JP2019524825A

JP2019524825A - 選択的ｂａｃｅ１阻害剤として有用な１，４−オキサジン

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Publication number: JP2019524825A
Application number: JP2019508192A
Authority: JP
Inventors: スティーブン・ジェイムズ・グリーン; エリック・ジェイムズ・ヘンブル; ダスティン・ジェイムズ・マーゴット
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2019-09-05
Also published as: EP3504211A1; US10399995B2; WO2018039062A1; US20190161502A1; CN109661397A

Abstract

本発明は、ＢＡＣＥ１阻害剤として有用な、式Ｉ：の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

Description

本発明は、選択的ＢＡＣＥ１阻害剤、この化合物を含む薬学的組成物、この化合物を使用して生理学的障害を治療する方法、ならびにこの化合物の合成に有用な中間体およびプロセスに関する。

本発明は、神経毒性かつ高凝集性の、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のペプチド断片、アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）ペプチドが関与する、アルツハイマー病ならびに他の疾患および障害の治療分野のものである。アルツハイマー病は、世界中で何百万人もの患者を冒す破壊的な神経変性障害である。疾患を停止、遅延、または回復させるのではなく、患者に一時的な対症効果のみを提供する、市場で現在承認されている薬剤を考慮すると、アルツハイマー病の治療において満たされていない重大な必要性がある。

アルツハイマー病は、脳内でのＡｂｅｔａの生成、凝集、および沈着を特徴とする。β−セクレターゼ（β部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素、ＢＡＣＥ）の完全または部分的な阻害は、マウスモデルにおいてプラーク関連およびプラーク依存性病理に対して顕著な効果を有することが示されており、Ａｂｅｔａペプチドレベルのわずかな低減でさえ、プラーク断面積およびシナプス欠損の長期間の顕著な低減をもたらす可能性があり、したがって特にアルツハイマー病の治療において、顕著な治療効果を提供することを示唆する。加えて、ＢＡＣＥ１およびＢＡＣＥ２と称されるＢＡＣＥの２つの相同体が同定されており、ＢＡＣＥ１がアルツハイマー病の発症に最も臨床的に重要であると考えられる。ＢＡＣＥ１は、主にニューロンで発現し、一方でＢＡＣＥ２は、主に末梢で発現することが示されている（Ｄ．Ｏｅｈｌｒｉｃｈ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２４，２０３３−２０４５（２０１４）を参照）。加えて、ＢＡＣＥ２は、それが色素細胞特異的メラニン細胞タンパク質のプロセシングにおいて役割を果たすと特定されているので、色素沈着に重要であり得る（Ｌ．Ｒｏｃｈｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１０（２６），１０６５８−１０６６３（２０１３）を参照）。中枢神経系（ＣＮＳ）透過を伴うＢＡＣＥ阻害剤、特にＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１に対して選択的である阻害剤が、アルツハイマー病などのＡｂｅｔａペプチド媒介性障害のための治療を提供するために所望される。

米国特許第８，８４６，６５８号は、ＢＡＣＥ阻害活性を有する特定のオキサジン誘導体を開示している。さらに、ＷＯ２０１２／０９５４６３もまた、ＢＡＣＥ阻害活性を有する特定のオキサジン誘導体を開示している。

本発明は、ＢＡＣＥ１の阻害剤である、ある特定の新規の化合物を提供する。加えて、本発明は、ＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１に対する選択的な阻害剤である、ある特定の新規の化合物を提供する。さらに、本発明は、ＣＮＳに透過する、ある特定の新規の化合物を提供する。本発明はまた、例えば、ＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１に対する選択的な阻害を通じて、改善された副作用プロファイルの可能性を有する、ある特定の新規の化合物を提供する。

したがって、本発明は、式Ｉの化合物、

またはその薬学的に許容される塩を提供する。

加えて、本発明は、式Ｉａの化合物、

またはその薬学的に許容される塩を提供する。

本発明はまた、患者におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。

本発明はさらに、患者における軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。本発明はまた、患者におけるＢＡＣＥを阻害する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。本発明はまた、患者におけるアミロイド前駆体タンパク質のＢＡＣＥ媒介性切断を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。本発明はさらに、患者におけるＡｂｅｔａペプチドの産生を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の式ＩもしくはＩａの化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。

さらに、本発明は、療法で、特に、アルツハイマー病の治療のために、または軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を予防するために使用するための、式ＩもしくはＩａの化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩を提供する。またさらに、本発明は、アルツハイマー病の治療のための薬剤の製造のための、式ＩもしくはＩａの化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩の使用を提供する。

本発明はさらに、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、式ＩもしくはＩａの化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、式ＩもしくはＩａの化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩を混和することを含む、薬学的組成物を調製するための方法を提供する。本発明はまた、式ＩおよびＩａの化合物の合成のための新規な中間体および方法も包含する。

軽度認知障害は、経時的に軽度認知障害からアルツハイマー認知症までを呈する患者の臨床所見および進行に基づき、アルツハイマー病と関連した認知症の潜在的な前駆期として定義されている。（Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５８，３９７−４０５（２００１）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，ｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５６，３０３−３０８（１９９９））。用語「軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を予防すること」は、患者における軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を抑制すること、遅延させること、停止させること、または回復させることを含む。

本明細書で使用されるとき、用語「治療」または「治療すること」は、既存の症状または障害の進行または重症度を抑制すること、遅延させること、停止させること、または回復させることを含む。

本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、ヒトを指す。

本明細書で使用される場合、「有効量」との用語は、患者への単回または複数回投与による投与の際に診断または治療下にある患者に所望の効果を提供する、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の量または投与量を指す。

