JP2019526245A - 巨核球組成物の製造および血小板減少症の処置のための療法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、2016年12月2日に出願された米国仮特許出願第62/429,501号、および参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、2016年8月4日に出願された米国仮特許出願第62/371,024号に基づく優先権を主張する。
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)によって授与された助成金番号R41HL130754の下で政府の支援を受けて成された。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明の分野は、巨核球(MK)組成物の製造およびMK組成物による血小板減少症の処置のための療法である。
血小板減少症は、血中血小板の欠乏(低血小板数)を特徴とする、まれであるが、しばしば重篤な状態である。正常な血小板数は、循環血液1マイクロリットル(μL)当たり150,000〜450,000血小板(PTL)である。血小板減少症は、血小板数が何らかの理由で正常値を下回った時に起こる。脳内出血を含む内出血を引き起こし得る、血小板数が10,000 PTL/μLを下回った時のような、まれな症例においては、血小板減少症は生命を脅かし得る。血小板減少症の最も一般的な症状には、容易なもしくは過剰の皮下出血、表在性もしくは遷延性の出血、および/または点状出血が含まれ、より重篤な症例においては、血尿および/もしくは血便、疲労、黄疸、または脾腫が含まれる。米国における血小板減少症の推定有病率は、100,000人におよそ9.5人であり、子供および成人の両方に影響している。血小板減少症は、しばしば、肝疾患(最も一般的な原因)、免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)、骨髄障害、腎不全、妊娠、化学療法によるもののような薬物誘発性血小板減少症、身体的外傷、アルコール中毒および/または重度のアルコール摂取、白血病を含むがんおよび悪性疾患、ならびにHIVまたはC型肝炎のような感染のような別の障害の結果として起こる。現在、血小板減少症のための大部分の処置は、結果として起こる低血小板数が修正されることを期待して、基礎をなす原因の処置に焦点を当てている。重篤な症例において、処置は、血液または血小板の輸血を含む場合がある。しかしながら、基礎をなす原因を処置することに未だ焦点が置かれているにも関わらず、血液および血小板の輸血は、循環血中血小板の一時的な増加しか提供せず、ボランティアドナーに依存しているため、これらの処置は、健常で有効な血小板が患者の血中で再増幅することを可能にする解決策を提供しない。造血幹細胞(HSC)増殖を使用したいくつかの実験的処置が出現しているが、それらは、エクスビボで生成された生成物の臨床的な価値に関して、限定された成功しか収めていない。血小板輸血不応状態およびヒト白血球抗原(HLA)クラスI抗体に対する同種免疫は、別の重大な臨床的懸念である。従って、血小板細胞が患者の血中で再増殖することを可能にする、血小板減少症の処置のためのドナー非依存性の細胞治療が必要とされている。さらに、エクスビボでの大規模な血小板製造が高コストであること、血小板が長期保存、例えば、凍結保存に耐えられないことが、培養物に由来する血小板の臨床移行をさらに困難にしている。従って、さらに、治療用組成物の長期保存を可能にする、血小板減少症の処置のためのドナー非依存性の細胞治療が必要とされている。
いくつかの態様において、本発明は、巨核球生成物を生成する方法に関する。いくつかの態様において、方法は、第1の培地において造血幹細胞(HSC)を含む細胞の集団を培養する第1の工程を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、少なくとも1種のサイトカインを含む。いくつかの態様において、第1の培地は、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン3(IL-3)、Fms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、トロンボポエチン(TPO)、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、幹細胞因子(SCF)を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、インターロイキン3(IL-3)を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、トロンボポエチン(TPO)を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、幹細胞因子(SCF)を含まない。いくつかの態様において、第1の培地は、インターロイキン3(IL-3)を含まない。いくつかの態様において、第1の培地は、トロンボポエチン(TPO)を含まない。いくつかの態様において、第1の培地は、無血清(SF)培地である。
血小板産生または血小板生成は、骨髄(BM)造血幹細胞(HSC)が、巨核球(MK)前駆細胞を生じ、それが、まず増殖し、系統特異的マーカーを獲得し、次いで、倍数体巨核球(即ち、二倍体2Nを超えた染色体組の複製)になる、独特の過程の最終結果である。細胞は、さらなる細胞質成熟および血小板前駆細胞伸長を受け、最終的に、血小板を循環中へ排出する。このインビボでの血小板放出は、骨髄微小環境内の内因的因子(例えば、細胞骨格変化)ならびに外因的因子(例えば、細胞間接触、可溶性因子、および剪断応力)の両方に依存する、高度に効率的な事象である。この高度に複雑な過程は、エクスビボで再現するのが非常に困難であり、それが、臨床的に生存可能な血小板をエクスビボで、例えば、組織培養フラスコにおいて作製する際の主要な障害となっている。理論によって拘束されることは望まないが、この分化過程の正確な再現が困難であることが、エクスビボ造血幹細胞増殖を使用した以前の処置が、限定された成功しか収めていない理由である。インビトロでは、巨核球の極めて小さい割合のみが血小板を排出することができ、培養された巨核球によって産生される血小板の数は、インビボでの率に決してかなわない。さらに、エクスビボでの血小板の産生は、一般に、極めて高コストの手段であり、血小板は、長期保存条件、例えば、凍結保存の下で十分に保存されない。
