KR20220020277A - 확장된 줄기 세포 생성물을 사용하여 혈액 악성종양을 갖는 환자에 대한 치료 결과를 개선시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

확장된 줄기 세포 생성물을 사용하여 혈액 악성종양을 갖는 환자에 대한 치료 결과를 개선시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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데베라 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

본 발명은 화학치료 요법과 조합하여 확장된 조혈 줄기 세포 생성물로 혈액 악성종양을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

확장된 줄기 세포 생성물을 사용하여 혈액 악성종양을 갖는 환자에 대한 치료 결과를 개선시키기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/849,588, 및 2019년 5월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/852,147의 우선권을 주장하며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 또 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자의 치료 결과를 개선시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 확장된 줄기 세포 생성물은 제대혈 단위의 HLA-유형을 서로에 또는 환자의 HLA-유형에 매칭시키지 않고 (즉, 그와 관계 없이) 조합된 (예를 들어, 풀링된) 다수의 공여자로부터 유래된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함한다. 확장된 줄기 세포 생성물은 다양한 강도의 화학치료 요법, 예컨대 유도 요법, 구제 요법 또는 강화 요법 후에 투여될 수 있다.
급성 골수성 백혈병 (AML)은 성인 급성 백혈병의 선두적인 원인이며, 모든 성인 백혈병의 대다수를 차지한다. 광범위한 연구에도 불구하고, AML은 낮은 장기 생존과 연관되며; 5-년 전체 생존율은 모든 환자 (SEER)에 대해 약 28.3% 및 20세 이상의 환자에 대해 약 24%이다. 대조적으로 20세 미만의 환자에 대해, 5-년 전체 생존율은 약 67%이다. 통상적인 화학치료는 일부 AML 환자에서 질환의 초기 완화를 효과적으로 달성할 수 있다. 그러나, 질환의 고도로 불균일한 성질로 인해, AML 환자의 약 30%는 화학치료에 반응하지 않는다. 화학치료는 대부분의 환자에서 질환의 완전한 제거를 달성하는데 실패하며, 완화 중인 환자의 70% 초과는 초기 치료 후 2년 내에 AML의 재발을 겪는다.
불량한 예후와 연관된 재발성 AML을 갖는 환자에 대한 표준 치료 요법은 현재 없다. 재발성 AML은 화학치료에 대한 저항성을 갖는 AML 세포 집단에 의해 매개되는 최소 잔존 질환 (MRD)으로 지칭되는 현상에 의해 유발될 수 있다. MRD는 백혈병 줄기 세포 (LSC) 집단에 의해 매개되는 것으로 제안되어 있는데, 이는 이 세포 집단이 화학치료 및 다른 치료를 견디는 능력을 갖기 때문이다. 따라서, AML을 표적화하고 MRD를 다루어 질환의 무재발 제거를 달성하는 치료의 개발은 연구의 활발한 영역이 되었다.
동종이형 조혈 줄기 세포 이식 (알로-HSCT)은 AML 환자에 대한 치유적 치료 선택안으로서 조사되었으며, 통상적인 화학치료보다 더 높은 무질환 생존율과 연관되었다. 이들 이식편은 통상적으로 골수, 말초 혈액, 및/또는 제대혈로부터 유래되며, 특히, 말초 혈액 이식편에 관하여 예를 들어, GM-CSF를 투여함으로써 공여자에서의 줄기 세포 동원에 이어진다. 이식편의 세포는 줄기 세포, 적혈구, T 세포, NK 세포 등을 포함한 백혈구, 및 혈소판을 포함한 혈액 및 면역 세포의 이종 믹스이다. 조혈 줄기 세포는 조혈 줄기 세포 이식편의 매우 소수의 세포, 일반적으로 총 세포 집단의 1% 미만을 포함한다. 공여자-유래 T 세포 매개 항-백혈병 효과는 환자에서 증가된 생존에 기여하는데, 이는 자가 및 T 세포 고갈된 이식편이 보다 높은 재발률과 연관된 것으로 보고되었기 때문이다. 임상에서 알로-HSCT의 사용은 적합하게 HLA-매칭된 공여자의 부족에 의해 제한되었으며, 독성 및 다른 연관된 합병증과 연관되었다. 면역 반응은 정상 조직 손상 (예를 들어, 이식편-대-숙주 질환 (GVHD))을 유발하는 것으로 보고되었다.
미세-이식편 (비-생착 줄기 세포 이식편의 주입) 및/또는 비-생착 공여자 림프구 주입은 AML 환자에 대한 잠재적 치유적 치료로서 조사되었다. 단일 공여자로부터의 동원된 PBSC의 비관련된 공여자 미스매칭된 미세이식은 환자에게 일부 이익을 제공하는 것으로 보고되었지만, 환자는 재발되었다. (Punwani et al., 2018, Leuk. Res. Rep. 9:18-20.) HLA-미스매칭된 동종이형 세포 치료는 또한 부분적으로 매칭된 동원된 말초 혈액 세포를 사용한 AML의 치료에 대해 조사되었다. (Mohrbacher et al., 2014, Blood 124:5944.) 8명의 환자 중 5명은 완전한 완화/3 내지 10+개월 지속되는 불완전한 혈액학적 회복을 갖는 완화 (CR/Cri)를 달성한 것으로 보고되었지만, 저자들은 이식편의 부분적 매칭에도 불구하고, 반응이 기대한 것만큼 내구성 있지 않았음을 보고하였다.
따라서, AML, 및 다른 혈액 악성종양을 표적화하여 질환의 무재발 제거를 달성하는 치료의 개발에 대한 필요가 남아 있다. 또한, 재발성/난치성 AML, 새로 발생한 AML, 및 치료-관련 AML을 포함한 AML, 뿐만 아니라 다른 혈액 악성종양, 예컨대 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 신생물 (MPN) 및 비-호지킨 림프종 (NHL)을 갖는 환자에 대한 기존의 치료 요법을 사용하여 보다 적은 독성 치료를 개발하고 치료 결과를 개선시킬 필요가 관련 기술분야에 남아 있다.
요약
이 요약은 상세한 설명에서 하기 추가로 기재된 단순화된 형태의 개념의 선택을 도입하기 위해 제공된다. 이 요약은 청구된 요지의 핵심적 특색을 확인하는 것으로 의도되지 않으며, 청구된 요지의 범주를 결정하는데 있어서 보조로서 사용될 것으로 의도되지도 않는다.
본 발명은 화학치료 요법, 또는 그의 사이클을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하고, 이어서 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 환자에게 투여함으로써 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자에 대한 치료 결과를 개선시키는 방법이며, 여기서 투여는 확장된 줄기 세포 생성물의 HLA-유형을 환자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 수행되는 것인 방법을 제공한다. 확장된 줄기 세포 생성물은 적어도 2명의 인간 공여자로부터의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 풀링으로부터 유래된 세포-기반 생성물이고, 여기서 공여자로부터의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 다른 공여자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 및 환자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 조합된다. 확장된 줄기 세포 생성물은 T 세포 및 적혈구가 고갈된다.
또한, (a) AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 인간 환자에의 투여를 위한 확장된 조혈 줄기 세포 생성물을 선택하는 단계이며, 여기서 선택은 확장된 줄기 세포 생성물의 HLA-유형 또는 환자의 HLA-유형을 고려하지 않는 (즉, 매칭시키지 않는) 것인 단계; (b) 화학치료 요법, 또는 그의 사이클을 환자에게 투여하는 단계; 및 (c) 선택된 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 인간 환자에 대한 치료 결과를 개선시키는 방법이 제공된다. 확장된 줄기 세포 생성물은 적어도 2명의 인간 공여자로부터의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 풀링으로부터 유래된 세포 기반 생성물이고, 여기서 공여자로부터의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 다른 공여자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 및 환자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 풀링된다. 상기와 같이, 확장된 줄기 세포 생성물은 T 세포 및 적혈구가 고갈된다.
본 발명은 또한 화학치료 요법, 또는 그의 사이클을 환자에게 투여하고, 이어서 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자에게 투여함으로써 AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자를 치료하는 방법이며, 여기서 투여는 확장된 줄기 세포 생성물의 HLA-유형을 환자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 수행되는 것인 방법을 제공한다. 확장된 줄기 세포 생성물은 적어도 2명의 인간 공여자로부터의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 풀링으로부터 유래된 세포-기반 생성물이고, 여기서 공여자로부터의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 다른 공여자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 및 환자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 풀링된다. 상기와 같이, 확장된 줄기 세포 생성물은 T 세포 및 적혈구가 고갈된다.
특정 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량은 약 5천만 내지 약 4억개의 생존 CD34+ 세포를 함유한다. 특정 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량은 약 5천만, 약 7천5백만, 약 1억, 약 2억, 약 3억, 또는 약 4억개의 생존 CD34+ 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 "기성품" 생성물로서 나중에 사용하기 위해 제조되고, 동결보존되고, 저장된다. 동결보존된 확장된 줄기 세포 생성물은 환자에게 투여하기 전에 해동된다.
확장된 줄기 세포 생성물은 적어도 2개의 확장된 조혈 줄기 세포 집단 및/또는 적어도 2개의 확장된 조혈 줄기 및 전구 세포 집단의 풀이고, 여기서 각각의 세포 집단은 별개의 공여자로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 각각의 세포 집단은 별개의 제대혈 단위 또는 태반 혈액 단위로부터 (즉, 출생시 상이한 인간으로부터) 얻어진다. 풀 중의 적어도 2개의 세포 집단의 HLA-유형은 서로에 HLA-매칭되지 않는다. 임의로, 확장된 줄기 세포 생성물은 확장 전에 풀링된 2개 이상의 조혈 줄기 세포 집단 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단의 풀이며, 풀은 이어서 확장되거나, 세포 집단은 확장 후에 풀링된다. 임의로, 확장된 줄기 세포 생성물은 확장 전에 풀링된 2개 이상의 인간 제대혈 또는 태반 혈액 줄기 세포 집단 또는 줄기 및 전구 세포 집단의 풀이며, 풀은 이어서 확장되거나, 세포 집단은 확장 후에 풀링된다. 한 실시양태에서, 풀 중의 세포 집단은 모두 동일한 인종, 예를 들어, 아프리카-미국인, 백인, 아시아인, 히스패닉계, 미국 원주민, 호주 원주민, 이뉴잇족, 태평양 섬주민의 개체의 제대혈 및/또는 태반 혈액으로부터 유래되거나, 모두 동일한 민족, 예를 들어, 아일랜드인, 이탈리아인, 인도인, 일본인, 중국인, 러시아인 등의 개체의 제대혈 및/또는 태반 혈액으로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 풀 중의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 인종 또는 민족과 무관하게 조합된다.
추가의 또 다른 실시양태에서, AML 또는 또 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자에 대한 치료 결과를 개선시키는 방법은 상기 투여 전에, 출생시 적어도 2명의 인간의 제대혈 및/또는 태반 혈액로부터 얻어진, 단리된 인간 제대혈 줄기 세포, 또는 줄기 및 전구 세포를 생체외에서 확장시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 확장 단계는 인간 제대혈 줄기 세포, 또는 줄기 및 전구 세포를 노치(Notch) 기능의 효능제와 접촉시키는 것을 포함한다. 효능제는 델타 단백질 또는 세레이트(Serrate) 단백질, 또는 델타 단백질 또는 세레이트 단백질의 단편일 수 있으며, 단편은 노치 단백질에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 확장 단계는 조혈 줄기 세포, 또는 줄기 및 전구 세포를 델타1ext-IgG (DXI)와 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, (a) 출생시 적어도 2명의 인간의 제대혈 및/또는 태반 혈액으로부터 얻어진 단리된 인간 제대혈 줄기 세포 또는 줄기 및 전구 세포로부터의 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 풍부화하여 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 풍부화된 세포 집단을 생산하는 단계; (b) 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 풍부화된 세포 집단을 생체외에서 확장시켜 확장된 줄기 세포 생성물을 생산하는 단계; (c) 화학치료 요법 또는 그의 사이클을 혈액 악성종양을 갖는 인간 환자에게 투여하는 단계; 및 (d) 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 이를 필요로 하는 인간 환자에게 투여하는 단계이며, 여기서 투여는 확장된 줄기 세포 생성물의 확장된 조혈 줄기 세포 또는 확장된 조혈 줄기 및 전구 세포의 HLA 유형을 환자의 HLA-유형에 매칭시키지 않고, 및 확장된 줄기 세포 생성물의 확장된 조혈 줄기 세포 또는 확장된 조혈 줄기 및 전구 세포의 HLA 유형을 서로에 매칭시키지 않고 수행되는 것인 단계를 포함하는, 혈액 악성종양을 갖는 인간 환자에 대한 치료 결과를 개선시키는 방법이 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 확장된 조혈 줄기 세포는 CD34+ 세포이다. 이 방법은 단계 (b) 후에 확장된 줄기 세포 생성물을 동결시키고 저장하는 단계 및 단계 (c) 전에 확장된 줄기 세포 생성물을 해동시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 환자는 AML, 예컨대 새로 발생한 AML, 재발성/난치성 AML 또는 치료 관련 AML, 또는 다른 혈액 악성종양, 예컨대 비-호지킨 림프종, 골수이형성 증후군 (MDS) 또는 골수증식성 신생물 (MPN)을 앓고 있다.
정의
본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가의 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 본 발명의 목적상, 하기 용어는 하기 정의된다.
본원에 사용된 "확장된 줄기 세포 생성물"은 세포 집단의 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 확장시키는 기술로 처리된 조혈 줄기 세포 또는 줄기 및 전구 세포에 대해 풍부호된 세포 집단을 지칭하며, 기술은 확장 기술로 처리되지 않은 세포의 분취물로 보여지는 것에 비해, (i) 이렇게 확장된 세포의 분취물에서, 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 수의 증가, 또는 (ii) 이렇게 확장된 세포의 분취물로 주입된 비-비만성 당뇨병성/중증-복합-면역결핍증 (NOD/SCID) 마우스에서 증진된 생착에 의해 나타내어진 바와 같이 제한-희석 분석에 의해 결정된 중증-복합-면역결핍증 (SCID) 재집단화 세포의 증가된 수를 발생시키는 것으로 나타났다. (미국 특허 공개 번호 2013/0095079; 문헌 [Delaney et al., 2010, Nature Med. 16(2):232-236] 참조.) 전형적으로, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 CD34+이다. 일부 실시양태에서, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 인간 제대혈 및/또는 인간 태반 혈액으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 노치-효능제 확장 방법을 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 DXI 확장 방법을 사용하여 제조된다. 확장된 줄기 세포 생성물은 T 세포 및 적혈구가 고갈된다.
본원에 사용된 "화학치료 요법"은 사용되는 약물, 그들의 투여량, 치료의 빈도 및 지속기간, 및 다른 고려사항을 한정하는 화학치료를 위한 요법을 지칭한다. 이러한 요법은 조합 화학치료에서 몇몇 화학치료 약물을 조합할 수 있다. 화학치료에 사용되는 약물의 대다수는 세포정지성 또는 세포독성이다.
본 발명의 상기 측면 및 많은 수반되는 이점은 이것이 첨부된 도면과 함께 취해질 때, 하기 상세한 설명을 참고로 보다 잘 이해될 것인 바와 같이 보다 용이하게 이해될 것이다:
도 1은 CD34+ 세포의 집단을 풍부화하고, 풍부화된 세포 집단을 확장시키기 위한 예시적인 절차를 보여주는 흐름도를 예시한다.