有効量は、既知の技術を使用して、かつ類似の状況下で得られる結果を観察することによって、当業者により容易に決定され得る。患者にとっての有効量を決定する際には、限定はされないが、患者のサイズ、年齢、および全般的な健康状態、関与する特定の疾患または障害、疾患または障害の関与の程度または重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与される製剤のバイオアベイラビリティ特性、選択される投与レジメン、併用する薬物の使用、ならびに他の関連した状況を含む、多数の要因が当業者により考慮される。

本発明の化合物は、概して、幅広い用量範囲にわたって有効である。例えば、１日当たりの用量は、通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内に属する。ある場合には、前述の範囲の下限よりも低い用量レベルが十分以上である場合があり、他の場合には、許容される副作用を伴って、さらに多い用量が用いられてもよく、したがって、前述の用量範囲は、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本発明の化合物は、好ましくは、経口および経皮経路を含む、化合物を生体利用可能にする任意の経路によって投与される薬学的組成物として製剤化される。より好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。そのような薬学的組成物およびその調製方法は、当該技術分野において周知である。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい）。

式ＩおよびＩａの化合物またはこれらの薬学的に許容される塩は、本発明の治療方法において特に有用であるが、ある特定の基、置換基、および立体配置が好ましい。以下の段落は、そのような好ましい基、置換基、および立体配置を記載する。これらの選好が、本発明の治療方法と新規の化合物との両方に適用可能であることが理解されるであろう。

スキームＡに示されるとおり、オキサジン環上で３位のメチルが６位のトリフルオロメチルに対してシス立体配置にある、式Ｉａの化合物が好ましい。

本発明が全ての個々のエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにラセミ体を含む該化合物のエナンチオマーの混合物を企図するが、以下に記載される絶対立体配置を有する化合物が特に好ましい。
Ｎ−［３−［（３Ｒ，６Ｒ）−５−アミノ−３，６−ジメチル−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−１，４−オキサジン−３−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−シアノ−チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボキサミド、およびその薬学的に許容される塩。

当業者は、本発明の化合物が、以下のスキームＢに示すように、互変異性型で存在し得ることを理解するであろう。本願において本発明の化合物の特定の互変異性体のうちの１つへの任意の参照が示されるとき、互変異性型とこれらの全ての混合物との両方を包含することが理解される。

さらに、以下の調製法に記載される特定の中間体は、１つ以上の窒素保護基を含み得る。保護基は、当業者によって理解されるように、特定の反応条件および実施される特定の変換に依存して変動し得ることを理解されたい。保護および脱保護条件は、当業者に周知であり、文献に記載されている（例えば、''Ｇｒｅｅｎｅ’ｓＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ''，ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｂｙＰｅｔｅｒＧ．Ｍ．ＷｕｔｓａｎｄＴｈｅｏｄｏｒａＷ．Ｇｒｅｅｎｅ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００７を参照）。

個々の異性体、エナンチオマー、およびジアステレオマーは、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって、本発明の化合物の合成における任意の好都合な時点において、当業者により分離または分解され得る（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔａｌ．，''Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ''，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１、およびＥ．Ｌ．ＥｌｉｅｌａｎｄＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，''ＳｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｏｍｐｏｕｎｄｓ''，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４を参照）。

本発明の化合物の薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩は、当該技術分野で周知の条件下で、例えば、本発明の化合物の適切な遊離塩基と、ジエチルエーテル等の好適な溶媒中の塩酸等の適切な薬学的に許容される酸との反応によって形成することができる。さらに、そのような塩の形成は、窒素保護基の脱保護時に同時に起こり得る。そのような塩の形成は、当該技術分野で周知であり、また理解されている。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，''Ｓａｌｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒｂａｓｉｃｄｒｕｇｓ，''ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．''ＳａｌｔＳｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｏｒＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＮｅｗＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｔｉｔｉｅｓ，'' ＯｒｇａｎｉｃＰｒｏｃｅｓｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，''ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳａｌｔｓ，''ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９，（１９７７）を参照。

特定の略語は以下のとおり定義される：「ＡＰＰ」は、アミロイド前駆体タンパク質を指し、「ＡＴＣＣ」は、アメリカンタイプカルチャーコレクションを指し、「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを指し、「ｃＤＮＡ」は、相補的デオキシリボ核酸を指し、「ＣＮＳ」は、中枢神経系を指し、「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを指し、「（ＤＨＱ）_２ＰＨＡＬ」は、ヒドロキニン１，４−フタラジンジイルジエーテルを指し、「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し、「ＥＢＳＳ」は、Ｅａｒｌｅ’ｓＢａｌａｎｃｅｓＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎを指し、「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫吸着検定法を指し、「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指し、「Ｆ１２」は、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地を指し、「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指し、「Ｆｃ」は、結晶化可能なフラグメントを指し、「ＦＲＥＴ」は、蛍光共鳴エネルギー移動を指し、「ＨＥＫ」は、ヒト胎児腎臓を指し、「ＩＣ_５０」は、その薬物について可能な最大阻害応答の５０％を生じる薬物の濃度を指し、「ＩｇＧ_１」は、免疫グロブリン様ドメインＦｃガンマ受容体を指し、「ＭＥＭ」は、最小必須培地を指し、「ＭｅＯＨ」は、メタノールまたはメチルアルコールを指し、「ＭＴＢＥ」は、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを指し、「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝食塩水を指し、「ＰＤＡＰＰ」は、血小板由来アミロイド前駆体タンパク質を指し、「ＲＦＵ」は、相対蛍光単位を指し、「ＲＴ−ＰＣＲ」は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を指し、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を指し、「ＳＣＸ」は、強い陽イオン交換を指し、「ｔＢｕＸｐｈｏｓ」は、２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ−２’、４’、６’−トリイソプロピルビフェニルを指し、「ｔＢｕＸｐｈｏｓプレ触媒第３世代」は、メタンスルホン酸［（２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ−２’、４’、６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル）−２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）を指し、「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指し、「ＴＭＥＭ」は、膜貫通タンパク質を指す。