以下の実施例は、インビトロの臍帯血(CB)CD34+細胞の増殖および巨核球(MK)への分化、結果として得られたMK生成物の凍結保存、ならびに増殖/分化を介して生成されたMK生成物のインビボの輸血に関する。細胞培養条件が列挙される場合、下記表5に対応する、付随する識別番号、例えば、CC#1が提供される。実施例において列挙された異なる細胞培養条件から入手されたCD41+MKの全体収量は、サイトカイン単独の存在下で増殖させたインプットCD34+細胞については細胞1個当たり8〜33 MK、サイトカイン+VPAの存在下で増殖させたインプットCD34+細胞については細胞1個当たり9〜34 MKの範囲であった。1 CBUから2×106個ものCD34+細胞が単離され得るとすれば、理論によって拘束されることは望まないが、インプットCD34+細胞1個当たり28 MK以上を与える培養物は、56×106 MKまたは80kgのレシピエントへ注入するための7×105 MK/kgに相当する量を超える量を生成すると予想される。
臍帯血(CB)CD34+細胞を入手し、試験群と対照群とに分離した。群を、以下の細胞培養プロトコルに供した。
0日目:CB CD34+細胞を、サイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した(試験群のみ)。対照群にはVPAを添加しなかった。
2〜8日目:細胞を、SF培養物中で増殖させ、7日目に収集した。全CD34+細胞増殖は、およそ200倍であった。
臍帯血(CB)CD34+細胞を入手した。群を、以下の細胞培養プロトコルに供した。
0日目:CD34+細胞をトロンボポエチン(TPO)を含む幹細胞因子(SCF)培地に播種した。
1〜7日目:細胞を培養物中で増殖させた。
7日目:細胞をトロンボポエチン(TPO)を含む無血清(SF)培地に再播種した。
8〜4日目:細胞を巨核球生成物へ分化させた。
14日目:細胞を収集し、定量し、特徴決定した。全CD41+巨核球増殖はおよそ3〜15倍であった。
バルプロ酸(VPA)への曝露が、巨核球(MK)にコミットされ分化する臍帯血(CB)CD34+細胞の能力に影響しないことを確かめるため、トロンボポエチン(TPO)によって媒介されるMKの分化および成熟に対するVPAの効果を試験した。このため、50,000個の凍結保存されたCB CD34+細胞を、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン3(IL-3)、Fms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、およびTPOが補足された無血清(SF)培地に播種し、前記実施例1に記載されたように、VPAの存在下または非存在下(試験対対照)で増殖させた。7日後に、収集する代わりに、VPAおよびサイトカインを除去するため、細胞を洗浄し、TPOのみが補足されたSF培地に再播種した。VPAによって増殖させた培養物においては、サイトカインのみによって増殖させた培養物より、およそ50%多いCD41+MKが検出された(図3A)。これは、VPAの存在下で播種されたCD34+細胞1個から生成されたおよそ40 MKという最終収量に相当し、それに対して、VPAの非存在下で播種されたCD34+細胞1個によって生成されたCD41+MKは、およそ5であった。q-PCR分析は、MK分化前にVPAに曝された培養物におけるMK特異的遺伝子(GATA1、PF4、およびNFE2)のアップレギュレーションを確認した(図3B)。これらの結果は、MK分化前のVPA曝露が、MKの最終収量を改善することを証明している。
臍帯血(CB)CD34+細胞を入手し、以下の処理(CC#15)に供した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜5日目:細胞をSF培養中で増殖させた。
5〜12日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種し、12日目に収集した。
臍帯血(CB)CD34+細胞を入手し、以下の処理に供した。
処理1:(CC#11)
0〜5日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。細胞を培養物中で増殖させた。
5〜8日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。細胞を培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
0〜5日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。細胞を培養物中で増殖させた。
5〜8日目:細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。細胞を培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜5日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
5〜8日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
8〜12日目:細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜5日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
5〜8日目:細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
8〜12日目:細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含む1/2体積のStemline培地に再播種した。
A. 臍帯血(CB)CD34+細胞を入手し、様々な培養プロトコル(本明細書中に記載されるCC#5、CC#15、CC#16、およびCC#17)に供した。結果として得られた分化巨核球生成物から、CD61+巨核球(MK)を免疫磁気的に精製した。CD61+MKを、未精製の不均一巨核球(MK)生成物と共に3ヶ月間凍結保存した。次いで、精製CD61+MKおよび不均一MK生成物を解凍し、表現型について評価した。精製CD61+MKについての結果は、下記表1に示され、不均一MK生成物の結果は、下記表2に示される。