도 2는 실시예 3에 기재된 임상 연구 동안의 대상체 배치를 나타낸다.
상세한 설명
예시적인 실시양태가 예시되고 기재되었지만, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않고 다양한 변화가 그에 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
조혈 줄기/전구 세포 이식, 특히 자가 조혈 줄기/전구 세포 이식은 일반적으로 고형 종양 또는 다발성 골수종에 대한 고-용량 화학치료 후 골수 무형성을 구제하기 위해 수행된다. 동종이형 조혈 줄기 세포 이식은 건강한 공여자 조혈 줄기 세포 이식편의 주입에 의해 질환에 걸린 혈액 및 면역계를 근절시키고 혈액학적 항상성을 복원시킴으로써 백혈병 및 다른 조혈 악성종양을 치유하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 동종이형 조혈 줄기 세포 이식에서의 끊임 없는 문제 중 하나는 성공적인 치료를 위해 충분한 HLA 항원 및/또는 환자와의 대립유전자 매칭을 갖는 이용가능한 동종이형 공여자의 결여였다. 보다 최근, 확장된 인간 제대혈 줄기/전구 세포 샘플의 HLA-유형 또는 환자의 HLA-유형을 고려하지 않고 확장된 조혈 줄기/전구 세포 샘플을 선택함으로써 면역손상된 인간 환자에서 조혈 기능을 제공하기 위한 방법 및 조성물이 고안되었다. 조혈 줄기/전구 세포 샘플은 조혈 기능을 일시적으로 대체하거나 보충하기 위해 또는 생명을 위협하는 감염의 비율을 감소시키기 위해 조혈 줄기 세포 이식 또는 고 용량 화학치료를 겪은 후 이환 및 사망의 높은 위험이 있는 인간 환자에서 사용될 수 있다. 예상치 않게, HLA 유형결정이 수행되지 않은 확장된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 생성물 (및 여기서 세포 생성물은 T 세포를 포함하지 않았음)은 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 특정 다른 혈액 악성종양을 갖는 인간 환자를 치료하고/거나 그의 개선된 결과의 기회를 증가시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 화학치료 요법을 AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자에게 투여하고, 이어서 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자를 치료하고, 그에 대한 치료 결과를 개선시키는 방법이며, 여기서 투여는 확장된 줄기 세포 생성물의 HLA-유형을 환자의 HLA-유형에 매칭시키지 않고 수행되는 것인 방법을 제공한다. 확장된 줄기 세포 생성물은 서로에 또는 환자의 HLA-유형에 HLA 매칭되지 않은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함하는 세포-기반 생성물이다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 서로에 또는 환자의 HLA-유형에 HLA-유형 매칭되지 않은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함하는, 적어도 2명의 상이한 인간 공여자로부터의 제대혈 단위 또는 태반 혈액 단위로부터의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 풀링으로부터 유래된 풀링된 생성물이다. 어구 "HLA-유형을 매칭시키지 않고", "비매칭된" 등은 환자 및 확장된 줄기 세포 생성물 중의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 사이에 임의의 HLA 항원 또는 대립유전자 (HLA-유형) 매치를 갖기 위한 단계가 취해지지 않는 것을 의미한다. 확장된 줄기 세포 생성물의 선택은 확장된 줄기 세포 생성물이 투여될 환자의 HLA-유형을 매칭시키지 않고 수행된다. 유사하게, 예를 들어, 확장된 줄기 세포 생성물이 유래되는 제대혈 단위 또는 태반 혈액 단위로부터의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 공급원에 관하여, 어구 "HLA-유형을 매칭시키지 않고"는 확장된 줄기 세포 생성물 중의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 사이의 임의의 HLA 항원 또는 대립유전자 (HLA-유형) 매치를 갖기 위한 단계가 취해지지 않는 것을 의미한다. 또한, 확장된 줄기 세포 생성물은 T 세포 및 적혈구가 고갈됨이 주목되어야 한다.
확장된 줄기 세포 생성물은 전형적으로 화학치료 요법 후에 투여된다. 화학치료 요법은 단일 작용제 또는 다중-작용제 요법일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학치료 요법은 유도 요법 또는 강화 요법이다. 유도 요법은 대안적인 치료가 존재하지 않는 진행성 암을 나타내는 환자에 대한 1차 치료로서 화학치료의 사용을 포함한다. 강화 요법은 특히 백혈병에 사용되는 완화 기간 직후 동안의 치료의 반복적 사이클을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학치료 요법은 구제 요법이다. 구제 요법은 치유 또는 삶의 연장을 희망하는 초기 치료 후 악성종양의 재발을 갖는 환자에서의 화학치료의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 화학치료 요법 후 약 12 내지 약 48시간, 또는 바람직하게는 화학치료 요법 후 약 24 내지 36시간에 투여된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 화학치료 요법의 각각의 사이클 후 약 12 내지 약 48시간, 또는 바람직하게는 각각의 사이클 후 약 24 내지 36시간에 투여되고, 여기서 화학치료 요법은 1개 초과의 사이클로 투여된다.
일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 화학치료 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 유도 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 강화 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 구제 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 화학치료 요법 (예컨대 유도, 구제, 또는 강화 요법)이 1개 초과의 사이클로 투여되는 경우, 확장된 줄기 세포 생성물은 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 사이클 또는 각각의 사이클 후 환자에게 투여된다. 본원에 사용된 "... 요법 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에"는 예컨대 CD34+ 줄기 세포 또는 전구 세포 생존율을 적어도 5%, 적어도 10%, 또는 적어도 20% 감소시키는 것에 의한, 환자의 혈액에서 CD34+ 줄기 세포의 생존율에 영향을 미칠 요법 (예를 들어, 유도 요법, 구제 요법 또는 강화 요법)의 성분 및 그들 성분의 활성 대사물의 제거를 지칭한다.
각각의 요법 또는 그의 사이클 후의 확장된 줄기 세포 생성물의 투여는 예컨대 완화 (예를 들어, 완전한 완화 (CR) 또는 불완전한 혈액학적 회복이 없는 완전한 완화 (Cri))를 달성하는 환자의 기회를 개선시킴으로써, AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자의 치료 결과를 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 개선된 치료 결과는 확장된 줄기 세포 생성물의 투여 후의 환자에서의 IL-2 수준의 증가와 연관된다. 증가된 IL-2 수준은 환자에서 증가된 면역 반응의 지표이다. 임의의 특정 이론에 구애되기를 의도하지는 않지만, 확장된 줄기 세포 생성물은 다수의 인간 공여자로부터의 비매칭된 제대혈 단위로부터 유래되기 때문에, 확장된 조혈 줄기 세포 생성물은 상이한 HLA 유형 및/또는 대립유전자를 갖는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함한다. 환자에의 투여 후의 확장된 줄기 세포 생성물의 많은 미스매칭된 HLA 유형 또는 대립유전자의 존재는 잠재적으로 증가된 항원 로드에 기인하여 환자의 면역 반응을 활성화시키고/거나 증가시킨다. 생성된 환자의 면역 반응의 활성화 또는 자극은 부분적으로 환자 자신의 T 세포 및/또는 NK 세포의 활성화에 기인할 수 있다.
확장된 줄기 세포 생성물은 환자에게 치료 유익을 제공하기 위해 생착될 것이 요구되거나 예상되지 않는다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 환자에서 일시적으로 또는 영구적으로 생착되지 않는다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 환자에서 일시적으로 생착되지 않는다. 생착은 전형적으로 환자에서 혼합된 키메라현상으로서 검출되며, 확장된 줄기 세포 생성물로부터의 세포가 확장된 줄기 세포 생성물의 투여 후 약 7 내지 약 14일에 환자의 혈액에서 검출되는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 조혈 재구성을 일시적으로 또는 장기로 측정가능하게 증가시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 환자에서 감염의 비율을 감소시키지 않는다.
빈번한 감염은 혈액 악성종양, 예컨대 AML의 치료에 사용되는 화학치료 요법의 통상적인 합병증이며, 치료 실패의 상당한 원인이다. 화학치료제는 또한 극심하게 면역억제성이고/거나 고도로 면역억제성일 수 있으며, 이는 연장된 호중구감소증의 기간을 초래할 수 있다. 화학치료 요법 후의 확장된 줄기 세포 생성물의 투여는 반드시 감염성 합병증을 방지하거나 화학치료 후 일시적 조혈 회복을 용이하게 하지는 않고, 그러나 오히려 백혈병에 대한 숙주 면역 반응을 유도함으로써 치료 결과를 개선시킬 수 있다.
확장된 줄기 세포 생성물의 제조
확장된 줄기 세포 생성물은 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함하며, T 세포 및 적혈구가 실질적으로 고갈되었고, 따라서 통상적으로 풍부한 수의 CD34+ 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함한다. 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 다수의 HLA-유형을 포함하는데, 이는 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 풀링 전에 서로에 매칭되지 않고, 또한 환자에 매칭되지 않기 때문이다. 본원에 사용된 T 세포가 실질적으로 고갈된은 확장된 줄기 세포 생성물 중의 1% 미만의 CD3+ 세포, 또는 0.5% 미만의 CD3+ 세포, 또는 0.1% 미만의 CD3+ 세포를 지칭한다.
일부 실시양태에서, CD34+ 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 제대혈로부터 또는 태반 혈액으로부터 유래된다. 인간 제대혈 및/또는 인간 태반 혈액은 제대혈 줄기 세포의 전형적인 공급원이다. 이러한 혈액은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 인간의 출생시 제대 및 태반 혈액의 수집의 논의에 대한, 미국 특허 번호 5,004,681 및 7,147,626 및 미국 특허 공개 번호 2013/0095079 (본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 제대혈 및/또는 인간 태반 혈액 수집은 멸균 조건 하에서 이루어진다. 수집시, 제대 또는 태반 혈액은 항응고제, 예컨대 CPD (시트레이트-포스페이트-덱스트로스), ACD (산 시트레이트-덱스트로스), 알세버 용액 (Alsever et al., 1941, N. Y. St. J. Med. 41:126), 드 고윈 용액 (De Gowin, et al., 1940, J. Am. Med. Ass. 114:850), 에드글루게이트-Mg (Smith, et al., 1959, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 38:573), 라우스-터너 용액 (Rous and Turner, 1916, J. Exp. Med. 23:219), 다른 글루코스 혼합물, 헤파린, 에틸 비스쿠마세테이트 등과 혼합된다. 일반적으로, 문헌 [Hurn, 1968, 저장 of Blood, Academic Press, New York, pp. 26-160)]을 참조한다. 한 실시양태에서, ACD가 사용될 수 있다.
제대혈은 바람직하게는 제대로부터의 직접적 배수에 의해 및/또는 뿌리에서 및 확대된 정맥에 분만된 태반으로부터의 바늘 흡인에 의해 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 수집된 인간 제대혈 및/또는 태반 혈액은 오염, 및 특히, 바이러스 오염이 없다.
특정 실시양태에서, 하기 시험은 통상적으로 또는 임상적으로 지시된 경우, 수집된 혈액에 대해 수행될 수 있다:
박테리아 배양: 미생물 오염의 부재를 보장하기 위해, 확립된 검정, 예컨대 호기성 및 혐기성 조건 하에서의 박테리아에 대한 통상적인 병원 배양이 수행될 수 있다.
병원성 미생물에 대한 진단 스크리닝: 특이적 병원성 미생물의 부재를 보장하기 위해, 다양한 진단 시험이 채용될 수 있다. 혈액을 통해 전파가능한 임의의 다수의 병원체에 대한 진단 스크리닝은 표준 절차에 의해 수행될 수 있다. 한 예로서, 수집된 혈액 샘플 (또는 모체 혈액 샘플)은 바이러스의 존재에 대한 진단 스크리닝으로 처리될 수 있다. 비리온, 바이러스-코딩된 단백질, 바이러스-특이적 핵산, 바이러스 단백질에 대한 항체 등의 검출에 기반한 임의의 다수의 공지된 검정 시스템이 사용될 수 있다. 수집된 혈액은 또한 인간 면역결핍 바이러스-1 또는 2 (HIV-1 또는 HIV-2), 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 I 및 II (HTLV-I 및 HTLV-II), B형 간염, C형 간염, 시토메갈로바이러스, 매독, 코로나 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 감염성 질환에 대해 시험될 수 있다.
바람직하게는, 제대혈의 수집 전에, 제대혈 세포가 예를 들어, 유전성 또는 감염성 질환, 예컨대 암, 백혈병, 면역 장애, 신경학적 장애, 간염, 또는 AIDS의 전파를 제기할 수 있는 위험을 확인하기 위해 모체 건강 내력이 결정된다. 수집된 제대혈은 세포 생존율, HLA 유형결정, ABO/Rh 유형결정, CD34+ 세포 카운트, 및 총 유핵 세포 카운트 중 하나 이상에 대한 시험을 겪을 수 있다.
제대혈 및/또는 태반 혈액이 출생시 인간 공여자로부터 수집되면, 혈액을 프로세싱하여 풍부화된 조혈 줄기 세포 집단, 또는 풍부화된 조혈 줄기 및 전구 세포 집단을 생산한다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 CD34+ 세포 또는 우세하게 CD34+ 세포이다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단은 T 세포 및 적혈구가 실질적으로 고갈되어, CD34+ 줄기 세포 및/또는 CD34+ 줄기 및 전구 세포가 풍부화된 세포 집단을 발생시킨다. 따라서, 풍부화는 세포 집단 중의 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 백분율이 (풍부화 절차 전의 집단에서의 백분율에 비해) 증가되는 과정을 지칭한다. 정제는 풍부화의 한 예이다. 특정 실시양태에서, 풍부화 절차 전의 집단에 비해, 확장된 줄기 세포 생성물 중의 세포의 백분율로서의 CD34+ 세포 (또는 다른 적합한 항원-양성 세포)의 수의 증가는 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 적어도 350배이고, 바람직하게는 100 내지 200배 또는 100 내지 400배이다.
풍부화를 위한 프로세싱 전에, 수집된 제대 및/또는 태반 혈액은 신선할 수 있거나 이전에 동결보존되었다. 세포 분리/선택을 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 기술은 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 풍부화를 수행하는데 사용될 수 있다. 세포 표면 마커의 차등적 발현에 의존하는 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 마커 CD34를 발현하는 세포는 CD34를 발현하는 세포가 보유되고, CD34를 발현하지 않는 세포가 보유되지 않도록 CD34에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 양성으로 선택될 수 있다. 더욱이, 채용되는 분리 기술은 선택되는 세포 집단의 생존율을 최대화해야 한다. 채용되는 특정 기술은 분리의 효율, 방법론의 세포독성, 성능의 용이성 및 속도, 및 세련된 장비 및/또는 기술적 기교에 대한 필요성에 의존할 것이다.
분리를 위한 절차는 항체-코팅된 자기 비드를 사용한 자기 분리, 친화도 크로마토그래피, 및 고체 매트릭스, 예를 들어, 플레이트에 부착된 항체로의 "패닝", 또는 다른 편리한 기술을 포함할 수 있다. 정확한 분리/선택을 제공하는 기술은 다양한 정도의 기교성, 예를 들어, 복수의 컬러 채널, 저각 및 둔각 광 산란 검출 채널, 임패던스 채널 등을 가질 수 있는 형광 활성화된 세포 분류기를 포함한다.
