JP2019513731A - 変形抗体を含む抗体−薬物接合体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、特定の構造のモチーフを抗体の末端に含む変形抗体がリンカーを介して薬物に結合した抗体−薬物接合体およびこれを含む組成物に関し、具体的には、重鎖または軽鎖Ｃ−末端に結合し、薬物接合収率が著しく増加した変形抗体を含む変形抗体−薬物接合体（ｍＡＤＣ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）接合体およびこれを含む組成物に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、特定の構造のモチーフを抗体の末端に含む変形抗体が、リンカーを介して薬物に結合した抗体−薬物接合体およびこれを含む組成物に関し、具体的には、重鎖または軽鎖Ｃ−末端に結合して、薬物接合収率が著しく増加した変形抗体を含む変形抗体−薬物接合体（ｍＡＤＣ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびこれを含む組成物に関する。
抗癌治療に用いられる薬物は、一般的に、毒性、特に、骨髄、粘膜、神経毒性を示す。したがって、強い抗癌作用を示し、且つより安全で癌細胞に特異性を示す抗癌剤の開発が求められる。癌細胞にのみ特異的に作用し、副作用は減少する抗癌剤は、様々な方向から開発が進められている。
かかる面において、特定の疾患で特異的に発現する標的（ｔａｒｇｅｔ）、すなわち、抗原に特異的に結合する抗体を用いた治療剤は、バイオ医薬品の中で現在最も活発に研究が進められている。特に、癌細胞の表面に特異的に発現する腫瘍−関連抗原を明らかにし、これに結合して細胞の成長を抑制したり死滅を誘導する抗体、すなわち、抗癌抗体を用いた腫瘍の診断および治療方法は、現在広く使用されており、今後の見通しも非常に明るい技術分野である。
しかし、かかる抗癌抗体は、標的特異性は非常に高いが、癌細胞の死滅効果は既存の細胞毒性薬物（抗癌剤）、すなわち、抗癌薬物に比べて低いことが多いため、細胞毒性薬物およびその他の細胞増殖抑制薬物などとの併用投与療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）で使用されることが多い。抗癌薬物は、抗癌抗体に比べては著しく高い細胞毒性を示すが、癌細胞への標的特異性は低いため、抗体治療剤に比べて非常に高い副作用（ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔ）を示す。したがって、抗癌抗体と抗癌薬物の併用投与療法は、それぞれの薬物を個別に投与した時よりもさらに高い治療効果を示すが、抗癌薬物の副作用は常に伴われるという根本的な限界を有している。
また、非常に高い細胞毒性のため、抗癌薬物の中で単独処方で抗癌治療剤として使用可能な薬物は、相対的に毒性の低いタキソール系やシスプラチン系の薬物と制限的である。細胞毒性が大きいほとんどの抗癌薬物の場合、非常に高い細胞毒性のため、単独薬物として処方することは事実上不可能である。単独処方での使用が不可能な抗癌薬物を癌細胞に対する標的特異性が非常に高い抗体に結合させることで、正常細胞への副作用なしに標的癌細胞にのみ抗癌薬物を運搬することができる。したがって、抗体−薬物接合体は、既存には使用が不可能な抗癌薬物の治療効能を向上させるための方法として脚光を浴びている。
現在、市場に発売されている抗体−薬物接合体は、ホジキンリンパ腫の治療剤であるアドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））と転移性乳癌治療剤であるカドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））がある。これらの抗体−薬物接合体は、細胞の分裂過程に関与する細胞内微小管であるチューブリンに接合し、細胞の分裂を抑制することで、癌の成長と分裂を阻害するチューブリン抑制剤が抗体に接合している構造を有する。これらの抗体−薬物接合体は、抗体が本来有しているリジンに薬物を接合するか（カドサイラ）、抗体の構造的安定性を維持させる重鎖−重鎖、あるいは重鎖−軽鎖を連結するジスルフィド基を還元させたシステイン基に薬物を接合する（アドセトリス）。かかる第１世代抗体−薬物接合体に使用された抗癌薬物の接合方式は、抗体当たり接合する薬物の個数を調節することができず、同じ薬物接合数を有する抗体−薬物接合体でも薬物の接合位置が互いに異なる位置異性体（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｉｓｏｍｅｒ）が生成されることになる。抗体当たりの薬物の接合個数は、抗体−薬物接合体の細胞毒性だけでなく、抗体−薬物接合体の安定性、凝集体形成可能性などにも影響を及ぼす要素であり、一般的に、薬物が多く接合するほど抗体自体の安定性が低下し、凝集体の形成可能性が高くなる。
また、第１世代抗体−薬物接合体は、抗体当たり接合する薬物の個数を調節することができないため、抗体当たり接合する薬物の個数は、平均的な数値を有することになる。例えば、カドサイラの場合には、抗体に接合した薬物の個数が１個から８個までの分布を有することになり、平均的に３．５個の薬物接合数を有することになる。同じ薬物接合個数でも薬物の接合位置に応じて抗体−薬物接合体の特性が異なり得る。Ｆａｂ付近やＦｃのｈｉｎｇｅ付近に薬物が接合する場合、抗原やＦｃγやＦｃＲｎ受容体との結合力に差が生じるため、抗体の安定性や抗原−抗体反応性が阻害される可能性もある。抗体当たり接合する薬物の個数が増加するほど、薬物の接合位置が互いに異なる位置異性体の個数も比例して増加し、かかる結果は、生産バッチによる抗体−薬物接合体の一貫した特性を維持するにも大きい影響を及ぼし得る。
したがって、近年、上記のような第１世代抗体−薬物接合体の欠点を改善するために、位置特異的薬物接合のための様々な接合技術が開発されている。ジェネンテック（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）では、抗体のアミノ酸を置換してシステイン基を導入した後、導入したシステイン基に位置特異的に薬物を接合するＴｈｉｏＭａｂ技術を用いて薬物を接合する技術を開発した。これにより、位置特異的に薬物が接合された抗体−薬物接合体が、第１世代抗体−薬物接合体の接合技術で製造されたものよりも生体内での活性に優れていることを示した（Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２６，９２５−９３２）。位置特異的接合は、基質特異性が非常に高いタンパク質酵素を用いた薬物接合方式でまた多くの会社が試みた。
ホルミルグリシン−生成酵素（Ｆｏｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）を用いた位置特異的接合（Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，２５，１３３１−１３４１）、グルタミントランスフェラーゼを用いた接合（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，２０，１６１−１６７）などの方法により、所望の個数の薬物を位置選択的に抗体に接合することができることが報告された。しかし、かかるタンパク質酵素を用いた接合は、３７℃で７２時間過量の薬物の存在下で接合をするか、または高濃度の接合酵素を要するという点などの欠点がある。
さらに他の位置特異的接合方法である非天然アミノ酸（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を用いた接合方法は、ｔＲＮＡ合成酵素のｍｕｔａｎｔを介して非天然アミノ酸をタンパク質に導入することができるｔＲＮＡを合成することで、天然状態のアミノ酸が有していない残基（ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ）をタンパク質内に導入することができる技術に基づいている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００，５６−６１）。これにより導入した非天然アミノ酸の残基に位置特異的接合をする方式で所望の位置に薬物を接合することができる（ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ．Ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１４，２５，３５１−３６１）。しかし、かかる方法は、高度の遺伝子工学的方法により転写段階（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）を調節しなければならない高難易度の作業が求められる。
前記のような位置特異的接合は、複雑な遺伝子工学的方法を用いて転写システムを変形するか、または過量の接合酵素を添加しなければならないなど、位置特異的接合反応のためにかかる時間とコストが非常に大きい。抗体は、抗癌薬物を癌細胞に特異的に伝達する輸送体（ｃａｒｒｉｅｒ）の役割をし、薬物は、癌細胞に運搬されるまで安定して抗体に接合されていれば良い抗体−薬物接合体の基本概念から見て、果して前記のような複雑で時間と経済的コストがかかる接合方法を使用して、抗体−薬物接合体を製造しなければならない必然性に疑問がありかねない。抗体−薬物接合体の生産において、位置特異的に接合することができ、且つ経済的効用性にも優れた接合方式は、既存の第１世代抗体−薬物接合体の接合方法だけでなく、新たに提示された位置特異的接合方式の限界を乗り越えることができる立派な代案になることができる。
抗体−薬物接合体は、既存の抗体医薬品に比べて著しく優れたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ効能を示している。しかし、抗体−薬物接合体を１次治療剤として使用するためのいくつかの臨床結果は、単クローン抗体治療剤と化学合成薬物の複合治療（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）に比べて有意な臨床的効用性の差を示すのに失敗した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｃｈｅ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／ｓｔｏｒｅ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｍｅｄ−ｃｏｒ−２０１４−１２−１９．ｈｔｍ）。かかる結果は、抗体−薬物接合体が、合成薬物だけではなく、単クローン抗体治療剤に比べて著しく高い治療費を要するという点を考慮したときに、抗体−薬物接合体の経済的効用性に大きな制約として作用し得る。かかる点で上述の位置特異的接合方式では、１次治療剤として使用できるという経済的効用性を提供するのに深刻な問題点を内包していると言える。
かかる技術的背景下で、本出願の発明者らは、位置特異的接合反応をするとともに、提示された接合反応よりも経済的効用性において著しく優れた抗体−薬物接合体に関する開発が切実に求められていることを認識し、かかる問題を解決するために、金属イオン結合モチーフが含まれたペプチドモチーフを含む変形抗体を介して位置特異的接合をするとともに、より著しく優れた薬物接合収率を有する変形抗体を発明した。かかる発明により、位置特異的接合方法による抗体−薬物接合体の優れた生体内抗癌効果だけではなく、より経済的に製造可能な抗体−薬物接合体を提供することを目的とする。
前記のような問題を解決するために、本発明では、特定の構造のモチーフが親抗体に結合し、薬物結合部位を有する形態の抗体（以下、変形抗体）を提供する。この変形抗体は、既存の金属イオン結合ペプチドモチーフを含む変形抗体を改良し、位置特異的接合の特性を維持するとともに、より高い薬物接合収率を有する変形抗体を提供する。また、この変形抗体を用いた抗体−薬物接合体の製造および抗癌薬物の製造方法を提供する。
前記目的を達成するために、本発明は、下記構造式（１）で表されるモチーフを抗体の末端に含む変形抗体がリンカーを介して薬物に結合した抗体−薬物接合体を提供する。
