のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６６のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７６のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８６のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９６のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４６と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５６と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６６と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７６と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８６と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９６と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片も、本発明に包含される。
本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合分子は、抗体クローン２１Ａ３に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：２７の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３７の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：２７と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３７と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４７のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５７のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６７のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７７のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８７のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９７のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４７と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５７と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６７と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７７と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８７と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９７と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片も、本発明に包含される。
本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合分子は、抗体クローン１０Ｃ３に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：２８の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３８の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：２８と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３８と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４８のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５８のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６８のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７８のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８８のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９８のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４８と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５８と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６８と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７８と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８８と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９８と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片も、本発明に包含される。
本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合分子は、抗体クローン１８Ｆ９に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：２９の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３９の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：２９と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：３９と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４９のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５９のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６９のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７９のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８９のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９９のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：４９と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：５９と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：６９と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：７９と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：８９と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：９９と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片も、本発明に包含される。
本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合分子は、抗体クローン１５Ｃ５に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：３０の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：４０の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：４０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５０のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６０のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７０のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８０のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９０のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１００のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５０と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６０と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７０と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８０と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９０と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１００と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片も、本発明に包含される。
本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関連し、ここでこの結合分子は、抗体クローン１Ｇ６に対応する抗体である。従って、本明細書に提供される結合分子は、抗体であってよく、ここでこの抗体は、以下の抗体のいずれか一つである：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：３１の配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：４１の配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：３１と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号：４１と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５１のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６１のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７１のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８１のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９１のアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１０１のアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体；又は
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９１と少なくとも６０％、好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１０１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体であって；ここでこの抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、抗体。
好ましくは、先に項目（２）−（４）において規定された抗体は、ＴＲＥＭ２切断を阻害する活性を有し、これは項目（１）で規定した抗体のそれと同等である。前述の抗体の抗体断片も、本発明に包含される。
本発明に従い、ＣＤＲ決定は、ＩＭＧＴ基準に従い実行されてよい(Ehrenmannら、第2章、R. Kontermann及びS. Dubel (編集)、Antibody Engineering Vol. 2, Springer-Verlag Berlin、ハイデルベルグ、2010)。
標的部位−特異的抗体（すなわち、特定の結合部位に結合する抗体）を産生するいくつかの技術は、当該技術分野において一般に公知である。例えば、ＴＲＥＭ２のエクトドメイン内の特定の結合部位に特異的に結合する抗体は、エクトドメイン又はＴＲＥＭ２内の所望の結合部位を含むペプチドによる、マウス又はラットの免疫化により産生され得る。例えば、配列番号：７−１５、２１及び２２に示されるペプチドのいずれか一つが、免疫化に使用されてよい。より詳細には、本発明の状況においては使用されるヒトＴＲＥＭ２に対する抗体の産生について、配列番号：７(AHVEHSISRS)、配列番号：８(EDAHVEH)、配列番号：９(SISRSL)及び／又は配列番号：２１(GESESFEDAHV)に示されるペプチドが、免疫化に使用されてよい。最も好ましくは、配列番号：７に示されるペプチドが使用される。マウスＴＲＥＭ２に対する抗体の産生に関して、配列番号：１０（AQVEHSTSRN)、配列番号：１１(EGAQVEH)、配列番号：１２(STSRNQ)及び／又は配列番号：２２(EHSTSRNQETSFP)に示されるペプチドが、免疫化に使用されてよい。ラットＴＲＥＭ２に対する抗体の産生について、配列番号：１３(AQVEHSTSSQ)、配列番号：１４(EGAQVEH)又は配列番号：１５(STSSQV)に示されるペプチドが、免疫化に使用されてよい。抗体産生のためにそのような免疫化を実施する上で利用可能ないくつかの施設が存在する。
前述のように動物の免疫化により抗体を産生した後、エピトープマッピングを行うことができる。エピトープマッピングは、その標的抗原上の抗体の結合部位（すなわち、エピトープ）を実験的に同定するプロセスである。エピトープマッピングのいくつかの方法が、当該技術分野において公知である。
例えば本発明の状況において、エピトープマッピングは、ＥＬＩＳＡにより実行されてよい。従って、ＴＲＥＭ２エクトドメインの切断型（例えば、スタルク領域の切断型）は、培養された細胞において発現され、且つＥＬＩＳＡを用いることにより、試験されるべき抗体／ナノボディにより検出され得る(例えば、論文(15)参照)。
加えて又は代わりに、エピトープマッピングは、免疫ブロッティングにより実行されてよい。従ってＴＲＥＭ２エクトドメインの切断型（例えば、スタルク領域の切断型）は、培養細胞において発現され、且つ免疫ブロッティングを用いることにより、試験されるべき抗体／ナノボディにより検出され得る。加えてＴＲＥＭ２の欠失構築体（例えば、スタルク領域欠失）は、免疫ブロッティングにより分析されてよい。
加えて又は代わりに、エピトープマッピングは、フローサイトメトリーにより実行されてよい。従って、細胞表面上のＴＲＥＭ２に結合する試験されるべき抗体／ナノボディの検出は、フローサイトメトリーにより評価され得る。この方法を用いることにより、エピトープマッピングは、ＴＲＥＭ２欠失構築体（例えば、スタルク領域の連続的な欠失を有する構築体）又はＴＲＥＭ２変異体を、使用することにより実行することができる。
加えて、本発明の状況において適用することができるエピトープマッピングのいくつかの方法が、Reineke及びSchutkowskiの文献(編集)、Methods of Molecular Biology, Epitope Mapping Protocols, vol. 524, 2008, Humana Pressにおいて、まとめられている。例えばエピトープマッピングはまた、重複するペプチドのタンパク質配列−由来の走査（ペプチド走査）；抗体結合に必要な最小ペプチド長を同定するために使用される切断分析；抗体結合に重要である主要残基を同定する完全置換分析；及び／又は、連続的なＣ末端切断された可溶性ＴＲＥＭ２の発現：により、実行されてよい。
本発明に従う結合分子を同定するために、標的エンゲージメントを行うことができる。標的エンゲージメントは、所定の化合物が、インビボにおいて、所望の標的と相互作用し、所望の結果（例えば、ＴＲＥＭ２などのバイオマーカーの減少）を生じることの検証である。従って、標的エンゲージメントは、所定の結合分子（例えば、先に説明されたように産生された抗体）が、インビボにおいて、最も好ましくはこの場合中枢神経系であってよい標的組織において、ＴＲＥＭ２切断を阻害することを、証明するために、実行することができる。標的エンゲージメントを認識するために使用することができるいくつかの手段及び方法が存在する。
例えば、本発明の状況においては、標的エンゲージメントは、組織及び／又は体液（例えば、血液、血清、血漿、ＣＳＦ、及び／又は尿）中の、可溶性ＴＲＥＭ２のレベルを評価することにより、行ってよい。従ってヒト、マウス、又はヒトとマウスの両方の組織及び／又は体液を使用してよい。可溶性ＴＲＥＭ２のレベルは、例えば論文(15)及び(17)に説明されたＥＬＩＳＡを用いて、評価してよい。