선택 과정에 사용되는 항체는 직접 분리를 허용하는 마커, 예컨대 자기 비드, 지지체에 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 제거될 수 있는 비오틴, 형광 활성화된 세포 분류기와 함께 사용될 수 있는 형광색소 등과 접합되어, 특정 세포 유형의 분리의 용이성을 허용할 수 있다. 잔류 세포의 생존율에 과도하게 해롭지 않은 임의의 기술이 채용될 수 있다. 예는 예를 들어, FDA 승인된 클리니막스® 프로세싱 시스템 (밀테니 비오텍 베. 파우. 운트 코. 카게(Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG)), 디나비즈(Dynabeads)™ CD34 단리 시스템 (인비트로젠 인크.(Invtrogen Inc.)), 이지셉(EasySep)™ 인간 CD34 양성 선택 키트 (스템셀 테크놀로지스, 인크.(Stemcell Technologies, Inc.)) 등을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 신선한 제대혈 단위는 특이적 모노클로날 항체에 커플링된 산화철 및 덱스트란으로 구성된 나노-크기 초-상자성 입자를 채용하는, 자기 세포 분리기, 예를 들어, 클리니막스® 세포 분리 시스템 (밀테니 비오텍(Miltenyi Biotec), 독일 베르기쉬 글라드바흐)과 관련되어 자기 입자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 항-CD34 항체를 사용하여 CD34+ 세포에 대해 선택하도록, 즉, 풍부화하도록 프로세싱된다. 클리니막스® 세포 분리기는 단일-사용 일회용 튜빙 세트를 갖춘 폐쇄된 멸균 시스템이다. 일회용 튜빙 세트는 CD34+ 세포를 풍부화하기 위해 수집된 제대 및/또는 태반 혈액의 단일 단위를 프로세싱하는데 사용되고, 그 후에 버려질 수 있다.
한 실시양태에서, 2개 이상의 제대혈 및/또는 태반 혈액 단위는 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 풍부화하기 전에 풀링될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CD34+ 줄기 세포 또는 CD34+ 줄기 및 전구 세포의 개별적 집단은 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 풍부화한 후에 풀링될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 풀링되는 제대혈 및/또는 태반 혈액 단위, 또는 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 집단의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개, 또는 적어도 임의의 상기 수이다. 일부 실시양태에서, 풀은 2 내지 8, 2 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 10, 2 내지 20, 4 내지 20, 2 내지 25 또는 4 내지 25개, 및 20 또는 25개 이하의 제대혈 및/또는 태반 혈액 단위, 또는 CD34+ 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단을 함유한다. 제대혈 및/또는 태반 혈액 단위 또는 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단은 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 HLA-유형과 무관하게 풀링된다. 특정 실시양태에서, 풀 중의 세포는 동일한 인종, 예를 들어, 아프리카-미국인, 백인, 아시아인, 히스패닉계, 미국 원주민, 호주 원주민, 이뉴잇족, 태평양 섬주민의 개체의 제대혈 및/또는 태반 혈액으로부터 유래되거나, 동일한 민족, 예를 들어, 아일랜드인, 이탈리아인, 인도인, 일본인, 중국인, 러시아인 등의 개체의 제대혈 및/또는 태반 혈액으로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, 풀 중의 세포는 인종 또는 민족과 무관하게 조합된다.
임의로, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 풍부화 전에, 제대혈 또는 태반 혈액의 적혈구 및 백혈구는 분리될 수 있다. 적혈구 및 백혈구의 분리가 일어났으면, 적혈구 분획은 버릴 수 있고, 백혈구 분획은 상기 기재된 바와 같이 자기 세포 분리기에서 프로세싱하여 CD34+ 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 풍부화할 수 있다. 백혈구 및 적혈구 분획의 분리는 원심분리 기술을 포함한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 분리 방법은 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 제품, 피콜(FICOLL)™ 또는 피콜-파크(FICOLL-PAQUE)™ 또는 퍼콜(PERCOLL)™ (지이 헬스케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스캐터웨이)의 사용을 포함한다. 피콜-파크™는 통상적으로 원뿔형 튜브의 바닥에 정치되고, 전혈은 위에 층상화된다. 원심분리된 후, 하기 층은 상부로부터 하부로 원뿔형 튜브에서 볼 수 있다: 혈장 및 다른 구성요소, 말초 혈액 단핵 세포 (백혈구)를 함유하는 버피 코트로 지칭되는 단핵 세포, 피콜-파크™, 및 펠릿 형태로 존재할 것인 적혈구 및 과립구. 이 분리 기술은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 용이한 수거를 허용한다.
임의로, CD34+ 세포 선택 전에, 제대혈 또는 태반 단위의 분취물은 총 유핵 세포 카운트 및/또는 CD34+ 세포 함량에 대해 점검될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, CD34+ 세포 선택 후에, CD34+ 및 CD34- 세포 분획 둘 다는 회수된다. 임의로, 비록 환자에 대한 또는 다른 제대혈 또는 태반 혈액 단위에 대한 CD34+ 세포 분획의 HLA 매칭이 수행되지 않더라도, DNA는 초기 HLA 유형결정 및 장래의 키메라현상 연구를 위해 CD34- 세포 분획의 샘플로부터 추출될 수 있다.
CD34+ 풍부화된 줄기 세포 또는 줄기 및 전구 세포 집단은 이어서 확장 전에, 저장 또는 수송을 위해 예를 들어, 적절한 세포 배양 배지 중의 현탁액에 의해 프로세싱될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 CD34+ 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 생존율의 유지에 적합한 세포 배양 배지이다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 예를 들어, 하기 농도로 존재하는 성장 인자의 존재 하에서의 스템스팬(STEMSPAN)™ 혈청 무함유 확장 배지 또는 스템스팬™ 혈청 무함유 확장 배지 II (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)일 수 있다: 50 내지 300 ng/ml의 줄기 세포 인자 (SCF), 50 내지 300 ng/ml의 Flt-3 수용체 리간드 (Flt3L), 50 내지 100 ng/ml의 트롬보포이에틴 (TPO), 50 내지 100 ng/ml의 인터류킨-6 (IL-6), 및 10 ng/ml의 인터류킨-3 (IL-3). 보다 구체적인 실시양태에서, 300 ng/ml의 줄기 세포 인자, 300 ng/ml의 Flt-3 수용체 리간드, 100 ng/ml의 트롬보포이에틴, 100 ng/ml의 인터류킨-6 및 10 ng/ml의 인터류킨-3, 또는 50 ng/ml의 줄기 세포 인자, 50 ng/ml의 Flt-3 수용체 리간드, 50 ng/ml의 트롬보포이에틴, 50 ng/ml의 인터류킨-6 및 10 ng/ml의 인터류킨-3이 사용된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 10 ng/ml 재조합 인간 인터류킨-3 (rhIL-3), 50 ng/ml 재조합 인간 인터류킨-6 (rhIL-6), 50 ng/ml 재조합 인간 트롬보포이에틴 (rhTPO), 50 ng/ml 재조합 인간 Flt-3 리간드 (rhFlt-3L), 50 ng/ml 재조합 인간 줄기 세포 인자 (rhSCF)로 보충된 스템스팬™ 혈청 무함유 확장 배지 또는 스템스팬™ 혈청 무함유 확장 배지 II (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)로 이루어진다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 재조합 인간 rhSCF, rhFlt-3L, rhTPO, rhIL-6 (각각 50 ng/ml 최종 농도로), 및 rhIL-3 (10 ng/ml 최종 농도로)으로 보충된 스템스팬 혈청 무함유 확장 배지 II (SFEM II, 스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)로 이루어진다.
구체적인 실시양태에서, 제대혈 및/또는 태반 혈액 단위는 적혈구 고갈되고, 적혈구 고갈된 분획 중의 CD34+ 세포의 수가 결정된다. 바람직하게는, 350만개 초과의 CD34+ 세포를 함유하는 제대혈 및/또는 태반 혈액 샘플은 상기 기재된 풍부화 방법으로 처리된다.
조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 상기 기재된 풍부화 방법 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법에 따라 (예를 들어, 출생시 인간으로부터 수집된 인간 제대혈 및/또는 인간 태반 혈액으로부터) 단리된 후, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포, 예를 들어, CD34+ 세포의 수를 증가시키기 위해 확장된다. 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 확장된 집단 (즉, 그의 증가된 수)을 발생시키는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 수를 확장시키기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 성장 및 분열하여 (증식하여) CD34+ 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 확장된 집단을 얻도록 (예를 들어 유사분열을 촉진시키는) 세포 성장 조건 하에서 배양된다. 한 실시양태에서, 출생시 단일 인간의 제대혈 및/또는 태반 혈액으로부터 유래된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 개별적 집단은 확장 전에 또는 후에, 다른 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 풀링될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 풀링 전에 확장된다. 바람직하게는, 확장에 사용되는 기술은 (i) 조혈 줄기 세포 또는 줄기 및 전구 세포의 비확장된 집단에 비해 확장된 줄기 세포 생성물 중의 조혈 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 및 전구 세포, 예를 들어, CD34+ 세포의 수의 증가를 발생시키는 것으로 나타난 것이고, 여기서 비확장된 세포 집단 및 확장된 세포 집단은 줄기 또는 줄기 및 전구 세포의 동일한 공급원의 상이한 분취물로부터의 것이고, 여기서 확장된 세포 (그러나 비확장된 세포는 그렇지 않음)는 확장 기술로 처리된다.
확장 기술은 미국 특허 번호 7,399,633 B2; 미국 특허 공개 번호 2013/0095079; 문헌 [Delaney et al., 2010, Nature Med. 16(2): 232-236]; [Zhang et al., 2008, Blood 111:3415-3423]; 또는 [Himburg et al., 2010, Nature Medicine 16(4):475-82] (각각 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들, 뿐만 아니라 하기 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 성장 인자의 존재 하에서 배양 배지에서 배양되고, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 증식하여 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 확장된 집단을 얻도록 (예를 들어, 유사분열을 촉진시키는) 세포 성장 조건에 노출된다. 바람직한 실시양태에서, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 분화를 억제하는데 유효한 노치 기능의 효능제 (전형적으로 노치 기능의 고정화된 효능제)의 소정량의 존재 하에서 배양되고, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 증식하여 확장된 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단을 생성하도록 (예를 들어, 유사분열을 촉진시키는) 세포 성장 조건에 노출된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 분화를 억제하는데 유효한 노치 기능의 효능제의 소정량과 함께 및 성장 인자의 존재 하에서 배양되고, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 증식하여 확장된 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단을 얻도록 (예를 들어, 유사분열을 촉진시키는) 세포 성장 조건에 노출된다. 이렇게 얻어진 확장된 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단은 "기성품 생성물"로서 나중의 사용을 위해 동결되고 저장될 수 있다. 임의로, 노치 경로 효능제는 불활성화되거나, 환자 내로의 이식 전에 확장된 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단으로부터 (예를 들어, 분리 또는 희석에 의해) 제거된다.
구체적인 실시양태에서, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25일 또는 그 초과 동안 배양되거나; 또는, 바람직하게는, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 적어도 10일 동안 또는 약 7 내지 약 14일 동안 배양된다.
조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 확장시키기 위한 예시적인 배양 조건은 하기 인간 성장 인자로 보충된 혈청 무함유 배지에서 피브로넥틴 단편 및 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 델타 단백질의 세포외 도메인 (델타1ext-IgG)의 존재 하에서 7 내지 14일 동안 세포를 배양하는 것을 포함한다: 줄기 세포 인자, Flt-3 수용체 리간드, 트롬보포이에틴, 인터류킨-6 및 인터류킨-3. 바람직하게는, 상기 성장 인자는 하기 농도로 존재한다: 50 내지 300 ng/ml 줄기 세포 인자, 50 내지 300 ng/ml Flt-3 수용체 리간드, 50 내지 100 ng/ml 트롬보포이에틴, 50 내지 100 ng/ml 인터류킨-6 및 10 ng/ml 인터류킨-3. 보다 구체적인 실시양태에서, 300 ng/ml 줄기 세포 인자, 300 ng/ml의 Flt-3 수용체 리간드, 100 ng/ml 트롬보포이에틴, 100 ng/ml 인터류킨-6 및 10 ng/ml 인터류킨-3, 또는 50 ng/ml 줄기 세포 인자, 50 ng/ml의 Flt-3 수용체 리간드, 50 ng/ml 트롬보포이에틴, 50 ng/ml 인터류킨-6 및 10 ng/ml 인터류킨-3이 사용된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 10 ng/ml 재조합 인간 인터류킨-3 (rhIL-3), 50 ng/ml 재조합 인간 인터류킨-6 (rhIL-6), 50 ng/ml 재조합 인간 트롬보포이에틴 (rhTPO), 50 ng/ml 재조합 인간 Flt-3 리간드 (rhFlt-3L), 50 ng/ml 재조합 인간 줄기 세포 인자 (rhSCF)로 보충된 스템스팬™ 혈청 무함유 확장 배지 (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)로 이루어진다. 또 다른 보다 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 재조합 인간 rhSCF, rhFlt-3L, rhTPO, rhIL-6 (각각 50 ng/ml 최종 농도로), 및 rhIL-3 (10 ng/ml 최종 농도로)으로 보충된 스템스팬 혈청 무함유 확장 배지 II (SFEM II, 스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)로 이루어진다.
일부 실시양태에서, DXI-매개 확장은 하기와 같이 수행된다: 델타1ext-IgG (DXI)를 세포 배양 디쉬의 표면 상에 고정화한다. 구체적인 실시양태에서, 세포 배양 디쉬를 4℃에서 밤새 (또는 37℃에서 최소 2시간 동안) 포스페이트 완충 염수 중 2.5 μg/ml 델타1ext-IgG 및 5 μg/ml 레트로넥틴(RetroNectin)® (rFN-CH-296으로도 지칭되는 재조합 인간 피브로넥틴 단편)으로 코팅한 후, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 첨가한다. 바람직하게는 세포 배양 배지는 10 ng/ml 재조합 인간 인터류킨-3 (rhIL-3), 50 ng/ml 재조합 인간 인터류킨-6 (rhIL-6), 50 ng/ml 재조합 인간 트롬보포이에틴 (rhTPO), 50 ng/ml 재조합 인간 Flt-3 리간드 (rhFlt-3L), 50 ng/ml 재조합 인간 줄기 세포 인자 (rhSCF)로 보충된 스템스팬™ 혈청 무함유 확장 배지 (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버), 또는 재조합 인간 rhSCF, rhFlt-3L, rhTPO, rhIL-6 (각각 50 ng/ml 최종 농도로), 및 rhIL-3 (10 ng/ml 최종 농도로)으로 보충된 스템스팬 혈청 무함유 확장 배지 II (SFEM II, 스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)로 이루어진다.