本発明の化合物またはその塩は、当業者に既知の様々な手順によって調製されてもよく、そのうちのいくつかが、以下のスキーム、調製法、および実施例に示される。当業者は、記載される経路の各々についての特定の合成ステップが、本発明の化合物またはその塩を調製するために、異なる様式で、または他のスキームからのステップと併せて、組み合わせることができることを認識する。以下のスキームにおける各々のステップの産物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、ろ過、磨砕、および結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することできる。以下のスキームにおいて、全ての置換基は、別途指示のない限り、以前に定義されたとおりである。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に入手可能である。例えば、特定の出発物質は、下記の調製に示されるとおり、調製されたＵＳ２０１１／００２１５２０に記載されている手順に類似した様式であり得る。本発明の範囲を限定することなく、以下のスキーム、調製物、および実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。

スキーム１において、５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル置換オキサジンは、当該技術分野において周知の条件下でアニリンに変換され得る。例えば、ヨウ化第一銅、炭酸カリウムなどの無機塩基、Ｌ−ヒドロキシプロリン、および水中のアンモニアの窒素源をマイクロ波条件下で約１００℃の温度で混合して、対応するアニリンを得る。

スキーム２において、対応するカルボン酸からその場で調製された酸塩化物を用いて、スキーム１によるアニリンをアシル化することによって、式Ｉａの化合物を調製することができる。例えば、工程Ａにおいて、１，４−ジオキサンなどの溶媒中で、酢酸カリウムおよびフェロシアン化カリウム三水和物などのシアン供給源の水溶液などの無機塩基、ｔＢｕＸｐｈｏｓプレ触媒第３世代のプレ触媒、ならびにｔＢｕＸｐｈｏｓなどの触媒を使用して、５−クロロチアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボキシレートという保護酸を、５−シアノ［１，３］チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボキシレートという保護酸に変換することができる。混合物を約９０℃に加熱することができ、ＥｔＯＡｃなどの溶媒中での有機抽出を用いた後処理およびクロマトグラフィー精製によってシアノ誘導体を単離することができる。次いで、シアノ誘導体をＴＨＦなどの溶媒中で、カリウムトリメチルシラノエートを使用して脱保護化して、所望のカルボン酸を得ることができる。工程Ｂにおいて、アセトニトリルなどの溶媒中で塩化オキサリルまたは塩化チオニルなどの塩化物供給源を使用し、触媒量のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを添加し、約１．５時間攪拌する、当該技術分野において周知の条件下で、カルボン酸を対応する酸塩化物にその場で変換することができる。粗酸塩化物材料を濃縮し、アセトニトリル中でスラリー化し、アセトニトリルなどの溶媒中で約５０℃に予熱したアニリンに添加する。次いで、生成物を、当該技術分野において周知の条件を使用して、単離および精製する。例えば、塩基性洗浄液からの単離およびＤＣＭを用いた抽出、続いてクロマトグラフィー精製により、式Ｉａの化合物が得られる。

以下の調製物および実施例は、本発明をさらに例示する。

調製物１
４−ブロモ−１−フルオロ−２−イソプロペニル−ベンゼン

臭化メチルトリフェニルホスホニウム（２７６ｍｍｏｌ、１００ｇ）およびＴＨＦ（１０００ｍＬ）を一緒に混合する。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２７６ｍｍｏｌ、３１ｇ）で処理する。室温で１時間撹拌し、次いでＴＨＦ（５００ｍＬ）に溶かした溶液としての１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）エタノン（５０ｇ、２３０ｍｍｏｌ）を、滴下漏斗を介して約５分かけて添加する。室温で３時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（１０００ｍＬ）および水（５００ｍＬ）で希釈し、層を分離する。ＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で水層を抽出する。有機抽出物を合わせ、食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させる。溶液をろ過し、真空中で濃縮して、粗生成物を得る。材料を最小限のＤＣＭに溶解し、約半分に分割する。各半分を、約５０ｇのシリカゲルを有するフリット漏斗に別々に入れる。１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出する。２つのろ液を合わせ、濃縮して、表題化合物（４３．３ｇ、８７．４％）を得る。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ２．１５（ｓ，３Ｈ），５．２８（ｄ，２Ｈ），６．９５（ｄｄ，１Ｈ），７．３４（ｍ，１Ｈ），７．４６（ｄｄ，１Ｈ）。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物２
（２Ｓ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）プロパン−１，２−ジオール

４−ブロモ−１−フルオロ−２−イソプロペニル−ベンゼン（２２．１ｇ、１０３ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（４００ｍＬ）および水（４００ｍＬ）に溶解する。０℃に冷却し、フェリシアン化カリウム（１１３ｇ、３３９ｍｍｏｌ）、オスミウム（ＶＩ）酸カリウム二水和物（０．２４ｇ、０．７１９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３３９ｍｍｏｌ、４７．３ｇ）および（ＤＨＱ）_２ＰＨＡＬ（０．８４ｇ、１．０３ｍｍｏｌ）を添加する。反応物をゆっくり室温にまで温めながら１８時間撹拌する。メタ重亜硫酸ナトリウム（６０ｇ、３０８ｍｍｏｌ）を約３０〜４５分かけて少しずつ注意深く添加し、次いでさらに１０分撹拌する。ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）で希釈する。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×５００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、食塩水（５００ｍＬ）で洗浄する。ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮して、表題化合物（３４．５ｇ、６８％純度、１０４％）を得る。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．５４（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｄ，１Ｈ），３．９２（ｄ，１Ｈ），６．９１（ｄｄ，１Ｈ），７．３４（ｍ，１Ｈ），７．７９（ｄｄ，１Ｈ）。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物３
（２Ｓ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−メチル−オキシラン