構造式（１）
Ｘａ−［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２
前記式中、Ｍｍｏｔｉｆ１またはＭｍｏｔｉｆ２は、それぞれ独立して、ＡＣＧＨＡ（配列番号１）、ＡＨＧＣＡ（配列番号２）、ＡＸＧＨＡ（配列番号３）およびＡＨＧＸＡ（配列番号４）から構成された配列のいずれか一つを含み、前記配列番号３または４中、Ｘは、システイン以外のアミノ酸残基を含み、
ＸａおよびＸｂは、それぞれ独立して、Ａ（ａｌａｎｉｎｅ）、Ｓ（ｓｅｒｉｎｅ）、Ｇ（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選択されるアミノ酸残基が０個〜２０個から構成されたペプチドであり、
ｎ１およびｎ２は、それぞれ、１〜１０の整数である。
また、本発明は、前記抗体−薬物接合体を含む癌の予防または治療用組成物を提供する。
Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒをターゲットとする抗体の抗体変異体であるＦＭ２、ＦＭ２ｂ（ｌｏｔ ｎｏ：４３９０f）、ＦＭ２ｂ（ｌｏｔ ｎｏ：５６９８ｆ）、ＦＭ２ａ、ＦＭ２Ｌ、ＦＭ１をＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥに接合した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。薬物が抗体の重鎖に導入したシステイン残基を含むモチーフに接合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で５０ｋＤａ付近の重鎖で二つのバンドで示される。 Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒをターゲットとする抗体の抗体変異体であるＦＭ２、ＦＭ２ｂ、ＦＭ２ａ、ＦＭ２Ｌ、ＦＭ１をｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｅを介してＭＭＡＥと連結された薬物−リンカー結合体であるｂｒ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥに接合した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。薬物が抗体の重鎖に導入したシステイン残基を含むモチーフに接合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で５０ｋＤａ付近の重鎖で二つのバンドで示される。 Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒが過発現したＫＢ−細胞を用いた細胞成長抑制能試験。親抗体であるＦｗｔと変形抗体−薬物接合体であるＦＭ２−Ｄ２（変形抗体であるＦＭ２とＭＭＡＥの変形抗体−薬物接合体においてＤＡＲが２を有する変形抗体−薬物接合体）、ＦＭ２ｂ−Ｄ２（ｏｒ ＦＭ２ｂ−Ｓ−Ｄ２）（変形抗体であるＦＭ２ｂ−ＳとＭＭＡＥの変形抗体−薬物接合体においてＤＡＲが２を有する変形抗体−薬物接合体）の細胞成長抑制能の比較。ＦＭ２−Ｄ２とＦＭ２ｂ−Ｄ２はほぼ同じ細胞内活性を示している。 Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒが過発現したＫＢ−細胞を用いた細胞成長抑制能試験。ＦＭ２ｂ−Ｓ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｆ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｙ−Ｄ２の細胞成長抑制能比較。ＦＭ２ｂ−Ｓ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｆ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｙ−Ｄ２はほぼ同じ細胞内活性を示している。 ＦＭ２ｂ−Ｓ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｆ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｋ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｙ−Ｄ２の２５℃と５０℃で０、１、３、５、７、１４日間保管した後、薬物の接合個数ＤＡＲとａｇｇｒｅｇａｔｅの変化測定。２５℃ではＤＡＲとｍｏｎｏｍｅｒの変化がほとんど発見されなかったが、５０℃ではＤＡＲ２の含量が減少し、ａｇｇｒｅｇａｔｅが時間の経過につれて形成されることが確認された。しかし、各変異体別にＤＡＲの変化とａｇｇｒｅｇａｔｅ形成において差は観察されなかった。
他に定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練された専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常使用されるものである。
抗体−薬物接合体は、ターゲット癌細胞に抗癌薬物を伝達するまでに抗癌薬物が抗体に安定して結合していなければならない。ターゲット癌細胞に伝達された抗癌薬物は、抗体から遊離され、癌細胞の死滅を誘導しなければならない。このためには、抗癌薬物をリンカーを用いて抗体に安定して結合するとともに、癌細胞から遊離される時には癌細胞の死滅を誘導する十分な細胞毒性を有する薬物−リンカーの構造を有していなければならない。また、薬物は、抗体に位置特異的に接合することで、抗体−薬物接合体の抗癌効能性と製造過程での均一性を示すべきである。
このために、本出願の発明者らは、韓国登録特許第１５４１７６４号にて抗体のＣ−末端に金属イオン結合モチーフを含むペプチドを導入して、位置特異的に薬物が接合することができ、所定の抗体対薬物の接合比率を達成することができることを示した。これにより薬物が変形抗体に位置特異的に接合するとともに、親抗体の特性は維持され、且つ非常に高い標的特異性と薬物効果を期待することができることを示した。しかし、合成薬物や単クローン抗体治療剤と比較して、著しく高い生産費は、薬物の接合収率の向上による経済的効用性の拡大を切実に要している。
そのため、本発明では、金属イオン結合モチーフが含まれたペプチドモチーフを含む変形抗体を改良、すなわち、親抗体の末端に導入した金属イオン結合モチーフの配列と１次構造に応じて抗体に接合される薬物の接合比率が著しく増加することができることを証明しようとした。
一観点で、本発明は、下記構造式（１）で表されるモチーフを抗体の末端に含む変形抗体がリンカーを介して薬物に結合された抗体−薬物接合体に関する。
構造式（１）
Ｘａ−［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２
前記式中、Ｍｍｏｔｉｆ１またはＭｍｏｔｉｆ２は、それぞれ独立して、ＡＣＧＨＡ（配列番号１）、ＡＨＧＣＡ（配列番号２）、ＡＸＧＨＡ（配列番号３）およびＡＨＧＸＡ（配列番号４）から構成された配列のいずれか一つを含み、前記配列番号３または４中、Ｘは、システイン以外のアミノ酸残基を含み、
ＸａおよびＸｂは、それぞれ独立して、Ａ（ａｌａｎｉｎｅ）、Ｓ（ｓｅｒｉｎｅ）、Ｇ（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選択されるアミノ酸残基が０個〜２０個から構成されたペプチドであり、
ｎ１およびｎ２は、それぞれ１〜１０の整数である。
前記構造式（１）で表されるモチーフは、金属イオン結合モチーフであるＣＧＨモチーフを含むペプチドであり、ＣＧＨモチーフは、以下の化学式１の構造を有する。
Figure 2019513731
前記化学式１中、Ｍは金属イオンを意味し、Ｒはシステイン以外のアミノ酸残基、特にアラニンが好ましい。
本発明によるモチーフにおいて、Ｍｍｏｔｉｆ１またはＭｍｏｔｉｆ２は、それぞれ、Ｃ末端とＮ末端にアラニンが位置するＡＣＧＨＡ（配列番号１）またはこのうち、システインをシステイン以外のアミノ酸残基で置換したＡＸＧＨＡ（配列番号３）を含む。Ｎ−末端とＣ−末端が変わっても依然として金属イオン結合特性を有することから、本発明によるモチーフにおいて、Ｍｍｏｔｉｆ１またはＭｍｏｔｉｆ２にＡＣＧＨＡ（配列番号１）またはＡＸＧＨＡ（配列番号３）でＮ−末端とＣ−末端が変更されたＡＨＧＣＡ（配列番号２）またはＡＨＧＸＡ（配列番号４）も含まれる。
本発明によるモチーフにおいて、Ｍｍｏｔｉｆ１またはＭｍｏｔｉｆ２は、それぞれ同一の配列を含んでもよく、互いに異なる配列を含んでもよい。
本発明による一実施形態において、前記Ｍｍｏｔｉｆ１またはＭｍｏｔｉｆ２がＡＸＧＨＡまたはＡＨＧＸＡに相当する場合、この際、Ｘは、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リジン（Ｋ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から構成された群から選択されるアミノ酸残基であってもよい。
本発明による一実施形態において、前記Ｍｍｏｔｉｆ２がＡＸＧＨＡ（配列番号３）を含み、Ｘはシステイン以外のアミノ酸残基の場合、ＡＣＧＨＡを含む場合に比べて高い薬物接合能を示すことができることを確認した。前記Ｍｍｏｔｉｆ２は、ＡＸＧＨＡ、この際、Ｘは、システイン以外のアミノ酸残基、例えば、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リジン（Ｋ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から構成された群から選択されるアミノ酸残基であってもよい。
Ｘａは、モチーフＭｍｏｔｉｆ１の５’末端に存在するアミノ酸残基であり、場合に応じて、抗体の末端と連結するために位置するペプチドであってもよく、Ａ（ａｌａｎｉｎｅ）、Ｓ（ｓｅｒｉｎｅ）、Ｇ（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選択されるアミノ酸残基が０個〜２０個から構成されたペプチドである。Ｘａのアミノ酸残基が０の場合、モチーフは、Ｘａを含まず、抗体にモチーフのＭｍｏｔｉｆ１が直接結合する形態であってもよい。Ｘａのアミノ酸残基が１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上であってもよく、例えば、２〜２０個、２〜１８個、２〜１６個、２〜１４個、２〜１２個、２〜１０個、２〜８個、２〜６個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個であってもよい。
Ｘｂは、Ｍｍｏｔｉｆ１およびＭｍｏｔｉｆ２を連結するためのリンカーであり、Ａ（ａｌａｎｉｎｅ）、Ｓ（ｓｅｒｉｎｅ）、Ｇ（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選択されるアミノ酸残基が０個〜２０個から構成されたペプチドである。Ｘｂのアミノ酸残基が０の場合、モチーフは、Ｘｂを含まず、Ｍｍｏｔｉｆ１およびＭｍｏｔｉｆ２が直接連結される形態であってもよい。Ｘｂのアミノ酸残基が１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上であってもよく、例えば、２〜２０個、２〜１８個、２〜１６個、２〜１４個、２〜１２個、２〜１０個、２〜８個、２〜６個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個であってもよい。