조혈 줄기 또는 줄기 및 전구 세포를 확장시키기 위한 다른 예시적인 배양 조건은 문헌 [Zhang et al., 2008, Blood 111:3415-3423] (본원에 참조로 포함됨)에 제시되어 있다. 구체적인 실시양태에서, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 헤파린, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴, 인슐린-유사 성장 인자-2 (IGF-2), 섬유모세포 성장 인자-1 (FGF-1), 및 Angptl3 또는 Angptl5로 보충된 혈청 무함유 배지에서 배양될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 배지는 10 μg/ml 헤파린, 10 ng/ml 줄기 세포 인자, 20 ng/ml 트롬보포이에틴, 20 ng/ml IGF-2, 및 10 ng/ml FGF-1, 및 100 ng/ml Angptl3 또는 Angptl5로 보충되고, 세포는 약 19 내지 23일 동안 배양된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 10 μg/ml 헤파린, 10 ng/ml 줄기 세포 인자, 20 ng/ml 트롬보포이에틴, 10 ng/ml FGF-1, 및 100 ng/ml Angptl5로 보충된 혈청 무함유 배지에서 약 11 내지 19일 동안 세포를 배양함으로써 확장될 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 조혈 줄기 또는 줄기 및 전구 세포는 50 ng/ml 줄기 세포 인자, 10 ng/ml 트롬보포이에틴, 50 ng/ml Flt-3 수용체 리간드, 및 100 ng/ml 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-2 (IGFBP2) 또는 500 ng/ml Angptl5로 보충된 혈청 무함유 배지에서 약 10일 동안 세포를 배양함으로써 확장될 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 10 μg/ml 헤파린, 10 ng/ml 줄기 세포 인자, 20 ng/ml 트롬보포이에틴, 10 ng/ml FGF-1, 500 ng/ml Angptl5, 및 500 ng/ml IGFBP2로 보충된 혈청 무함유 배지에서 약 11일 동안 세포를 배양함으로써 확장될 수 있다. 문헌 [Zhang et al., 2008, Blood 111:3415-3423] (본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 확장시키기 위한 또 다른 예시적인 배양 조건은 문헌 [Himburg et al., 2010, Nature Medicine 16(4):475-482] (본원에 참조로 포함됨)에 제시되어 있다. 구체적인 실시양태에서, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 트롬보포이에틴, 줄기 세포 인자, Flt-3 수용체 리간드, 및 플레이오트로핀으로 보충된 액체 현탁액 배양액에서 배양될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 액체 현탁액 배양액은 20 ng/ml 트롬보포이에틴, 125 ng/ml 줄기 세포 인자, 50 ng/ml Flt-3 수용체 리간드, 및 10, 100, 500, 또는 1000 ng/ml 플레이오트로핀으로 보충되고, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 약 7일 동안 배양된다.
조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 확장 후, 세포 및 생존 CD34+ 세포의 총 수가 결정된다. 예를 들어, 확장 동안 제14일에, 샘플은 총 생존 유핵 세포 카운트의 결정을 위해 취해질 수 있다. 또한, CD34+ 세포의 총 수는 다중-파라미터 유동 세포계측법에 의해, 및, 따라서, 샘플 중의 CD34+ 세포의 백분율이 결정될 수 있다. 바람직하게는, CD34+ 세포의 절대 수의 적어도 10배 증가를 발생시키지 않은 배양은 중단된다. 유사하게, 동결보존 전에 또는 해동 후에, 확장된 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단의 분취물은 확장된 집단 중의 총 생존 CD34+ 세포 수를 계산하기 위해, 총 유핵 세포 및 생존 CD34+ 세포의 백분율의 결정을 위해 취해질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 5천만개 미만의 CD34+ 생존 세포를 함유하는 집단은 버려질 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 총 생존 CD34+ (또는 다른 항원-양성) 세포 수는 치료 용도를 위한 최종 생성물의 방출을 위한 효력 검정이 고려될 수 있다. 생존율은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 트리판 블루 배제 또는 7-아미노-악티노마이신 D (7-AAD) 배제에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 총 유핵 세포 카운트 (TNC) 및 다른 데이터는 생성물의 효력을 계산하는데 사용된다. 생존 CD34+ 세포의 백분율은 유동 세포계측법 및 생존 세포에 의해 배제된 염색의 사용에 의해 평가될 수 있다. 생존 CD34+ 세포의 백분율 = 샘플의 분취물에서 7-AAD (또는 다른 적절한 염색)를 배제하는 CD34+ 세포의 수 나누기 분취물의 TNC (생존 및 비-생존 둘 다). 샘플 중의 생존 CD34+ 세포는 하기와 같이 계산될 수 있다: 생존 CD34+ 세포 = 샘플의 TNC x 샘플 중의 % 생존 CD34+ 세포. 생존 CD34+ 세포에서의 풍부화 또는 확장 동안 비례적 증가는 하기와 같이 계산될 수 있다: 배양 후 총 생존 CD34+ 세포/배양 전 총 생존 CD34+ 세포.
일부 실시양태에서, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 상기 기재된 바와 같이, 노치 기능의 효능제 및 1종 이상의 성장 인자 또는 시토카인의 존재 하에서 주어진 기간 동안 세포를 배양함으로써 확장된다. 노치 효능제로도 지칭되는 노치 기능의 효능제는 노치 경로 기능의 활성화를 촉진시키는, 즉, 유발하거나 증가시키는 작용제이다. 본원에 사용된 "노치 기능"은 노치의 세포내 도메인의 핵 전위, RBP-Jκ 또는 그의 드로소필라(Drosophila) 동족체 헤어리스 서프레서(Suppressor of Hairless)의 핵 전위; 스플리트(Split) 복합체의 인핸서, 예를 들어, 마스터마인드(Mastermind)의 bHLH 유전자의 활성화; HES-1 유전자 또는 KBF2 (CBF1로도 지칭됨) 유전자의 활성화; 드로소필라 신경모세포 분리의 억제; 및 델타, 재그드(Jagged)/세레이트, 프린지(Fringe), 델텍스(Deltex) 또는 RBP-Jκ/헤어리스 서프레서, 또는 그의 동족체 또는 유사체에의 노치의 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 노치 신호전달 (신호 전달) 경로에 의해 매개되는 기능을 의미한다. 노치 신호 전달 경로 및 활성화에 대한 그의 효과의 논의에 대해서는 일반적으로 리뷰 논문 [Kopan et al., 2009, Cell 137:216-233]을 참조하며; 또한 문헌 [Jarriault et al., 1998, Mol. Cell. Biol. 18:7423-7431]을 참조한다 (둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
노치 활성화는 세포를 노치 효능제에 노출시킴으로써 수행된다. 노치 기능의 효능제는 가용성 분자, 세포-표면 상에 재조합적으로 발현되는 분자, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 노출되는 세포 단층 상의 분자, 또는 고체 상 상에 고정화된 분자일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 노치 효능제는 노치의 세포외 도메인에 결합하고 노치 신호 전달을 활성화시키는 세포외 결합 리간드 델타 및 세레이트, 또는 노치의 세포외 도메인에 결합하고 노치 신호 전달을 활성화시키는 델타 또는 세레이트의 단편이다. 델타 및 세레이트의 핵산 및 아미노산 서열은 인간을 포함한 몇몇 종으로부터 단리되었고, 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 국제 특허 공개 번호 WO 93/12141, WO 96/27610, WO 97/01571, 및 문헌 [Gray et al., 1999, Am. J. Path. 154:785-794]에 개시되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 노치 효능제는 myc 에피토프 태그에 융합된 단백질의 세포외 도메인으로 이루어진 델타 또는 세레이트 단백질 (각각 델타ext-myc 또는 세레이트ext-myc)의 고정화된 단편 또는 IgG의 Fc 부분에 융합된 단백질의 세포외 도메인으로 이루어진 델타 또는 세레이트 단백질 (각각 델타ext-IgG 또는 세레이트ext-IgG)의 고정화된 단편이다. 노치 효능제는 노치 단백질 및 그의 유사체 및 유도체 (단편을 포함함); 노치 경로의 다른 요소인 단백질 및 그의 유사체 및 유도체 (단편을 포함함); 그에 대한 항체 및 그의 결합 영역을 함유하는 이러한 항체의 단편 또는 다른 유도체; 단백질 및 유도체 또는 유사체를 코딩하는 핵산; 뿐만 아니라 노치 경로 활성이 촉진되도록 노치 단백질 또는 노치 경로의 다른 단백질에 결합하거나 다르게는 그와 상호작용하는 단백질 및 그의 유도체 및 유사체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 효능제는 세포내 도메인을 포함하는 노치 단백질 및 그의 유도체, 상기를 코딩하는 노치 핵산, 및 노치 리간드의 노치-상호작용 도메인 (예를 들어, 델타 또는 세레이트의 세포외 도메인)을 포함하는 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 효능제는 RBPJκ/헤어리스 서프레서 또는 델텍스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 프린지는 예를 들어 델타 단백질과 함께 노치 활성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 이들 단백질, 그의 단편 및 유도체는 재조합적으로 발현되고 단리될 수 있거나, 화학적으로 합성될 수 있다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 노치 효능제는 노치를 효능작용하는 단백질 또는 그의 단편 또는 유도체를 재조합적으로 발현하는 세포이다. 세포는 그것이 노치 신호 전달이 활성화되어야 하는 조혈 줄기 세포 또는 줄기 및 전구 세포에 이용가능하게 되는, 예를 들어, 그것이 분비되고, 세포 표면 상에 발현되는 등의 방식으로 노치 효능제를 발현한다.
추가의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 노치의 효능제는 노치 신호전달 경로의 구성원에 결합하는 펩티드모방체 또는 펩티드 유사체 또는 유기 분자이다. 이러한 효능제는 관련 기술분야에 공지된 것들로부터 선택되는 결합 검정, 예를 들어 문헌 [Rebay et al., 1991, Cell 67:687-699] 및 국제 특허 공개 번호 WO 92/19734 (둘 다 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 세포 응집 검정에 의해 확인될 수 있다.
바람직한 실시양태에서 효능제는 적어도 노치 단백질 또는 노치의 단편에의 결합을 매개하는 노치-상호작용 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 단편으로 이루어진 단백질이며, 노치의 단편은 효능제 단백질에의 결합을 담당하는 노치의 영역, 예를 들어, 노치의 표피 성장 인자-유사 반복부 11 및 12를 함유한다. 본원에 사용된 노치 상호작용 유전자는 유전자 노치, 델타, 세레이트, RBPJκ, 헤어리스 서프레서 및 델텍스, 뿐만 아니라 서열 상동성 또는 유전자 상호작용에 의해 확인될 수 있는 델타/세레이트 패밀리 또는 델텍스 패밀리의 다른 구성원 및 보다 일반적으로, 분자 상호작용 (예를 들어, 시험관내 결합, 또는 유전자 상호작용 (예를 들어, 드로소필라에서 표현형적으로 묘사된 바와 같음)에 의해 확인되는 유전자의 "노치 캐스케이드" 또는 "노치 군"의 구성원을 의미할 것이다. 노치에의 결합을 담당하는 영역을 함유하는 노치-결합 단백질의 예시적인 단편은 미국 특허 번호 5,648,464; 5,849,869; 및 5,856,441 (본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 이용되는 노치 효능제는 상업적으로 얻어지거나, 재조합 발현에 의해 생산되거나, 화학적으로 합성될 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 노치 효능제에의 세포의 노출은 세포 표면 상에 노치 리간드를 재조합적으로 발현하는 다른 세포와의 인큐베이션에 의해 수행되지 않고 (다른 실시양태에서, 이 방법이 사용될 수 있지만), 오히려 무세포 노치 리간드에의 노출, 예를 들어, 노치의 무세포 리간드와의 인큐베이션에 의해 수행되며, 리간드는 고체 상의 표면 상에 고정화되며, 예를 들어, 조직 배양 기재, 디쉬, 플라스크, 보틀, 백 등의 표면 상에 고정화된다.
구체적인 실시양태에서, 노치 활성은 노치 수용체의 세포외 부분에의 노치 리간드 (예를 들어, 델타, 세레이트)의 결합에 의해 촉진된다. 노치 신호전달은 노치의 세포외 도메인 및 인접한 세포에 막-결합되거나 고체 표면 상에 고정화된 그의 리간드 사이의 물리적 상호작용에 의해 촉발되는 것으로 보인다. 전장 리간드는 노치의 효능제인데, 이는 하나의 세포 상의 그들의 발현이 노치 수용체를 발현하는 이웃하는 세포에서의 경로의 활성화를 촉발시키기 때문이다. 고체 표면, 예컨대 조직 배양 플레이트 상에 고정화된 단백질의 세포외 도메인 또는 그의 노치-결합 부분을 포함하는 가용성 말단절단된 델타 또는 세레이트 분자는 특히 바람직한 노치 경로 효능제이다. 이러한 가용성 단백질은 항체 또는 상호작용 단백질, 예를 들어 델타 또는 세레이트가 융합 단백질로서 발현되는 에피토프 태그 (예를 들어, 항체 9E10에 의해 인식되는 myc 에피토프 태그)에 대해 지정된 항체 또는 델타 또는 세레이트가 융합 단백질로서 발현되는 에피토프 태그 (예를 들어, 단백질 A에 의해 결합된 이뮤노글로불린 에피토프 태그)와 상호작용하는 단백질에 의해 고체 표면 상에 고정화될 수 있다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 및 아르타바니스-차코나스(Artavanis-Tsakonas) 등의 미국 특허 번호 5,780,300에 기재된 바와 같이, 노치 효능제는 노치 또는 노치 신호전달 경로의 구성원의 활성화에 요구되는 성숙 또는 프로세싱 단계를 매개하는 세포 과정을 촉진시키거나 활성화시키는 시약, 예컨대 노치 프로세싱에 요구되는 푸린-유사 컨버타제, 쿠즈바니안(Kuzbanian), 노치의 상류의 또는 평행한 노치 경로의 활성화에 요구되는 것으로 생각되는 메탈로프로테아제-디스인테그린 (ADAM) (Schlondorff and Blobel, 1999, J. Cell Sci. 112:3603-3617), 또는, 보다 일반적으로, 세포 트래피킹 및 프로세싱 단백질, 예컨대 세포 구획 사이의 이동에 요구되는 GTP아제의 rab 패밀리 (Rab GTP아제에 대한 검토를 위해서는, 문헌 [Olkkonen and Stenmark, 1997, Int. Rev. Cytol. 176:1-85] 참조)를 포함한다. 효능제는 상기 과정 중 하나의 활성을 증가시키는 임의의 분자, 예컨대 푸린, 쿠즈바니안 또는 rab 단백질을 코딩하는 핵산, 또는 그의 단편 또는 유도체 또는 우성 활성 돌연변이체, 또는 상기 단백질에 결합하고 그의 기능을 활성화시키는 펩티드모방체 또는 펩티드 유사체 또는 유기 분자일 수 있다.
미국 특허 번호 5,780,300 (본원에 참조로 포함됨)은 노치 경로를 활성화시키는데 사용될 수 있는 노치 효능제 분자의 부류 (및 그들의 확인 방법), 예를 들어 RBP-Jκ를 갖는 노치 안키린 반복부의 해리를 촉발시킴으로써 세포질로부터 핵으로의 RBP-Jκ의 전위를 촉진시키는 분자를 추가로 개시하고 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, DXI 확장 방법이 사용된다. 노치 효능제는 미국 특허 번호 7,399,633에 기재된 바와 같은 IgG의 Fc 부분에 융합된 단백질의 세포외 도메인으로 이루어진 델타 (델타ext-IgG 또는 DXI)의 고정화된 단편 또는 미국 특허 번호 10,208,286 (둘 다 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 고정화된 노치-1 또는 노치-2 특이적 항체이다. 바람직하게는, 델타1ext-IgG는 세포 배양 디쉬의 표면 상에 고정화된다. 구체적인 실시양태에서, 세포 배양 디쉬를 4℃에서 밤새 (또는 37℃에서 최소 2시간 동안) 포스페이트 완충 염수 중 2.5 μg/ml 델타1ext-IgG 및 5 μg/ml 레트로넥틴® (rFN-CH-296으로도 지칭되는 재조합 인간 피브로넥틴 단편)으로 코팅한 후, 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 첨가한다. 바람직하게는, 세포 배양 배지는 10 ng/ml 재조합 인간 인터류킨-3 (rhIL-3), 50 ng/ml 재조합 인간 인터류킨-6 (rhIL-6), 50 ng/ml 재조합 인간 트롬보포이에틴 (rhTPO), 50 ng/ml 재조합 인간 Flt-3 리간드 (rhFlt-3L), 50 ng/ml 재조합 인간 줄기 세포 인자 (rhSCF)로 보충된 스템스팬™ 혈청 무함유 확장 배지 (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버), 또는 재조합 인간 rhSCF, rhFlt-3L, rhTPO, rhIL-6 (각각 50 ng/ml 최종 농도로), 및 rhIL-3 (10 ng/ml 최종 농도로)으로 보충된 스템스팬 혈청 무함유 확장 배지 II (SFEM II, 스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)로 이루어진다. 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 약 7 내지 약 14일 동안 배양된다.