加えて又は代わりに、標的エンゲージメントは、組織試料（例えば、血液、脳、肝臓、及び／又は脾臓）中のＴＲＥＭ２成熟を評価することにより行ってよい。従ってヒト、マウス、又は両方の組織試料を使用してよい。ＴＲＥＭ２成熟は、免疫沈降及び／又は免疫ブロッティングを使用することにより、評価してよい。
加えて又は代わりに、標的エンゲージメントは、試験されるべき結合分子が、結合分子に曝露されない対照細胞と比べ、ＴＲＥＭ２の表面発現を増大するかどうかを評価する、フローサイトメトリーにより行ってよい。
従って、所定の結合分子の標的エンゲージメントは、該結合分子の存在下で、可溶性ＴＲＥＭ２の量が、結合分子に曝露されない（一つ又は複数の）対照体液と比較して、（一つ又は複数の）体液において減少される場合に、明らかにされ；例えば、論文(15)に説明された方法を参照のこと。加えて又は代わりに、所定の結合分子の標的エンゲージメントは、該結合分子の存在下で、成熟ＴＲＥＭ２の量が、結合分子に曝露されない（一つ又は複数の）対照体液と比較して、（一つ又は複数の）体液において増加される場合に、明らかにされ；例えば、論文(15)に説明された方法を参照のこと。
本明細書において用語「ＴＲＥＭ２」は：
（ｉ）配列番号：１−６のいずれか一つのアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び更により好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列：を含む又はこれからなるポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドが、ミクログリア細胞の貪食、遊走及び／又は生存を誘導する活性を有するものを指す。
本明細書に提供される結合分子は、膜結合型ＴＲＥＭ２の切断を阻害する。従って本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子に関し、ここでＴＲＥＭ２は：
（ｉ）配列番号：１又は４のアミノ酸配列；もしくは
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び更により好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列：を含む又はこれからなるポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドが、ミクログリア細胞の（適切な）貪食、遊走及び／又は生存を促進する活性を有するものである。
好ましくは、この結合分子は、ミクログリア細胞の（適切な）貪食を促進する活性を有する。所定の結合分子が、細胞の（適切な）貪食活性を促進するかどうかを分析する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば論文(15)に説明されている。
本明細書において、用語「ＴＲＥＭ２のエクトドメイン」は：
（ｉ）配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列；もしくは
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び更により好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列で：を含む又はこれからなるポリペプチドあって、ここでＴＲＥＭ２の細胞内ドメインと組合せた場合に、このポリペプチドは、ミクログリア細胞の（適切な）貪食、遊走及び／又は生存を促進する活性を有するものを指す。好ましくは、この活性は、ミクログリア細胞の（適切な）貪食の促進である。
Ｈｉｓ１５７は、ＴＲＥＭ２のエクトドメイン／細胞外ドメインのいわゆるスタルク領域に配置されている。従って、本発明の状況においては、本明細書に提供される結合分子の結合部位は、ＴＲＥＭ２のスタルク領域内であることが想起される。当該技術分野において公知のように、ＴＲＥＭ２のスタルク領域は、Ｉｇ−様ドメインと膜貫通ドメインの間の領域である。
本明細書において用語「ＴＲＥＭ２の細胞内ドメイン」とは：
（ｉ）配列番号：１９又は２０のアミノ酸配列；もしくは
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び更により好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列：を含む又はこれからなるポリペプチドであって、ここでＴＲＥＭ２のエクトドメインと組合せた場合に、このポリペプチドは、ミクログリア細胞の（適切な）貪食、遊走及び／又は生存を促進する活性を有するものを指す。好ましくは、この活性は、ミクログリア細胞の（適切な）貪食の促進である。
前述のように、本明細書に提供される結合分子は、神経変性障害などの、神経障害の治療及び／又は予防（好ましくは治療）に適している。従って本発明の一態様は、神経障害の治療及び／又は予防において使用するための本明細書に提供される結合分子に関連している。神経障害の治療及び／又は予防において使用するための医薬組成物もまた、本発明に包含されており、ここでこの医薬組成物は：
（ｉ）本発明の結合分子；及び
（ｉｉ）任意に医薬として許容し得る担体：を含有している。
従って、本発明は、神経障害を治療及び／又は予防する方法を提供し、ここでこの方法は、本明細書に提供される結合分子の有効量を、そのような治療を必要とする対象へ投与することを含む。
本明細書に提供される結合分子又は本明細書に提供される医薬組成物が、脳において有効であることを保証するために、当該技術分野において公知のいくつかの手段及び方法が、適用され得る。例えば、本明細書に提供される結合分子又は本明細書に提供される医薬組成物は、例えば、ALZET（登録商標）浸透圧ポンプ(http://www.alzet.com/research_applications/AB.html参照)などの、浸透圧ポンプを使用して、中枢神経系へ（例えば、脳へ）注入されてよい。加えて又は代わりに、本発明の結合分子（例えば、本発明の抗体、ナノボディ又は小型分子）は、血液−脳関門を通過するために、改変されてよい。これに関して適している改変は、受容体−介在性トランスサイトーシス（トランスフェリン）；トランスポーター−介在性送達；ウイルス−介在性送達；ナノ粒子−ベースの送達；リポソーム送達；二重特異性抗体の作製；又は、血液−脳関門を自発的に超える高い等電点（ｐＩ）を持つナノボディの作製を含む(35)。
ＡＤなどの、いくつかの神経変性障害の発症機序は、アミロイド−βペプチド（Ａ−β）の蓄積により誘発されると考えられ、これは例えばミクログリア細胞による、Ａ−βの過剰生成及び／又はクリアランス機序の不全が原因である。Ａ−βは、様々なサイズであることができる、オリゴマーへ自己凝集し、且つ脳実質及び血管においてびまん性の老人斑（すなわち、アミロイドプラーク）を形成する。Ａ−βオリゴマー及びプラークは、強力な神経毒であり、プロテアソーム機能をブロックし、ミトコンドリアの活性を阻害し、細胞内Ｃａ２＋レベルを変更し、且つ炎症過程を刺激する。Ａ−βは、微小管結合タンパク質タウのリン酸化を調節するシグナル伝達経路と相互作用する。タウの過剰リン酸化は、軸索輸送の調節におけるその正常な機能を破壊し、且つ神経原線維濃縮体及び毒性種である可溶性タウの蓄積に繋がる。更に、プロテアソームによる過剰リン酸化タウの分解は、Ａ−βの作用により阻害される。従って、本明細書に提供される結合分子によるようなミクログリア細胞の機能の活性化は、炎症成分による神経障害；並びに、アミロイドプラーク及び／又は過剰リン酸化タウの蓄積に関連している障害の治療及び／又は予防の戦略を表している。
従って本明細書に提供される結合分子、医薬組成物、又は治療的方法により、治療及び／又は予防され得る神経障害は、炎症成分による神経障害であることができる。本明細書に提供される結合分子、医薬組成物、又は治療的方法により治療及び／又は予防され得る神経障害は、好ましくは神経変性障害である。該神経変性障害は、ミクログリア細胞の機能障害により特徴付けられる。該神経変性障害はまた、アミロイドプラーク及び／又は過剰リン酸化タウの蓄積によっても特徴付けられる。例えば、本明細書に提供される結合分子、医薬組成物、又は治療的方法により治療及び／又は予防されるべき神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ＦＴＬＤ−様症候群、パーキンソン病、那須ハコラ病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、免疫媒介性神経障害、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であることができる。本明細書に提供される結合分子、医薬組成物、又は治療的方法により治療及び／又は予防され得る神経変性障害はまた、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、又はシャルコー・マリー・トゥス病であることもできる。好ましくは、ＡＤが、本明細書に提供される手段及び方法により治療及び／又は予防される。
本明細書に提供される結合分子又は医薬組成物はまた、併用療法の形態で投与されてよい。従って本発明の一態様は、治療及び／又は予防は併用療法である、本明細書に提供される結合分子、医薬組成物、又は治療的方法に関し、ここで該結合分子又は該医薬組成物は、別の活性物質と、同時に又は連続して投与される。他の活性物質は、好ましくは、神経変性障害などの、神経障害を治療及び／又は予防するために使用される医薬品である。例えば、該他の活性物質は、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）アンタゴニスト又は免疫治療薬（すなわち抗体）であってよい。
ＡＤなどの神経変性障害に対し特定の作用を有することが示されているいくつかのアセチルコリンエステラーゼインヒビターが、当該技術分野において公知であり、これはタクリン、リバスチグミン、ガランタミン及びドネペジルが挙げられる。神経変性障害の治療に使用されるＮＭＤＡＲアンタゴニストは、メマンチンである。しかし、本明細書に提供される結合分子又は医薬組成物は、免疫療法との併用療法において使用されることが優先される。該免疫療法は、Ａ−β免疫療法であることができる。例えば、該Ａ−β免疫療法は、アミロイド−βペプチドについて特異的である抗体を含むことができる。アミロイド−関連した免疫療法のため多くの薬物が、臨床試験中であり、例えば、ＡＡＢ−００３、ＡＣＩ−２４、ＡＮ−１７９２、アデュカヌマブ、Ａｆｆｉｔｏｐｅ ＡＤ０２、ＢＡＮ２４０１、バピネオズマブ、ＣＡＤ１０６、クレネツマブ、ＧＳＫ９３３７７６、Ｇａｍｍａｇｒａｄ（登録商標）、ガムネックス、ガンテネルマブ、ＬＹ３００２８１３、ＭＥＤＩ１８１４、Ｏｃｔａｇａｍ（登録商標）１０％、Ｐｏｎｅｚｕｍａｂ、ＳＡＲ２２８８１０、ソラネズマブ、又はＶａｎｕｔｉｄｅ ｃｒｉｄｉｆｉｃａｒがある。
本発明の一態様において、神経（例えば、神経変性）障害は、健常対照者の脳脊髄液（ＣＳＦ）に比べ、そのＣＳＦが増大したレベルの可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）、総タウ、及び／又はリン酸化タウを有する患者において、治療及び／又は予防される。加えて又は代わりに、神経（例えば、神経変性）障害は、健常対照者の血清と比べ、その血清が、増大したレベルの可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）、総タウ、及び／又リン酸化タウを有する患者において治療及び／又は予防されてよい。従って、神経（例えば、神経変性）障害は、健常対照者の血清及び／又はＣＳＦと比べ、各々、その血清及び／又はＣＳＦが、増大したレベルの可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）を有する患者において治療及び／又は予防されてよい。前述のように、神経障害の経過に伴うＴＲＥＭ２及びタウの変化は、当該技術分野において一般に公知であり、且つ例えば論文(17-19、36、37)において説明されている。
本明細書に提供される結合分子又は医薬組成物により治療されるべき患者を同定するために、造影技術も使用されてよい。例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、又は単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）又はポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）による進歩した医用画像は、神経変性障害などの神経障害の診断を補助するために使用することができる。
前述のように、ｐ．Ｈ１５７Ｙ変異のキャリアは、増大したＴＲＥＭ２シェディングを患っている。従って位置Ｈｉｓ１５７でのＴＲＥＭ２の切断の阻害は、本明細書に提供される結合分子又は医薬組成物の投与から特に恩恵がある。従って、本発明の一態様は、本明細書に提供される結合分子、医薬組成物、治療的方法に関し、ここで神経変性障害は、ＴＲＥＭ２のｐ．Ｈ１５７Ｙ変異を保有する患者において治療及び／又は予防される。
本発明の特定の態様は、以下の項目により規定される。
１．ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）のエクトドメイン内に結合部位を有する結合分子であって、ここで該結合分子が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、結合分子。
２．結合部位が、以下からなる群から選択される、ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の少なくとも１つの位置を含む、項目１の結合分子：
１４８位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１４８）；
１４９位のセリン（Ｓｅｒ１４９）；
１５０位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ１５０）；
１５１位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５１）；
１５２位のアスパラギン酸（Ａｓｐ１５２）；
１５３位のアラニン（Ａｌａ１５３）；
１５４位のヒスチジン（Ｈｉｓ１５４）；
１５５位のバリン（Ｖａｌ１５５）；
１５６位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５６）；
１５７位のヒスチジン（Ｈｉｓ１５７）；
１５８位のセリン（Ｓｅｒ１５８）；
１５９位のイソロイシン（Ｉｌｅ １５９）；
１６０位のセリン（Ｓｅｒ１６０）；
１６１位のアルギニン（Ａｒｇ１６１）；
１６２位のセリン（Ｓｅｒ１６２）；
１６３位のロイシン（Ｌｅｕ１６３）；
１６４位のロイシン（Ｌｅｕ１６４）；
１６５位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１６５）；及び
１６６位のグリシン（Ｇｌｙ１６６）。
３．結合部位が、以下からなる群から選択される、マウス膜結合型ＴＲＥＭ２の少なくとも１つの位置を含む、項目１の結合分子：
１４８位のセリン（Ｓｅｒ１４８）；
１４９位のセリン（Ｓｅｒ１４９）；
１５０位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ１５０）；
１５１位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５１）；
１５２位のグリシン（Ｇｌｙ１５２）；
１５３位のアラニン（Ａｌａ１５３）；
１５４位のグルタミン（Ｇｌｎ１５４）；
１５５位のバリン（Ｖａｌ１５５）；
１５６位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５６）；
１５７位のヒスチジン（Ｈｉｓ１５７）；
１５８位のセリン（Ｓｅｒ１５８）；
１５９位のトレオニン（Ｔｈｒ１５９）；
１６０位のセリン（Ｓｅｒ１６０）；
１６１位のアルギニン（Ａｒｇ１６１）；
１６２位のアスパラギン（Ａｓｎ１６２）；
１６３位のグルタミン（Ｇｌｎ１６３）；
１６４位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１６４）；
１６５位のトレオニン（Ｔｈｒ１６５）；及び
１６６位のセリン（Ｓｅｒ１６６）。
４．結合部位が、配列番号：７−１５、２１及び２２のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれか一つを含む又はこれと重複している、項目１−３のいずれか一つの結合分子。
５．結合部位が、ＴＲＥＭ２の１５７位にヒスチジンを含む、項目１−４のいずれか一つの結合分子。
６．結合分子が、切断酵素のＴＲＥＭ２へのアクセスを阻害することにより、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、項目１−５のいずれか一つの結合分子。
７．ＴＲＥＭ２切断の阻害が、免疫ブロッティング、可溶性ＴＲＥＭ２のＥＬＩＳＡ−ベースの定量、表面ビオチン化アッセイによる表面−結合型ＴＲＥＭ２の定量、フローサイトメトリーによる表面−結合型ＴＲＥＭ２の定量、表面免疫細胞化学による表面−結合型ＴＲＥＭ２の定量、及び／又は細胞−ベースのＥＬＩＳＡ技術による表面−結合型ＴＲＥＭ２の定量により、アッセイされる、項目１−６のいずれか一つの結合分子。
８．該結合分子の存在下での膜−結合型ＴＲＥＭ２の量が、結合分子の非存在下での膜−結合型ＴＲＥＭ２の量よりも少なくとも１０％より多い、項目１−７のいずれか一つの結合分子。
９．切断酵素が、メタロプロテイナーゼである、項目６−８のいずれか一つの結合分子。
１０．結合分子が、切断酵素のＴＲＥＭ２への結合に干渉し、ここで切断酵素が、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメイン−含有タンパク質（ＡＤＡＭ）又はマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である、項目６−９のいずれか一つの結合分子。
１１．ＡＤＡＭが、ＡＤＡＭ１０及び／又はＡＤＡＭ１７である、項目１０の結合分子。
１２．結合分子が、ミクログリア細胞の活性及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の活性を保持及び／又は刺激する、項目１−１１のいずれか一つの結合分子。