ｎ１およびｎ２は、それぞれ、Ｍｍｏｔｉｆ１およびＭｍｏｔｉｆ２の繰り返し回数を示し、１〜１０の整数である。前記ｎ１およびｎ２は、それぞれ、１であってもよく、この際、Ｍｍｏｔｉｆ１およびＭｍｏｔｉｆ２にＡＣＧＨＡ（配列番号１）、ＡＨＧＣＡ（配列番号２）、ＡＸＧＨＡ（配列番号３）およびＡＨＧＸＡ（配列番号４）から構成された配列のいずれか一つが、ＸｂのリンカーなしにまたはＸｂのリンカーを含んで連結されてもよい。例えば、［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２の構造は、Ｘｂのリンカーがない場合、ＡＣＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号５）、ＡＣＧＨＡＡＨＧＣＡ（配列番号６）、ＡＣＧＨＡＡＸＧＨＡ（配列番号７）、ＡＣＧＨＡＡＨＧＸＡ（配列番号８）、ＡＨＧＣＡＡＨＧＣＡ（配列番号９）、ＡＨＧＣＡＡＣＧＨＡ（配列番号１０）、ＡＨＧＣＡＡＸＧＨＡ（配列番号１１）、ＡＨＧＣＡＡＨＧＸＡ（配列番号１２）、ＡＸＧＨＡＡＸＧＨＡ（配列番号１３）、ＡＸＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号１４）、ＡＸＧＨＡＡＨＧＣＡ（配列番号１５）、ＡＸＧＨＡＡＨＧＸＡ（配列番号１６）、ＡＨＧＸＡＡＨＧＸＡ（配列番号１７）、ＡＨＧＸＡＡＣＧＨＡ（配列番号１８）、ＡＨＧＸＡＡＨＧＣＡ（配列番号１９）、またはＡＨＧＸＡＡＸＧＨＡ（配列番号２０）であってもよく、薬物の結合のために、Ｃ（システイン）を必須に含むモチーフがＭｍｏｔｉｆ１およびＭｍｏｔｉｆ２に選別されてもよい。
Ｘｂが存在する場合の前記アミノ酸配列において、５’末端から６番目の位置にアミノ酸残基が１個〜２０個から構成されたペプチドがさらに含まれてもよい。この際、Ｘは、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リジン（Ｋ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から構成された群から選択されてもよい。
［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２の構造は、Ｘｂのリンカーがない場合、例えば、Ｘがセリンであれば、Ｘを含む配列番号７、８、１１〜２０においてＸ位置にセリンを含み、ＡＣＧＨＡＡＳＧＨＡ（配列番号２１）、ＡＣＧＨＡＡＨＧＳＡ（配列番号２２）、ＡＨＧＣＡＡＳＧＨＡ（配列番号２３）、ＡＨＧＣＡＡＨＧＳＡ（配列番号２４）、ＡＳＧＨＡＡＳＧＨＡ（配列番号２５）、ＡＳＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号２６）、ＡＳＧＨＡＡＨＧＣＡ（配列番号２７）、ＡＳＧＨＡＡＨＧＳＡ（配列番号２８）、ＡＨＧＳＡＡＨＧＳＡ（配列番号２９）、ＡＨＧＳＡＡＣＧＨＡ（配列番号３０）、ＡＨＧＳＡＡＨＧＣＡ（配列番号３１）、またはＡＨＧＳＡＡＳＧＨＡ（配列番号３２）であってもよい。
［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２の構造は、Ｘｂのリンカーがない場合、例えば、Ｘがアラニン（Ａ）であれば、ＡＣＧＨＡＡＡＧＨＡ（配列番号３３）、ＡＣＧＨＡＡＨＧＡＡ（配列番号３４）、ＡＨＧＣＡＡＡＧＨＡ（配列番号３５）、ＡＨＧＣＡＡＨＧＡＡ（配列番号３６）、ＡＡＧＨＡＡＡＧＨＡ（配列番号３７）、ＡＡＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号３８）、ＡＡＧＨＡＡＨＧＣＡ（配列番号３９）、ＡＡＧＨＡＡＨＧＡＡ（配列番号４０）、ＡＨＧＡＡＡＨＧＡＡ（配列番号４１）、ＡＨＧＡＡＡＣＧＨＡ（配列番号４２）、ＡＨＧＡＡＡＨＧＣＡ（配列番号４３）、またはＡＨＧＡＡＡＡＧＨＡ（配列番号４４）であってもよい。
［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２の構造は、Ｘｂのリンカーがない場合、例えば、Ｘがトレオニン（Ｔ）であれば、ＡＣＧＨＡＡＴＧＨＡ（配列番号４５）、ＡＣＧＨＡＡＨＧＴＡ（配列番号４６）、ＡＨＧＣＡＡＴＧＨＡ（配列番号４７）、ＡＨＧＣＡＡＨＧＴＡ（配列番号４８）、ＡＴＧＨＡＡＴＧＨＡ（配列番号４９）、ＡＴＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号５０）、ＡＴＧＨＡＡＨＧＣＡ（配列番号５１）、ＡＴＧＨＡＡＨＧＴＡ（配列番号５２）、ＡＨＧＴＡＡＨＧＴＡ（配列番号５３）、ＡＨＧＴＡＡＣＧＨＡ（配列番号５４）、ＡＨＧＴＡＡＨＧＣＡ（配列番号５５）、またはＡＨＧＴＡＡＴＧＨＡ（配列番号５６）であってもよい。
［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２の構造は、Ｘｂのリンカーがない場合、例えば、Ｘがチロシン（Ｙ）であれば、ＡＣＧＨＡＡＹＧＨＡ（配列番号５７）、ＡＣＧＨＡＡＨＧＹＡ（配列番号５８）、ＡＨＧＣＡＡＹＧＨＡ（配列番号５９）、ＡＨＧＣＡＡＨＧＹＡ（配列番号６０）、ＡＹＧＨＡＡＹＧＨＡ（配列番号６１）、ＡＹＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号６２）、ＡＹＧＨＡＡＨＧＣＡ（配列番号６３）、ＡＹＧＨＡＡＨＧＹＡ（配列番号６４）、ＡＨＧＹＡＡＨＧＹＡ（配列番号６５）、ＡＨＧＹＡＡＣＧＨＡ（配列番号６６）、ＡＨＧＹＡＡＨＧＣＡ（配列番号６７）、またはＡＨＧＹＡＡＹＧＨＡ（配列番号６８）であってもよい。
［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２の構造は、Ｘｂのリンカーがない場合、例えば、Ｘがアスパラギン酸（Ｄ）であれば、ＡＣＧＨＡＡＤＧＨＡ（配列番号６９）、ＡＣＧＨＡＡＨＧＤＡ（配列番号７０）、ＡＨＧＣＡＡＤＧＨＡ（配列番号７１）、ＡＨＧＣＡＡＨＧＤＡ（配列番号７２）、ＡＤＧＨＡＡＤＧＨＡ（配列番号７３）、ＡＤＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号７４）、ＡＤＧＨＡＡＨＧＣＡ（配列番号７５）、ＡＤＧＨＡＡＨＧＤＡ（配列番号７６）、ＡＨＧＤＡＡＨＧＤＡ（配列番号７７）、ＡＨＧＤＡＡＣＧＨＡ（配列番号７８）、ＡＨＧＤＡＡＨＧＣＡ（配列番号７９）、またはＡＨＧＤＡＡＤＧＨＡ（配列番号８０）であってもよい。
［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２の構造は、Ｘｂのリンカーがない場合、例えば、Ｘがリジン（Ｋ）であれば、ＡＣＧＨＡＡＫＧＨＡ（配列番号８１）、ＡＣＧＨＡＡＨＧＫＡ（配列番号８２）、ＡＨＧＣＡＡＫＧＨＡ（配列番号８３）、ＡＨＧＣＡＡＨＧＫＡ（配列番号８４）、ＡＫＧＨＡＡＫＧＨＡ（配列番号８５）、ＡＫＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号８６）、ＡＫＧＨＡＡＨＧＣＡ（配列番号８７）、ＡＫＧＨＡＡＨＧＫＡ（配列番号８８）、ＡＨＧＫＡＡＨＧＫＡ（配列番号８９）、ＡＨＧＫＡＡＣＧＨＡ（配列番号９０）、ＡＨＧＫＡＡＨＧＫＡ（配列番号９１）、またはＡＨＧＫＡＡＫＧＨＡ（配列番号９２）であってもよい。
［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２の構造は、Ｘｂのリンカーがない場合、例えば、Ｘがフェニルアラニン（Ｆ）であれば、ＡＣＧＨＡＡＦＧＨＡ（配列番号９３）、ＡＣＧＨＡＡＨＧＦＡ（配列番号９４）、ＡＨＧＣＡＡＦＧＨＡ（配列番号９５）、ＡＨＧＣＡＡＨＧＦＡ（配列番号９６）、ＡＦＧＨＡＡＦＧＨＡ（配列番号９７）、ＡＦＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号９８）、ＡＦＧＨＡＡＨＧＣＡ（配列番号９９）、ＡＦＧＨＡＡＨＧＦＡ（配列番号１００）、ＡＨＧＦＡＡＨＧＦＡ（配列番号１０１）、ＡＨＧＦＡＡＣＧＨＡ（配列番号１０２）、ＡＨＧＦＡＡＨＧＦＡ（配列番号１０３）、またはＡＨＧＦＡＡＦＧＨＡ（配列番号１０４）であってもよい。
Ｘｂが存在する場合の上記配列番号５〜１０４のアミノ酸配列において、５’末端から６番目の位置にアミノ酸残基が１個〜２０個から構成されたペプチドがさらに含まれてもよい。この際、Ｘは、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リジン（Ｋ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から構成された群から選択されてもよい。
前記ｎ１およびｎ２は、それぞれ、２以上であってもよく、例えば、前記ｎ１およびｎ２が２の場合、Ｍｍｏｔｉｆ１およびＭｍｏｔｉｆ２それぞれが、同じアミノ酸配列を含む場合、ＡＣＧＨＡ（配列番号１）、ＡＨＧＣＡ（配列番号２）、ＡＸＧＨＡ（配列番号３）およびＡＨＧＸＡ（配列番号４）から構成された配列のいずれか一つがそれぞれ２回ずつ繰り返された配列が含まれるか、または異なる配列、例えば、ＡＣＧＨＡおよびＡＨＧＣＡ、ＡＣＧＨＡおよびＡＸＧＨＡ、ＡＣＧＨＡおよびＡＨＧＸＡ、ＡＨＧＣＡおよびＡＣＧＨＡ、ＡＨＧＣＡおよびＡＸＧＨＡ、ＡＨＧＣＡおよびＡＨＧＸＡ、ＡＸＧＨＡおよびＡＣＧＨＡ、ＡＸＧＨＡおよびＡＨＧＣＡ、ＡＸＧＨＡおよびＡＨＧＸＡ、ＡＨＧＸＡおよびＡＣＧＨＡ、ＡＨＧＸＡおよびＡＨＧＣＡ、またはＡＨＧＸＡおよびＡＸＧＨＡがそれぞれ２回ずつ繰り返された配列が含まれてもよい。前記ｎ１およびｎ２が３〜１０の場合には、Ｍｍｏｔｉｆ１およびＭｍｏｔｉｆ２それぞれが、ＡＣＧＨＡ（配列番号１）、ＡＨＧＣＡ（配列番号２）、ＡＸＧＨＡ（配列番号３）およびＡＨＧＸＡ（配列番号４）から構成された配列のいずれか一つに相当する同一配列を含むか、異なる配列を含み、それぞれ、３〜１０回ずつ繰り返されてもよい。
好ましくは、前記ｎ１およびｎ２は、それぞれ、１であってもよく、Ｘｂのリンカーが存在しないこともあり、この際、本発明によるモチーフは、例えば、配列番号５〜１０４から構成された群から選択される一つ以上の配列を含んでもよい。
前記モチーフは、抗体の重鎖または軽鎖Ｃ−末端、具体的には、重鎖Ｃ−末端に結合することができ、これにより薬物接合収率が著しく増加した変形抗体およびこれを含む薬物接合体を提供することができる。前記薬物の接合収率を高めることで、抗体−薬物接合体の生産収率を高めることができる。高い収率で接合された薬物は、変形抗体によってターゲット癌細胞に特異的に伝達されることで治療効果を高めることができ、高い抗体−薬物接合体の接合収率により、抗体−薬物接合体治療剤の生産コストを低減することができる。
前記モチーフは、親抗体とアミノ結合による融合（ｆｕｓｉｏｎ）形態で直接結合されるか、親抗体の末端官能基とモチーフのうち末端官能基が化学的に結合する形態、またはモチーフのうち末端官能基と薬物を連結するリンカーに媒介された（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）形態の結合も可能である。
前記リンカーは、モチーフ内の特定の残基と薬物を連結する形態であってもよく、変形抗体のうちモチーフ上に存在する求核性残基（例えば、システイン）に反応する求電子性基を有する反応性部位を有することができる。前記リンカーは、例えば、モチーフに結合する反応性官能基、アミノ酸および自己切断スペーサを含んでもよい。
前記官能基は、ｉ）マレイミド基、アセトアミド基、またはその誘導体、ｉｉ）アジリジン基、アリールハライド、アクリロイル基、またはその誘導体、ｉｉｉ）アルキル化反応基、アリール化反応基、ピリジルジスルフィド、チオニトロ安息香酸、またはその誘導体であってもよい。具体的には、前記リンカーは、具体例として、ｉ）マレイミド基またはその誘導体−バリン−シトルリン−パラアニリン安息香酸（ｐａｒａ−ａｎｉｌｉｎｅ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ：ＰＡＢＡ）；またはｉｉ）アセトアミド基またはその誘導体−バリン−シトルリン（ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）−パラアニリン安息香酸（ｐａｒａ−ａｎｉｌｉｎｅ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ：ＰＡＢＡ）の形態であってもよいが、これに制限されるものではない。
前記リンカーによる残基と薬物の結合は、公知の方法、例えば、アルキル化、二硫化（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）相互交換方法およびトランスチオエステル化反応法が用いられることができる。これにより、モチーフ内のシステイン残基のチオール基を介して抗体と薬物が接合されることができる。