확장된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포가 얻어져 확장된 줄기 세포 생성물을 형성하면, 확장된 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단은 예를 들어, "기성품" 생성물을 제조하기 위해 수집되고 동결보존될 수 있다. 한 실시양태에서, 확장된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단은 1개 이상의 백 (또는 단위)에서 나누어지고 동결될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 2개 이상의 확장된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단은 풀링되고, 별개의 분취물로 나누어질 수 있고, 각각의 분취물은 동결된다. 바람직한 실시양태에서, 약 5천만 내지 약 4억개의 CD34+ 세포는 확장된 줄기 세포 생성물의 단일 백 (또는 단위)에서 동결된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 약 1억 내지 약 3억개의 CD34+ 세포는 확장된 줄기 세포 생성물의 단일 백 (또는 단위)에서 동결된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 약 1억, 2억, 3억 또는 4억개의 CD34+ 세포는 확장된 줄기 세포 생성물의 단일 백 (또는 단위)에서 동결된다.
바람직한 실시양태에서, 확장된 줄기 생성물은 신선하며, 즉, 이는 확장 또는 동결보존 전에 이전에 동결되지 않았다. 용어 "동결된/동결하는" 및 "동결보존된/동결보존하는"은 본 출원에서 상호교환가능하게 사용된다. 동결보존은 세포를 생존 형태로 동결하는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의할 수 있다. 세포의 동결은 통상적으로 파괴적이다. 냉각시, 세포 내의 물은 동결된다. 이어서 세포막에 대한 삼투 효과, 세포 탈수, 용질 농도, 및 얼음 결정 형성에 의해 손상이 일어난다. 얼음이 세포 외부에서 형성됨에 따라, 이용가능한 물은 용액으로부터 제거되고, 세포로부터 빠져나가, 삼투 탈수를 유발하고, 용질 농도를 상승시키며, 이는 결국 세포를 파괴한다. 논의에 대해서는, 문헌 [Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251-272]을 참조한다.
이들 손상 효과는 (a) 동결보호제의 사용, (b) 동결 속도의 제어, 및 (c) 분해 반응을 최소화하는 충분히 낮은 온도에서의 저장에 의해 회피될 수 있다.
사용될 수 있는 동결보호제는 디메틸 술폭시드 (DMSO) (Lovelock and Bishop, 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, 1961, Nature 190:1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘 (Rinfret, 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:576), 폴리에틸렌 글리콜 (Sloviter and Ravdin, 1962, Nature 196:548), 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨 (Rowe et al., 1962, Fed. Proc. 21:157), D-소르비톨, i-이노시톨, D-락토스, 콜린 클로라이드 (Bender et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15:520), 아미노산 (Phan The Tran and Bender, 1960, Exp. Cell Res. 20:651), 메탄올, 아세트아미드, 글리세롤 모노아세테이트 (Lovelock, 1954, Biochem. J. 56:265), 무기 염 (Phan The Tran and Bender, 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388; Phan The Tran and Bender, 1961, in Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, Ilbery ed., Butterworth, London, p. 59), 및 크리오스토르(CryoStor)® CS10 (바이오라이프 솔루션즈 인크.(BioLife Solutions Inc.), 미국 워싱턴주 보텔)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 저 농도에서 세포에 비독성인 액체인 DMSO가 사용된다. 혈장의 첨가 (예를 들어, 약 20 내지 25%의 농도로)는 DMSO의 보호 효과를 증강시킬 수 있다. DMSO의 첨가 후, 세포는 동결될 때까지 0℃에서 보관되어야 하는데, 이는 약 1%의 DMSO 농도는 4℃ 초과의 온도에서 독성이기 때문이다.
제어된 느린 냉각 속도는 중요할 수 있다. 상이한 동결보호제 (Rapatz et al., 1968, Cryobiology 5(1):18-25) 및 상이한 세포 유형은 상이한 최적 냉각 속도를 갖는다 (예를 들어, 골수-줄기 세포의 생존에 대한 및 그들의 이식 잠재성에 대한 냉각 속도의 효과에 대해서는, 문헌 [Rowe and Rinfret, 1962, Blood 20:636]; [Rowe, 1966, Cryobiology 3(1):12-18]; [Lewis, et al., 1967, Transfusion 7(1):17-32]; 및 [Mazur, 1970, Science 168:939-949] 참조). 물이 얼음으로 변하는 융합 상의 열은 최소이어야 한다. 냉각 절차는 예를 들어, 프로그램가능한 동결 장치 또는 메탄올 조 절차의 사용에 의해 수행될 수 있다.
프로그램가능한 동결 장치는 최적 냉각 속도의 결정을 허용하며, 표준 재현가능한 냉각을 용이하게 한다. 프로그램가능한 제어된-속도 동결기, 예컨대 크리오메드(Cryomed) 또는 플라나(Planar)는 바람직한 냉각 속도 곡선으로의 동결 요법의 조정을 허용한다. 예를 들어, 10% DMSO 및 20% 혈장 중 골수 세포에 대해, 최적 속도는 0℃에서 -80℃까지 1° 내지 3℃/분이다. 바람직한 실시양태에서, 이 냉각 속도가 사용될 수 있다. 세포를 보유하는 용기는 극저온 온도에서 안정하고, 동결 및 해동 둘 다의 효과적인 제어를 위해 급속한 열 전달을 허용해야 한다. 밀봉된 플라스틱 바이알 (예를 들어, 눈크(Nunc), 휘튼 크리얼스) 또는 유리 앰풀은 다수의 소량 (1 내지 2 ml)을 위해 사용될 수 있는 반면, 보다 큰 부피 (100 내지 200 ml)는 냉각 동안의 보다 양호한 열 전달을 위해 금속 플레이트 사이에 보유된 폴리올레핀 백 (예를 들어, 델메드(Delmed))에서 동결될 수 있다. 골수 세포의 백은 이들을 우연히 대략 3℃/분의 냉각 속도를 제공하는 -80℃ 동결기에 정치함으로써 성공적으로 동결되었다).
대안적인 실시양태에서, 메탄올 조 냉각 방법이 사용될 수 있다. 메탄올 조 방법은 대규모로 다수의 작은 항목의 통상적인 동결보존에 매우 적합하다. 방법은 동결 속도의 수동 제어 및 속도를 모니터링하기 위한 레코더를 요구하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, DMSO-처리된 세포는 얼음 상에서 사전-냉각되고, 냉장된 메탄올을 함유하는 트레이에 옮겨지며, 이는 이어서 기계적 냉장고 (예를 들어, 해리스(Harris) 또는 레브코(Revco))에서 -80℃에서 정치된다. 메탄올 조 및 샘플의 열전대 측정은 1° 내지 3℃/분의 바람직한 냉각 속도를 지시한다. 적어도 2시간 후, 시편은 -80℃의 온도에 도달하였고, 영구 저장을 위해 액체 질소 (-196℃) 내로 직접적으로 정치될 수 있다.
철저한 동결 후, 확장된 줄기 세포 생성물은 장기 극저온 저장 용기에 급속하게 옮겨질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 액체 질소 (-196℃) 또는 그의 증기 (-165℃)에 극저온 저장될 수 있다. 이러한 저장은 열 누출 및 질소 소실이 절대 최소로 유지되도록, 극도로 낮은 진공 및 내부 초절연을 갖는 대형 써모스(Thermos) 용기와 유사한 고도로 효율적인 액체 질소 냉장고의 이용가능성에 의해 크게 용이하게 된다.
적합한 래킹 시스템은 상업적으로 입수가능하며, 목록화, 저장, 및 개별적 시편의 회수에 사용될 수 있다.
특히 골수 또는 말초 혈액으로부터의 조혈 줄기 세포의 조작, 동결보존, 및 장기 저장을 위한 고려사항 및 절차는 대체로 확장된 조혈 줄기 세포 또는 줄기 및 전구 세포에 적용가능하다. 이러한 논의는 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 하기 참고문헌에서 발견될 수 있다: Gorin, 1986, Clinics In Haematology 15(1):19-48; Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, July 22-26, 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, pp. 107-186.
생존 세포의 동결보존의 다른 방법, 또는 그의 변형이 이용가능하며, 사용을 위해 상정된다 (예를 들어, 냉각 금속-거울 기술; 문헌 [Livesey and Linner, 1987, Nature 327:255]; [Linner et al., 1986, J. Histochem. Cytochem. 34(9):1123-1135]; 또한 세칸(Senkan) 등에 의한 미국 특허 번호 4,199,022, 슈바르츠(Schwartz)에 의한 미국 특허 번호 3,753,357, 파이(Fahy)에 의한 미국 특허 번호 4,559,298 참조).
동결보존된 또는 동결된 세포는 바람직하게는 신속하게 해동되고 (예를 들어, 37°내지 41℃에서 유지된 수조에서), 해동 즉시 냉장된다. 구체적인 실시양태에서, 동결된 세포를 함유하는 바이알은 가온 수조에서 그의 목까지 침지될 수 있으며; 부드러운 회전은 세포 현탁액의 혼합을 보장할 것인데, 이는 그것이 해동하고, 수조로부터 내부 얼음 덩어리로의 열 전달을 증가시키기 때문이다. 얼음이 완전히 용해되자마자, 바이알은 얼음에 즉시 정치될 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 해동되거나, 그의 부분은 이를 필요로 하는 (예를 들어, AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 인간 환자에 주입될 수 있다. 해동된 세포의 프로세싱에 관한 몇몇 절차가 이용가능하며, 바람직한 것으로 간주되는 경우 채용될 수 있다.
해동시 세포 클럼핑을 방지하기 위해 세포를 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 클럼핑을 방지하기 위해, DN아제 (Spitzer et al., 1980, Cancer 45:3075-3085), 저분자량 덱스트란 및 시트레이트, 히드록시에틸 전분 (Stiff et al., 1983, Cryobiology 20:17-24) 등의 동결 전 및/또는 후의 첨가를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 절차가 사용될 수 있다.
동결보호제는, 인간에서 독성인 경우, 해동된 확장된 줄기 세포 생성물의 치료적 사용 전에 제거되어야 한다. 동결보존제로서 DMSO를 채용하는 실시양태에서, 세포 소실을 회피하기 위해 이 단계를 생략하는 것이 바람직하다. 그러나, 동결보호제의 제거가 바람직한 경우, 제거는 바람직하게는 해동시 달성된다.
동결보호제를 제거하는 한 방법은 비유의한 농도로의 희석에 의한 것이다. 이는 배지의 첨가, 이어서, 필요에 따라, 세포를 펠릿화하기 위한 원심분리의 1개 이상의 사이클, 상청액의 제거, 및 세포의 재현탁에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 해동된 세포 중의 세포내 DMSO는 회수된 세포에 유해하게 영향을 미치지 않을 수준 (1% 미만)까지 감소될 수 있다. 이는 바람직하게는 DMSO 제거 동안 일어나는 삼투 구배를 잠재적으로 손상시키는 것을 최소화하기 위해 서서히 수행된다.
동결보호제의 제거 후, 세포 카운트 (예를 들어, 혈구계측기의 사용에 의해) 및 생존율 시험 (예를 들어, 트리판 블루 배제에 의해; Kuchler, 1977, Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa., pp. 18-19; 1964, Methods in Medical Research, Eisen et al., eds., Vol. 10, Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, pp. 39-47)은 세포 생존을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 생존 항원 (예를 들어, CD34) 양성 세포의 백분율은 세포의 분취물 중의 7-AAD (또는 생존 세포에 의해 배제된 다른 적합한 염료)를 배제한 항원 양성 세포의 수를 세포의 분취물 중의 유핵 세포 (TNC) (생존 및 비-생존 둘 다)의 총 수로 나누어 계산함으로써 결정될 수 있다. 이어서 생존 항원 양성 세포의 수는 생존 항원 양성 세포의 백분율을 TNC로 곱합으로써 결정될 수 있다.
동결보존 전에 및/또는 해동 후에, 유핵 세포의 총 수, 또는 구체적인 실시양태에서, CD34+ 세포의 총 수가 결정될 수 있다. 예를 들어, 총 유핵 세포 카운트는 혈구계측기 및 트리판 블루 염료의 배제를 사용함으로써 수행될 수 있다. 높은 세포충실성의 것인 시편은 수동 카운팅을 위한 적절한 농도 범위로 희석될 수 있다. 생성물에 대한 최종 세포 카운트는 임의의 희석 인자에 대해 보정된다. 총 유핵 세포 카운트 = mL 당 생존 유핵 세포 x mL로의 생성물의 부피. 샘플 중의 CD34+ 양성 세포의 수는 예를 들어, 형광색소에 접합된 항-CD34 모노클로날 항체를 사용한 유동 세포계측법의 사용에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 동결보존 전의 출발 조혈 줄기 세포 또는 줄기 및 전구 세포 집단, 제대혈 및/또는 태반 혈액, 또는 확장된 줄기 세포 생성물, 또는 해동 후의 확장된 줄기 세포 생성물의 신원 및 순도는 다중-파라미터 유동 세포계측 면역표현형결정으로 처리될 수 있으며, 이는 샘플에 존재하는 생존 항원 양성 세포의 백분율을 제공한다. 각각의 샘플은 형광색소에 직접적으로 접합된 모노클로날 항체의 패널을 사용하여 하기 세포 표현형 중 하나 이상에 대해 시험될 수 있다:
1. CD34+ HPC
2. T 세포 (CD3+, CD4+ 및 CD8+ 하위세트 둘 다를 포함함)
3. B 세포 (CD19+ 또는 CD20+)
4. NK 세포 (CD56+)
5. 단핵구 (CD14+)
6. 골수단핵구 (CD15+)
7. 거핵구 (CD41+)
8. 수지상 세포 (계통 음성/HLA-DR브라이트 및 CD123브라이트, 또는 계통 음성/HLA-DR브라이트 및 CD11c브라이트).