１３．ミクログリア細胞及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の活性が、貪食活性、遊走、カルシウムシグナル伝達、Ｓｙｋ活性化、増殖、炎症性サイトカイン産生及び／又は生存の調節である、項目１２の結合分子。
１４．結合分子が、抗体又は小型分子である、項目１−１３のいずれか一つの結合分子。
１５．抗体が、モノクローナル抗体である、項目１４の結合分子。
１６．抗体が、抗体断片である、項目１４又は１５の結合分子。
１７．抗体断片が、ナノボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又は単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）である、項目１６の結合分子。
１８．抗体又は抗体断片が、ヒト化抗体／抗体断片、完全ヒト抗体／抗体断片、マウス抗体／抗体断片、ラット抗体／抗体断片、ウサギ抗体／抗体断片、ハムスター抗体／抗体断片、ヤギ抗体／抗体断片、モルモット抗体／抗体断片、フェレット抗体／抗体断片、ニワトリ抗体／抗体断片、ヒツジ抗体／抗体断片、又はサル抗体／抗体断片である、項目１５−１７のいずれか一つの結合分子。
１９．抗体が、キメラ抗体及び／又は二重特異性抗体である、項目１５−１８のいずれか一つの結合分子。
２０．抗体が：
（１）重鎖可変領域が、配列番号：３２の配列を含み、及び軽鎖可変領域が、配列番号：４２の配列を含む抗体であって；並びに、ここで抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する；抗体；
（２）重鎖可変領域が、配列番号：３２への少なくとも８５％同一性を有する配列を含み、及び軽鎖可変領域が、配列番号：４２への少なくとも８５％同一性を有する配列を含む抗体であって；並びに、ここで抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する；抗体；
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５２のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６２のアミノ酸配列を含み；及び、重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７２のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８２のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９２のアミノ酸配列を含み；及び、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１０２のアミノ酸配列を含む抗体であって；並びに、ここで抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する；抗体；或いは
（４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９２と少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；及び、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１０２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体であって；並びに、ここで抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する；抗体：のいずれか一つである、項目１４−１９のいずれか一つの結合分子。
２１．ＴＲＥＭ２が、
（ｉ）配列番号：１−６のいずれか一つのアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列；を含むか又はこれからなるポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドが、ミクログリア細胞及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の適切な貪食、遊走、及び／又は生存を促進する活性を有するものである、項目１−２０のいずれか一つの結合分子。
２２．ＴＲＥＭ２のエクトドメインが、
（ｉ）配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列；もしくは、
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列；を含むか又はこれらからなるポリペプチドであって、ここでＴＲＥＭ２の細胞内ドメインと一緒にされた場合、このポリペプチドは、ミクログリア細胞及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の適切な貪食、遊走、及び／又は生存を促進する活性を有するものである、項目１−２１のいずれか一つの結合分子。
２３．ＴＲＥＭ２の細胞内ドメインが、
（ｉ）配列番号：１９又は２０のアミノ酸配列；もしくは、
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列；を含むか又はこれらからなるポリペプチドであって、ここでＴＲＥＭ２のエクトドメインと一緒にされた場合、このポリペプチドは、ミクログリア細胞及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の適切な貪食、遊走、及び／又は生存を促進する活性を有するものである、項目２２の結合分子。
２４．神経障害の治療及び／又は予防における使用のための、項目１−２３のいずれか一つの結合分子。
２５．医薬組成物が：
（ｉ）項目１−２３のいずれか一つの結合分子；及び
（ｉｉ）任意に医薬として許容し得る担体：を含有する、神経障害の治療及び／又は予防における使用のための医薬組成物。
２６．方法が、項目１−２３のいずれか一つの結合分子の有効量を、そのような治療を必要とする対象へ投与することを含む、神経障害を治療及び／又は予防する方法。
２７．神経障害が、炎症成分を伴う神経障害である、項目２４に従う使用のための結合分子、項目２５に従う使用のための医薬組成物、又は項目２６の方法。
２８．神経障害が、神経変性障害である、項目２４又は２７に従う使用のための結合分子、項目２５又は２７に従う使用のための医薬組成物、もしくは項目２６又は２７の方法。
２９．神経変性障害が、ミクログリア細胞及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の低下した機能により特徴付けられる、項目２８に従う使用のための結合分子、項目２８に従う使用のための医薬組成物、又は項目２８の方法。
３０．該神経変性障害が、アミロイドプラーク及び／又は過剰リン酸化タウの蓄積により特徴付けられる、項目２８又は２９に従う使用のための結合分子、項目２８又は２９に従う使用のための医薬組成物、もしくは項目２８又は２９の方法。
３１．該神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ＦＴＬＤ−様症候群、パーキンソン病、那須ハコラ病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、免疫−媒介型ニューロパチー、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、項目２８−３０のいずれか一つに従う使用のための結合分子、項目２８−３０のいずれか一つに従う使用のための医薬組成物、又は項目２８−３０のいずれか一つの方法。
３２．治療及び／又は予防が併用治療であり、ここで該結合分子又は該医薬組成物が、別の活性物質と同時に又は連続して投与される、項目２４及び２７−３１のいずれか一つに従う使用のための結合分子、項目２５及び２７−３１のいずれか一つに従う使用のための医薬組成物、又は項目２６−３１のいずれか一つの方法。
３３．該他の活性物質が、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）アンタゴニスト又は免疫治療薬である、項目３２に従う使用のための結合分子、項目３２に従う使用のための医薬組成物、又は項目３２の方法。
３４．該免疫治療が、Ａ−β免疫療法である、項目３３に従う使用のための結合分子、項目３３に従う使用のための医薬組成物、又は項目３３の方法。
３５．該Ａ−β免疫療法が、アミロイド−βペプチドに特異的である抗体を含む、項目３４に従う使用のための結合分子、項目３４に従う使用のための医薬組成物、又は項目３４の方法。
３６．神経障害が、その脳脊髄液（ＣＳＦ）が、健常対照者のＣＳＦと比べ増大したレベルの可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）、総タウ、及び／又はリン酸化タウを有する患者において治療及び／又は予防される、項目２４及び２７−３５のいずれか一つに従う使用のための結合分子、項目２５及び２７−３５のいずれか一つに従う使用のための医薬組成物、又は項目２６−３５のいずれか一つの方法。
３７．神経変性障害が、ＴＲＥＭ２のｐ．Ｈ１５７Ｙ変異を保有する患者において治療及び／又は予防される、項目２４及び２７−３６のいずれか一つに従う使用のための結合分子、項目２５及び２７−３６のいずれか一つに従う使用のための医薬組成物、又は項目２６−３７のいずれか一つの方法。
本明細書において用語「抗体」は、抗原又はエピトープに特異的に結合することが可能である、一つの免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、又はそれらの断片に由来する、これを手本に変更するか又はこれらにより実質的にコードされた、ペプチド又はポリペプチドを含み、例えば論文(38-40)を参照されたい。用語「抗体」は、抗原（ＴＲＥＭ２など）への結合能を保持している、抗原−結合する部位、すなわち「抗原結合部位」（例えば、断片、部分配列、又は相補性決定領域（ＣＤＲ））を含み、これらは、例えば、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む、二価の断片；（ｉｉｉ）Ｆａｂ’断片、すなわち、Ｆ（ａｂ’）２断片が、穏やかな還元により分裂される場合に形成される２つの断片の一方；（ｉｖ）Ｆａｂ’−ＳＨ断片、すなわち、遊離のスルフヒドリル基を含むＦａｂ’断片；（ｖ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄ断片；（ｖｉ）抗体の１本の腕のＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｖｉｉ）ｓｃＦｖ断片、すなわち重鎖及び軽鎖の可変領域が一緒に融合されている、単鎖可変断片；又は、（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）：を含むか或いはこれらからなる。本明細書において提供される抗体断片はまた、（ｉｘ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片であってよい(例えば、Wardら(41)参照)。
本明細書に提供される抗体断片はまた、単ドメイン抗体、ｓｄＡｂであってよい。単ドメイン抗体は、ナノボディとも称され；例えば、Gibbs, 2005, “Nanobody”、Scientific American Magazineを参照されたい。ｓｄＡｂ又はナノボディは、単独のモノマー性可変抗体ドメインからなる抗体断片である。分子量がわずかに１２−１５ｋＤａである、単−ドメイン抗体は、２本のタンパク質重鎖及び２本の軽鎖で構成される通常型抗体（１５０−１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、且つＦａｂ断片（〜５０ｋＤａ、１本の軽鎖及び半分の重鎖）並びに単鎖可変断片（〜２５ｋＤａ、２個の可変ドメイン、一方は軽鎖に由来し、他方は重鎖に由来する）よりさえ小さい；例えば論文(42)参照。
様々な手順が、当該技術分野において公知であり、且つそのような抗体及び／又は断片の作製に使用することができる(例えば論文(43)参照)。本明細書において略語「ＶＬ」、「ＶＨ」、「ＣＬ」及び「ＣＨ」は、各々、抗体軽鎖の可変ドメイン、抗体重鎖の可変ドメイン、抗体軽鎖の定常ドメイン及び抗体重鎖の定常ドメインを指す。
抗体断片は、例えば、無傷の抗体の、組換え技術又は酵素的もしくは化学的切断により、調製されることができる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の作製のために、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨを、ＶＬ及びＶＨ領域を対合させ、一価の分子を形成する一本鎖タンパク質として作製することを可能にする、合成リンカーによる組換え法を用いて、一緒にすることができる(例えば、Birdら(44)及び(45))。単鎖抗体を作製するための更なる技術は、例えば、論文(46)及び米国特許第４，９４６，７７８号に説明されている。
抗体（ポリクローナル及びモノクローナル）を作製し且つ単離する免疫化の方法は、当業者に公知であり、且つ科学文献及び特許文献において説明されている(例えば論文(47-50)参照)。抗体はまた、動物を使用する従来のインビボ法に加えて又は代わりに；例えば、組換え抗体結合部位を発現しているファージディスプレイライブラリーを使用することにより、インビトロにおいて作製することができる(例えば、Hoogenboom(51)及びKatz(52)参照)。
抗体が抗原（ＴＲＥＭ２のエクトドメインなど）に結合する能力は、当業者に馴染みのある様々な手順を用いて、決定されてよい。例えば、結合は、抗体を、蛍光剤、酵素標識又は放射性同位体などの検出可能な標識により標識することにより、決定されてよい。或いは、抗体の抗原への結合は、その上に検出可能な標識を有する二次抗体を使用することにより、検出されてよい。特定のアッセイとしては、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、放射線免疫検定、免疫組織化学的方法及びウェスタンブロットが挙げられる。
例えばＴＲＥＭ２切断部位に対するモノクローナル抗体の作製及び選択は、以下のように行うことができる。ＴＲＥＭ２切断部位を含むペプチド（例えば、アミノ酸配列AHVEHSISRS、配列番号：７を含むペプチド）を、Ｎ末端でオボアルブミン（ＯＶＡ）に結合させる。マウス又はラットなどの非−ヒト動物を、このＯＶＡ−結合したペプチド及び不完全フロイントアジュバントにより免疫化する。６週間後、不完全フロイントアジュバントを含まない追加免疫を３日間与え、その後融合する。骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３の免疫脾細胞との融合は、ポリエチレングリコール１５００を用い、標準手順に従い行うことができる(Koehler及びMilstein、Nature. 1975, 256:495-497)。ハイブリドーマ上清を、アビジン−コートされたプレートに結合されたビオチン化型ペプチドを用いる、酵素結合免疫検定において、ペプチド（例えば、配列番号：７のペプチド）への結合について試験することができる。結合した抗体は、ＩｇＧアイソタイプに対する抗体により検出することができる。
ＴＲＥＭ２−反応性ハイブリドーマ上清は、ヒト野生型ＴＲＥＭ２を安定して過剰に発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞の細胞表面上のＴＲＥＭ２を検出するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。この手順は、Kleinbergerらの論文、2014に説明されている。特にヒト完全長ＴＲＥＭ２又は空のベクター（対照）のいずれかを発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞は、各ＴＲＥＭ２−反応性上清と一緒にインキュベーションすることができる。ＴＲＥＭ２−反応性上清の結合は、アイソタイプ−特異的抗体を用いて可視化することができる。ＴＲＥＭ２切断部位に対するモノクローナル抗体の作製及び選択に関する詳細な説明は、実施例に示している。
本発明の状況において有用な抗体は、例えば、ポリクローナル性又はモノクローナル性であることができる。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に生じる可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単独の抗原性部位に対し方向付けられている。モノクローナル抗体は、本質的に他の免疫グロブリンが混入されていないハイブリドーマ培養により合成され得る点が、有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団中にある抗体の特徴を指摘し、且ついずれか特定の方法による抗体産生に必要とされるとは解釈されない。モノクローナル抗体の調製に関して、連続細胞培養により抗体を提供するいくつかの技術を使用することができる。例としては、ハイブリドーマ技術(50)、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術(53)、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(54)が挙げられる。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Kohler及びMilsteinの論文(50)に最初に説明されたハイブリドーマ法により作製されてよいか、又は例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に説明されているような、組換え法により作製されてよい。本発明での使用のためのモノクローナル抗体はまた、例えば、Clacksonらの論文(55)；並びに、Marksらの論文(56)に説明された技術を用い、ファージ抗体ライブラリーから単離されてよい。