臍帯血(CB)CD34+細胞を入手し、以下の処理に供する。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のIL-3、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含む無血清(SF)培養物に播種する。1日目:1mMバルプロ酸(VPA)および50ng/mL IL-6をSF培養物に添加する。
1〜7日目:細胞をSF培養物中で増殖させる。
7日目:細胞を10ng/mL〜150ng/mLの範囲の量のSCFおよび100ng/mLの量のTPOを含むSF培地に再播種する。
7〜10日:細胞を増殖させ、分化させる。
10日目:細胞を100ng/mLの量のTPOを含むSF培地に再播種する。
10〜14日目:細胞を分化させる。
14日目:細胞を収集し、定量し、特徴決定する。
エクスビボで生成されたMKの、免疫低下NSGマウスへの注入後にインビボで血小板を生成する能力を調査した。最初に、新鮮なヒト多血小板血漿をレシピエント動物へ注入し、注入の約1時間後〜5日後、マウス末梢血(mPB)中のヒトPTLの存在を査定した(図8A)。ヒトCD41標識とカップリングされた、ヒトPTLのサイズおよび光散乱特性を、MK培養物注入後のmPB中のヒトPTLの検出のための陽性対照として使用した。MK培養物をエクスビボで生成し、採集し、定量し、表現型的に評価し、4つの異なる実験群に注入した:基本MK培養系(0〜7日目、100ng/ml SCFおよび50ng/ml TPOを含むSF QBSF培地、その後、8〜10日目、50ng/ml TPOのみを含むSF QBSF培地)(Iancu-Rubin et al. Blood 2011,Exp Hematol 2012 and 2014,Leukemia 2017)において生成されたMK集団を受容した第1の群;サイトカイン単独の存在下で生成されたMK(CC#10)を受容した第2の群;サイトカイン+VPAの存在下で生成されたMK(CC#16)を受容した第3の群;および新たに精製されたCD61+MKを受容した第4の群。これらの3つの群において注入されたMK培養物(CC#16)は、不均一MK集団を含み、注入された細胞の総数は約60万〜約500万と変動した(下記表3参照)。図8に例示されるように、エクスビボで生成されたMK生成物の注入によって、NSGレシピエントマウスのmPBにhPTLが検出可能となり、マウス骨髄(mBM)にCD41+細胞が検出可能となった。
臍帯血(CB)に由来するCD34+HSCを、バルプロ酸(VPA)の非存在下または存在下で4日間または7日間増殖させ、次いで、様々なサイトカインカクテルを利用した条件において巨核球(MK)の分化および成熟に向けて誘導した。VPAなしの細胞培養条件(「サイトカイン単独」)は、本明細書中に記載されるCC#1〜4、9〜14を含み、VPAを含むもの(「サイトカイン+VPA」)は、本明細書中に記載されるCC#5〜8、15〜20を含む。両方の細胞培養物群におけるMK収量の平均値±標準偏差(SD)は、下記表4に表される。代表的なフローサイトメトリー分析が、図9A(サイトカインのみのCC#11)および9B(サイトカイン+VPAのCC#17)に表される。「サイトカイン単独」および「サイトカイン+VPA」について共通の時点(8日目)で採取されたCFUの代表的な数が、図10に表される。
以下の付加的な細胞培養プロトコルを、臍帯血(CB)CD34+細胞に対して実施した。
処理1:(CC#1)
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞を100ng mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng mL TPOを含むQBSF培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞を100ng mL TPOのみを含むQBSF培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むQBSF培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目:細胞は、100ng/mL TPOのみを含むQBSF培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0〜5日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。細胞を、SF培養物中で増殖させた。
5〜12日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0〜5日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。細胞を、SF培養物中で増殖させた。
5〜8日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。細胞を増殖させた。
8〜12日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含む1/2体積のStemline培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0〜5日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。細胞をSF培養物中で増殖させた。
5〜12日目:細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0〜5日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。細胞をSF培養物中で増殖させた。
5〜8日目:細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。細胞を増殖させた。
8〜12日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含む1/2体積のStemline培地に再播種した。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜5日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