一つの具体例において、チオール−リンカー結合のために使用されるマレイミド基の場合、システイン残基のチオールがマレイミド基に対して有する求核反応性がタンパク質の中で存在する他のアミノ酸官能基、例えば、リジン残基のアミノ基またはＮ−末端アミノ基に比べて、約１，０００倍も高いことからシステインに特異的に結合させるのに活用することができる。したがって、マレイミド基、その誘導体またはアセトアミド基またはその誘導体、例えば、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド基による変形抗体−薬物接合体は、システインがチオエーテル結合により薬物と結合されることが分かる。
前記抗体は、単クローン抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体から構成された群から選択される一つ以上であってもよい。また、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）などの変形抗体や、抗体断片などもいずれも使用可能である。「抗体断片」は、少なくとも抗原に対する結合機能を有している断片を意味し、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、ミニボディ、スキャブ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｃＡｂ）、抗体不変領域の誘導体、タンパク質スカホールド（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）に基づく人工抗体などを含む。
場合に応じて、前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭから構成された群から選択されてもよい。
前記抗体は、具体的には、癌特異抗原、細胞表面受容体タンパク質、細胞表面タンパク質、膜貫通タンパク質、シグナル伝逹タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達または分化に関する分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関する分子、血管形成に関する分子、または血管新生に関する分子に対する結合能と特異性を有してもよく、例えば、（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形態形成タンパク質受容体−ＩＢ型、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００１２０３）；
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００３４８６）；
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回の膜貫通上皮抗原、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０１２４４９）；
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ３６１４８６）；
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核細胞強化因子、メソテリン、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００５８２３）；
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体族３４（リン酸ナトリウム）、構成員２、第ＩＩ型ナトリウム−依存性ホスフェート輸送体３ｂ、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００６４２４）；
（７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７個のトロンボスポンジンリピート（第１型および類似第１型）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＢ０４０８７８）；
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８O１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＹ３５８６２８）；
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＹ２７５４６３）；
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０１７７６３）；
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回の膜貫通上皮抗原２、６回の膜貫通前立腺タンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ４５５１３８）；
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一時的受容体潜在的カチオンチャネル、Ｍ亜族、構成員４、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０１７６３６）；
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌腫−由来成長因子、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００３２０３またはＮＭ＿００３２１２）；
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバールウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２ＧｅｎＢａｎｋ承認番号Ｍ２６００４）；
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（イムノグロブリン−関連ベータ）、Ｂ２９、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０００６２６）；
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼ固定タンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０３０７６４）；
（１７）ＨＥＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号Ｍ１１７３０）；
（１８）ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から選択されるＥｒｂＢ受容体；
（１９）ＮＣＡ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号Ｍ１８７２８）；
（２０）ＭＤＰ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＢＣ０１７０２３）；
（２１）ＩＬ２０Ｒα（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ１８４９７１）；
（２２）ブレビカン（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ２２９０５３）；
（２３）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００４４４２）；
（２４）ＡＳＬＧ６５９（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＸ０９２３２８）；
（２５）ＰＳＣＡ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＪ２９７４３６）；
（２６）ＧＥＤＡ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＹ２６０７６３）；
（２７）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、ＮＰ＿４４３１７７．１）；
（２８）ＣＤ２２（Ｂ−細胞受容体ＣＤ２２−Ｂイソ型、ＮＰ−００１７６２．１）；
（２９）ＣＤ７９ａ（Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有的に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面で複合体を形成するＢ細胞特異的タンパク質であるＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、イムノグロブリン−関連アルファは、Ｂ細胞分化に関与する信号を伝達する、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００１７７４．１）；
（３０）ＣＸＣＲ５（ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化したＧタンパク質カップリングされた受容体であるバーキットリンパ種受容体１は、リンパ球の移動および体液性免疫に作用し、ＨＩＶ−２感染に参加し、ＡＩＤＳ、リンパ種、骨髄腫および白血病の発病と関連があると思われる、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００１７０７．１）；
（３１）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドに結合しＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示する、ＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００２１１１．１）；
（３２）Ｐ２Ｘ５（細胞の他、ＡＴＰによってゲートされるイオンチャネルである、プリン性受容体Ｐ２Ｘリガンド−ゲートイオンチャネル５は、シナプス伝達および神経発生に関与することができ、その欠乏は、特発性排尿筋不安定の病態生理に寄与することができる、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００２５５２．２）；
（３３）ＣＤ７２（Ｂ−細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００１７７３．１）；
（３４）ＬＹ６４（ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）族の第Ｉ型膜タンパク質である、リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）は、Ｂ細胞活性化およびアポトーシスを調節し、これの機能喪失は、全身性エリテマトーデス患者の疾病活性増加と関連する、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００５５７３．１）；
（３５）ＦｃＲＨ１（Ｃ２型Ｉｇ−類似およびＩＴＡＭドメインを含有するイムノグロブリンＦｃドメインに対する推定的受容体であるＦｃ受容体様タンパク質１は、Ｂリンパ球分化に関与することができる、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿４４３１７０．１）；
（３６）ＩＲＴＡ２（Ｂ細胞発生およびリンパ腫発生に作用することができる推定的免疫数溶体であるイムノグロブリン巨大族受容体転座関連２、転座による前記遺伝子脱調節はいくつかのＢ細胞悪性腫瘍で起こる、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿１１２５７１．１）；
（３７）ＴＥＮＢ２（成長因子のＥＧＦ／ヘレグリン族およびホリスタチンと関連のある推定的膜貫通プロテオグリカン、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ１７９２７４）；
（３８）ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７（精巣腫瘍過発現タンパク質）；