本明細書において使用される用語「ポリクローナル抗体」は、１又は複数の他の同一でない抗体の存在中で又は存在下で作製された抗体を指す。概して、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を産生するいくつかの別のＢリンパ球の存在下で、Ｂリンパ球から作製される。通常ポリクローナル抗体は、免疫化した動物から直接得られる。
本明細書において用語「抗体」は、ジクローナル抗体及びオリゴクローナル抗体を更に含む。用語「ジクローナル抗体」は、標的タンパク質（ＴＲＥＭ２のエクトドメインなど）に対する少なくとも２種の抗体の調製を指す。典型的には、これらの異なる抗体は、異なるエピトープに結合する。用語「オリゴクローナル抗体」は、標的タンパク質（ＴＲＥＭ２のエクトドメインなど）に対する３〜１００種の異なる抗体の調製を指す。典型的には、このような調製における抗体は、広範な異なるエピトープに結合する。
用語「抗体」はまた、二重特異性（すなわち、二機能性）抗体にも関する。本明細書において使用される用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体を指す。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含む、様々な方法により、作製することができる(例えば、Songsivilaiら(57)、及びKostelnyら(58)参照)。加えて二重特異性抗体は、ダイアボディ(59)又は「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」(60)及び(61)として形成されてよい。用語「抗体」はまた、「三機能性抗体」にも関する。
本明細書に提供される抗体は、更に完全−ヒト抗体、マウス抗体又はラット抗体であってよい。本明細書で使用される用語「完全−ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。完全ヒト抗体は、マウスにおいて、マウス細胞において、又はマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて作製される場合には、マウス糖鎖を含んでよい。或いは、「完全−ヒト抗体」は、ラットにおいて、ラット細胞において、又はラット細胞由来のハイブリドーマにおいて作製される場合には、ラット糖鎖を含んでよい。同様に、「（完全−）マウス抗体」又は「（完全−）マウスの抗体」は、マウス（マウスの）免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。用語「（完全−）ラット抗体」は、ラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。これと一致して、用語「（完全−）ウサギ抗体」、「（完全−）ハムスター抗体」、「（完全−）ヤギ抗体」、「（完全−）モルモット抗体」、「（完全−）フェレット抗体」、「（完全−）ネコ抗体」、「（完全−）イヌ抗体」、「（完全−）ニワトリ抗体」、「（完全−）ヒツジ抗体」、「（完全−）ウシ抗体」、「（完全−）ウマ抗体」、「（完全−）ラクダ抗体」及び「（完全−）サル抗体」は、各々、ウサギ、ハムスター、ヤギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、又はサルの免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。
完全−ヒト抗体は、例えば、完全−ヒト抗体の作製及びスクリーニングを可能にする、広範に使用されるスクリーニング技術である、ファージディスプレイにより作製されてよい。従ってファージ抗体もまた、本発明の状況において使用することができる。ファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，４０３，４８４号、第５，９６９，１０８号及び第５，８８５，７９３号に説明されている。完全−ヒト抗体の開発を可能にする別の技術は、マウスハイブリドーマ技術の改変に関与している。マウスは、それら自身のマウス遺伝子の交換で、ヒト免疫グロブリン座を含むように、トランスジェニックに作製される（例えば、米国特許第５，８７７，３９７号参照）。（完全−）マウス又は（完全−）ラット抗体は、同様に作製されてよい。
本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体であってもよい。用語「キメラ抗体」は、別のヒト又は非−ヒト種（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）に由来する、抗体領域（例えば、定常領域）と融合又はキメラ化された、ヒト又は非−ヒト種の可変領域を含む抗体を指す。
本明細書において用語「抗体」はまた、組換えヒト抗体、異種抗体及びヘテロハイブリッド抗体にも関する。用語「組換えヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体などの、組換え手段により調製、発現、作出もしくは単離されたヒト配列抗体；宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；又は、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関与する任意の他の手段により調製、発現、作出もしくは単離された抗体の全てを含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域（存在するならば）を有する。しかしこのような抗体は、インビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合は、インビボ体細胞変異誘発）に供することができ；従って、組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し且つこれに関連する一方で、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパトア内には天然には存在しない配列である。
「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック非−ヒト生物に関連して定義される。この用語は、トランスジェニック非−ヒト動物からなるものではない生物において認められるものに対応する、及び一般にトランスジェニック非−ヒト動物のもの以外の種に由来する、アミノ酸配列又はコード核酸配列を有する抗体を指す。用語「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物の軽鎖及び重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖に会合されたヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例は、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む。
本明細書に提供される抗体はまた、ヒト化抗体であってよい。非−ヒト（例えば、マウス又はウサギ）抗体の「ヒト化」形状は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、又は他の抗原−結合部分配列など）であり、これらは、非−ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む。時には、ヒト化抗体は、その中のレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット又はウサギなどの非−ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非−ヒト残基により置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてもインポートされたＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても認められない残基を含んでよい。これらの改変は、抗体性能の更なる精緻化及び最適化をもたらす。概して、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが、非−ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、並びにＦＲ領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである、少なくとも一つの、及び典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一つの部分を含んでよい。更なる詳細については、例えば、Jonesら(62)、Riechmannら(63)、及びPrestaら(64)の論文を参照されたい。同じく、トランスジェニック動物は、ヒト化抗体を発現するために使用することができる。抗体のヒト化の一般的方法は、ＣＤＲグラフティングに関与し、ここでは非−ヒト‘ドナー’抗体由来の機能性抗原−結合部位は、ヒト’アクセプター’抗体上にグラフトされる。ＣＤＲグラフティング法は、当該技術分野において公知であり、且つ例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，６９３，７６１号及び第６，４０７，２１３号に説明されている。別の関連方法は、遺伝子再構成及び遺伝子変換を受けることが可能である（例えば、米国特許第７，１２９，０８４号参照）、１又は複数のヒト化された免疫グロブリン座を含むように遺伝子操作されたトランスジェニック動物からのヒト化抗体の作製である。
従って本発明の状況において用語「抗体」は、完全免疫グロブリン分子、並びにそのような免疫グロブリン分子の一部分に関する。更に、この用語は、前述のように、改変及び／又は変更された抗体分子に関する。この用語はまた、組換えにより又は合成により作製／合成された抗体に関する。この用語はまた、無傷の抗体、並びに分離された軽鎖及び重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は単離されたＣＤＲのような、それらの抗体断片にも関する。本明細書に提供される抗体は更に、二機能性抗体、三機能性抗体、完全−ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はｓｃＦｖ−もしくは抗体−融合タンパク質のような抗体構築体であってよい。言及したように、抗体を作製する技術は、当該技術分野において周知であり、且つ例えば、Peteringらの論文(65)にまとめられている。加えて、抗体を作製するいくつかの技術が、例えば、Harlowの「Antibody, A Laboratory Manual」、CSH Press、Cold Spring Harbor、1988に説明されている。
本発明の結合分子は、天然の分子、例えば天然の抗体であってよい。しかし本発明の結合分子はまた、非天然の分子であってよい。例えば、本発明の結合分子は、天然の抗体と同一ではないアミノ酸配列を有する抗体であってよいか、或いは類似の側鎖官能性を提供する合成アミノ酸などの、少なくとも１つの非天然のアミノ酸残基を含む抗体であってよい。例えば、芳香族アミノ酸は、Ｄ−又はＬ−ナフチルアラニン、Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン、Ｄ−又はＬ−２−チエニルアラニン、Ｄ−又はＬ−１−,２−，３−，又は４−ピレニルアラニン、Ｄ−又はＬ−３−チエニルアラニン、Ｄ−又はＬ−（２−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−又はＬ−（３−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−又はＬ−（２−ピラジニル）−アラニン、Ｄ−又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−又はＬ−ｐビフェニルアラニン、Ｄ−又はＬ−ｐ−メトキシビフェンイルアラニン、Ｄ−又はＬ−２−インドール（アルキル）アラニン、及びＤ−又はＬ−アルキルアラニンにより置き換えられることができ、ここでアルキル基は、置換又は非置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、及びイソ−ペンチルからなる群から選択される。非カルボキシラートアミノ酸は、非限定的例として考えられ得るホスホ−又はスルホ−アミノ酸により提供されるような、負帯電を有するように作製することができる。更なる非天然のアミノ酸は、アルキル基を、任意の天然のアミノ酸と組合せることにより作製されるアルキル化アミノ酸である。リジン及びアルギニンなどの塩基性天然のアミノ酸は、アミン（ＮＨ２）官能性で、アルキル基により置換されることができる。非天然のアミノ酸上のまた他の置換は、アスパラギン又はグルタミンのニトリル誘導体（例えば、ＣＯＮＨ２官能性の代わりにＣＮ−部分を含む）、及びメチオニンのスルホキシド誘導体がある。
本明細書に提供される抗体はまた、高親和性抗体であってもよい。抗体に関する用語「高親和性」は、平衡会合定数（Ｋａ）が少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも約１０８Ｍ−１、少なくとも約１０９Ｍ−１、少なくとも約１０１０Ｍ−１、少なくとも約１０１１Ｍ−１、又は少なくとも約１０１２Ｍ−１又はそれよりも大きい、例えば最大１０１３Ｍ−１又は１０１４Ｍ−１又はそれよりも大きいことを指す。しかし「高親和性」結合は、とりわけ抗体アイソタイプ間で変動し得る。本明細書において使用される用語「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡会合定数を指すことが意図されている。この定数は、単位１／Ｍを有する。「高親和性抗体」は通常、過度の超変異、親和性成熟、及び好ましくはＩｇＧなどの適用可能なアイソタイプへの適切なアイソタイプスイッチングをうけた抗体である。
好ましくは、本明細書に提供される結合分子は、ＴＲＥＭ２のエクトドメインへ特異的に結合する。結合分子に言及する場合、語句「特異的に結合する」又は「結合が特異的」とは、ＴＲＥＭ２のエクトドメインなどの、標的分子に、専ら又は優先的に、中間の又は高い親和性を有する、結合分子を指す。語句「へ特異的に結合する」とは、タンパク質及び他の生物製剤の異種集団の存在下での、標的タンパク質（ＴＲＥＭ２のエクトドメインなど）の存在の決定要因である、結合反応を指す。従って、指定されたアッセイ条件下で、特定された結合分子は、特定の標的タンパク質（例えば、ＴＲＥＭ２のエクトドメイン）へ優先的に結合し、且つ被験試料中に存在する著しい量の他の成分には結合しない。このような条件下での標的タンパク質への特異的結合は、特定の標的タンパク質へのその特異性について選択される結合分子を必要とすることがある。様々なアッセイフォーマットを使用し、特定の標的タンパク質と特異的に反応する結合分子を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫検定、免疫沈降、ビアコア及びウェスタンブロットを使用し、ＴＲＥＭ２のエクトドメインに特異的に結合する結合分子を同定することができる。典型的には、特異的又は選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナル又はノイズであるか、及びより典型的には１０倍を超えるバックグラウンドであろう。結合分子が抗体であるならば、語句「へ特異的に結合する」は、タンパク質及び他の生物製剤の異種集団中での、抗原（ＴＲＥＭ２のエクトドメインなど）の存在の決定要因である結合反応を指す。典型的には、その抗原へ特異的に結合する抗体は、会合定数（Ｋａ）少なくとも約１×１０６Ｍ−１もしくは１０７Ｍ−１、又は約１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、又は約１０１０Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１、又はより高い値で、該抗原へ結合し；及び／或いは、予め決定された抗原又は密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に関するその親和性よりも、少なくとも２倍以上である親和性で、予め決定された抗原（例えば、ＴＲＥＭ２のエクトドメイン）へ結合する。
前述のように、本発明は、神経変性障害などの神経障害の治療及び／又は予防において使用するための結合分子；並びに、該結合分子を含有する医薬組成物に関する。該医薬組成物(すなわち、医薬品)は、任意に医薬として許容し得る担体を含有する。該医薬組成物は、治療上許容し得る希釈剤又は賦形剤を、更に含有してよい。
本発明の典型的医薬組成物は、本明細書に提供される結合分子及び担体又は賦形剤を混合することにより、調製される。好適な担体及び賦形剤は、当業者に周知であり、且つ例えば、論文(66-68)において詳細に説明されている。これらの製剤はまた、薬物の外観を向上するか又は医薬製品（すなわち、医薬品）の製造を補助するために、１又は複数の緩衝液、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、抗酸化剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色剤、甘味料、香料、香味剤、希釈剤及び他の公知の添加剤も含有して良い。例えば、本発明の医薬組成物は、本発明の結合分子を、外界温度、適切なｐＨで、且つ所望の純度で、生理的に許容し得る担体、すなわちレシピエントにとって無毒の担体と、好適な投与剤形へ利用される用量及び濃度で、混合することにより、製剤化されてよい。本発明の医薬組成物は、無菌であってよい。