5日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
5〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8日目:細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含む1/2体積のStemline培地に再播種した。
8〜12日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜5日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
5日目:細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
5〜12日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
12日目:細胞を収集した。
0日目:CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清(SF)培養物(Stemline培地)に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子(SCF)、50ng/mLの量のインターロイキン3(IL-3)、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、および100ng/mLの量のトロンボポエチン(TPO)を含んでいた。
1日目:1mMバルプロ酸(VPA)をSF培養物に添加した。
1〜5日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
5日目:細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
5〜8日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
8日目:細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
8〜12日目:細胞をSF培養物中で増殖させた。
12日目:細胞を収集した。
Claims (20)
- 以下の工程を含む、巨核球(MK)生成物を作製する方法:
(i)少なくとも1種のサイトカインを含む第1の培地において造血幹細胞(HSC)を含む細胞の集団を培養し、約24時間〜約96時間、細胞の集団を一次増殖させる工程、
(ii)少なくとも1種のサイトカインを含む第2の培地において細胞の集団を培養し、約24時間〜約96時間、細胞の集団を二次増殖させる工程であって、第2の培地における細胞の集団の培養が巨核球生成物発達バイアスを誘導する、工程、および
(iii)結果として得られた巨核球生成物を収集する工程。 - (iii)の収集工程の前に実施される、
少なくとも1種のサイトカインを含む第3の培地において細胞の集団を培養し、約72時間〜約120時間、細胞の集団を三次増殖させる工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - (ii)の工程がクロマチン修飾剤の培地への添加をさらに含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- クロマチン修飾剤がバルプロ酸(VPA)を含む、請求項3に記載の方法。
- 造血幹細胞を含む細胞の集団が、臍帯血(CB)、骨髄(BM)、末梢血(PB)、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の培地が、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン3(IL-3)、Fms様チロシンキナーゼ3(FLT-3)、トロンボポエチン(TPO)、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の培地が、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 第3の培地がトロンボポエチンを含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の培地、第2の培地、および第3の培地のうちの少なくとも一つが、無血清(SF)培養物である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(ii)が少なくとも1種の付加的なサイトカインの添加をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種の付加的なサイトカインがインターロイキン6(IL-6)を含む、請求項10に記載の方法。
- 巨核球生成物が、巨核球前駆細胞、未熟巨核球、成熟巨核球、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 巨核球前駆細胞、未熟巨核球、および成熟巨核球を含む巨核球生成物であって、該組成物が凍結保存されている、巨核球生成物。
- 請求項1〜12のいずれか一項によってエクスビボで生成された巨核球生成物を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象において血小板減少症を処置する方法。
- 巨核球生成物が、巨核球前駆細胞、未熟巨核球、および成熟巨核球の不均一な集団である、請求項14に記載の方法。
- 巨核球生成物が対象への投与の前に凍結保存される、請求項14〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 巨核球前駆細胞、未熟巨核球、および成熟巨核球と、薬学的に許容される担体または保存剤とを含む、巨核球生成物。
- 治療的に有効な量の請求項17に記載の組成物を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象において血小板減少症を処置する方法。
- その必要のある対象における血小板減少症の処置において使用するための、請求項17に記載の組成物。
- その必要のある対象における血小板減少症の処置のための医薬の製造における、請求項17に記載の組成物の使用。
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