（３９）アンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＰＴＥＮ、ヒトカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ３）（前立腺癌で過発現するタンパク質）；
（４０）ＣＤ２０；
（４１）ＣＤ３０；
（４２）ＣＤ３３；
（４３）ＣＤ５２；
（４４）ＥｐＣａｍ；
（４５）ＣＥＡ；
（４６）ｇｐＡ３３；
（４７）Ｍｕｃｉｎｓ；
（４８）ＴＡＧ−７２；
（４９）炭酸脱水酵素ＩＸ（Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ）；
（５０）ＰＳＭＡ；
（５１）葉酸受容体（Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＦＯＬＲ 遺伝子により発現するタンパク質ファミリ。葉酸と高い結合力を有しており、５−メチルテトラヒドロ葉酸を細胞内に運搬する）；
（５２）ガングリオシド（ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２）；
（５３）糖水化物Ｌｅｗｉｓ−Ｙ；
（５４）ＶＥＧＦ；
（５５）ＶＥＧＦＲ；
（５６）ａＶｂ３；
（５７）ａ５ｂ１；
（５８）ＥＲＢ３；
（５９）ｃ−ＭＥＴ；
（６０）ＥｐｈＡ３；
（６１）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２；
（６２）ＲＡＮＫＬ；
（６３）ＦＡＰ；および
（６４）Ｔｅｎａｓｃｉｎから構成された群から選択される一つ以上のターゲットに結合能を有することができるが、これに制限されるものではない。
本発明による一実施形態において、配列番号１１５の重鎖および配列番号１１６の軽鎖を含む葉酸受容体（Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合する抗体（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）を親抗体として用いた。前記親抗体の重鎖末端に金属イオン結合モチーフを導入し、ペプチドモチーフの配列および配置に応じて様々な変形抗体を製造した後、変形抗体による薬物の接合比率の差を測定した。前記変形抗体は、配列番号１１７〜１２１から構成された群から選択される一つ以上の重鎖を含むことができる。
また、本発明による他の実施形態において、Ｈｅｒ２に特異的に結合する抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を親抗体として用いた。前記親抗体の重鎖末端に金属イオン結合モチーフを導入し、ペプチドモチーフの配列および配置に応じて様々な変形抗体を製造した後、変形抗体による薬物の接合比率の差を測定した。
結果、本発明による抗体−薬物接合体においてＦａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂにモチーフが導入された時に同等程度の高い薬物接合収率を有することを確認した。したがって、本発明によるモチーフは、抗体の種類と関係なく抗体−薬物接合体の製造において抗体に薬物を結合するためのプラットフォーム技術として活用することができる。
一つの実施形態において、前記抗体は、親抗体または変形抗体の可変領域およびＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むことができる。例えば、Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂまたはその変形抗体のＶＨとＶＬを使用し、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３を含むことができる。例えば、前記Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ抗体の可変領域は、配列番号１２２の重鎖可変領域および／または配列番号１２３の軽鎖可変領域を含むことができる。
他の実施形態において、前記抗体は、親抗体または変形抗体のＦａｂおよびＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃを含むことができる。具体的には、Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂまたはその変形抗体のＦａｂ部分とＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ部分を融合（ｆｕｓｉｏｎ）した形態を含むことができる。例えば、前記Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ抗体のＦａｂは、配列番号１２２の重鎖可変領域およびＣＨ１を含む配列（配列番号１２４）および／または配列番号１２３の軽鎖可変領域を含むことができる。前記Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ抗体は、配列番号１２７の重鎖および／または配列番号１２８の軽鎖を含むことができる。
本発明での変形抗体と結合する薬物は、疾病の治療効果のある薬物であれば、いずれも制限なく使用可能であり、特に、腫瘍細胞の増殖抑制効能のある癌治療用薬物が好ましい。
前記薬物は、変形抗体の末端に導入されたモチーフのシステイン基またはセリン基に接合されることができる。
本発明の変形抗体−薬物接合体に使用可能な薬物は、具体的には、細胞毒性または細胞増殖抑制効果を有する任意の化合物、部分または基を含み、（ｉ）マイクロチューブリン抑制剤、有糸分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、またはＤＮＡインターカレータとして機能することができる化学療法剤；（ｉｉ）酵素的に機能することができるタンパク質毒素；（ｉｉｉ）特定の癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の発現を抑制させることができるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ；または（ｉｖ）ラジオアイソトープなどが含まれてもよい。
かかる薬物には、例えば、マイタンシノイド、オーリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、１−（２クロロエチル）−１，２−ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラミシン、エトポシド、６−メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキサン、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、ミトマイシンＡ、ミトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、核酸分解酵素、細菌や動植物由来の毒素、シスプラチン、イリノテカン、パクリタキセルおよびドセタキセルから選択される一つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
場合に応じて、前記薬物は、リンカーおよびリンカー試薬上の求電子性基と共有結合を形成するために反応することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基から構成された群から選択される一つ以上の求核基を含むことができる。
さらに他の観点で、本発明は、前記抗体−薬物接合体を有効成分として含む治療用組成物を提供する。前記組成物において変形抗体−薬物接合体の薬物は、癌の治療において腫瘍細胞を死滅または抑制する薬物の局所的伝達のための抗体接合体の使用により薬物部分が腫瘍内に抗体−抗原として標的化した伝達および細胞内への蓄積を可能とする。
また、本発明では、変形抗体−薬物接合体を有効成分とし、癌、自己免疫、炎症性または感染性疾病または疾患のある前記標的細胞に接触し、標的細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
本発明での治療可能な癌は、肝臓癌、胃癌、乳癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭頸部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫および中枢神経系腫瘍から選択される一つ以上の物であり、これに限定されない。具体例として、試験管内の葉酸受容体が増幅された癌細胞であるＫＢ細胞で変形抗体−薬物接合体を接触して細胞増殖抑制を誘導することができる。したがって、本発明での変形抗体−薬物接合体を有効成分とした抑制方法は、前記疾病と関する細胞を死滅させたり増殖速度を減少させて抑制させる効果を有する。
本発明で使用される技術用語および科学用語において他の定義がなければ、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が一般的に理解している意味を有する。また、従来と同様の技術的構成および作用に対する繰り返される説明は省略する。
以下、本発明を具体的な実施例によってより詳細に説明する。しかし、本発明は、下記の実施例により限定されるものではなく、本発明の思想と範囲内で様々な変形または修正が可能であることは通常の技術者にとって自明である。
実施例１．発現ベクターｐＡＶ４の製造
発現ベクタークローニングは、親ベクターであるｐＳＧＨＶ０（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２８５１８３）を用いて産業体で抗体の作製に使用できるように目的に合わせて改良させて開発したｐＡＶ４ベクターを用いた。親ベクターは、大腸菌のようなバクテリアを用いてヒト由来タンパク質を発現させる場合、細胞内に過量発現されるが、活性を有する物質として得られ難いタンパク質の場合に、動物細胞を用いて細胞外に生理活性を有する関心タンパク質を高濃度で発現させて簡単に精製する目的で作製された研究用ベクターである。しかし、産業体で生産用に使用するには様々な制限があるため、このベクターの最大の利点である発現量が高いことを生産に利用するために、産業体で使用可能に改良したものである。また、抗体の場合、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）の二つのタンパク質を同時に発現させなければならないため、かかる目的に適するベクターを開発した。
実施例２．Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒに結合能がある親抗体および金属イオン結合モチーフであるＡＣＧＨＡを導入した変形抗体のベクターの製造
葉酸受容体に結合能がある親抗体（Ｆｗｔ）ベクターを製造するために、配列番号１２５の重鎖と配列番号１２６の軽鎖コーディングｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で発現が極大化するようにコドン最適化した配列でそれぞれ合成した。この遺伝子をｐＡＶ４ベクターのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩとＡｐａＩ／ＳｍａＩにそれぞれクローニングし、親抗体ベクター（ｐＦｗｔ）を製造した。
Figure 2019513731
２−１．Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ 結合親抗体であるＦｗｔの変形抗体ＦＭ２の製造：
金属イオン結合モチーフ（ＡＣＧＨＡ）２個を有するＦｗｔの変形抗体であるＦＭ２（Ｆｗｔ−ＡＣＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号５）、ＦＭ２）を製造するために、親抗体であるＦｗｔのベクター（ｐＦｗｔ）を鋳型とし、ＸｈｏＩ−Ｑ５−Ｆ正方向プライマー（５'−ＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴ ＡＴＣＡＴＣＣ−３'：配列番号１０５）とＭ２逆方向プライマー（５'−ＣＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡ ＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣ−３'：配列番号１０６）を用いてＰＣＲで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＦｗｔと接合し、変形抗体ベクター（ｐＦＭ２）を製造した。