本発明の結合分子は、医薬として許容し得る塩の形状で存在してよい。用語「医薬として許容し得る塩」は、本発明の化合物の生物学的な有効性及び特性を保持し、且つ好適な無毒の有機酸又は無機酸又は有機塩基又は無機塩基から形成される、従来型の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。酸付加塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸など無機酸から誘導されたもの、並びにｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、及び同類のものなどの、有機酸から誘導されたものを含む。塩基付加塩は、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、及び第４級水酸化アンモニウム、例えばテトラメチル水酸化アンモニウムなどから誘導されたものを含む。化合物の改善された物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性及び溶解度を得るための、医薬化合物の塩への化学的修飾は、薬化学者に周知の技術である。これは例えば、論文(69)又は(70)において説明されている。例えば、本明細書に提供される化合物の医薬として許容し得る塩は、ナトリウム塩であってよい。
本発明の医薬組成物は、良好な医療実践と一致する様式で、製剤化され、1服用量とされ(dosed)、且つ投与される。この状況において考慮される要因は、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、患者の年齢及び性別、並びに医療実践者に公知の他の要因を含む。ここで、「有効量」（「（治療的）有効投与量」としても公知）は、医師又は他の臨床担当者により求められる、対象の生物学的及び医学的反応を誘起するであろう化合物の量を意味する。本発明の結合分子、又は本発明の医薬組成物の「有効量」は、そのような考察に支配され、且つ治療される神経障害の症状を阻害するのに必要な最小量である。例えば、そのような量は、総じて、レシピエントの細胞に、又は哺乳動物に毒性がある量を下回ってよい。
本発明の結合分子又は本発明の医薬組成物は、経口、局所（口腔内及び舌下を含む）、経直腸、経膣、経真皮、非経口、皮下、腹腔内、肺内、皮内、髄腔内及び硬膜外、及び鼻腔内の投与、並びに局所治療が望ましいならば病巣内投与を含む、任意の適切な手法により投与されてよい。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。前述のように、浸透圧ポンプを使用し、本発明の結合分子又は医薬組成物を、ＣＮＳへ、例えば脳へ、直接送達してもよい。
本発明の結合分子又は本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、液剤、分散剤、懸濁剤、シロップ剤、スプレー、坐剤、ゲル剤、乳剤、貼付剤など、任意の使いやすい投与剤形で投与されてよい。このような組成物は、例えば、希釈剤、担体、ｐＨ調節剤、甘味料、増量剤、及び更なる活性物質などの、医薬調製において慣習的な成分を含んでよい。
先に考察したように、本発明の結合分子又は本発明の医薬組成物は、ＡＤなどの神経変性障害を含む神経障害の予防及び／又は治療に有用である。用語「治療」、「治療している」、「治療する」などは、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得るという一般的意味で本明細書において使用される。この効果は、疾患及び／又は疾患が原因の有害作用の部分的又は完全な治癒に関して、治療的である。本明細書において使用される用語「治療」は、対象における疾患の任意の治療に及び、且つ（ａ）疾患を阻害する、すなわち、アミロイドプラークの形成の阻害のようにその発達を停止することか；又は、（ｂ）疾患を改善する（すなわち、軽減する）、すなわち、アミロイドプラークの退縮のように、疾患の退縮を引き起こすこと：を含む。従って、神経変性障害などの神経障害を治療する化合物は、神経変性障害などの神経障害を改善及び／又は阻害する化合物である。好ましくは、本明細書において使用される用語「治療」は、既に確定されかつ顕在化された神経変性障害の治療などの、既に顕在化した神経障害の医学的介入に関する。本明細書において用語「予防している」、「予防」又は「予防する」は、予防的処置、すなわち、疾患を治癒することよりも、それを予防することを目的とする方策又は手順に関する。予防は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に阻止する点で予防的である、望ましい薬理学的及び／又は生理学的効果が得られることを意味する。従って、本明細書において「神経障害／神経変性障害を予防している」は、対象において生じる神経障害／神経変性障害を防止すること、及び神経障害／神経変性障害の症状の発生を防止することを含む。
本発明の目的に関して、「対象」（又は「患者」）は、脊椎動物であってよい。本発明の状況において、用語「対象」は、ヒト及び他の動物の両方、特に哺乳動物、及び他の生物を含む。従って、本明細書に提供される手段及び方法は、ヒト療法及び獣医学適用の両方に適用可能である。従って本明細書において、対象は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ、又はサル、例えば霊長類などの動物であってよい。好ましくは、対象は、哺乳動物である。より好ましくは、対象は、マウス又はヒトである。最も好ましくは、対象は、ヒトである。
本明細書において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド（アミド）結合により連結されたアミノ酸モノマーを含む又はこれからなる全ての分子を含む。従って用語「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質などの、全てのアミノ酸配列を含む。本明細書記載の「ポリペプチド」は、天然のポリペプチド又は非−天然のポリペプチドであってよい。非−天然のポリペプチドは、天然の対応物と比べ、少なくとも１つの変異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加）を含んでよい。非−天然のポリペプチドはまた、ベクターにおいてクローン化され、並びに／又は該ポリペプチドの天然のプロモーターではないプロモーターへ機能的に連結されてよい。該プロモーターは、構成的に活性があるプロモーターであってよい。本明細書において使用される用語「アミノ酸」又は「残基」は、天然のアミノ酸の、並びに他のアミノ酸（例えば、非−天然のアミノ酸、核酸配列によりコードされないアミノ酸、合成アミノ酸など）の、Ｌ−及びＤ−異性体の両方を含む。天然のアミノ酸の例は、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）である。翻訳後修飾された天然のアミノ酸は、デヒドロブチリン（Ｄｈｂ）及びラビオニン（Ｌａｂ）である。非−天然のアミノ酸の例は、先に説明されている。非−天然のポリペプチドは、例えば、アミノ酸配列に共有的もしくは非共有的に結合された、レポーター分子又は別のリガンドなどは、ポリペプチドの天然の形のアミノ酸配列と比べ、１又は複数の非−アミノ酸置換基、又は異種のアミノ酸置換基を含んでよい。
本発明の状況において、用語「同一性」又は「％同一性」は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列が、本明細書に示された配列と、例えば、配列番号：１−６又は１７−２０の配列と、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％、及び更により好ましくは少なくとも９９％同一性を有することを意味し、ここでより高い同一性の値は、より低いものよりも好ましい。本発明に従い、２種以上の核酸配列又はアミノ酸配列の状況における用語「同一性(identity/identities)」又は「％同一性(percent identity/identities)」は、アミノ酸残基又はヌクレオチドが同一であるか、又はそれらが同一であると特定された割合を有する、２種以上の配列を指す（例えば、当該技術分野において公知の配列比較アルゴリズムを使用し測定されるか、又は手作業で並置され且つ目視検査されることにより、比較ウインドウにわたり、又は指定された領域にわたり、最大対応となるよう比較し且つ並置した場合に、例えば配列番号：１−６又は１７−２０のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性）。好ましくは説明された同一性は、本明細書に提供される配列の全てのアミノ酸の長さにわたって存在する。
当業者は、当該技術分野において公知のように、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム(71)又はＦＡＳＴＤＢ(72)を基にしたものなどのアルゴリズムを使用し、配列間／配列中の％同一性をどのようにして決定するかを知っているであろう。同じくＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム(73-75)も、当業者に利用可能である。例えば、ベーシックローカルアライメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）を表す、ＢＬＡＳＴ ２．０(73-75)は、ローカル配列アライメントを検索するために使用することができる。先に考察したようにＢＬＡＳＴは、配列類似性を決定するために、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生じる。これらのアライメントのローカル特徴のために、ＢＬＡＳＴは、正確なマッチの決定において、及び類似配列の同定において、特に有用である。ＢＬＡＳＴ(73-75)を使用する類似のコンピュータ技術は、ＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬなどのヌクレオチドデータベースにおける同一分子又は関連分子の検索に使用される。
本発明は、以下の非限定的な図面、表及び実施例を参照し、更に説明される。
図面及び表を説明する。
ＴＲＥＭ２エクトドメイン切断部位の同定。 （Ａ）膜−結合型ＴＲＥＭ２の図示。ＡＤＡＭ１０によるシェディング時に、ＴＲＥＭ２の残存するＣ末端の残り(stub)は、γ−セクレターゼにより、膜内で切断される。アミノ酸変化を生じる同定されたＴＲＥＭ２バリアントが、示される。 ＴＲＥＭ２エクトドメイン切断部位の同定。 （Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞において安定して発現されたＣ末端のＦＬＡＧ−タグ付けされたＴＲＥＭ２を使用し、エクトドメイン切断部位を同定した。ＴＲＥＭ２ Ｃ末端断片の濃縮のために、細胞を、１０μＭ ＤＡＰＴで処理し、その後タンパク質抽出した。右側のグラフは、ＤＡＰＴ処置後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により同定された、Ｈｉｓ１５７の後ろの切断にフィットする、一個の突出したピークを示す。ＡＤＡＭインヒビター（ＧＭ、広範なＡＤＡＭインヒビター；ＧＩ、選択的ＡＤＡＭ１０インヒビター）による処理は、同定されたピークを示さなかった（下側グラフ）。 ＴＲＥＭ２エクトドメイン切断部位の同定。 （Ｃ）ＴＲＥＭ２エクトドメイン切断部位を同定する別の戦略。ＴＥＶ−プロテアーゼ切断部位、それに続くＦＬＡＧ−タグを、ＴＲＥＭ２のアミノ酸１４０の後ろに導入した。可溶性ＴＲＥＭ２を、上清から精製した。Ｉｇ−様Ｖ−型ドメインを含むＮ末端部分を、ＴＥＶ−プロテアーゼ切断により除去し、残りのＣ末端ペプチドを、抗−ＦＬＡＧ抗体を用いて精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。右側グラフは、Ｈｉｓ１５７の後ろの切断されたペプチドに対応する単独のピークを示している。 ＴＲＥＭ２エクトドメイン切断部位の同定。 （Ｄ）ＰＭＡ処理後のＡＤＡＭ１７活性の増加は、単独のピークを示し、これは大量の代替切断生成物の誘導を伴わない、Ｈ１５７での切断を確認している。 （Ｅ）位置Ｈ１５７での、主要なＴＲＥＭ２エクトドメイン切断部位の図示。少量の代替切断部位は、Ｌ１６３、Ｌ１６４及びＥ１６５で検出される。暗灰色の背景を伴うアミノ酸は、ＴＲＥＭ２膜貫通ドメインのスタートを示している。切断−部位−特異的抗体を作製するためのラットの免疫化に使用されたエクトドメイン切断部位を包含する十量体ペプチドは、ボックス内に示した。
図２ ＴＲＥＭ２ Ｈ１５７Ｙバリアントに関連した患者の増大したシェディング。 （Ａ）ＡＤ−関連バリアントｐ．Ｈ１５７Ｙを発現している細胞由来の上清中のｓＴＲＥＭ２の抗−ＨＡ免疫ブロッティングは、野生型（ＷＴ）対照と比べ、増大したｓＴＲＥＭ２レベルを示す。ＦＴＤ−様-会合したＴＲＥＭ２変異ｐ．Ｔ６６Ｍは、減少したシェディングのための対照として使用した(15)。 （Ｂ）膜−結合型ＴＲＥＭ２の免疫ブロッティングは、成熟ＴＲＥＭ２（未熟バンドの上側のスメア）の低下したレベルを示す。このＣ末端断片はまた、Ｈ１５７Ｙ発現細胞においても低下したレベルを示すことに留意。ヒトＴＲＥＭ２ Ｃ末端に特異的である９Ｄ１１抗体を、免疫ブロッティングに使用した。 （Ｃ）ｓＴＲＥＭ２レベルの定量。 （Ｄ）成熟／未熟ＴＲＥＭ２レベルの定量。 （Ｅ）ｓＴＲＥＭ２／成熟ＴＲＥＭ２レベルの定量。 （Ｆ）未熟ＴＲＥＭ２の定量。 図２ ＴＲＥＭ２ Ｈ１５７Ｙバリアントに関連した患者の増大したシェディング。 （Ｇ）ＴＲＥＭ２ ＣＴＦ／未熟ＴＲＥＭ２レベルの定量。 （Ｈ）成熟した表面露出された変異体ＴＲＥＭ２の表面ビオチン化は、表面結合したｐ．Ｈ１５７Ｙ ＴＲＥＭ２の低下したレベルを示す。ＦＴＤ−様-会合したＴＲＥＭ２変異Ｔ６６Ｍは、低下した細胞表面ＴＲＥＭ２発現の対照として使用した（(15)参照）。 （Ｉ）細胞−ベースのＥＬＩＳＡによる表面結合したＴＲＥＭ２の定量は、ｐ．Ｔ６６Ｍ及びｐ．Ｈ１５７Ｙ ＴＲＥＭ２の低下した表面発現を示す。 （Ｊ）ＴＲＥＭ２バリアントＨ１５７Ｙは、エクトドメイン切断部位の位置を変化しない。グラフは、Ｙ１５７の後ろで切断された生成物に対応する、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析における単独のピークを示している。
図３ ＴＲＥＭ２ Ｈ１５７Ｙバリアントを発現している細胞において損なわれた貪食。 ＴＲＥＭ２−ＤＡＰ１２融合構築体を安定して発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞における、ｐＨｒｏｄｏ大腸菌の貪食は、インキュベーションの１時間後（灰色）及び２時間後（黒色）に、野生型（ＷＴ）発現細胞と比べ、Ｈ１５７Ｙ発現細胞における低下した貪食性の取込みを示している。サイトカラシンＤ（１０μＭ）を、貪食阻害に対する陰性対照として使用した。ＥＶ、空のベクター対照。
図４ ＴＲＥＭ２（配列番号：１）のアミノ酸１４９−１７４の二次構造の推定（ｓ２Ｄ法）。 黒色ラインは、同定された切断部位を示す。
図５ ＴＲＥＭ２（配列番号：１）のアミノ酸１５８−１７５の二次構造の推定（ｓ２Ｄ法）。 切断のＣ末端側のアミノ酸配列（＝残りのＣＴＦのＮ末端部分）
図６ ＴＲＥＭ２（配列番号：１）のアミノ酸１３２−１５７の二次構造の推定（ｓ２Ｄ法）。 切断のＮ末端側のアミノ酸配列（＝可溶性ＴＲＥＭ２のＣ末端部分）
図７ 切断−部位−特異的抗体を使用するＴＲＥＭ２エクトドメインシェディングの阻害。 （Ａ）指定されたクローン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を使用する２４時間抗体処理時に、ｗｔ ＴＲＥＭ２を安定して過剰発現しているＨＥＫ細胞の、馴化培地由来の可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）及び膜画分由来の成熟／未熟ＴＲＥＭ２の、抗−ＨＡ免疫ブロッティング。エクトドメインシェディングを最も強力に減少する選択された抗体クローンは、灰色ボックスで示した。免疫ブロット法は、２回の独立した実験の代表である。 図７ 切断−部位−特異的抗体を使用するＴＲＥＭ２エクトドメインシェディングの阻害。 （Ｂ）ｓＴＲＥＭ２のＥＬＩＳＡ−媒介した定量（ｎ＝２）は、エクトドメイン切断部位に対し方向付けられた選択された抗体クローン（１４Ｄ３及び１４Ｄ８、灰色のボックス中）は、ＡＤＡＭ１０インヒビターＧＩ２５４０２３Ｘ（陽性対照）と同等の、ｓＴＲＥＭ２レベルの減少に繋がることを示している。 図７ 切断−部位−特異的抗体を使用するＴＲＥＭ２エクトドメインシェディングの阻害。 （Ｃ）成熟ＴＲＥＭ２の免疫ブロッティングの定量分析（ｎ＝２）は、選択された抗体クローン（１４Ｄ３及び１４Ｄ８、灰色のボックス中）は、ＡＤＡＭ１０インヒビターＧＩ２５４０２３Ｘ（陽性対照）と同等の又は更により高い、成熟ＴＲＥＭ２のレベルの増加を生じることを明らかにしている。 図７Ｂ及びＣのｓＴＲＥＭ２及び成熟ＴＲＥＭ２のレベルは、平均±ＳＥＭで表し、且つ免疫ブロット法から定量したように未熟ＴＲＥＭ２のレベルに対し規準化した。ヒトＴＲＥＭ２のＣ末端に対して特異的であるモノクローナル抗体を、陽性対照として使用した。Ｎｏ ｔｒ．；未処置。
図８ 作製された抗体の一部の可変領域からのアミノ酸配列のアライメント。 （Ａ）可変重鎖からのアミノ酸配列のアライメント。ＣＤＲ領域は、ボックスで囲んだ。個々の抗体クローン間の配列変動は、灰色で示す。アミノ酸番号を示し、且つＣＤＲ決定は、ＩＭＧＴ基準に従って行った。コンセンサス配列、保存率、及び配列ロゴは、ＣＬＣ ＭＡＩＮワークベンチ６．９．１．を用いて作製した。＊は、個々の抗体クローン間のアミノ酸配列における変動のある位置である。 図８ 作製された抗体の一部の可変領域からのアミノ酸配列のアライメント （Ｂ）可変軽鎖からのアミノ酸配列のアライメント。ＣＤＲ領域は、ボックスで囲んだ。個々の抗体クローン間の配列変動は、灰色で示す。アミノ酸番号を示し、且つＣＤＲ決定は、ＩＭＧＴ基準に従って行った。コンセンサス配列、保存率、及び配列ロゴは、ＣＬＣ ＭＡＩＮワークベンチ６．９．１．を用いて作製した。＊は、個々の抗体クローン間のアミノ酸配列における変動のある位置である。