치료 방법
본 발명에 따르면, AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자에 대한 치료 결과를 개선시키는 방법이 제공된다. AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 환자는 화학치료 요법, 또는 그의 사이클을 투여하고, 이어서 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 환자에게 투여함으로써 치료되고, 여기서 투여는 확장된 줄기 세포 생성물의 HLA-유형을 환자의 HLA-유형에 매칭시키지 않고 수행된다. 확장된 줄기 세포 생성물은 공여자의 HLA 유형에 서로에 매칭시키지 않고 및 또한 환자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 적어도 2명 또는 적어도 4명의 인간 공여자로부터의 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포로부터 유래된 풀링된 생성물이다. 어구 "HLA-유형을 매칭시키지 않고"는 확장된 줄기 세포 생성물 (또는 확장된 줄기 세포 생성물 중의 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포)에 기여하는 환자 사이의 및/또는 공여자 사이의 임의의 HLA 항원 또는 대립유전자 매치를 갖기 위한 단계가 취해지지 않는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량은 화학치료 요법 또는 그의 사이클, 예컨대 유도 요법 후에 투여될 수 있다. 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량은 또한 강화 요법 또는 그의 사이클 후에 투여될 수 있다. 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량은 또한 구제 요법 또는 그의 사이클 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량은 바람직할 경우 또는 필요에 따라, 제2 유도 요법 또는 그의 사이클 또는 유도 요법의 제2 사이클 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량은 바람직할 경우 또는 필요에 따라 제2 강화 요법 또는 그의 사이클, 또는 강화 요법의 제2 사이클 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량은 바람직할 경우 또는 필요에 따라 제2 구제 요법 또는 그의 사이클, 또는 구제 요법의 제2 사이클 후에 투여될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 확장된 줄기 세포 생성물은 전형적으로 1개 초과의 사이클을 갖는 요법에 대해, 요법의 마지막 용량이 투여된 후에, 또는 요법의 각각의 사이클의 마지막 용량 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 요법이 완료된 후 약 12 내지 약 48시간, 또는 바람직하게는 요법의 완료 후 약 24 내지 약 36시간에 투여된다.
일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 화학치료 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 유도 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 강화 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물은 구제 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 청소된 후에 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 화학치료 요법 (예컨대 유도, 구제 또는 강화 요법)이 1개 초과의 사이클로 투여되는 경우, 확장된 줄기 세포 생성물은 각각의 사이클 후에 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여된다. 본원에 사용된 "... 요법 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에"는 예컨대 CD34+ 줄기 세포 또는 전구 세포 생존율을 적어도 5%, 적어도 10% 또는 적어도 20% 감소시키는 것에 의한, 환자의 혈액에서 CD34+ 줄기 세포의 생존율에 영향을 미칠 요법 (예를 들어, 화학치료 요법, 유도 요법, 구제 요법 또는 강화 요법)의 성분 및 그들 성분의 활성 대사물의 제거를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 화학치료 요법은 유도 요법이다. 일부 실시양태에서, 유도 요법은 시타라빈 및 안트라시클린, 예컨대 다우노루비신 또는 이다루비신의 투여이다. 일부 실시양태에서, 화학치료 요법은 시타라빈 및 다우노루비신 또는 이다루비신의 "7 + 3" 요법이다. 시타라빈의 조합 (시토사르(Cytosar)-U®)은 약 4 내지 약 7일에 걸쳐 주어지고, 약 3일 동안 주어진 안트라시클린 약물, 예컨대 다우노루비신 (세루비딘(Cerubidine)®) 또는 이다루비신 (이다마이신(Idamycin)®)은 가장 자주 사용된다. 환자는 또한 보다 낮은 백혈구 카운트를 돕기 위해 히드록시우레아 (드록시아(Droxia)®, 히드레아(Hydrea)®)가 주어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 일부 노인에 대해 데시타빈 (다코겐(Dacogen)™), 아자시티딘 (비다자(Vidaza)®), 및 저 용량 시타라빈이 유도 요법에서 대신 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유도 요법은 GCLAC, 즉, G-CSF, 클로파라빈 및 고 용량 시타라빈의 투여이다.
일부 실시양태에서, 화학치료 요법은 강화 요법이다. 일부 실시양태에서, 강화 요법은 고 용량 시타라빈의 투여이다. 일부 실시양태에서, 강화 요법은 중간 용량 시타라빈이다. 일부 실시양태에서, 고- 또는 중간-용량 시타라빈의 2 내지 4 사이클 (라운드)이 투여된다. 확장된 줄기 세포 생성물은 각각의 사이클 후에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학치료 요법은 구제 요법이다. 일부 실시양태에서, 구제 요법은 클라드리빈, 고 용량 시타라빈 및 G-CSF의 투여 (CLAG)이다. 일부 실시양태에서, 구제 요법은 에토포시드, 시타라빈 및 미톡산트론의 조합 (MEC)이다. 확장된 줄기 세포 생성물은 각각의 사이클 후에 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, 화학치료 요법은 7 + 3 (Ara-C (시타라빈)의 7일 더하기 안트라시클린 항생제, 다우노루비신 (DA 또는 DAC 변형) 또는 이다루비신 (IA 또는 IAC 변형) 중 어느 하나의 3일); 5 + 2 (Ara-C (시타라빈)의 5일 더하기 이다루비신 (IA 또는 IAC 변형)의 2일; BACOD (블레오마이신, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손); CBV (시클로포스파미드, BCNU (카르무스틴), VP-16 (에토포시드)); CHOEP (시클로포스파미드, 히드록시다우노루비신 (독소루비신), 에토포시드, 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®), 프레드니손); CEPP (시클로포스파미드, 에토포시드, 프로카르바진, 프레드니손); CHOP (시클로포스파미드, 히드록시다우노루비신 (독소루비신), 빈크리스틴, 프레드니손); CHOP-R 또는 R-CHOP (CHOP + 리툭시맙); CVAD 및 하이퍼-CVAD (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 덱사메타손); DA 또는 DAC (다우노루비신 x 3일 더하기 ara-C (시타라빈) x 7일, 7 + 3 요법의 변형); DAT (다우노루비신, 시타라빈 (ara-C), 티오구아닌); DHAP (덱사메타손, 시타라빈 (ara-C), 백금 작용제); DHAP-R 또는 R-DHAP (덱사메타손, 시타라빈 (ara-C), 백금 작용제 더하기 리툭시맙); DICE (덱사메타손, 이포스파미드, 시스플라틴, 에토포시드 (VP-16)); EPOCH (에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 및 히드록시다우노루비신); EPOCH-R 또는 R-EPOCH (에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 및 히드록시다우노루비신 더하기 리툭시맙); ESHAP (에토포시드, 메틸프레드니솔론, 시타라빈 (ara-C), 백금 작용제); FCM 또는 FMC (플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론); FCM-R 또는 R-FCM 또는 R-FMC 또는 FMC-R (플루다라빈, 시클로포스파미드, 미톡산트론 더하기 리툭시맙); FCR (플루다라빈, 시클로포스파미드, 리툭시맙); FM (플루다라빈, 미톡산트론); FM-R 또는 R-FM 또는 RFM 또는 FMR (플루다라빈, 미톡산트론, 및 리툭시맙); FLAG (플루다라빈, 시타라빈, G-CSF); FLAG-Ida 또는 FLAG-IDA 또는 IDA-FLAG 또는 Ida-FLAG (플루다라빈, 시타라빈, 이다루비신, G-CSF); FLAG-Mito 또는 FLAG-MITO 또는 Mito-FLAG 또는 MITO-FLAG 또는 FLANG (미톡산트론, 플루다라빈, 시타라빈, G-CSF); FLAMSA (플루다라빈, 시타라빈, 암사크린); FLAMSA-BU 또는 FLAMSA-Bu (플루다라빈, 시타라빈, 암사크린, 부술판); FLAMSA-MEL 또는 FLAMSA-Mel (플루다라빈, 시타라빈, 암사크린, 멜팔란); GDP (겜시타빈, 덱사메타손, 시스플라틴); GemOx 또는 GEMOX (겜시타빈, 옥살리플라틴); GemOx-R 또는 GEMOX-R 또는 R-GemOx 또는 R-GEMOX (겜시타빈, 옥살리플라틴, 리툭시맙); GCLAC (G-CSF, 클로파라빈 및 고 용량 시타라빈); IA 또는 IAC (이다루비신 x 3일 더하기 Ara-C (시타라빈) x 7일); ICE (이포스파미드, 카르보플라틴, 에토포시드 (VP-16)); ICE-R 또는 R-ICE 또는 RICE (ICE + 리툭시맙); m-BACOD (메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신 (아드리아마이신(Adriamycin)®), 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손); MACOP-B (메토트렉세이트, 류코보린 (폴린산), 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신); MINE (메스나, 이포스파미드, 노반트론, 에토포시드); MINE-R 또는 R-MINE (메스나, 이포스파미드, 노반트론, 에토포시드 더하기 리툭시맙); ProMACE-MOPP (메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포시드 및 MOPP); R-Benda (리툭시맙 + 벤다무스틴); R-DHAP 또는 DHAP-R (리툭시맙 + DHAP); R-FCM 또는 FCM-R (리툭시맙 + FCM); R-ICE 또는 ICE-R 또는 RICE (리툭시맙 + ICE); 또는 TAD (티오구아닌, 시타라빈 (ara-C), 다우노루비신)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물의 투여는 환자가 완화를 달성할 기회를 개선시킴으로써 AML을 갖는 환자의 치료 결과를 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물의 투여는 환자가 완전한 반응/완화 (CR), 예를 들어, 형태학적 CR, 세포유전학적 CR, 또는 분자적 CR, 또는 불완전한 혈액 카운트 회복을 갖는 완전한 반응/완화 (CRi)를 달성할 기회를 개선시킴으로써 AML을 갖는 환자의 치료 결과를 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 개선된 치료 결과는 형태학적 백혈병 없는 상태, 부분적 반응 또는 안정한 질환 이외의 것이다. 일부 실시양태에서, 개선된 치료 결과는 확장된 줄기 세포 생성물의 투여 후의 환자에서의 IL-2 수준의 증가와 연관된다.
일부 실시양태에서, AML을 갖는 환자는 약 20 내지 약 60세이다. 일부 실시양태에서, AML을 갖는 환자는 20세 미만이다. 일부 실시양태에서, AML을 갖는 환자는 60세 초과 또는 70세 초과이다. 일부 실시양태에서, AML을 갖는 환자는 60세 초과 또는 70세 초과이고, 감소된 강도 화학치료 요법을 받고 있다.
확장된 줄기 세포 생성물은 환자의 치료 결과를 개선시키기 위해, AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는, 이를 필요로 하는 인간 환자에게 고정 용량으로서 투여된다. 바람직하게는, 확장된 줄기 세포 생성물은 주입, 예컨대 정맥내 주입에 의해 투여된다. 확장된 줄기 세포 생성물의 다른 적합한 투여의 방법은 본 발명에 의해 포함된다. 확장된 줄기 세포 생성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 볼루스 주사에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다.
투여되는 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량은 특정 장애 또는 상태, 예컨대 AML 또는 다른 혈액 악성종양, 예컨대 예를 들어 예컨대 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 신생물 (MPN) 및 비-호지킨 림프종 (NHL)의 치료에 유효하다. 일부 실시양태에서, 환자는 AML, 예컨대 재발성/난치성 AML, 새로 발생한 AML, 또는 치료-관련 AML을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 골수이형성 증후군 (MDS), 예컨대 다계통 이형성증을 갖는 MDS (MDS-MLD); 단일 계통 이형성증을 갖는 MDS (MDS-SLD); 환상 철적혈모세포를 갖는 MDS (MDS-RS); 과다 모세포를 갖는 MDS (MDS-EB); 단리된 del(5q)을 갖는 MDS 또는 분류불가능성 MDS (MDS-U)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 골수증식성 신생물 (MPN), 예컨대 만성 골수성 백혈병, 진성 적혈구증가증 (p. vera), 원발성 골수섬유증, 본태성 고혈소판증, 만성 호중구성 백혈병, 또는 만성 호산구성 백혈병을 갖는다.
구체적인 실시양태에서, 투여를 위한 확장된 줄기 세포 생성물의 적합한 고정 투여량은 용량 당 약 5천만, 7천5백만, 1억, 2억, 3억, 또는 4억개의 CD34+ 세포이고, 필요한 만큼 자주의 간격으로 1회, 2회, 3회, 또는 그 초과의 회수로 환자에게 투여될 수 있다. 확장된 줄기 세포 생성물이 동결되거나 동결보존된 생성물인 경우, CD34+ 세포의 수는 동결 또는 동결보존 전의 그들 세포의 수를 지칭한다. 구체적인 실시양태에서, 환자는 적용되는 바에 따라, 요법 당 또는 요법의 사이클 당 (예를 들어, 다중-사이클 요법에 대해) 확장된 줄기 세포 생성물의 단일 고정 용량을 받는다. 구체적인 실시양태에서, 환자는 요법의 사이클 당 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 받으며, 투여는 사이클의 완료 후에 일어난다. 구체적인 실시양태에서, 환자는 요법 당 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 받으며, 투여는 요법의 완료 후에 일어난다.
제약 조성물
확장된 줄기 세포 생성물은 확장된 줄기 세포 생성물의 치료 유효량인 고정 용량을 포함하는 제약 (치료) 조성물로서 환자에게 투여될 수 있고, 여기서 투여는 확장된 줄기 세포 생성물의 HLA-유형을 환자에 또는 확장된 줄기 세포 생성물 중의 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포에 서로에 매칭시키지 않고 수행된다.
본 발명은 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 확장된 줄기 세포 생성물의 치료 유효량인 고정 용량, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 담체 및 조성물은 바람직하게는 멸균성이다. 제제는 투여의 방식에 적합해야 한다. 제약 조성물은 인간에서의 치료 용도를 위해 허용된다. 조성물은 바람직할 경우 또한 pH 완충제를 함유할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 통상적인 절차에 따라 인간에의 줄기 세포의 정맥내 투여를 위해 적응된 제약 조성물로서 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중 용액이다. 필요할 경우, 조성물은 또한 주사의 부위에서의 통증을 완화시키기 위해 가용화제 및 국소 마취제, 예컨대 리도카인을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 확장된 줄기 세포 생성물 및 희석제, 예컨대 멸균 등장성 수성 완충제의 1개 이상의 용량으로 충전된 1개 이상의 용기 또는 백을 포함하는 제약 팩 또는 키트를 제공한다. 임의로 이러한 용기(들) 또는 백과 연관되는 것은 제약 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 처방된 형태로의 통지일 수 있으며, 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 AML 또는 다른 혈액 악성종양을 갖는 환자에 대한 치료 결과를 개선시키기 위한 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량의 용도를 제공하고, 여기서 확장된 줄기 세포 생성물은 다수의 공여자로부터의 확장된 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 풀을 포함하고, 여기서 조혈 줄기 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 서로에 또는 환자에 HLA-매칭되지 않았다. 일부 실시양태에서, 확장된 조혈 줄기 또는 줄기 및 전구 세포는 CD34+이다. 일부 실시양태에서, 확장된 줄기 세포 생성물의 적합한 고정 용량은 약 5천만, 7천5백만, 1억, 2억, 3억, 또는 4억개의 CD34+ 세포이다.
실시예
실시예 1: 인간 제대혈 단위로부터의 인간 확장된 줄기 세포 생성물의 생성
하기 섹션은 도 1에서 흐름도로서 묘사된 바와 같은 확장된 줄기 세포 생성물의 생산 및 저장을 기재한다.
제대혈/태반 혈액 단위(들)를 출생시 인간 공여자로부터 수집하였다. 이어서 수집된 혈액을 항-응고제와 혼합하여 응고를 방지하였다. 혈액을 모니터링된 냉장고에서 4℃에서 격리 하에 저장하였다. 받은 단위를 평가하고, 확장을 위해 프로세싱될 단위를 결정하였다. 하기 정보를 단위에 대해 수집하였다: 받은 날짜, 단위의 연령 (시간으로), 공여자의 임신 나이 (주수로), 공여자의 성별, 및 단위의 부피. 또한, 각각의 단위의 총 유핵 세포 카운트 및 총 CD34+ 세포 카운트를 결정하고, 퍼센트 CD34+ 세포를 계산하였다. 단위가 350만개 미만의 CD34+ 세포를 가진 경우, 단위를 버렸다. 단위를 확장을 위해 선택한 경우, 이를 격리로부터 제거하고, 고유한 로트 번호 식별자로 할당하였으며, 이는 제조 과정 전반에 걸쳐 보유된다.