（２Ｓ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）プロパン−１，２−ジオール（２５．６ｇ、１０３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７００ｍＬ）に溶解する。トリエチルアミン（２０６ｍｍｏｌ、２９ｍＬ）を添加する。０℃に冷却し、シリンジ添加により数分間かけてメタンスルホニルクロリド（１１３ｍｍｏｌ、９ｍＬ）で処理する。溶液を２時間撹拌する。いくらかの出発ジオールが残っている可能性があり、その場合には、まだ０℃の間に追加（４．５ｍＬ、５６ｍｍｏｌ）のメタンスルホニルクロリドを添加する。中間体メシレートへの変換が観察されるまでＬＣ／ＭＳでモニターしながら、さらに１時間撹拌する（ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）３４４／３４６［Ｍ＋Ｈ_２Ｏ］^＋）。反応物を１ＮＨＣｌ（５００ｍＬ）に注ぎ、ＤＣＭ（２ｘ４００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、ＮａＨＣＯ_３（水溶液）で洗浄し、次いで食塩水で洗浄する。ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、粗メシレート中間体を得る。残留物をＭＴＢＥ（７００ｍＬ）に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム（水溶液）（２５７ｍｍｏｌ、２５７ｍＬ）で処理する。得られた二相反応物を、室温で一晩激しく撹拌する。反応物をＮａＨ_２ＰＯ_４（水溶液、４００ｍＬ）に注ぐ。層を分離し、水層を追加のＭＴＢＥ（２×２００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、ＮａＨ_２ＰＯ_４（水溶液）で洗浄し、次いで食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮する。０〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（１７．８ｇ、７０％）を得る。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．６７（ｓ，３Ｈ），２．８１（ｄ，１Ｈ），２．９７（ｄ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，１Ｈ），７．３８（ｍ，１Ｈ），７．５６（ｄｄ，１Ｈ）。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物４
（２Ｓ）−１−アジド−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）プロパン−２−オール

（２Ｓ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−メチル−オキシラン（２９．２ｇ、１１９ｍｍｏｌ）をエタノール（４５０ｍＬ）に溶解する。アジ化ナトリウム（２７３ｍｍｏｌ、１７．８ｇ）、塩化アンモニウム（５９４ｍｍｏｌ、３１．８ｇ）および１８−クラウン−６（１１９ｍｍｏｌ、３１．４ｇ）を添加する。溶液を窒素下で５時間８４℃に温める。反応物のヘッドスペースを１ＮＮａＯＨ溶液に通気して、反応中に発生し得るＮＨ_３ガスを捕捉する。溶液を室温に冷却する。ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ_３（水溶液、３００ｍＬ）に注ぐ。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、表題化合物（３０．９ｇ、９０％純度、９５％）を得る。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．６１（ｓ，３Ｈ），３．５８（ｄ，１Ｈ），３．８２（ｄ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），７．８１（ｄｄ，１Ｈ）。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物５
（２Ｓ）−１−アミノ−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）プロパン−２−オール

水素化リチウムアルミニウム（ＴＨＦ中２Ｍ、１２４ｍｍｏｌ、６２．０ｍＬ）の溶液をＴＨＦ（２５０ｍＬ）に添加し、０℃に冷却する。ＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶かした溶液としての（２Ｓ）−１−アジド−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）プロパン−２−オール（３０．９ｇ、１１３ｍｍｏｌ）を、滴下漏斗を介してゆっくりと約１時間かけて添加する。ＬＣ／ＭＳでモニターしながら３時間撹拌する。水（４．７ｍＬ）、５ＭＮａＯＨ（４．７ｍＬ）、およびさらに水（１４ｍＬ）を注意深く添加することによって反応をクエンチする。混合物を室温で２時間撹拌する。ＭｇＳＯ_４（〜３ｇ）を添加し、ろ過し、濃縮して、表題化合物（２０．９８ｇ、７５．０％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）２４８／２５０［Ｍ＋Ｈ］^＋。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物６
Ｎ−［（２Ｓ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−ヒドロキシ−プロピル］−２−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド

（２Ｓ）−１−アミノ−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）プロパン−２−オール（２０．９８ｇ、８４．５７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５００ｍＬ）に溶解し、約０℃に冷却する。２−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（１０１．５ｍｍｏｌ、２３．１９ｇ）を添加し、続いてＮａＯＨ（水中１Ｍ、９３．０２ｍｍｏｌ、９３．０２ｍＬ）を滴下漏斗を介して１５分かけて滴下する。５分間撹拌し、次いで室温に温め、４時間撹拌を続ける。ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨ_２ＰＯ_４（水溶液、３００ｍＬ）に注ぐ。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、粗生成物を得る。０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより残留物を精製して、表題化合物（２４．９ｇ、６８％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）４３１／４３３［Ｍ−Ｈ］−。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物７
（２Ｒ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−メチル−１−（２−ニトロフェニル）スルホニル−アジリジン

Ｎ−［（２Ｓ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−ヒドロキシ−プロピル］−２−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド（２４．９ｇ、５７．５ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（４００ｍＬ）およびＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解する。０℃に冷却する。トリフェニルホスフィン（８６．２ｍｍｏｌ、２２．８ｇ）およびジイソプロピルアゾジカルボキシレート（８６．２ｍｍｏｌ、１７．８ｇ）を、シリンジを介して、〜１０分かけて添加する。室温で２４時間撹拌する。ＮａＨＣＯ_３（水溶液、５００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を水で洗浄し、次いで食塩水で洗浄する。ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、粗生成物を得る。０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（１２．７ｇ、５３．２％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）４１５／４１７［Ｍ＋Ｈ］^＋。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物８
（２Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチル−プロパン酸プロピル