図９ 抗体クローン並びに各コンセンサス配列のアミノ酸配列。太字の大文字は、比較配列の１００％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。太字の小文字は、比較配列の＞５０％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。太字でない大文字は、比較配列の＞８０％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。＊は、コンセンサス配列が決定されないことを示している。従って、＊は任意のアミノ酸であることができる。ＣＤＲ配列には下線を付けた。 図９ 抗体クローン並びに各コンセンサス配列のアミノ酸配列。太字の大文字は、比較配列の１００％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。太字の小文字は、比較配列の＞５０％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。太字でない大文字は、比較配列の＞８０％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。＊は、コンセンサス配列が決定されないことを示している。従って、＊は任意のアミノ酸であることができる。ＣＤＲ配列には下線を付けた。 図９ 抗体クローン並びに各コンセンサス配列のアミノ酸配列。太字の大文字は、比較配列の１００％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。太字の小文字は、比較配列の＞５０％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。太字でない大文字は、比較配列の＞８０％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。＊は、コンセンサス配列が決定されないことを示している。従って、＊は任意のアミノ酸であることができる。ＣＤＲ配列には下線を付けた。 図９ 抗体クローン並びに各コンセンサス配列のアミノ酸配列。太字の大文字は、比較配列の１００％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。太字の小文字は、比較配列の＞５０％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。太字でない大文字は、比較配列の＞８０％が、その位置に同じアミノ酸を有することを示している。＊は、コンセンサス配列が決定されないことを示している。従って、＊は任意のアミノ酸であることができる。ＣＤＲ配列には下線を付けた。
表１ 同定されたペプチドのリスト及び計算された質量に対する測定されたペプチド質量の比較。［Ｍ＋Ｈ］＋は、一価に帯電したペプチドを示す。
表２ 同定されたペプチド及び計算された質量に対する測定されたペプチド質量の比較。［Ｍ＋Ｈ］＋は、一価に帯電したペプチドを示す。
実施例は、本発明を例証している。
実施例１：ＡＤＡＭ切断部位に生じ、且つシェディング及び貪食機能に影響を及ぼすアルツハイマー関連ＴＲＥＭ２バリアント
材料及び方法
ｃＤＮＡ構築体
野生型（ＷＴ）ヒトＴＲＥＭ２のコード配列を、内在性ＴＲＥＭ２シグナルペプチド（ａａ１−１８）の後ろに位置したＨＡ−タグ（YPYDVPDYA、それに続くリンカー配列SGGGGGLE）及びＣ末端ＦＬＡＧタグ（DYKDDDDK）を導入したｃＤＮＡクローン（クローン６９３；Holzel Diagnostika、独国）から、ＰＣＲにより増幅した。ＴＲＥＭ２構築体を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（New England Biolabs）及びＸｈｏＩ（Thermo Scientific）を用いて、ｐｃＤＮＡ５ＴＭ／ＦＲＴ／ＴＯ又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクター（両方共Life Technologies）へ、サブクローニングした。貪食実験のために、ＴＲＥＭ２−ＤＡＰ１２融合構築体を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ（Thermo Scientific）により線状化されたｐｃＤＮＡ５ＴＭ／ＦＲＴ／ＴＯベクターと一緒に、各々、１又は２のｇＢｌｏｃｋ遺伝子断片（Integrated DNA Technologies）を使用する、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）法（New England BioLabs）を用いて作製した。ＴＲＥＭ２−ＤＡＰ１２融合構築体は、ＤＡＰ１２（ａａ２８−１１３）に融合されたａａ１６９（プロリン１６９）を含むＴＲＥＭ２のエクトドメインを含んだ。更に、アスパラギン酸からアラニンへのＤＡＰ１２の膜貫通ドメインにおけるアミノ酸変化（ｐ．Ｄ５０Ａ）を、含んだ。加えて、ＴＲＥＭ２−ＤＡＰ１２融合構築体は、前述のように内在性ＴＲＥＭ２シグナルペプチドの後に、ＨＡ−タグを含んだ。ＴＲＥＭ２ミスセンス変異ｐ．Ｔ６６Ｍ（ＡＣＧ＞ＡＴＧ）、及びｐ．Ｈ１５７Ｙ（ＣＡＣ＞ＴＡＣ）を、位置指定変異誘発により各プラスミドへ導入し（Stratagene、ラホヤ、CA）、且つ全ての構築体をＤＮＡシークエンシングにより検証した。
細胞培養及びアイソジェニック細胞株の作製
Ｆｌｐ−Ｉｎ ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ；Life Technologies)を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ゼオシン（２００ｍｇ／ｍｌ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン(PAA Laboratories)を補充した、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）構築体のトランスフェクションを、リポフェクタミン２０００を製造業者の推奨に従い用いて実行した。ヒトＴＲＥＭ２ ｃＤＮＡ構築体の安定した過剰発現のために、ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、ＴＲＥＭ２ ｃＤＮＡ構築体及びｐＯＧ４４（Ｆｌｐ−リコンビナーゼ発現ベクター；Life Technologies)と同時トランスフェクションし、ヒグロマイシンＢ（２００ｍｇ／ｍｌ）を用いて選択した。別に言及しないならば、細胞培養実験のための製品は、Life Technologies社から入手した。
抗体
免疫ブロット検出のために、以下の抗体を使用した：ＨＲＰへ複合されたラットモノクローナル抗−ＨＡ抗体（３Ｆ１０；１：２，０００；Roche）、及びヒトＴＲＥＭ２のＣ末端に対するラットモノクローナル抗体（１：５、Dr. Kremmer/Dr. Feederle Service Unit Monoclonal Antibodiesにより提供、Helmholtz Zentrum、ミュンヘンより)。二次抗体は、ＨＲＰ−複合ヤギ抗−ラットＩｇＧ（１：１０，０００、Santa Cruz Biotechnology)であった。
細胞表面ビオチン化
表面ビオチン化は、ポリ−Ｌ−リジン−コートディッシュ上で一晩成長させた、ＴＲＥＭ２ ｃＤＮＡ構築体を安定して過剰発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を用いて実行した。細胞は、冷ＰＢＳにより３回洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌ ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン(Pierce)を含有するＰＢＳと共に、３０分間、ＲＴでインキュベーションした。細胞を、ＰＢＳにより３回洗浄し、ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌにより、１０分間、ＲＴでクエンチした。更にＰＢＳ中での３回の洗浄工程の後、細胞を、ＰＢＳ中に収集し、且つプロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma)を新たに補充した、細胞溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中で、氷上で、２０分間溶解した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法(Pierce)を用いて測定し、等量のタンパク質を、ストレプトアビジンセファロース(GE Healthcare)を使用する、一晩、４℃での沈殿に供した。ストレプトアビジンセファロースを、ＳＴＥＮ−ＮａＣｌ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ＮＰ−４０）、ＳＴＥＮ−ＳＤＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ＮＰ−４０、０．１（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）、ＳＴＥＮ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ＮＰ−４０）の各１ｍｌで１回洗浄し、βメルカプトエタノールを補充した２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で、９５℃で１０分間煮沸することにより、タンパク質を溶離した。ストレプトアビジン−沈殿した試料からの免疫ブロット法では、カルネキシン反応性は検出されず、これは表面ビオチン化手順時の細胞の完全性が確認されることに留意。
馴化培地、細胞溶解液の調製、及び免疫ブロッティング
ＴＲＥＭ２又はＴＲＥＭ２−ＤＡＰ１２ ｃＤＮＡ構築体を安定して過剰発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、密度１．５×１０５／ｃｍ２で播種し、播種後４８時間で培地を交換した。順化培地を、１８〜２０時間後に収集し、氷上で直ちに冷却し、１３，０００ｒｐｍで、４℃、２０分間遠心し、上清を分析まで−２０℃で凍結した。上清を、標準１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに直接供した。膜画分を調製するために、細胞を、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、氷冷した低張緩衝液（０．０１Ｍトリス、ｐＨ７；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＥＧＴＡ）中で再懸濁し、新たにプロテアーゼインヒビター(Sigma)を補充し、氷上で３０分間インキュベーションした。液体窒素で瞬間凍結し且つ解凍した後、破壊された細胞を、１３，０００ｒｐｍで、４℃、４５分間遠心した。得られたペレットを、ＳＴＥ溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中に再懸濁し、氷上で２０分間インキュベーションし、且つ１３，０００ｒｐｍで、４℃、３０分間の遠心分離により透明化した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ法を用いて測定し、等量のタンパク質を、βメルカプトエタノールを補充したＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、二フッ化ポリビニリデンメンブレン(Hybond P；Amersham Biosciences、アイレスバリー、英国)に転写した。結合した抗体を、増強された化学発光技術(Pierce)を用い、対応するＨＲＰ−複合二次抗体により可視化した。免疫ブロットの定量は、ＬＡＳ−４０００イメージリーダーで行い、Ｍｕｌｔｉ−Ｇａｕｇｅ Ｖ３．０ソフトウェア(両方共Fujifilm Life Science)を用いて分析した。
貪食アッセイ
蛍光発生する大腸菌粒子（ｐＨｒｏｄｏ Ｇｒｅｅｎ, Molecular Probes）の貪食を、野生型又は変異体ＴＲＥＭ２−ＤＡＰ１２融合構築体のいずれかを安定して発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を用いて分析した。簡単に述べると、細胞を、密度２×１０５個（ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ）細胞で、２４−ウェルプレート中にプレーティングし、２４〜４８時間培養した。ｐＨｒｏｄｏ大腸菌生体粒子を、ＰＢＳ中に、濃度１ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解し、合計５０ｍｇの生体粒子を条件に従い添加し、３７℃で、６０又は１２０分間インキュベーションした。陰性対照として、貪食を１０ｍＭサイトカラシンＤを、ｐＨｒｏｄｏ大腸菌生体粒子の添加前３０分に添加することにより、阻害した。細胞をトリプシン処理により収集し、ＦＡＣＳ試料緩衝液で２回洗浄し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ ＶＹＢフローサイトメーター(Miltenyi Biotec)上で、フローサイトメトリーにより分析した。データ解析は、ＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙソフトウェア(Miltenyi Biotec)を用いて行った。
細胞−ベースのＥＬＩＳＡ
空ベクター（ｐｃＤＮＡ５ＴＭ／ＦＲＴ／ＴＯ）又はＴＲＥＭ２ ｃＤＮＡ（野生型若しくは各変異体）のいずれかを安定して発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、ポリ−Ｌ−リジンコートされた９６−ウェルプレートに、濃度１５，０００個細胞／ウェルで播種した。播種の１日後、非特異的結合は、氷上で、ＤＭＥＭ細胞培養培地中の１０％ＢＳＡを用いて、２０分間ブロックした。表面露出されたＴＲＥＭ２を、５％ＢＳＡを補充したＤＭＥＭ中のＨＲＰ−結合した抗−ＨＡ抗体（３Ｆ１０；希釈１：４００）を用いて、氷上で、９０分間染色した。未結合の抗体は、ＤＭＥＭ及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）による、４回の洗浄により、洗浄除去し、基質希釈緩衝液（０．０５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２５Ｍクエン酸、ｐＨ＝５．５；０．７５％Ｈ２Ｏ２を補充）中の１００μｇ／ｍｌテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の添加により呈色反応を開始させた。呈色反応は、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させ、吸光度を自動プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで測定した。
エクトドメイン切断のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の解析
ＷＴ及びＨ１５７Ｙ ＴＲＥＭ２を安定して発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、ＰＢＳ中に収集した。細胞ペレットを、使用時まで、−２０℃で凍結した。細胞を、プロテアーゼインヒビターミックス(Sigma-Aldrich)を含有する溶解緩衝液（４％ＤＤＭ、０．１％Ｎ−オクチルグルコシド、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１４０ｍＭ ＮａＣｌ）中に、氷上で、２０分間溶解した。１３，０００ｇで、２０分間の透明化スピン後、上清を、１００，０００ｇで１時間の遠心分離による、２回目の透明化スピンに供し、且つ抗−ＦＬＡＧ Ｍ２−アガロース(Sigma-Aldrich)と共に一晩、４℃で回転することにより、インキュベーションした。ビーズを、ＩＰ／ＭＳ緩衝液（０．１％Ｎ−オクチルグルコシド、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１４０ｍＭ ＮａＣｌ）により４回、並びに水により２回洗浄した。ビーズは、ＩＰ／ＭＳ分析まで、−２０℃で貯蔵した。
ＴＲＥＭ２ ＷＴ ＴＥＶ−ＦＬＡＧ構築体を、ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞へ、一過性にトランスフェクションした。２４時間後、新鮮な培地を添加した。７２時間後、上清を収集し、細胞デブリを除くために、遠心分離した。上清のｐＨを、１Ｍトリス／ＨＣｌを用いて、ｐＨ＝８．０に調節し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ＝８．０を添加し（最終濃度３．７５ｍＭ）、且つ上清を、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２−アガロース(Sigma-Aldrich)と共に、一晩４℃で回転することにより、インキュベーションした。ビーズを、ＩＰ／ＭＳ緩衝液（０．１％Ｎ−オクチルグルコシド、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１４０ｍＭ ＮａＣｌ）により４回、並びに水により２回洗浄した。ＴＲＥＭ２エクトドメインを、１００ｍＭグリシンｐＨ＝２．５を用いて、ビーズから溶離し、氷上で１０分間インキュベーションした。遠心分離（１，２００ｇで５分間）時に、上清を、１／８容量の１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０の添加により、直ちに中和させた。ＥＤＴＡの添加後、ＤＴＴ（最終濃度、各々、０．５ｍＭ及び１ｍＭ）、及びＲｏｃｈｅ完全プロテアーゼインヒビター、１０ユニットのＡｃＴＥＶ(Life Technologies)を添加し、且つ消化を、４℃で一晩実行した。ＩＰ／ＭＳ緩衝液１ｍＬの添加時に、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２−アガロース(Sigma-Aldrich)を添加し、免疫沈降を、４℃で１時間行った。ビーズを、ＩＰ／ＭＳ緩衝液（０．１％Ｎ−オクチルグルコシド、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１４０ｍＭ ＮａＣｌ）により３回、並びに水により３回洗浄した。ビーズは、ＩＰ／ＭＳ分析まで、−２０℃で貯蔵した。