２−２．Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ結合変形抗体ＦＭ１の製造：
金属イオン結合モチーフ（ＡＣＧＨＡ）を一つだけ有するトラスツズマブ変形抗体であるＦＭ１（Ｆｗｔ−ＧＧＧＡＣＧＨＡ、ｐＦＭ１）を製造するために、上記で製造したＦＭ２を鋳型とし、正方向プライマー（５'−ＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴ ＡＴＣＡＴＣＣ−３'：配列番号１０７）と逆方向プライマー（５'−ＣＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣ ＡＣＡＡＧＣＡ ＣＣＴＣ ＣＡＣＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡ−３'：配列番号１０８）を使用して、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製、ＥｚＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ｅｚ００４Ｓ）方法を用いてＰＣＲで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＦｗｔと接合し、変形抗体ベクター（ｐＦＭ１）を製造した。
２−３．Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ結合変形抗体ＦＭ２Ｌの製造：
金属イオン結合モチーフ（ＡＣＧＨＡ）が３個のアミノ酸リンカーで連結された変形抗体であるＦＭ２Ｌ（Ｆｗｔ−ＡＣＧＨＡＧＧＧＡＣＧＨＡ、ｐＦＭ２Ｌ）を製造するために、上記で製造した変形抗体ＦＭ２を鋳型とし、正方向プライマー（５'−ＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣ−３'：配列番号１０９）と逆方向プライマー（５'−ＣＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣ−３'：配列番号１１０）を使用し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製、ＥｚＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ｅｚ００４Ｓ）方法でＰＣＲを用いて二つの金属イオン結合モチーフの間にグリシンリンカーを添加した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＦｗｔと接合し、変形抗体ベクター（ｐＦＭ２Ｌ）を製造した。
２−４．Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ結合変形抗体ＦＭ２ａの製造：
ＦＭ２変形抗体に存在する２個の金属イオン結合モチーフであるＡＣＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号５）で内側のシステインをセリン（ｓｅｒｉｎｅ）で置換し、一つの金属イオン結合モチーフだけが存在する変形抗体であるＦＭ２ａ（Ｆｗｔ−ＡＳＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号２６）、ｐＦＭ２ａ）を製造するために、上記で製造した変形抗体ＦＭ２を鋳型とし、正方向プライマー（５'−ＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴ ＡＴＣＡＴＣＣ−３'：配列番号１１１）と逆方向プライマー（５'−ＣＡＧＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧ ＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧ−３’：配列番号１１２）をＰＣＲを用いて内側のシステインをセリンで置換した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＦｗｔと接合し、変形抗体ベクター（ｐＦＭ２ａ）を製造した。
２−５．Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ結合変形抗体ＦＭ２ｂの製造：
ＦＭ２変形抗体に存在する２個の金属イオン結合モチーフであるＡＣＧＨＡＡＣＧＨＡで外側のシステインをセリン（ｓｅｒｉｎｅ）で置換し、一つの金属イオン結合モチーフだけが存在する変形抗体であるＦＭ２ｂ（Ｆｗｔ−ＡＣＧＨＡＡＳＧＨＡ（配列番号２１）、ｐＦＭ２ｂ）を製造するために、上記で製造した変形抗体ＦＭ２を鋳型とし、正方向プライマー（５'−ＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣ−３'：配列番号１１３）と逆方向プライマー（５'−ＣＡＧＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡ ＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧ−３'：配列番号１１４）を使用し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製、ＥｚＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ｅｚ００４Ｓ）方法でＰＣＲを用いて内側のシステインをセリンで置換した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＦｗｔと接合し、変形抗体ベクター（ｐＦＭ２ｂ）を製造した。
Figure 2019513731
Figure 2019513731
Figure 2019513731
実施例３．Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ結合親抗体であるＦｗｔと変形抗体の発現および精製
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いて、実施例２で製造したＦｗｔおよびその金属イオン結合モチーフ変形抗体（ＦＭ１、ＦＭ２、ＦＭ２Ｌ、ＦＭ２ａ、ＦＭ２ｂ）のタンパク質発現を確認した。ＣＨＯ−Ｋ１は、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）と抗生剤を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ）に３７℃、５％ ＣＯ２、培養器で培養した。Ｆｗｔおよびその変形抗体発現ベクターを導入する前日、１００ｍｍ培養皿に細胞を５×１０６／ｍｌ濃度で接種して培養した後、ＦＢＳと抗生剤のない８００μｌのＤＭＥＭと１０μｇのＦｗｔまたは変形抗体発現ベクターを混合し、常温で１分間維持した後、２０μｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ｌｉｎｅａｒ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ（Ｃａｔ．ｎｏ：２３９６６、ＭＷ〜２５、０００））と混合し、１０〜１５分程度常温で放置した。この際、前日に培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、新たな培養液６ｍｌのＤＭＥＭを添加した。１０〜１５分間常温に放置したＦｗｔまたはその変形抗体の発現ベクターをこの培養皿に添加した。翌日、ＰＢＳで洗浄し、ＦＢＳのないＩＭＤＭ（Ｃａｔ．Ｎｏ １２２００−０２８、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地を添加し、タンパク質発現を確認した。
このように発現されたＦｗｔおよびその金属イオン結合モチーフ変形抗体は、下記のように精製した。具体的には、細胞培養液に分泌したＦｗｔおよびその金属イオン結合モチーフ変形抗体を精製するために、培養液を遠心分離して細胞を除去した後、上澄み液のみを取り、この上澄み液を平衡緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）カラムに注入して平衡緩衝液で十分に洗浄した後、Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液（１００ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ２．８）でｐＨを変化させてタンパク質を溶出させた。前記溶液をリン酸塩緩衝液で透析した後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、米国）を使用して濃縮し、最終的に高純度に精製されたタンパク質を得た。
実施例４．Ｆｗｔの変形抗体とｍａｌｅｉｍｉｄｅ基とシステインの反応による抗体−薬物接合体の製造
本発明では、ＭＭＡＥとＦｗｔの変形抗体を接合させてＦＭｘ（Ｆｗｔの金属イオン結合モチーフ変異体）−ＭＭＡＥ結合体を製造した。ＭＭＡＥとして知られたオーリスタチン（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）の接合可能性誘導体である単一メチルオーリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、化学式２参照）として、
Figure 2019513731
細胞内でタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）により分解されるバリン−シトルリン（ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）と自己分解スペーサ基であるパラアニリン安息香酸（ｐａｒａ−ａｎｉｌｉｎｅ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ：ＰＡＢＡ）によりチオール基に選択的に結合するマレイミド基に連結される構造を有する。これを通称ＭＣ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）−ＶＣ（ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとし、オーリスタチンは、細胞内毒性が強い物質であって、細胞増殖抑制試験でのＩＣ５０値が２００〜３００ｐＭと知られている。
本発明では、精製された変形抗体１当量当たり還元剤であるＴＣＥＰを３当量加え、４℃で３０分間反応させてチオール基を還元させた後、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを３当量添加し、常温で２時間ほど反応させる。反応は、過量のシステインを加えて終結し、過量のＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとＴＣＥＰは、遠心分離濾過フィルターとリン酸塩緩衝液での透析により除去し、最終精製されたＦＭｘ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを製造した。
各変形抗体の重鎖への接合収率は、以下の表３とおりである。
Figure 2019513731
前記の表３に示されているように、各変形抗体の間に重鎖への薬物接合収率は非常に大きい差を示している。ＦＭ１、ＦＭ２、ＦＭ２ａ、ＦＭ２Ｌなどの変形抗体は、同じ薬物接合条件で約６３〜６６％の接合収率を示す反面、ＦＭ２ｂの場合、９７．５％の非常に高い薬物接合収率を示している。ＦＭ２ｂの場合、互いに異なる２個の発現バッチ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｂａｔｃｈ）から出た試料でほとんど類似した接合収率を示している。
実施例５．Ｆｗｔの変形抗体とブロモアセトアミド（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）基とシステインの反応による抗体−薬物接合体の製造