（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸（７．８４ｇ、４８．６ｍｍｏｌ）を１−プロパノール（３６．７ｍＬ）に溶解する。ＨＣｌ（Ｈ_２Ｏ中３７質量％、６３．２ｍｍｏｌ、５．２ｍＬ）を添加する。溶液を８５℃に２０時間加熱し、次いで室温に冷却する。エチルエーテル（２００ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ_３（水溶液、２００ｍＬ）に注ぐ。水層を追加のエチルエーテル（２×１００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、水で洗浄し、次いで食塩水で洗浄する。ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、室温で濃縮して、表題化合物（７ｇ、７３％）を得る。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ０．９９（ｔ，３Ｈ），１．６１（ｓ，３Ｈ），１．７５（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｂｓ，１Ｈ）４．２７（ｍ，２Ｈ）。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物９
（２Ｒ）−２−［（２Ｓ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（２−ニトロフェニル）スルホニルアミノ］プロポキシ］−３，３，３−トリフルオロ−２−メチル−プロパン酸プロピル

（２Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチル−プロパン酸プロピル（１．５６６ｍｍｏｌ、０．３７３０ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解する。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．５６６ｍｍｏｌ、０．１７７４ｇ）を添加し、室温で１時間撹拌する。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．５ｍＬ）に溶かした溶液としての（２Ｒ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−メチル−１−（２−ニトロフェニル）スルホニル−アジリジン（５００ｍｇ、１．２０４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２４時間撹拌する。ＮＨ_４Ｃｌ（水溶液、１５０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、粗生成物を得る。０〜５０％ＴＨＦ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（０．５ｇ、７０％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）６１７／６１９［Ｍ−Ｈ］−。

調製物１０
（２Ｒ）−２−［（２Ｒ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（２−ニトロフェニル）スルホニルアミノ］プロポキシ］−３，３，３−トリフルオロ−２−メチル−プロパンアミド

（２Ｒ）−２−［（２Ｒ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（２−ニトロフェニル）スルホニルアミノ］プロポキシ］−３，３，３−トリフルオロ−２−メチル−プロパン酸プロピル（０．７２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を７Ｍアンモニア・メタノール（３０ｍＬ）に溶解する。溶液を、密封し、６０℃に１８時間加熱する。溶液を濃縮して、粗生成物を得る。０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（０．５５ｇ、８２％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）５７０／５７２［Ｍ−Ｈ］−。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物１１
Ｎ−［（１Ｒ）−１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｒ）−１−シアノ−２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−エトキシ］−１−メチル−エチル］−２−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド

（２Ｒ）−２−［（２Ｒ）−２−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（２−ニトロフェニル）スルホニルアミノ］プロポキシ］−３，３，３−トリフルオロ−２−メチル−プロパンアミド（０．６５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解する。０℃に冷却する。トリエチルアミン（２．８ｍｍｏｌ、０．４０ｍＬ）を添加し、続いて無水トリフルオロ酢酸（１．４ｍｍｏｌ、０．１９ｍＬ）を添加する。０℃で〜１０分間撹拌し、次いで室温で４時間撹拌する。ＮａＨＣＯ_３（水溶液）に注ぎ、ＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、表題化合物（５９０ｍｇ、９４％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）５５２／５５４［Ｍ−Ｈ］−。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物１２
（３Ｒ，６Ｒ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，６−ジメチル−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−１，４−オキサジン−５−アミン

Ｎ−［（１Ｒ）−１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｒ）−１−シアノ−２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−エトキシ］−１−メチル−エチル］−２−ニトロ−ベンゼンスルホンアミド（２．８４ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５１ｍＬ）に溶解する。Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（１５．４ｍｍｏｌ、２．５１ｇ）を添加し、続いて炭酸カリウム（１５．４ｍｍｏｌ、２．１２ｇ）を添加する。反応物を８０℃に加熱し、２４時間撹拌する。室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ_３（水溶液、１００ｍＬ）に注ぐ。水層をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、粗生成物を得る。０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（１．２２ｇ、６５％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）３６９／３７１［Ｍ＋Ｈ］^＋。ＵＳ２０１１／００２１５２０も参照。

調製物１３
（３Ｒ，６Ｒ）−３−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−３，６−ジメチル−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−１，４−オキサジン−５−アミン

スキーム１：マイクロ波容器において、（３Ｒ，６Ｒ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，６−ジメチル−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−１，４−オキサジン−５−アミン（３００ｍｇ、０．８１２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（９ｍＬ）に溶解する。水（１６．２５ｍｍｏｌ、１．３４ｍＬ）に溶かした、ヨウ化第一銅（０．８１２６ｍｍｏｌ、０．１５７９ｇ）、炭酸カリウム（２．４３８ｍｍｏｌ、０．３３６９ｇ）、Ｌ−ヒドロキシプロリン（１．６２５ｍｍｏｌ、０．２１３１ｇ）、およびアンモニア（２３質量％）を添加する。マイクロ波容器を密封し、マイクロ波照射により１００℃に９０分間加熱する。反応混合物を１０ｇのＳＣＸ（イオン交換樹脂）カートリッジに入れる。ＭｅＯＨ（約２０ｍＬ）、１：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨ、ＭｅＯＨで溶出し、溶出液を画分１として集め、これを廃棄する。表題生成物をＭｅＯＨ（約４０ｍＬ）に溶かした７ＮＮＨ_３で溶出する。生成物が画分１に観察される場合には必要に応じて繰り返す。画分２を濃縮して、表題化合物（０．２００ｇ、８０％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３０６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