ＩＰ／ＭＳ分析は、先に説明したように、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＳＴＲ(Applied Biosystems)を用いて行った。免疫沈降したペプチドを、α−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸で飽和したＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ／水（１：２０：２０）により溶離した。この溶解した試料を、ステンレスプレート上で乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析に供した。
結果及び考察
ＴＲＥＭ２は、最近、後発性アルツハイマー病の発症のリスク増大に結びつけられているＩ型膜貫通糖タンパク質である。図１Ａは、これまでに文献に報告されたＴＲＥＭ２バリアントの概要を提供する。より詳細に生化学的に研究されたバリアントは、Ｉｇ−様ドメインに位置し、且つ明らかに類似の機序を通じてそれらの作用を発揮する（Ｙ３８Ｃ及びＴ６６Ｍなど、Kleinbergerら、2014)。ここで、スタルク領域に位置するバリアントは、エクトドメインシェディングに影響を有するかどうかを調べた。エクトドメイン切断部位を決定することから、開始した。第一の実験において、Ｃ末端側にＦＬＡＧ−タグ付けされたＣ末端断片（ＣＴＦ）を、免疫沈降した。ＣＴＦ濃縮は、インヒビターとしてＤＡＰＴを使用する、γ−セクレターゼ阻害により遂行した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、Ｈｉｓ１５７のＣ末端の切断に対応する単独の突出したピークを明らかにしたのに対し、ＧＭ及びＧＩインヒビター使用するＡＤＡＭ阻害時の質量スペクトルは、予想されたようにピークを示さなかった（図１Ｂ）。第二の独立した実験において、ＴＥＶ−ＦＬＡＧ部位を、スタルク領域に挿入し、且つＮ末端ＦＬＡＧタグを有する短いペプチドを、ＴＥＶ消化時に免疫沈降させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は再度、Ｈｉｓ１５７のＣ末端側エクトドメイン切断に対応する単独の突出したピークを同定し、従って第一の実験からの知見を確認した（図１Ｃ）。重要なことに、追加のプロテアーゼの活性化及び促進されたシェディングに繋がる、１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）による処理時に、主要な代替切断部位は同定されなかった（図１Ｄ）。図１Ｅは、スタルク領域中のエクトドメイン切断部位の位置を示している。
興味深いことに、報告されたＴＲＥＭ２バリアントの中でとりわけ、これまでは、切断部位が正確に位置づけられたもの、すなわちＨ１５７Ｙがある。従ってこのバリアントのＴＲＥＭ２生化学及び機能に与える影響を分析した。図２Ａ、Ｃは、バリアントは、ｓＴＲＥＭ２のレベルを有意に増加することを示している。更に、膜画分のウェスタンブロット定量は、成熟ＴＲＥＭ２が、ＷＴレベルと比べ有意に少ないことを明らかにし（図２Ｂ、Ｄ）、これは、バリアントＨ１５７Ｙのエクトドメインシェディングの増加は、更により顕著であることを示している（図２Ｅ）。定量はまた、ＷＴレベルと比較した場合に、約２倍より多い未熟ＴＲＥＭ２を明らかにしている（図２Ｆ）。予想外のことに、バリアントＨ１５７Ｙに関して、減少したＣＴＦレベルが認められた（図２Ｇ）一方で、シェディングは明確に上昇した。プロテアーゼインヒビター処理実験は、この知見は、より早期の切断、すなわちリソソームのＣＴＦ分解から生じるかどうかを示すであろう。観察された成熟ＴＲＥＭ２レベルの減少（図２Ｄ）と一致して、細胞表面ビオチン化は、ＷＴレベルと比べ、より低いレベルの膜−結合型完全長ＴＲＥＭ２を示した（図２Ｈ）。加えて、細胞−ベースのＥＬＩＳＡにおいて、再度、膜−結合型ＴＲＥＭ２レベルの有意な減少が認められた（図２Ｉ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、ＤＡＰＴを使用するＣＴＦ濃縮時の、Ｙ１５７のＣ末端側切断に対応する、単独の突出したピークを示し、これはエクトドメイン切断は、ＷＴタンパク質における部位と正確に同じ部位で起こることを示している（図２Ｊ）。以下において、膜−結合型完全長ＴＲＥＭ２の低下したレベル及びｓＴＲＥＭ２の増加したレベルの機能上の結果を、貪食アッセイにおいて調べた。大腸菌ｐＨｒｏｄｏの取込みは、ＷＴ ＴＲＥＭ２と比べ、バリアントＨ１５７Ｙの有意に損なわれた貪食活性を明らかにし（図３）、これは、完全長膜−結合型ＴＲＥＭ２は、貪食が生じるために必要であるという見解を裏付けている。
実施例２：ＴＲＥＭ２スタルク領域の二次構造の推測
材料及び方法
ＴＲＥＭ２スタルク領域の二次構造を推測するために、P. Sormanni、C. Camilloni、P. Fariselli及びM. Vendruscoloにより説明されたｓ２Ｄ法を使用した。特に、ｓ２Ｄ法は、タンパク質中の順序付けられた領域及び無秩序とされた領域の統計集団の同時の配列−ベースの推測を基にし、且つSormanniらの文献(76)により詳細に説明されている。
結果及び考察
ＴＲＥＭ２スタルク領域における二次構造集団の推測は、このタンパク質の領域は、特に切断部位のＣ末端で、有意な割合のアルファ−ヘリカル構造を示すことを明らかにしている。従って、アルファ−ヘリックス−介在型タンパク質−タンパク質相互作用（ＴＲＥＭ２−ＡＤＡＭ；ＴＲＥＭ２−ＭＭＰ）を阻害する小型分子は、拘束型アルファ−ヘリカルペプチド、又はそのホットスポット残基、すなわちその相互作用を介在するために必須であるそれらの残基の空間配向を模倣することによりアルファヘリックスのトポグラフィーにマッチするプロテオミメティックのいずれかを設計することにより、設計されてよい。そのようなアプローチは、当該技術分野において公知であり、且つ例えば、Azzarito Vら(34)において検証されている。
ＴＲＥＭ２スタルク領域の二次構造の推測の結果は、図４−６に示している。図４において、エクトドメイン切断部位は、黒色垂直線により示されている。
実施例３： ＴＲＥＭ２切断を阻害するＴＲＥＭ２切断部位に特異性のある抗体
材料及び方法
ＴＲＥＭ２切断部位に対するモノクローナル抗体の作製及び選択
ヒトＴＲＥＭ２アイソフォーム１のアミノ酸ＡＨＶＥＨＳＩＳＲＳ（配列番号：７）を含むペプチドを、合成し、且つＮ末端でオボアルブミン又はビオチン(Peps4LS、ハイデルベルグ、独国)へ結合させた。Ｌｏｕ／ｃラットを、５００μｌ ＰＢＳ中の５０μｇのＯＶＡ−結合ペプチド、５ｎｍｏｌ ＣｐＧ２００６(TIB MOLBIOL、ベルリン、独国)、及び５００μｌ不完全フロイトアジュバントの混合物により、皮下（ｓ．ｃ．）及び腹腔内（ｉ．ｐ．）で免疫化した。６週間後、フロイントアジュバントを含まない追加免疫を、融合前の３日間ｉ．ｐ．及びｓ．ｃ．投与した。骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３のラット免疫脾細胞との融合は、標準手順に従い(Koehler及びMilstein, Nature. 1975, 256:495-497)、ポリエチレングリコール１５００を用いて行った。融合後、これらの細胞を、ＨＡＴ ＨｙｂｒｉＭａｘ培地補充物(Sigma)を補充した、２０％ウシ胎仔血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、ピルビン酸、及び非必須アミノ酸を含むＲＰＭＩ １６４０を用いて９６−ウェルプレート中にプレーティングした。ハイブリドーマ上清を、アビジン−コートされたプレートに結合させたビオチン化されたペプチド（０．２μｇ／ｍｌ）を使用する酵素結合免疫検定において試験した。ＰＢＳ／２％ ＦＣＳによるブロック後、ハイブリドーマ上清を、３０分間添加した。ＰＢＳにより１回洗浄した後、結合した抗体を、４種のラットＩｇＧアイソタイプに対するＨＲＰ−複合ｍＡｂのカクテルにより、検出した。ＨＲＰは、ＴＭＢ基質（１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、Thermo)を使用し、容易に視認した。
ＴＲＥＭ２−反応性上清は、引き続き、ヒト野生型ＴＲＥＭ２を安定して過剰発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞の細胞表面上のＴＲＥＭ２を検出するそれらの能力についてスクリーニングした(Kleinbergerら、2014)。ヒト完全長ＴＲＥＭ２又は空ベクター（＝対照）のいずれかを発現しているＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、９６−ウェル組織培養プレートにおいて培養し、ＰＢＳにより２回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりブロックし、且つ各ＴＲＥＭ２−反応性上清（ブロック緩衝液中に１：２希釈した）と一緒に、氷上で６０分間インキュベーションした。引き続き細胞を、ＰＢＳにより３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで、室温で２０分間固定し、且つＰＢＳにより３回洗浄した。ＴＲＥＭ２−反応性上清の結合は、アイソタイプ−特異的マウス−抗ラット二次抗体を用いて可視化し、引き続きＡｌｅｘａ−４８８(Life Technologies)と結合させたヤギ抗−マウス三次抗体と共にインキュベーションした。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール(Dapi, Life Technologies)を、核対比染色として使用した。画像を、Ｃｙｔａｔｉｏｎマルチ−検出リーダー(Biotek)を用いて自動的に獲得した。
細胞表面上のＴＲＥＭ２に対し選択的に結合することが可能であるＴＲＥＭ２−反応性上清のハイブリドーマ細胞を、限定希釈により、少なくとも２倍でクローニングした。そのＩｇＧサブクラスを、捕獲としてのマウス抗−ラットカッパ軽鎖抗体、及び検出のためのＨＲＰ−結合したマウス抗−ラットＩｇＧサブクラス−特異的抗体による、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。
作製された抗体の一部の可変重鎖及び可変軽鎖のアミノ酸配列のアライメントを、図８に示す。対応する配列はまた、図９にも示す。
エクトドメイン切断部位に特異的な抗体を使用するｗｔ ＴＲＥＭ２を安定して過剰発現しているＨＥＫ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞の処理
１×１０６〜１．５×１０６個細胞を、６−ウェルフォーマットで播種した。２４時間後、新鮮な培地を、これらの細胞に添加した。Dr. Feederle(Helmholtz Center Munich, Core Facility Monoclonal Antibody Development)により作製された抗体クローンを、同時に、すなわち一晩の処理（約２４時間）のために、最終濃度５０μｇ／ｍＬで、添加した。翌日、馴化培地及び細胞を収集し、且つ「馴化培地、細胞溶解液の調製、及び免疫ブロッティング」に説明したように処理した。
ＡＤＡＭ１０インヒビターＧＩ２５４０２３Ｘ（最終濃度５μＭ）及びヒトＴＲＥＭ２のＣ末端に特異的である対照モノクローナル抗体を、各々、陽性対照及び陰性対照として使用した。
ｓＴＲＥＭ２ ＥＬＩＳＡ
細胞培養上清中のｓＴＲＥＭ２のレベルの定量のために、ヒトｓＴＲＥＭ２のためのＥＬＩＳＡを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ２４００を用いて確立した。ストレプトアビジン−コートした９６−ウェルプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を溶媒とする０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ブロック緩衝液）中、４℃で一晩ブロックした。ヒトｓＴＲＥＭ２の検出のために、プレートを、ブロック緩衝液中に希釈したビオチン化されたポリクローナルヤギ抗−ヒトＴＲＥＭ２捕獲抗体（０．２５ｍｇ／ｍｌ；R&D Systems)と共に、室温で、１時間振盪させた。プレートを引き続き、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液）で４回洗浄し、且つプロテアーゼインヒビター(Sigma)を補充した、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を溶媒とする０．２５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（アッセイ緩衝液）中に１：４希釈した試料と共に、室温で２時間インキュベーションした。組換えヒトＴＲＥＭ２タンパク質(Holzel Diagnostika)を、２倍の連続希釈でアッセイ緩衝液中に希釈し、且つ標準曲線に使用した（濃度範囲、４０００〜６２．５ｐｇ／ｍｌ）。プレートを、洗浄緩衝液により５分間、３回洗浄し、その後ブロック緩衝液中に希釈したマウスモノクローナル抗−ＴＲＥＭ２抗体（１ｍｇ／ｍｌ；Santa Cruz Biotechnology；Ｂ−３）と一緒に、室温で１時間インキュベーションした。更に３回の洗浄工程後、プレートを、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ-標識した抗−マウス二次抗体（１：１０００；Meso Scale Discovery)と一緒にインキュベーションし、且つ暗所で１時間インキュベーションした。最後に、プレートを、洗浄緩衝液により３回洗浄し、引き続きＰＢＳ中での２回の洗浄工程とし、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅａｄ緩衝液を添加することにより、呈色させた。電気化学刺激後の620nmでの発光を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ２４００リーダーを用いて測定した。ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞から分泌されたｓＴＲＥＭ２のレベルを定量するために、生物学的複製(biological replicates)からの馴化培地を、２つ組で分析した。ｓＴＲＥＭ２標準曲線を、５−パラメータロジスティックフィットにより、ＭａｓｔｅｒＰｌｅｘ ＲｅａｄｅｒＦｉｔソフトウェア(MiraiBio Group, Hitachi Solutions America)を用いて作製した。ｓＴＲＥＭ２のレベルは引き続き、ウェスタンブロットから定量したように、未熟ＴＲＥＭ２のレベルに対して規準化した。
結果
ＴＲＥＭ２は、細胞膜上に発現され、そのようなものだから貪食及び走化性などのミクログリア機能を媒介する。ミクログリアの貪食活性及び走化活性を促進する細胞外因子は、下流の細胞内シグナル伝達を開始するためにＴＲＥＭ２の細胞外ドメインへ結合することが必要であるので、ミクログリア活性は、細胞表面上の完全長、すなわち未切断の、ＴＲＥＭ２のレベルと相関している。エクトドメイン切断部位は、本明細書において決定されており、且つこれは、切断部位に対し方向づけられたモノクローナル抗体の作製により、エクトドメイン切断を阻害し、且つこれにより細胞表面上の完全長ＴＲＥＭ２のレベルを増加することが可能であると考えられた。これは次に、増強されたＴＲＥＭ２−関連したミクログリア活性を生じる。
第一工程として、ラットを、ヒスチジン１５７とセリン１５８の間に切断部位を持つ十量体ペプチド(153AHVEHSISRS162)（配列番号：７）により免疫化した。以下のように、抗体クローンを、細胞培養実験において、異なる抗体濃度を試験することができるよう、ハイブリドーマ上清から精製する。特にｗｔＴＲＥＭ２を安定して過剰発現しているＨＥＫ細胞を、９種の異なる抗体クローンにより、最終濃度５０μｇ／ｍＬで２４時間処理した。陰性対照として、本発明者らは、ＴＲＥＭ２のＣ末端に結合し且つそのためにエクトドメインシェディングを妨害しないモノクローナル抗体を含んだ。陽性対照として、本発明者らは、切断を強力に阻害することがわかっているＡＤＡＭ１０インヒビターＧＩ２５４０２３Ｘを含んだ(Kleinbergerら, 2014)。順化培地を収集し、異なる抗体クローンのエクトドメイン切断に及ぼす影響を調べるために、免疫ブロッティングに供した（図７Ａ）。
図７Ａの上側ブロットに示されるｓＴＲＥＭ２レベルは、選択された抗体クローンは、エクトドメイン切断の程度を強力に低下することを明確に示している。これは、クローン１４Ｄ３及び１４Ｄ８について特に明白である（ボックスで強調した）。予測され且つ下側ブロットにおいて示されたように、エクトドメイン切断の阻害は、膜画分中の成熟ＴＲＥＭ２のレベルの対応する増加に繋がり、これは、クローン１４Ｄ３及び１４Ｄ８について、ＡＤＡＭ１０インヒビターＧＩ２５４０２３Ｘにより認められる増加よりも高くはなく、同等である。
ウェスタンブロットは、ほとんどの抗体の作用について代表的である、単独の実験の結果のみを示す。各抗体のより堅固な作用を測定するために、本発明者らは次に、先に確立されたｓＴＲＥＭ２ ＥＬＩＳＡを用いる(Kleinbergerら, 2014)、ｓＴＲＥＭ２レベルの定量に移った。図７Ｂは、２つの独立した実験から得られた、未熟ＴＲＥＭ２レベルに規準化されたＥＬＩＳＡデータを示す。本発明者らの免疫ブロットの知見と一致して（図７Ａ）、本発明者らは、抗体クローン１４Ｄ３及び１４Ｄ８を使用し、ｓＴＲＥＭ２の減少したレベルを確定した。注目すべきは、クローン１４Ｄ３は、約７０％だけシェディングを減少したのに対し、ＡＤＡＭ１０インヒビターＧＩ２５４０２３Ｘによる処理は、約６０％だけシェディングを減少した。いくつかの残りの抗体クローン（７Ａ１２、１０Ｃ３、１５Ｃ５、１８Ｆ９、及び２１Ａ３）に関して、本発明者らは、ｓＴＲＥＭ２レベルの減少に向かうわずかな傾向を認めたが、クローン１４Ｄ３及び１４Ｄ８と比べて、余り顕著ではなかった。予想されたように、陰性対照（ヒトＴＲＥＭ２のＣ末端を検出する対照抗体）中のｓＴＲＥＭ２レベルは、未処理細胞の上清と同じ桁であった。