확장 배양의 계획된 개시 전에, 조직 배양 용기를 먼저 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 최소 2시간 동안 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 2.5 μg/ml의 델타1ext-IgG 및 5 μg/ml의 레트로넥틴® (재조합 인간 피브로넥틴 단편) (클론테크 래버러토리스, 인크.(Clontech Laboratories, Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨)으로 코팅하였다. 이어서 플라스크를 PBS로 세척하고, 이어서 PBS-2% 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 차단하였다. 신선한 제대혈 단위를 클리니막스® 플러스 세포 분리 시스템을 사용하여 프로세싱하여 CD34+ 세포에 대해 선택하였다. CD34+ 세포 선택 전에, 신선한 제대혈 단위의 분취물을 총 세포 카운트 및 CD34+ 세포 함량에 대해 점검하였다. CD34+ 및 CD34- 세포 분획 둘 다를 프로세싱 후에 회수하였다. 풍부화 후, CD34+ 세포의 백분율은 풍부화 전의 샘플 중의 CD34+ 세포의 백분율에 비해 88 내지 400배 증가하였다. 풍부화된 CD34+ 세포 분획을 rhIL-3 (10 ng/ml), rhIL-6 (50 ng/ml), rhTPO (50 ng/ml), rhFlt-3L (50 ng/ml), rhSCF (50 ng/ml)로 보충된 스템스팬™ 혈청 무함유 확장 배지 II (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)로 이루어진 최종 배양 배지에 재현탁시켰다.
다수의 공여자로부터의 CD34+ 풍부화된 세포를 ≤ 1.8 x 104개의 총 유핵 세포/용기 표면적의 cm2의 농도로 특이적으로 표지되고 제조된 조직 배양 용기에 첨가하고, 이어서 단지 생성물의 그 로트에 전념하는 개별적으로 모니터링되고 알람화된 인큐베이터 내로 정치하였다. CD34+ 풍부화된 세포는 서로에 HLA-매칭되지 않았다. 약 2 내지 약 4일의 배양 후, 신선한 배양 배지 (상기와 같음)의 원래 부피의 50%를 용기에 첨가하였다. 세포 배양 용기를 인큐베이터로부터 주기적으로 (1 내지 3일마다) 제거하고, 도립 현미경에 의해 세포 성장 및 오염의 징후에 대해 검사하였다. 약 제5 내지 8일에, 용기를 부드럽게 교반하여 세포를 혼합하고, 1 ml 샘플을 과정 시험에서를 위해 제거하였다. 세포의 샘플을 카운팅하고, CD34, CD7, CD14, CD15 및 CD56의 발현에 대해 표현형결정하였다. 배양 기간 전반에 걸쳐, 세포 밀도가 ≥ 8 x 105개의 세포/ml로 증가하는 경우 필요에 따라 세포를 추가의 플라스크에 옮겼다. 동결보존을 위한 세포를 수거하기 전날, 신선한 배지를 첨가하였다.
제14일에, 확장된 줄기 세포 집단을 동결보존을 위해 수거하였다. 용기를 교반하고, 전체 내용물을 멸균 500 ml 원심분리 튜브에 옮겼다. 수거된 세포를 원심분리하고, 이어서 포스페이트 완충 염수 (PBS)에서의 원심분리에 의해 1회 세척하고, 인간 혈청 알부민 (HAS), 물 중 균형 전해질의 멸균, 비발열성 등장성 용액 (노르모솔(Normosol)-R®; 호스피라(Hospira), 미국 일리노이주 레이크 포레스트) 및 10% DMSO를 함유하는 디메틸술폭시드 (DMSO) 또는 크리오스토르® CS10 동결보존 배지를 함유하는 동결보호제 용액에 재현탁시켰다. 샘플을 방출 시험의 완료를 위해 취하였다. 확장된 줄기 세포 생성물을 제어된-속도 동결기에서 동결시키고, 증기-상 액체 질소 (LN2) 동결기 중의 저장소에 옮겼다.
배양 기간의 종료시, 생성된 세포 집단은 CD34, CD7, CD14, CD15 및 CD56 항원의 존재에 대한 유동 세포계측 분석에 의해 입증된 바와 같이, CD34+ 줄기 및 전구 세포 및 보다 성숙한 골수 및 림프 전구체로 이루어진 균질성이었다. CD34+ 세포의 약 100 내지 약 400배 확장 및 총 세포 수의 617 내지 3337배 확장 (N = 상기 기재된 바와 같이 최종 확장 절차에 따라 프로세싱된 9개의 개별적 제대혈 단위)의 범위의 배양 기간 동안 CD34+ 및 총 세포 수의 유의한 증가가 있었다. 면역표현형결정에 의해 측정된 바와 같은 T 세포의 본질적으로 완전한 결여가 있었다. 기능적으로, 이들 세포는 이전에 기재된 바와 같이 NOD/SCID 마우스 모델에서 다계통 인간 조혈 생착이 가능하다 (미국 특허 공개 번호 2013/0095079 참조).
실시예 2: 동결된 인간 제대혈 단위로부터의 인간 확장된 줄기 세포 생성물의 생성
풀링된 인간 제대혈 단위 (4 내지 20개의 개별적 단위의 풀)로부터 선택된 풍부화된 CD34+ 세포로부터 생성된 총 세포 자손을 함유하는 확장된 줄기 세포 생성물을 제조하였다. 풀링된 인간 제대혈 단위를 하기와 같이 노치 리간드 델타1ext -IgG (DXI) 및 재조합 시토카인의 존재 하에서 배양하였다.
약 2백만 내지 2천만개의 세포를 갖는 제대혈 단위를 사용을 위해 선택하였다. 제대혈 단위를 해동시키고, 이어서 원심분리하여 동결보호제를 제거하고, 선택 완충제에 재현탁시키고, 단일 용기 내로 풀링하였다. 선택 완충제는 전형적으로 1 mM EDTA 및 다른 성분을 갖는 PBS였다. 제대혈 단위를 전형적으로 쌍으로 해동시켰다. 세포를 선택된 완충제에서 2회 세척하였다. 세포를 HLA 항원 또는 대립유전자의 고려 없이 풀링하였다 (즉, 비매칭됨). 풀링된 제대혈 단위를 상자성 비드와 함께 사전-인큐베이션하고, 이어서 클리니막스에 의해 프로세싱하여 단일 사용 튜빙 세트를 사용하여 CD34+ 세포를 풍부화하였다. 선택 후, 세포를 원심분리하고, 수집된 CD34+ 세포를 세포 배양 배지 (5가지 재조합 인간 시토카인 IL-3 (10 ng/ml), 및 IL-6, TPO, SCF, 및 Flt-3L (각각 50 ng/ml로)로 보충된 스템스팬 혈청 무함유 확장 배지 II (SFEMII) 배지)에 현탁시켰다. 이어서 풍부화된 CD34+ 세포를 샘플링하여 생존 세포 수득량 및 조성물 중 CD34+ 세포의 백분율을 결정하였다. CD34+ 세포를 5가지 재조합 인간 시토카인 (IL-3, IL-6, TPO, SCF, Flt-3L))으로 보충된 스템스팬 SFEMII 배지를 사용하여 적합한 표적 시드 밀도로 코팅된 플라스크 내로 정치하였다. 사용 전에, 플라스크를 재조합 단백질 DXI (2.5 마이크로그램/ml) 및 레트로넥틴® 재조합 인간 피브로넥틴 단편 (rFN-CH-206) (5 마이크로그램/ml)으로 코팅하고; 비결합된 단백질을 사용 전에 플라스크로부터 세척하였다. 플라스크를 필요에 따라 신선한 SFEMII 배지 및 시토카인으로 공급하였다. 세포가 충분한 세포 수에 도달한 경우, 세포를 수거하고, 풀링하고, 동일한 SFEMII 배지 및 5가지 시토카인을 사용하여 적합한 표적 시드 밀도로 보다 큰 용기 내로 통과시켰다. 용기를 또한 상기 기재된 바와 같이 DXI 및 레트로넥틴® 재조합 인간 피브로넥틴 단편 (rFN-CH-206)으로 밤새 사전-코팅하였다. 용기를 세포 밀도 및 생존율에 대해 모니터링하고, 필요에 따라 신선한 SFEMII 배지 및 시토카인의 충분한 부피까지 공급하였다. 세포가 바람직한 세포 밀도에 도달한 경우, 세포를 약간의 교반에 의해 수거하고, 원심분리에 의해 농축시키고, 배지를 제거하고, 세포를 세척 완충제 내로 재현탁시켰다. 생존 CD34+ 세포 카운트를 결정하였다. 세척 및 수거 후, 세포 펠릿을 알부민을 갖는 균형 전해질 용액에 재현탁시켰다. 최종 줄기 세포 생성물은 전형적으로 약 5천만 내지 약 1억개의 세포/ml를 함유하였다.
이어서 최종 세포 생성물을 동결보호제 배지에 첨가하고, 이어서 표지된 크리오스토르 백 내로 무균 충전시키고, 제어된 속도 동결기에서 동결보존하고, <-150℃에서 증기-상 액체 질소 (LN2) 동결기에서 저장하였다. 백을 약 20 ml/백의 부피로 약 5천만 내지 약 4억개의 CD34+ 세포로 충전하였다. 동결보호제 배지는 기재된 바와 같은 노르모솔-R 또는 크리오스토르® CS10에 약 4% 인간 혈청 알부민 (HSA), 10% 디메틸술폭시드 (DMSO)를 함유하였다.
실시예 3: 확장된 줄기 세포 생성물로의 AML을 갖는 환자의 치료
강한 골수억제성 화학치료 요법을 겪은 급성 골수성 백혈병을 갖는 환자는 전체 치료 결과에 영향을 미치는 생명을 위협하는 감염에 대한 위험이 있다. 중증 박테리아 또는 진균 감염의 비율에 대한 비-HLA 매칭된, 풀링된 제대혈-유래 생체외 확장된 CD34+ 줄기 세포 생성물 (딜라누비셀 또는 NLA101)의 사용을 I상 및 2상 연구에서 조사하였다. 딜라누비셀을 유도 및 강화 화학치료과 함께 투여하였다. 전반적 2상 무작위 개방-표지 연구는 계획된 220명의 대상체 중 146명을 4개의 치료 부문 중 하나로 등록하였다: 치료의 표준 (SOC) 단독 또는 SOC 더하기 저, 중간, 또는 고 용량 딜라누비셀 (각각 100 x 106, 300 x 106, 또는 800 x 106개의 CD34+ 세포). 딜라누비셀의 최대 3개의 용량은 화학치료의 각각의 라운드로 주어질 수 있었고, 대상체를 화학치료 또는 딜라누비셀의 마지막 용량 후 최대 84일 또는 30일 동안 추적하였다. 연구가 중단된 경우, 감염 비율에 대한 특정 효과가 나타나지 않았으며, 놀랍게도, 딜라누비셀-치료된 대상체는 화학치료 단독을 받은 대조군 부문에 대한 환자와 비교하여 더 높은 완전한 반응 (CR) 비율을 경험하였다. 또한, 딜라누비셀로의 치료는 혈청 인터류킨-2 (IL-2) 수준의 일시적 용량-의존적 증가와 연관되었다. 데이터 안전성 모니터링 위원회-관련된 안전성 문제는 없었지만, 소수의 예상치 않은 심각한 유해 사건 (SAE)이 관찰되었다. 그러나, 이식편-대-숙주 질환 또는 시토카인 방출 증후군은 관찰되지 않았다.
물질 및 방법
시험 설계: 이 연구는 AML을 갖는 성인 대상체에서 화학치료-유도된 호중구감소증과 연관된 감염의 비율을 감소시키는 딜라누비셀의 안전성 및 효능의 2상 개방-표지, 다기관, 무작위, 대조, 용량-발견 연구였다. 이 연구는 미국 (US), 대한민국 (SK), 및 오스트레일리아 (AU)에서 36개의 사이트에서 수행되었다. 등록 후, 대상체를 대조군 부문 (치료의 표준 (SOC) 화학치료) 또는 3개의 임상시험용 부문 (SOC 화학치료 + 저 용량, 중간 용량, 또는 고 용량 딜라누비셀) 중 하나로 1:1:1:1로 무작위화하였다. 무작위화는 지리적 영역 (US 대 SK/AU)에 의해 계층화되었다.
임상시험용 부문으로 무작위화된 대상체는 화학치료의 제1 사이클 후에 딜라누비셀의 단일 고정 할당 용량, 및 후속 화학치료 사이클 후에 최대 2개의 추가의 용량 (사이클 당 1회의 주입)을 받기에 적격이었다. SOC 부문으로 무작위화된 대상체는 필적하게 치료되었지만, 화학치료의 최대 3개의 사이클 동안 딜라누비셀의 주입이 없었다. 모든 대상체는 무작위화 후 84일, 또는 딜라누비셀의 최종 주입 후 30일, 또는 SOC 부문에 대한 마지막 화학치료 주입 후의 일 후 30일 (어느 것이든 더 긴 것) 동안 추적되었다. 연구는 비계획된 중간 분석의 완료 후에 146명의 대상체 (66%)의 등록 후에 중단되었다.
프로토콜 및 그의 보정은 관련 기관 위원회 및 윤리 위원회에 의해 승인되었으며, 임의의 연구 절차 전에 서면 고지 동의서를 요구하였다. 안전성은 독립적 데이터 안전성 모니터링 위원회(Data Safety Monitoring Board) (DSMB)에 의해 감독되었다.
환자: 적격 대상체는 비치료된 새로 발생한 또는 속발성 AML을 가졌어야 하며, 지역 기관 표준에 따라 치유적 의도로 화학치료의 적어도 2개의 사이클을 받도록 계획되었다. 유도 화학치료는 안트라시클린 및 시타라빈 백본을 함유하고, 중등도 내지 중증 골수억제를 초래할 것으로 예상될 것이 요구되었다. 대상체는 또한 ≥ 50의 카르노프스키(Karnofsky) 점수 또는 0, 1, 또는 2의 동부 종양학 협력 그룹(Eastern Cooperative Oncology Group) (ECOG) 성능 상태를 가질 것이 요구되었으며, 적당한 신장, 간, 폐, 및 심장 기능을 갖고, 스크리닝시 활동성 비제어된 감염의 증거를 갖지 않을 것이 요구되었다. 과립구 수혈, 면역치료, 다른 임상시험용 작용제의 수반 사용은 배제되었다.
연구 치료: 딜라누비셀은 상기 기재된 바와 같이 풀링된, 비매칭된 제대혈 유래 CD34+ 세포로부터 유래된 생체외 확장된 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 생성물이다. CD34+ 세포를 자격 있는 스크리닝된 제대혈 공여자로부터 단리하고, 고정화된 노치 리간드 및 재조합 시토카인 (일반적으로 상기 기재된 바와 같음)의 존재 하에서 16일 동안 배양하였다. 확장된 줄기 세포 생성물을 주입할 때까지 동결보존하고, 대략 20 ml의 부피 중 대략 1억개 (저 용량), 3억개 (중간 용량), 및 8억개 (고 용량)의 CD34+ 세포/백의 고정 용량으로 연구 사이트에 제공하였다. 딜라누비셀을 주어진 사이클 동안 화학치료의 마지막 용량 후 대략 24 내지 36시간에 5 내지 10분에 걸쳐 정맥내로 제공하였다. 투여는 경구 아세트아미노펜 및 정맥내 항히스타민의 투여에 바로 선행되었다.