本実施例では、ブロモアセトアミド基によりシステインのチオール基に結合する抗体−薬物接合体を製造した。ブロモアセトアミドは、細胞内でタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって分解されるバリン−シトルリン（ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）と自己分解スペーサ基であるパラアニリン安息香酸（ｐａｒａ−ａｎｉｌｉｎｅ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ：ＰＡＢＡ）によりＭＭＡＥと結合した構造を有し、ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｅとチオール基との結合によりＭＭＡＥを変形抗体に結合させる。これをｂｒ（ｂｒｏｍｏ ａｃｅｔａｍｉｄｅ）−ＶＣ（ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと名付ける。
本発明では、精製された変形抗体１当量当たり還元剤であるＴＣＥＰを３当量加え、４℃で３０分間反応させてチオール基を還元させた後、ｂｒ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを３当量添加し、３７℃で２時間反応させる。反応は、過量のシステインを加えて終結し、過量のｂｒ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとＴＣＥＰは、遠心分離濾過フィルターとリン酸塩緩衝液での透析により除去し、最終精製されたＦＭｘ−ａｃｅｔａｍｉｄｅ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを製造した。
各変形抗体の重鎖への接合収率は、以下の表４のとおりである。
Figure 2019513731
前記の表４に示されているように、各変形抗体の間に重鎖への薬物接合収率は、ＦＭ２ｂがその他の変形抗体に比べて著しく優れた接合収率を示している。Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅによる接合反応でもＦＭ２ｂは、他の変形抗体に比べて著しく優れた接合収率を示す。
Figure 2019513731
実施例６．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ変形抗体の生産
実施例２で使用した方法のように、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂのＣ−末端にシステインを含む金属イオンモチーフを導入した変形抗体を作製した。
６−１．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの変形抗体ＨＭ２の製造：
金属イオン結合モチーフ（ＡＣＧＨＡ）２個を有するｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの変形抗体であるＨＭ２（ＨＲ−ＡＣＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号５）、ＨＭ２）を製造するために、親抗体であるｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂのベクター（ｐＨＲ）を鋳型とし、ＸｈｏＩ−Ｑ５−Ｆ正方向プライマー（５'−ＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴ ＡＴＣＡＴＣＣ−３'：配列番号１１１）とＭ２逆方向プライマー（５'−ＣＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡ ＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣ−３'：配列番号１１２）を用いてＰＣＲで増幅した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＨＲと接合し、変形抗体ベクター（ｐＨＭ２）を製造した。
６−２．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの変形抗体ＨＭ２ａの製造：
ＨＭ２変形抗体に存在する２個の金属イオン結合モチーフであるＡＣＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号５）で内側のシステインをセリン（ｓｅｒｉｎｅ）で置換し、一つの金属イオン結合モチーフだけが存在する変形抗体であるＨＭ２ａ（ＨＲ−ＡＳＧＨＡＡＣＧＨＡ（配列番号２６）、ｐＨＭ２ａ）を製造するために、上記で製造した変形抗体ＨＭ２を鋳型とし、正方向プライマー（５'−ＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴ ＡＴＣＡＴＣＣ−３'：配列番号１１１）と逆方向プライマー（５'−ＣＡＧＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧ ＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧ−３'：配列番号１１２）をＰＣＲを用いて内側のシステインをセリンで置換した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＨＲと接合し、変形抗体ベクター（ｐＨＭ２ａ）を製造した。
６−３．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの変形抗体ＨＭ２ｂの製造：
ＨＭ２変形抗体に存在する２個の金属イオン結合モチーフであるＡＣＧＨＡＡＣＧＨＡで外側のシステインをセリン（ｓｅｒｉｎｅ）で置換し、一つの金属イオン結合モチーフだけが存在する変形抗体であるＨＭ２ｂ（ＨＲ−ＡＣＧＨＡＡＳＧＨＡ（配列番号２１）、ｐＨＭ２ｂ）を製造するために、上記で製造した変形抗体ＨＭ２を鋳型とし、正方向プライマー（５'−ＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣ−３'：配列番号１０９）と逆方向プライマー（５'−ＣＡＧＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡ ＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧ−３'：配列番号１１４）を使用し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製、ＥｚＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ、Ｅｚ００４Ｓ）方法でＰＣＲを用いて内側のシステインをセリンで置換した。前記増幅されたヌクレオチドを末端に存在する二つの制限酵素であるＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部を有している発現ベクターｐＨＲと接合し、変形抗体ベクター（ｐＨＭ２ｂ）を製造した。
実施例７．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ変形抗体の発現および精製
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いて、実施例６で製造したｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ変形抗体（ＨＭ２、ＨＭ２ａ、ＨＭ２ｂ）のタンパク質発現を確認した。ＣＨＯ−Ｋ１は１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）と抗生剤を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ）に３７℃、５％ＣＯ２、培養器で培養した。変形抗体発現ベクターを導入する前日、１００ｍｍ培養皿に細胞を５×１０６／ｍｌ濃度で接種して培養した後、ＦＢＳと抗生剤がない８００μｌのＤＭＥＭと１０μｇの変形抗体発現ベクターを混合し、常温で１分間維持した後、２０μｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ｌｉｎｅａｒ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ（Ｃａｔ．ｎｏ：２３９６６、ＭＷ〜２５、０００））と混合し、１０〜１５分位常温で放置した。この際、前日に培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、新たな培養液６ｍｌのＤＭＥＭを添加した。１０〜１５分間常温に放置した変形抗体の発現ベクターをこの培養皿に添加した。翌日、ＰＢＳで洗浄し、ＦＢＳがないＩＭＤＭ（Ｃａｔ．Ｎｏ １２２００−０２８、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地を添加し、タンパク質発現を確認した。
このように発現された変形抗体は、下記のように精製した。具体的には、細胞培養液に分泌した変形抗体を精製するために、培養液を遠心分離して細胞を除去した後、上澄み液のみを取り、この上澄み液を平衡緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）カラムに注入し、平衡緩衝液で十分に洗浄した後、Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液（１００ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ２．８）でｐＨを変化させてタンパク質を溶出させた。前記溶液をリン酸塩緩衝液に透析した後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、米国）を使用して濃縮し、最終的に高純度に精製されたタンパク質を得た。
実施例８．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの変形抗体とＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの接合による抗体−薬物接合体の製造
本発明では、ＭＭＡＥと実施例６、７で生産したｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの変形抗体を接合してＨＭｘ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの金属イオン結合モチーフ変異体）−ＭＭＡＥ結合体を製造した。本発明では、精製された変形抗体１当量当たり還元剤であるＴＣＥＰを３当量加え、４℃で３０分間反応させてチオール基を還元させた後、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを２．５当量添加し、常温で２時間ほど反応させる。反応は、過量のシステインを加えて終結し、過量のＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとＴＣＥＰは、遠心分離濾過フィルターとリン酸塩緩衝液での透析により除去し、最終精製されたＦＭｘ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを製造した。
各変形抗体の重鎖への接合収率は、以下の表６のとおりである。
Figure 2019513731
前記の表６に示されているように、各変形抗体の間に重鎖への薬物接合収率は、非常に大きい差を示している。ＨＭ２とＨＭ２ａの変形抗体は、同じ薬物接合条件で約５５〜６２％の接合収率を示す反面、ＨＭ２ｂの場合、８５．５％の非常に高い薬物接合収率を示している。かかる結果は、Ｍ２ｂのｓｅｑｕｅｎｃｅがＦａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂだけでなく、他の抗体に導入された時にも同様に高い接合収率を有することを示す。