本発明者らはまた、免疫ブロッティングから成熟ＴＲＥＭ２のレベルを定量的に分析した。図７Ｃは、２つの独立した実験から得られた、未熟ＴＲＥＭ２レベルに規準化された膜画分中の成熟ＴＲＥＭ２のレベルを示す。本発明者らは、ｓＴＲＥＭ２の減少と良好に一致するような（図７Ｂ）、抗体クローン１４Ｄ３及び１４Ｄ８に関する膜画分中の成熟ＴＲＥＭ２のレベルの増加を確定した。より詳細には、示されたｓＴＲＥＭ２において最も強力な減少を示したクローン１４Ｄ３は、膜画分中の成熟ＴＲＥＭ２において最強の増加を示した。更に、膜画分中のＴＲＥＭ２の増加したレベルが、クローン７Ａ１２、８Ａ１１、及び１０Ｃ３について、追加的に検出された。予想されたように、試験した全ての条件下でのＧＩ処理は、成熟ＴＲＥＭ２の増大したレベルを生じた。
まとめると、エクトドメインシェディングは、エクトドメイン切断部位に対して方向付けられた本明細書に提供される抗体クローンを用いて、阻害することができると結論づけることができる。特に、クローン１４Ｄ３は、ｓＴＲＥＭ２の約７０％までの減少を生じるのに対し、成熟ＴＲＥＭ２の増加レベルは最大５倍である。クローン１４Ｄ８は、クローン１４Ｄ３と比較すると、同様の結果を生じるが、これは１４Ｄ３もより穏やかであった。
本発明は、以下のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列について言及する：
配列番号：１：ヒトＴＲＥＭ２、膜結合型
>sp|Q9NZC2-1|TREM2_HUMANミエロイド細胞に発現するトリガー受容体2、OS=ホモ・サピエンス、GN=TREM2、PE=1、SV=1
MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT
配列番号：２：ヒトＴＲＥＭ２、選択的スプライシングバリアント（分泌型ＴＲＥＭ２）
ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体2の>sp|Q9NZC2-2|TREM2_HUMANアイソフォーム2、OS=ホモ・サピエンス、GN=TREM2
MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRAERHVKEDDGRKSPGEVPPGTSPACILATWPPGLLVLLWQETTLPEHCFSWTLEAGTG
配列番号：３：ヒトＴＲＥＭ２、選択的スプライシングバリアント（分泌型ＴＲＥＭ２）
ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体2の>sp|Q9NZC2-3|TREM2_HUMANアイソフォーム3、OS=ホモ・サピエンス、GN=TREM2
MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRPSQGSHLPSCLSKEPLGRRNPLPTHFHPSPPGLHLSHQDSSSQRPLGCSLAWTEARDTSTQ
配列番号：４：マウスＴＲＥＭ２、膜結合型
>sp|Q99NH8|TREM2_MOUSEミエロイド細胞に発現するトリガー受容体2、OS=マス・マスキュラス、GN=Trem2、PE=1、SV=1
MGPLHQFLLLLITALSQALNTTVLQGMAGQSLRVSCTYDALKHWGRRKAWCRQLGEEGPCQRVVSTHGVWLLAFLKKRNGSTVIADDTLAGTVTITLKNLQAGDAGLYQCQSLRGREAEVLQKVLVEVLEDPLDDQDAGDLWVPEESSSFEGAQVEHSTSRNQETSFPPTSILLLLACVLLSKFLAASILWAVARGRQKPGTPVVRGLDCGQDAGHQLQILTGPGGT
配列番号：５：マウスＴＲＥＭ２、選択的スプライシングバリアント（分泌型ＴＲＥＭ２）
ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体2の>sp|Q99NH8-2|TREM2_MOUSEアイソフォーム2、OS=マス・マスキュラス、GN=Trem2、
MGPLHQFLLLLITALSQALNTTVLQGMAGQSLRVSCTYDALKHWGRRKAWCRQLGEEGPCQRVVSTHGVWLLAFLKKRNGSTVIADDTLAGTVTITLKNLQAGDAGLYQCQSLRGREAEVLQKVLVEVLEDPLDDQDAGDLWVPEESSSFEGAQVEHSTSRQVSSCGSPLAYHLPPLSKESRDLLPTHLHSSPPGLRSPEQVSCSQHPLGCGQGQAEAGNTCGQRAGLWPRCWAPTSDPHWTRRYVREF
配列番号：６：ラットＴＲＥＭ２
>tr|D3ZZ89|D3ZZ89_RATタンパク質Trem2、OS=ラッタス・ノルビジカス、GN=Trem2、PE=4、SV=1
MEPLHVFVLLLVTELSQALNTTVLQGVAGQSLRVSCTYDALRHWGRRKAWCRQLAEEGPCQRVVSTHGVWLLAFLRKQNGSTVITDDTLAGTVTITLRNLQAGDAGLYQCQSLRGREAEVLQKVVVEVLEDPLDDQDAGDLWVPEESESFEGAQVEHSTSSQVSSCGSPLTYHLPPKEPIRKDLLPTHFHSSPPGLCPPEQASYSQHPLGCGQGQAEAGDTCGQWARL
配列番号：７：ヒトＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
AHVEHSISRS
配列番号：８：ヒトＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
EDAHVEH
配列番号：９：ヒトＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
SISRSL
配列番号：１０：マウスＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
AQVEHSTSRN
配列番号：１１：マウスＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
EGAQVEH
配列番号：１２：マウスＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
STSRNQ
配列番号：１３：ラットＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
AQVEHSTSSQ
配列番号：１４：ラットＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
EGAQVEH
配列番号：１５：ラットＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
STSSQV
配列番号：１６：ＡＤＡＭ１０の最小切断部位が推定され得るヒトＴＲＥＭ２内のアミノ酸部分配列
GESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTS
配列番号：１７：ヒトＴＲＥＭ２のエクトドメイン
MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTS
配列番号：１８：マウスＴＲＥＭ２のエクトドメイン
MGPLHQFLLLLITALSQALNTTVLQGMAGQSLRVSCTYDALKHWGRRKAWCRQLGEEGPCQRVVSTHGVWLLAFLKKRNGSTVIADDTLAGTVTITLKNLQAGDAGLYQCQSLRGREAEVLQKVLVEVLEDPLDDQDAGDLWVPEESSSFEGAQVEHSTSRNQETSFPPTS
配列番号：１９：ヒトＴＲＥＭ２の細胞内ドメイン
AAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT
配列番号：２０：マウスＴＲＥＭ２の細胞内ドメイン
VARGRQKPGTPVVRGLDCGQDAGHQLQILTGPGGT
配列番号：２１：ヒトＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
GESESFEDAHV
配列番号：２２：マウスＴＲＥＭ２に対する抗体作製のための免疫化に使用されたペプチド
EHSTSRNQETSFP
更なる配列を、図９に示している。

Claims (15)

  1. ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）のエクトドメイン内の結合部位を有する結合分子であって、ここで該結合分子が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する、結合分子。
  2. 前記結合部位が、以下からなる群から選択される、ヒト膜結合型ＴＲＥＭ２の少なくとも１つの位置を含む、請求項１記載の結合分子：
    １５７位のヒスチジン（Ｈｉｓ１５７）；
    １４８位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１４８）；
    １４９位のセリン（Ｓｅｒ１４９）；
    １５０位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ１５０）；
    １５１位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５１）；
    １５２位のアスパラギン酸（Ａｓｐ１５２）；
    １５３位のアラニン（Ａｌａ１５３）；
    １５４位のヒスチジン（Ｈｉｓ１５４）；
    １５５位のバリン（Ｖａｌ１５５）；
    １５６位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１５６）；
    １５８位のセリン（Ｓｅｒ１５８）；
    １５９位のイソロイシン（Ｉｌｅ１５９）；
    １６０位のセリン（Ｓｅｒ１６０）；
    １６１位のアルギニン（Ａｒｇ１６１）；
    １６２位のセリン（Ｓｅｒ１６２）；
    １６３位のロイシン（Ｌｅｕ１６３）；
    １６４位のロイシン（Ｌｅｕ１６４）；
    １６５位のグルタミン酸（Ｇｌｕ１６５）；及び
    １６６位のグリシン（Ｇｌｙ１６６）。
  3. 前記結合部位が、配列番号：７−１５、２１及び２２のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれか一つを含む又はこれと重複している、請求項１又は２記載の結合分子。
  4. 前記結合分子が、切断酵素のＴＲＥＭ２へのアクセスを阻害することにより、ＴＲＥＭ２切断を阻害し、ここでこの切断酵素が、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、又はマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である、請求項１〜３のいずれか一項記載の結合分子。
  5. 前記結合分子が、ミクログリア細胞の活性及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の活性を保持及び／又は刺激する、請求項１〜４のいずれか一項記載の結合分子。
  6. 前記ミクログリア細胞及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の活性が、貪食活性、遊走、カルシウムシグナル伝達、Ｓｙｋ活性化、増殖、炎症性サイトカイン産生及び／又は生存の調節である、請求項５記載の結合分子。
  7. 前記結合分子が：
    （ｉ）抗体が、モノクローナル抗体であってよく；及び／又は、抗体は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ハムスター抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、フェレット抗体、ニワトリ抗体、ヒツジ抗体、もしくはサル抗体、キメラ抗体、及び二重特異性抗体からなる群から選択される抗体であってよい：抗体；
    （ｉｉ）抗体断片が、ナノボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、もしくは単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び／又は、ヒト化抗体断片、完全ヒト抗体断片、マウス抗体断片、ラット抗体断片、ウサギ抗体断片、ハムスター抗体断片、ヤギ抗体断片、モルモット抗体断片、フェレット抗体断片、ニワトリ抗体断片、ヒツジ抗体断片、及びサル抗体断片からなる群から選択される抗体断片であってよい：抗体断片；或いは
    （ｉｉｉ）小型分子：である、請求項１〜６のいずれか一項記載の結合分子。
  8. 前記抗体が：
    （１）重鎖可変領域が、配列番号：３２の配列を含み、及び軽鎖可変領域が、配列番号：４２の配列を含み；並びに、ここで抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する；抗体；
    （２）重鎖可変領域が、配列番号：３２と少なくとも８５％同一性を有する配列を含み、及び軽鎖可変領域が、配列番号：４２と少なくとも８５％同一性を有する配列を含み；並びに、ここで抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する；抗体；
    （３）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５２のアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６２のアミノ酸配列を含み；及び、重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７２のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８２のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９２のアミノ酸配列を含み；及び、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１０２のアミノ酸配列を含み；並びに、ここで抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する；抗体；或いは
    （４）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：５２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：６２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：７２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号：８２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号：９２と少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；及び、軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号：１０２と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；並びに、ここで抗体が、ＴＲＥＭ２切断を阻害する；抗体：のいずれか一つである、請求項７記載の結合分子。
  9. 前記ＴＲＥＭ２が、
    （ｉ）配列番号：１−６のいずれか一つのアミノ酸配列；又は
    （ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列：を含むか又はこれらからなるポリペプチドであり、ここでこのポリペプチドが、ミクログリア細胞及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の適切な貪食、遊走、及び／又は生存を促進する活性を有するものである、請求項１〜８のいずれか一項記載の結合分子。
  10. 前記ＴＲＥＭ２のエクトドメインが、
    （ｉ）配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列；もしくは、
    （ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列：を含むか又はこれらからなるポリペプチドであって、ここでＴＲＥＭ２の細胞内ドメインと一緒にされた場合、このポリペプチドが、ミクログリア細胞及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の適切な貪食、遊走、及び／又は生存を促進する活性を有するものである、請求項１〜９のいずれか一項記載の結合分子。
  11. 前記ＴＲＥＭ２の細胞内ドメインが、
    （ｉ）配列番号：１９又は２０のアミノ酸配列；もしくは、
    （ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列：を含むか又はこれらからなるポリペプチドであって、ここでＴＲＥＭ２のエクトドメインと一緒にされた場合、このポリペプチドが、ミクログリア細胞及び／又は他のＴＲＥＭ２発現細胞の適切な貪食、遊走、及び／又は生存を促進する活性を有するものである、請求項１０記載の結合分子。
  12. 神経障害の治療及び／又は予防に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項記載の結合分子。
  13. 神経障害の治療及び／又は予防に使用するための医薬組成物であって、ここでこの医薬組成物が：
    （ｉ）請求項１〜１１のいずれか一項記載の結合分子；及び
    （ｉｉ）任意に医薬として許容し得る担体：を含有する、医薬組成物。
  14. 前記神経障害が、神経変性障害である、請求項１２記載の使用のための結合分子、請求項１３記載の使用のための医薬組成物。
  15. 前記神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ＦＴＬＤ−様症候群、パーキンソン病、那須ハコラ病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、免疫−媒介型神経障害、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１４記載の使用のための結合分子、請求項１４記載の使用のための医薬組成物。
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