종점 및 통계적 분석: 연구의 1차 종점은 84-일 연구 기간의 과정에 걸친 중증 (유해 사건에 대한 통상 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Events) (CTCAE) 등급 3 이상) 박테리아 또는 진균 감염의 비율이었다. 분석을 대상체 내의 고유 등급 ≥ 3 감염의 수를 카운팅하고, 연구 중인 날의 수에 의해 정규화함으로써 수행하였다. 정규화된 감염 비율을 치료 부문 사이의 감염 비율을 비교하기 위해 음성 이항 회귀를 사용하여 치료 부문 (참조로서 SOC) 및 지리적 영역에 대해 회귀시켰다. 연구 제1일로부터 연구 중인 날의 수는 사망 또는 추적 소실에 기인한 차등적 추적을 처리하기 위한 오프셋 변수로서 사용되었다. 사건 비율 비 및 95% 신뢰 구간은 각각 연관의 강도 및 정확성의 척도로서 계산되었다.
핵심 2차 종점은 최량 전체 치료 반응, 필그라스팀의 사용, 및 열성 호중구감소증의 발생 및 지속기간, 및 안전성을 포함하였다. 치료 반응은 개정 국제 실무 그룹(Revised International Working Group) 기준에 따른 완전한 완화 (CR) 또는 불완전한 카운트 회복을 갖는 완전한 완화 (CRi)로서 정의되었으며, 치료 부문을 지리적 영역에 의해 계층화된, 코크란-만텔-한셀(Cochran-Mantel-Hansel) 검정을 사용하여 비교하였다.
결과
등록 종료 전에 이 연구에 대해 스크리닝된 162명의 대상체 중에서, 146명을 등록하고, 연구 치료를 받도록 무작위화하였다: 37명은 저 용량 부문으로, 38명은 중간 용량 부문으로, 35명은 고 용량 부문으로, 및 36명은 SOC 부문으로 무작위화하였다. 연구가 중단된 때에, SOC 부문에서 6명 (16.7%)의 대상체 대비, 저 용량 부문에서 18명의 대상체 (48.6%), 중간 용량 부문에서 17명의 대상체 (44.7%), 고 용량 부문에서 10명의 대상체 (28.6%)가 프로토콜에 따라 연구를 완료하였다. 대상체 배치의 요약은 도 2에 제공된다. 딜라누비셀로 치료된 대상체의 수는 저 용량 부문에서 33명 (89.2%), 중간 용량 부문에서 34명 (89.5%), 및 고 용량 부문에서 34명 (97.1%)이었다. 대상체 당 받은 딜라누비셀 용량의 중위 수는 모든 3개의 부문에서 2였다.
무작위화된 대상체의 전체 중위 연령은 60세였다 (범위, 19 내지 77세). 대상체의 성별은 고르게 분할되었으며, 남성 (75명의 대상체; 51.4%) 대 여성 (71명의 대상체, 48.6%)이었다. 대상체의 대다수는 백인 (110명의 대상체; 75.3%)이었다. 가장 기준선 질환 특징은 군 중에서 상대적으로 균형화되었지만, 대상체의 보다 높은 백분율은 SOC 부문에서 비바람직한 위험 AML을 가졌다.
연구 기간 동안 일어난 등급 ≥ 3 박테리아 또는 진균 감염의 총 수는 저 용량 부문에서 23, 중간 용량 부문에서 22, 고 용량 부문에서 25, 및 SOC 부문에서 20이었다. SOC 대비 총 딜라누비셀의 시험은 통계적으로 유의하지 않았다, p=0.9604. SOC 부문 대비 각각의 치료 부문에 대한 비율 비 및 연관된 95% CI는 0.88 (0.44, 1.77; p = 0.7291) 저 용량, 0.93 (0.46, 1.88; p=0.8471) 중간 용량, 및 1.05 (0.53, 2.09; p = 0.8868) 고 용량이었다.
표 1은 연구의 과정에 걸친 치료 부문에 의한 CR 아님 (모든 다른 비-CR 반응 평가) 대비 완전한 완화 (CR) (형태학적 CR, 세포유전학적 CR, 분자적 Cr 또는 CRi를 포함함)의 최량 전체 반응 비율을 요약한다. 각각의 치료 부문은 SOC 부문에 비해 수치적으로 바람직한 CR 비율을 가졌으며, 이는 중간 용량 부문 (p = 0.0024) 및 총 치료 군 (p = 0.0086)에서 통계적으로 유의하였다. 이 관찰은 특히 단일 공여자, 비매칭된 확장된 제대혈 생성물을 사용한 이전의 연구 (Delaney et al., 2016, Lancet 3(7):PE330-339)의 관점에서 예상치 않은 것이었다. CR 비율은 이전의 연구의 1차 종점이 아니었지만, CR 비율의 증가는 보고되지 않았다.
표 1: 치료 군에 의한 완전한 반응/완화 비율
Figure pct00001
주: CR = 형태학적 CR, 세포유전학적 CR, 분자적 CR, 또는 불완전한 혈액 카운트 회복을 갖는 CR (CRi); CR 아님 = 형태학적 백혈병 없는 상태, 부분적 완화/반응, 초기 평가, 치료 실패
*지리적 영역에 의해 계층화된 CMH 시험으로부터의 p-값
전체 딜라누비셀은 일반적으로 관련된 사건의 용량 의존적 증가와 함께 양호하게 내성화되었지만, 고 용량 부문에서의 안전성 사건의 전체 발생은 SOC 부문에서의 그것보다 단지 보통으로 더 높았다. 딜라누비셀과 관련된 것으로서 평가된 가장 통상적인 유해 사건은 열/열성 호중구감소증, 주입 반응, 및 염증성 징후 및 증상이었다. 연구에서 사망의 발생은 SOC 부문에 비해 임의의 확장된 줄기 세포 생성물 부문에서 상승되지 않았다. DSMB는 연구 전반에 걸쳐 안전성을 모니터링하였으며, 안전성 문제를 일으키지 않았다. SOC 부문에 비해 각각의 치료 부문에서 수치적으로 바람직한 CR 비율은 예상치 않은 것이었다.
실시예 4: 확장된 줄기 세포 생성물로의 혈액 악성종양을 갖는 환자의 치료
혈액 악성종양을 갖고 강한 화학치료 요법을 겪은 환자를 치료의 표준 (SOC) 더하기 저, 중간, 또는 고 용량 딜라누비셀 (각각 100 x 106, 300 x 106, 또는 800 x 106개의 CD34+ 세포)로 치료한다. 딜라누비셀은 화학치료의 각각의 사이클 후에 투여된다. 환자는 표준 관행을 따르고, CR 아님 (모든 다른 비-CR 반응 평가) 대비 완전한 완화 (CR) (형태학적 CR, 세포유전학적 CR, 분자적 Cr 또는 CRi를 포함함)의 최량 전체 반응 비율이 연구의 과정에 걸쳐 평가된다.
본 발명은 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 의해 범주에 있어서 제한되지 않아야 한다. 사실, 본원에 기재된 것들 외에도 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 해당하는 것으로 의도된다.
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독점적 소유 또는 특권이 청구된 본 발명의 실시양태는 하기와 같이 정의된다.

Claims (47)

  1. 유도 화학치료 요법을 급성 골수성 백혈병 (AML)을 갖는 인간 환자에게 투여하는 단계;
    유도 요법의 투여 후에 CD34+ 풍부화된, T 세포 고갈된, 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 환자에게 투여하는 단계이며; 여기서 확장된 줄기 세포 생성물은 적어도 2명의 상이한 인간 공여자로부터의 제대혈 단위로부터 유래된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함하고, 제대혈 단위는 공여자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 및 인간 환자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 선택되는 것인 단계;
    환자의 상태를 모니터링하여 환자가 완화를 달성하였는지 여부를 결정하는 단계; 및
    환자가 완화를 달성하지 않은 경우, 환자에게 제2 유도 화학치료 요법을 투여하고, 이어서 확장된 줄기 세포 생성물의 제2 고정 용량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 급성 골수성 백혈병 (AML)을 갖는 인간 환자에 대한 치료 결과를 개선시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 완화를 달성한 환자에게 강화 화학치료 요법을 투여하고, 이어서 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 용량이 유도 화학치료 요법 후 약 12 내지 48시간, 또는 바람직하게는 약 24 내지 36시간에 투여되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 용량이 유도 화학치료 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여되는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 용량이 강화 화학치료 요법 후 약 12 내지 48시간, 또는 바람직하게는 약 24 내지 36시간에 투여되는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 용량이 강화 화학치료 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 투여되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 유도 화학치료 요법이 시타라빈 및 안트라시클린의 조합의 투여를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 안트라시클린이 다우노루비신 또는 이다루비신인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 유도 요법이 7 + 3 요법인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 유도 화학치료 요법이 시타라빈 및 다우노루비신의 투여를 포함하는 것인 방법.
  11. 제2항에 있어서, 강화 화학치료 요법이 중간 용량 또는 고 용량 시타라빈의 투여를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 구제 화학치료 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 구제 화학치료 요법이 클라드리빈, 고 용량 시타라빈 및 G-CSF (CLAG) 또는 에토포시드, 시타라빈 및 미톡산트론 (MEC)을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 고정 용량이 약 5천만개의 CD34+ 세포 내지 약 4억개의 CD34+ 세포를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 고정 용량이 약 1억 내지 약 3억개의 CD34+ 세포를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 고정 용량이 동일하거나;
    b. 유도 화학치료 요법 후에 투여된 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 고정 용량이 동일하거나; 또는
    c. 유도 화학치료 요법 후에 투여된 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 고정 용량이 강화 화학치료 요법 후에 투여된 고정 용량과는 상이한 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물이 동결보호제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물이 CD34+ 인간 제대혈 줄기 및 전구 세포를 풍부화하고, CD34+ 풍부화된 인간 제대혈 줄기 및 전구 세포를 노치(Notch) 효능제로 확장시키는 것을 포함하는 단계에 의해 생산된 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 노치 효능제가 IgG의 Fc 부분에 융합된 델타의 세포외 도메인 (델타ext-IgG)인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물이 적어도 4명의 상이한 인간 공여자로부터의, 적어도 6명의 상이한 인간 공여자로부터의, 또는 적어도 8명의 상이한 인간 공여자로부터의 제대혈 단위로부터 유래되는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물이 투여 후 제14일에 환자에서 일시적으로 생착되지 않는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 모니터링 단계가 환자가 형태학에 의해 < 5% 골수 모세포를 갖는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 유도 요법 후에 및 강화 요법 전에, 환자가 HLA-유형 환자에 적어도 부분적으로 매칭된 제대혈 단위를 받지 않는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 적어도 부분적으로 매칭된 제대혈 단위가 자가 이식편, 반수체동종 이식편, 매칭된 관련된 공여자 이식편, 매칭된 비관련된 공여자 이식편, 또는 미스매칭된 비관련된 공여자 이식편인 방법.
  25. 화학치료 요법을 혈액 악성종양을 갖는 인간 환자에게 투여하는 단계;
    화학치료 요법의 투여 후에 확장된 줄기 세포 생성물의 고정 용량을 환자에게 투여하는 단계이며; 여기서 확장된 줄기 세포 생성물은 적어도 2명의 상이한 인간 공여자로부터 유래된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함하고, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포는 공여자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 및 인간 환자의 HLA 유형에 매칭시키지 않고 선택되는 것인 단계;
    환자의 상태를 모니터링하여 환자가 완화를 달성하였는지 여부를 결정하는 단계; 및
    환자가 완화를 달성하지 않은 경우, 임의로 환자에게 제2 화학치료 요법을 투여하고, 이어서 확장된 줄기 세포 생성물의 또 다른 고정 용량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 혈액 악성종양을 갖는 인간 환자에 대한 치료 결과를 개선시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 용량이 화학치료 요법 후 약 12 내지 48시간, 또는 바람직하게는 약 24 내지 36시간에 투여되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 용량이 화학치료 요법의 성분 및 그의 활성 대사물이 환자의 혈액으로부터 제거된 후에 환자에게 투여되는 것인 방법.
  28. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 악성종양이 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수이형성 증후군 (MDS), 비-호지킨 림프종 (NHL) 및 골수증식성 신생물 (MPN)로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, AML이 새로 발생한 급성 골수성 백혈병 (AML), 재발성/난치성 AML 또는 치료-관련 AML인 방법.
  30. 제28항에 있어서, MDS가 다계통 이형성증을 갖는 MDS (MDS-MLD); 단일 계통 이형성증을 갖는 MDS (MDS-SLD); 환상 철적혈모세포를 갖는 MDS (MDS-RS); 과다 모세포를 갖는 MDS (MDS-EB); 단리된 del(5q)을 갖는 MDS; 및 분류불가능성 MDS (MDS-U)로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, MPN이 만성 골수성 백혈병, 진성 적혈구증가증 (p. vera), 원발성 골수섬유증, 본태성 고혈소판증, 만성 호중구성 백혈병, 또는 만성 호산구성 백혈병으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물이 적어도 2명의 상이한 인간 공여자로부터의 제대혈 단위로부터 유래된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함하는 것인 방법.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료 요법이 유도 요법, 구제 요법, 및 강화 요법으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료 요법이 시타라빈 및 안트라시클린의 투여를 포함하는 유도 요법인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 안트라시클린이 다우노루비신 또는 이다루비신인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 유도 요법이 7 + 3 요법인 방법.
  37. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료 요법이 중간 용량 또는 고 용량 시타라빈의 투여를 포함하는 강화 요법인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 화학치료 요법이 구제 요법인 방법.
  39. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 구제 요법이 클라드리빈, 고 용량 시타라빈 및 G-CSF (CLAG) 또는 에토포시드, 시타라빈 및 미톡산트론 (MEC)인 방법.
  40. 제25항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 고정 용량이 약 5천만개의 CD34+ 세포 내지 약 4억개의 CD34+ 세포를 포함하는 것인 방법.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 고정 용량이 약 1억 내지 약 3억개의 CD34+ 세포를 포함하는 것인 방법.
  42. 제25항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물의 각각의 고정 용량이 동일한 것인 방법.
  43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물이 동결보호제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  44. 제25항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물이 CD34+ 인간 제대혈 줄기 및 전구 세포를 풍부화하고, CD34+ 풍부화된 인간 제대혈 줄기 및 전구 세포를 노치 효능제로 확장시키는 것을 포함하는 단계에 의해 생산된 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 노치 효능제가 IgG의 Fc 부분에 융합된 델타의 세포외 도메인 (델타ext-IgG)인 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물이 적어도 4명의 상이한 인간 공여자로부터의, 적어도 6명의 상이한 인간 공여자로부터의, 또는 적어도 8명의 상이한 인간 공여자로부터의 제대혈 단위로부터 유래되는 것인 방법.
  47. 제25항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 줄기 세포 생성물이 투여 후 제14일에 결정된 바와 같이, 환자에서 일시적으로 생착되지 않는 것인 방법.
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