調製物１４
２−［（２，６−ジクロロ−３−ピリジル）アミノ］−２−オキソ−酢酸エチル

塩化エチルオキサリル（３０８ｇ、２２１１ｍｍｏｌ）を、２，６−ジクロロピリジン−３−アミン（３００ｇ、１８４０．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３２１ｍＬ）をＴＨＦ（３Ｌ）に溶かした溶液に、０℃で、窒素雰囲気下で、４５分かけて添加する。５℃で１５分間撹拌し、次いで２０℃に３０分間加熱する。ＬＣＭＳにより反応が不完全な場合は、反応混合物を１０℃に冷却し、満足な変換が達成されるまでトリエチルアミンおよび塩化エチルオキサリルをさらに仕込むべきである。反応が完了したら、１０℃に冷却し、水（３Ｌ）でクエンチし、１０分間撹拌する。揮発性物質を減圧下で除去し、材料をＥｔＯＡｃ（３Ｌ）で抽出する。有機抽出物を水（１．５Ｌ）および食塩水（１．５Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させて、ベージュ色の固体として表題化合物（４７６．８ｇ、８９％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^３５Ｃｌ／^３７Ｃｌ）２６３．０／２６５．０／２６７．０［Ｍ＋Ｈ］^＋。

調製物１５
５−クロロチアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボン酸エチル

２−［（２，６−ジクロロ−３−ピリジル）アミノ］−２−オキソ−酢酸エチル（２３０ｇ、８７４．３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．１Ｌ）に溶解し、２，４−ビス（４−メトキシフェニル）−２，４−ジチオキソ−１，３，２，４−ジチアジホスフェタン（ローソン試薬）（２７３ｇ、６５４．７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を８０℃に２時間加熱する。反応混合物を１５℃に冷却し、固体をろ過により除去し、固体をアセトニトリル（１．４Ｌ）で洗浄する。ろ液を１５℃に冷却し、炭酸セシウム（４９８．５ｇ、１５３０ｍｍｏｌ）を少しずつ３０分かけて添加し、次いで５０℃で１７時間または反応が完了するまで撹拌する。反応混合物を１５℃に冷却し、全ての固体が溶解するまで水を添加する。さらに水（４．５Ｌ）を添加し、１５分間撹拌し、沈殿した固体を収集し、水（１．５Ｌ）で洗浄する。この固体を周囲温度で１時間水（１．５Ｌ）中にスラリー化し、ろ過し、水（５００ｍＬ）で洗浄し、固体をろ過により収集し、減圧下４０℃で乾燥させて、約１７％の不純物を含む褐色固体として表題化合物（１５６．９ｇ、６１％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^３５Ｃｌ／^３７Ｃｌ）２４２．８／２４４．８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

調製物１６
５−シアノ［１，３］チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボン酸エチル

スキーム２、工程Ａ：窒素雰囲気下で、１，４−ジオキサン（５００ｍＬ）および５０ｍＭ酢酸カリウム水溶液（４９０ｍＬ）を、５−クロロチアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボン酸エチル（４９．３５ｇ、１９３．２ｍｍｏｌ）、フェロシアン化カリウム三水和物（３６ｇ、９７．８ｍｍｏｌ）、ｔＢｕＸｐｈｏｓプレ触媒第３世代（４．８１ｇ、５．９ｍｍｏｌ）およびｔＢｕＸｐｈｏｓ（２．５５ｇ、５．９ｍｍｏｌ）に添加する。得られた混合物を９０℃に１．５時間加熱し、次いで、反応が完了したら、２０℃に冷却し、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（１Ｌ）との間で分配する。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×５００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、褐色固体（５０ｇ）を得る。この材料を本質的に同様に調製された粗材料と合わせて全粗材料（１０５．７ｇ、７３％純度、３３１ｍｍｏｌ）を得、合わせた材料を、ＤＣＭ中の０％〜２０％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、合わせた収量（６３．４ｇ、５４％）の黄褐色の固体としての表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ２３４．０（Ｍ＋Ｈ）。Ｓｅｎｅｃａｌｅｔａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１３，５２，１００３５−１００３９に記載された条件から適応。

調製物１７
５−シアノ［１，３］チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボン酸

スキーム２、工程Ａ：５−シアノチアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボン酸エチル（６９．０ｇ、２８７ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１．４Ｌ）に溶解し、混合物を内温１０℃に冷却する。内温１６℃未満に維持しながら、トリメチルシラノ酸カリウム（５１．２ｇ、３５９ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、混合物を周囲温度で１．５時間撹拌する。ろ過により固体を収集し、ＴＨＦ（５００ｍＬ）で洗浄し、窒素流下で乾燥させる。固体を１：１のＴＨＦ／水（１２００ｍＬ）に溶解し、２Ｎ塩酸水溶液（１４３ｍＬ、２８６ｍｍｏｌ）を使用して酸性化する。有機溶媒を減圧下で除去し、残りの水性混合物を氷水浴中で冷却する。固体をろ過により収集し、デシケーター中の真空下で乾燥させて、淡オレンジ色の粉末として表題化合物（５７．２ｇ、９２％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１６０．０（Ｍ−ＣＯ_２Ｈ）。

実施例１
Ｎ−［３−［（３Ｒ，６Ｒ）−５−アミノ−３，６−ジメチル−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−１，４−オキサジン−３−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−シアノ−チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボキサミド

スキーム２、工程Ｂ：５−シアノチアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボン酸（０．１２７７ｍｍｏｌ、０．０２６２１ｇ）をアセトニトリル（４ｍＬ）と一緒に混合する。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．００８３６ｍＬ）を添加し、続いて塩化オキサリル（０．１２７７ｍｍｏｌ、０．０１１０８ｍＬ）を添加する。スラリーを室温で１．５時間撹拌する。別の容器に、（３Ｒ，６Ｒ）−３−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−３，６−ジメチル−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−１，４−オキサジン−５−アミン（３０ｍｇ、０．０９８２６ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（４ｍＬ、７６．３ｍｍｏｌ、３．１３ｇ、４ｍＬ、１００質量％）に溶解し、この溶液を５０℃に温める。酸塩化物混合物を濃縮して、粗酸塩化物を得、これをアセトニトリル（４ｍＬ）中に再スラリー化する。この酸塩化物混合物を、アニリン溶液に５０℃のまま添加し、１８時間撹拌する。室温に冷却し、ＮａＨＣＯ_３（水溶液）に注ぐ。ＤＣＭ（３×７５ｍＬ）で抽出し、有機抽出物を食塩水で洗浄し、溶液を濃縮して、粗生成物を得る。０〜１０％（ＭｅＯＨ中の７ＮＮＨ_３）／ＤＣＭの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（２６ｍｇ、５３％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ：４９３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

インビトロアッセイ手順：
ＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１の選択性を評価するために、試験化合物を、以下に記載されるように、ＢＡＣＥ１およびＢＡＣＥ２に対する特異的な基質を使用したＦＲＥＴアッセイにおいて評価する。インビトロ酵素および細胞アッセイのために、試験化合物を、ＤＭＳＯ中で調製し、１０ｍＭ原液を作製する。原液は、ＤＭＳＯ中で段階希釈されて、インビトロ酵素および全細胞アッセイを実施する前に、９６ウェル丸底プレート中で、１０μＭ〜０．０５ｎＭの範囲の最終化合物濃度を有する、１０点希釈曲線を得る。

インビトロプロテアーゼ阻害アッセイ：
ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃの発現。
ＲＴ−ＰＣＲにより全脳ｃＤＮＡからヒトＢＡＣＥ１（受託番号：ＡＦ１９０７２５）およびヒトＢＡＣＥ２（受託番号：ＡＦ２０４９４４）をクローニングする。アミノ酸配列番号１〜４６０に対応するヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ_１（Ｆｃ）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに挿入する（Ｖａｓｓａｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４２（１９９９））。それぞれｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃと名づけられた、この、ＢＡＣＥ１（１−４６０）またはＢＡＣＥ２（１−４６０）およびヒトＦｃの融合タンパク質を、ｐＪＢ０２ベクター中で構築する。ヒトＢＡＣＥ１（１−４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ）およびヒトＢＡＣＥ２（１−４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃ）を、ＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現する。各コンストラクトのｃＤＮＡ（２５０μｇ）をＦｕｇｅｎｅ６と混合し、１リットルのＨＥＫ２９３細胞に添加する。トランスフェクションの４日後、培養上清を、精製のために採取する。ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃを、以下に記載するように、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製する。酵素は、小アリコートで−８０℃で貯蔵される。（Ｙａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９１（６）１２４９−５９（２００４）を参照）。

ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃの精製。
ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃまたはｈｕＢＡＣＥ２：ＦｃのｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培養上清を、回収する。０．２２μｍの滅菌フィルターを通じて培養上清をろ過することによって細胞残屑を除去する。プロテインＡ−アガロース（５ｍＬ）（ベッド容量）を培養上清（４リットル）に添加する。この混合物を４℃で一晩穏やかに攪拌する。プロテインＡ−アガロース樹脂を回収し、低圧クロマトグラフィカラムに詰める。カラムは、１時間当たり２０ｍＬの流速で、２０×ベッド容量のＰＢＳで洗浄する。結合したｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃまたはｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃのタンパク質を、１時間当たり２０ｍＬの流速で、５０ｍＭの酢酸、ｐＨ３．６で溶離する。溶出液の画分（１ｍＬ）を直ちに酢酸アンモニウム（０．５ｍＬ、２００ｍＭ）、ｐＨ６．５で中和する。最終産物の純度は、４〜２０％のＴｒｉｓ−ＧｌｙｃｉｎｅＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける電気泳動によって評価する。酵素は、小アリコートで−８０℃で貯蔵される。

ＢＡＣＥ１のＦＲＥＴアッセイ
試験化合物の段階希釈物を、上述のとおり調製する。化合物を、ＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中でさらに２０×希釈する。各々の希釈物（１０μＬ）を、反応混合物（２５μＬの５０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ４．６、１ｍＭのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、およびＡＰＰの配列に基づく１５μＭのＦＲＥＴ基質）を含む対応する低タンパク質結合ブラックプレートの列Ａ〜Ｈの各々のウェルに添加する（Ｙａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９１（６）１２４９−５９（２００４）を参照）。含有物を、１０分間プレートシェーカー上で十分に混合する。ＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中のヒトＢＡＣＥ１（１−４６０）：Ｆｃ（２００ｐＭを１５μＬ）（Ｖａｓｓｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４１（１９９９）を参照）を、基質および試験化合物を含むプレートに添加して、反応を開始する。０時間における混合物のＲＦＵは、プレートシェーカー上での短時間の混合後、励起波長３５５ｎｍおよび放出波長４６０ｎｍで記録される。反応プレートは、アルミホイルで被覆され、１６〜２４時間室温で、暗い加湿オーブン内で保持される。インキュベーションの終わりにおけるＲＦＵは、０時間において使用された同じ励起および放出設定で記録される。０時間におけるＲＦＵとインキュベーションの終わりの差は、化合物処理下でのＢＡＣＥ１の活性を表す。ＲＦＵの差は、阻害剤濃度に対してプロットされ、曲線は、ＩＣ_５０値を得るために、４パラメータロジスティック方程式に適合される。（Ｍａｙ，ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３１，１６５０７−１６５１６（２０１１））。

実施例１の化合物は、本質的に上記のとおり試験され、８．１８ｎＭ±１．８６のＢＡＣＥ１に対するＩＣ_５０、ｎ＝１３（平均±平均の標準偏差）を示す。このデータは、実施例１の化合物が、インビトロで、精製された組み換えＢＡＣＥ１酵素活性を阻害することを実証する。

ＢＡＣＥ２ＴＭＥＭ２７のＦＲＥＴアッセイ
試験化合物の段階希釈物を、上述のとおり調製する。化合物を、ＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中でさらに２０×希釈する。各々の希釈物（１０μＬ）を、反応混合物（２５μＬの５０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ４．６、１ｍＭのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、および５μＭのＴＭＥＭＦＲＥＴ基質）（ｄａｂｃｙｌ−ＱＴＬＥＦＬＫＩＰＳ−ＬｕｃＹ、ＷＯ２０１０／０６３６４０Ａ１）を含む対応する低タンパク質結合ブラックプレートの列Ａ〜Ｈの各々のウェルに添加する。次いで、ＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中の２０μＭのヒトＢＡＣＥ２（１−４６０）：Ｆｃの１５μＬ（Ｖａｓｓｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４１（１９９９）を参照）を、基質および試験化合物を含むプレートに添加して、反応を開始する。含有物は、１０分間プレートシェーカー上で十分に混合される。０時間における混合物のＲＦＵは、励起波長４３０ｎｍおよび放出波長５３５ｎｍで記録される。反応プレートは、アルミホイルで被覆され、１６〜２４時間室温で、暗い加湿オーブン内で保持される。インキュベーションの終わりにおけるＲＦＵは、０時間において使用された同じ励起および放出設定で記録される。０時間におけるＲＦＵとインキュベーションの終わりの差は、化合物処理下でのＢＡＣＥ２の活性を表す。ＲＦＵの差は、阻害剤濃度に対してプロットされ、曲線は、ＩＣ_５０値を得るために、４パラメータロジスティック方程式に適合される。（Ｍａｙ，ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３１，１６５０７−１６５１６（２０１１））。

実施例１の化合物は、本質的に上記のとおり試験され、４４６ｎＭ±９２のＢＡＣＥ２に対するＩＣ_５０、ｎ＝６（平均±平均の標準偏差）を示す。ＢＡＣＥ１（ＦＲＥＴＩＣ_５０酵素アッセイ）のＢＡＣＥ２（ＴＭＥＭ２７ＬｕｃＹＦＲＥＴアッセイ）に対する比は、約５０倍であり、ＢＡＣＥ１酵素を阻害するための機能的選択性を示す。上記のデータは、実施例１の化合物がＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１に対して選択的であることを実証する。

ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔ全細胞アッセイ
ＢＡＣＥ１活性の阻害の測定のための慣例的な全細胞アッセイは、ヒトＡＰＰ６９５ＷｔのｃＤＮＡを安定的に発現する、ヒト神経芽腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ２２６６）を利用する。細胞は、慣例的には継代数６代まで使用し、その後廃棄する。

ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔ細胞を、２００μＬの培地（１０％ＦＢＳを含む、５０％ＭＥＭ／ＥＢＳＳおよびＨａｍ’ｓＦ１２、１×各ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ならびにＮａＨＣＯ_３）中、５．０×１０^４細胞／ウェルで、９６ウェル組織培養プレートに播種する。翌日、培地を細胞から除去し、新鮮培地が添加され、次いで、所望の濃度範囲において、試験化合物の存在／非存在下で、３７℃で２４時間インキュベートされる。

インキュベーションの終わりに、培養上清を、特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによるＡｂｅｔａペプチド１−４０および１−４２の分析によって、ベータ−セクレターゼ活性の実証のために分析する。Ａｂｅｔａのこれらの特異的イソ型を測定するために、モノクローナル２Ｇ３を、Ａｂｅｔａ１−４０のための捕捉抗体として使用し、モノクローナル２１Ｆ１２を、Ａｂｅｔａ１−４２のための捕捉抗体として使用する。Ａｂｅｔａ１−４０とＡｂｅｔａ１−４２のＥＬＩＳＡの両方は、レポーティング抗体としてビオチン化３Ｄ６を使用する（抗体の説明について、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１５５０−１５５５（１９９７）を参照）。化合物による処理後に培養上清中に放出されたＡｂｅｔａの濃度は、そのような条件下でＢＡＣＥ１の活性に対応する。１０点阻害曲線がプロットされ、４パラメータロジスティック方程式に適合されて、Ａｂｅｔａ低下効果に対するＩＣ_５０値を得る。

実施例１の化合物は、本質的に上記のとおり試験され、ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５ＷｔＡ−ｂｅｔａ（１−４０）ＥＬＩＳＡに対して、１．８８ｎＭ±０．１７のＩＣ_５０、ｎ＝３、およびＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５ＷｔＡ−ｂｅｔａ（１−４２）ＥＬＩＳＡに対して、３．５５ｎＭ±０．８８のＩＣ_５０、ｎ＝３（平均±平均の標準偏差）を示す。上記のデータは、実施例１の化合物が全細胞アッセイにおいてＢＡＣＥ１を阻害することを示す。

これらの研究は、本発明の化合物がＢＡＣＥ１を阻害し、したがって、Ａｂｅｔａのレベルを低減するのに有用であることを示す。

Claims

式：

の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
３位のメチルが、オキサジン環上で、６位のトリフルオロメチルに対してシス立体配置にある、請求項１に記載の化合物または塩。
前記化合物が、Ｎ−［３−［（３Ｒ，６Ｒ）−５−アミノ−３，６−ジメチル−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−１，４−オキサジン−３−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−シアノ−チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−カルボキサミドである、請求項１または請求項２に記載の化合物またはその塩。
患者におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
患者における軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
治療法に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
アルツハイマー病の治療に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
軽度認知障害のアルツハイマー病への進行の治療に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、薬学的組成物。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に混合することを含む、薬学的組成物を調製するための方法。