実施例９．Ｍ２ｂ（ＡＣＧＨＡＡＳＧＨＡ：配列番号２１）配列でＳｅｒｉｎｅを置換した変形抗体の生産
前記の実施例で金属イオン結合モチーフであるＭ２（ＡＣＧＨＡＡＣＧＨＡ）で後側のｃｙｓｔｅｉｎｅをｓｅｒｉｎｅで置換したＭ２ｂ（ＡＣＧＨＡＡＳＧＨＡ）がＭ２配列に比べて著しく高い薬物接合能を示すことを確認することができた。かかるｓｅｒｉｎｅ置換部位が他のアミノ酸の置換でも同じ効果を示すか確認するために、この位置に様々なアミノ酸を置換した変形抗体を生産した。
Figure 2019513731
上記の表７のようなＣ−末端の配列を有する変形抗体をＦＭ２ｂまたはＦＭ２ｂ−Ｓに導入し、それぞれ、ＦＭ２ｂ−Ａ、ＦＭ２ｂ−Ｔ、ＦＭ２ｂ−Ｙ、ＦＭ２ｂ−Ｄ、ＦＭ２ｂ−Ｋ、ＦＭ２ｂ−Ｆの変形抗体を生産した。
実施例１０．ＦＭ２ｂ変形抗体とＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの接合による抗体−薬物接合体の生産
本発明では、ＭＭＡＥと実施例９のように生産したＦＭ２ｂ−Ｘ（Ｘ＝Ａ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｋ、あるいはＦ）変形抗体を接合させてＦＭ２ｂ−Ｘ−ＭＭＡＥ結合体を製造した。本発明では、精製された変形抗体１当量当たり還元剤であるＴＣＥＰを３当量加え、４℃で３０分間反応させてチオール基を還元させた後、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを２．５当量添加し、常温で２時間ほど反応させる。反応は、過量のシステインを加えて終結し、過量のＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとＴＣＥＰは、遠心分離濾過フィルターとリン酸塩緩衝液での透析により除去し、最終精製されたＦＭｂ−Ｘ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを製造した。各変形抗体の重鎖への接合収率は、以下の表８のとおりである。
Figure 2019513731
前記の表８に示されているように、Ｍ２ｂ配列であるＡＣＧＨＡＡＳＧＨＡの後側のｓｅｒｉｎｅ位置に他のアミノ酸で置換してもＦＭ２ｂとほとんど類似した接合結果が出ることが分かる。
実施例１１．ＤＡＲ２である抗体−薬物接合体の精製
前記の実施例４のように製造された各変形抗体−薬物接合体は、変形抗体当たり接合された薬物の個数（ＤＡＲ：ｄｒｕｇ−ｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ）が異なるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで薬物の細胞毒性を比較することが容易でない。したがって、同じＤＡＲを有するように変形抗体−薬物接合体を精製するために、疎水性クロマトグラフィーを用いて変形抗体−薬物接合体を精製した。フェニル（ｐｈｅｎｙｌ）カラムクロマトグラフィーを用いてＤＡＲが２を有する変形抗体−薬物接合体を精製した。カラムを１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０緩衝液で平衡化した後、変形抗体−薬物接合体をカラムに注入した。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、３０％のアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）が含まれた前記緩衝液を加え、ＤＡＲにしたがって変形抗体−薬物接合体を溶出した。溶出した変形抗体−薬物接合体は、１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、３０ｍＭ ｓｕｃｒｏｓｅ、ｐＨ６．０の緩衝液で透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）を用いて緩衝液を交換した。
実施例１２．試験管内の抗体−薬物接合体の安定性の試験
上記の実施例９、１０、１１のように、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ薬物が２個接合された抗体−薬物接合体であるＦＭ２ｂ−Ｓ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｆ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｋ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｙ−Ｄ２を生産した。生産された抗体−薬物接合体をそれぞれ、２５℃と５０℃の温度条件でｉｎｃｕｂａｔｉｏｎし、薬物接合個数の変化とａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎの変化を測定した。
各試験試料は、１ｍｇ／ｍｌの濃度で１１０μＬの濃度で、それぞれ１２個ずつを準備した。各抗体−薬物接合体の試料のうち６個の試料は２５℃、残りの６個の試料は６０℃条件で０、１、３、５、７、１４日間保管し、ＤＡＲとｍｏｎｏｍｅｒの変化を測定した。２５℃でＤＡＲ２の含量は、各試料別に１．５〜２％程度の減少が観察され、ｍｏｎｏｍｅｒの純度は、０．３〜４％程度の減少が観察されたが、各試料別に差はあまり大きくなかった。５０℃でのＤＡＲ２の含量とｍｏｎｏｍｅｒ純度の変化は、２５℃で観察された値よりは大きく観察されたが、試料別の差はあまり大きくなかった。したがって、各抗体変異体間の差はあまり大きくないことを確認することができた。
Figure 2019513731
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実施例１３．試験管内の細胞増殖抑制能の試験
変形抗体−薬物接合体の試験管内細胞増殖抑制能を比較するために、Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒが過発現したＫＢ−細胞を用いて細胞成長抑制能の試験を行った。ＫＢ−細胞は１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に希釈し、１×１０４個／ウェル（ｗｅｌｌ）になるように調整した後、１００μｌの細胞培養物を９６−ウェル（ｗｅｌｌ）プレートの各ウェルに加えた。以降、ウェルプレートを５％二酸化炭素および３７℃に設定された培養器で２４時間培養し、細胞をプレートに付着させた。各試験試料を培地に希釈した後、最終濃度６．４５ｎＭ、３．２３ｎＭ、１．６１ｎＭ、０．８０６ｎＭ、０．４０３ｎＭ、０．２０２ｎＭ、０．１０１ｎＭ、０．０５０４ｎＭ、０．０２５２ｎＭおよび０．０１２６ｎＭになるように添加し、同時に対照群ウェルには培地のみ（薬物なし）添加した。５日間培養した後、２０μｌ／ウェルでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６−ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬［ＭＴＳ−基礎検定；生きている細胞のジヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によってＭＴＳが紫色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を形成し、生成された紫色のホルマザンの量によって増殖測定］を添加した後、３７℃に設定された培養器で２時間培養した。細胞溶菌を吸光分析装置でＯ．Ｄ．４９０ｎｍで測定し、ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（％）を測定した。
１３−１．ＦＭ２−Ｄ２とＦＭ２ｂ−Ｄ２（ｏｒ ＦＭ２ｂ−Ｓ−Ｄ２）の細胞成長抑制能比較の試験：
親抗体であるＦｗｔと前記例でＭＭＡＥを接合させた後、同じＤＡＲを有するように精製した変形抗体−薬物接合体であるＦＭ２−Ｄ２（変形抗体であるＦＭ２のＭＭＡＥ薬物接合体としてＤＡＲ２を有する変形抗体−薬物接合体）とＦＭ２ｂ−Ｄ２（変形抗体であるＦＭ２ｂのＭＭＡＥ薬物接合体としてＤＡＲ２を有する変形抗体−薬物接合体）を前記のようにＫＢ ｃｅｌｌに処理した後、薬物の細胞成長抑制能を比較した。
図３に示されているように、親抗体に比べて抗体−薬物接合体であるＦＭ２−Ｄ２とＦＭ２ｂ−Ｄ２は、著しく優れた抗癌効能を示している。ＦＭ２−Ｄ２とＦＭ２ｂ−Ｄ２は、ほとんど同じ癌細胞成長抑制能を示している。かかる結果は、変形抗体であるＦＭ２とＦＭ２ｂとの間には変形抗体−薬物接合体として同じＤＡＲを有している時に、癌細胞成長抑制能の活性差がないということを示している。
１３−２．ＦＭ２−Ｄ２とＦＭ２ｂ−Ｄ２（ｏｒ ＦＭ２ｂ−Ｓ−Ｄ２）の細胞成長抑制能の比較試験：
ＦＭ２ｂ−Ｓと他の変異体に基づく抗体−薬物接合体間の細胞成長抑制能を比較するために、ＦＭ２ｂ−Ｓ、−Ｆ、−Ｙ変異体にＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを接合させた後、同じＤＡＲを有するように精製した後、上記のようにＫＢ ｃｅｌｌに処理した後、薬物の細胞成長抑制能を比較した。
図４に示されているように、ＦＭ２ｂ−Ｓ−Ｄ２とＦＭ２ｂ−Ｆ−Ｄ２、ＦＭ２ｂ−Ｙ−Ｄ２はほとんど同じ細胞成長抑制能を示している。それぞれのＩＣ５０値はＦＭ２ｂ−Ｓ−Ｄ２は０．２５ｎＭ、ＦＭ２ｂ−Ｆ−Ｄ２は０．２６ｎＭ、ＦＭ２ｂ−Ｙ−Ｄ２は０．２４ｎＭが測定された。かかる結果は、ＦＭ２ｂ−Ｓのｓｅｒｉｎｅの代りに、それぞれｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、ｔｙｒｏｓｉｎｅで置換した抗体変異体に基づく抗体−薬物接合体の間には癌細胞成長抑制能の活性差がないということを示している。
かかる結果からみて、Ｍ２ｂ配列を導入した抗体を用いて抗体−薬物接合体に製造された時に、他の変形抗体と比較して著しく優れた薬物の接合収率を有しており、且つ抗体−薬物接合体としての抗癌活性では差がないという点を示している。また、Ｍ２ｂ配列であるＡＣＧＨＡ−ＡＳＧＨＡでｓｅｒｉｎｅ位置に他のアミノ酸が置換されても薬物の接合収率や安定性、抗癌活性にも差がないことを確認することができた。したがって、ＦＭ２ｂやＨＭ２ｂに使用されたようなモチーフであるＡＣＧＨＡ−ＡＸＧＨＡ（Ｘは、システイン以外の他のアミノ酸）を抗体の重鎖末端に導入する時に、その他の変形抗体に比べて著しく優れた接合収率を有することで、より効率的で経済的な抗体−薬物接合体を生産することができることを意味する。
本発明による抗体変異体により生産される抗体−薬物接合体は、薬物の接合収率を高めることで、抗体−薬物接合体の生産性を大幅に向上させることができる。また、位置特異的接合により抗体の末端部分に接合した薬物は親抗体の構造的安定性を阻害しないことから、親抗体が本来有している抗原特異性と構造的安定性を維持することができ、親抗体が有している高い抗原特異性によって抗体に接合された薬物を癌細胞に特異的に運搬することができる。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、かかる具体的技術は単に好ましい実施様態であって、これにより本発明の範囲が制限されるものではない点は明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。

Claims (14)

  1. 下記構造式（１）で表されるモチーフを抗体の末端に含む変形抗体がリンカーを介して薬物に結合した抗体−薬物接合体：
    構造式（１）
    Ｘａ−［Ｍｍｏｔｉｆ１］ｎ１−Ｘｂ−［Ｍｍｏｔｉｆ２］ｎ２
    前記式中、Ｍｍｏｔｉｆ１またはＭｍｏｔｉｆ２は、それぞれ独立して、ＡＣＧＨＡ（配列番号１）、ＡＨＧＣＡ（配列番号２）、ＡＸＧＨＡ（配列番号３）およびＡＨＧＸＡ（配列番号４）から構成された配列のいずれか一つを含み、前記配列番号３または４の中、Ｘは、システイン以外のアミノ酸残基を含み、
    ＸａおよびＸｂは、それぞれ独立して、Ａ（ａｌａｎｉｎｅ）、Ｓ（ｓｅｒｉｎｅ）、Ｇ（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選択されるアミノ酸残基が０個〜２０個から構成されたペプチドであり、
    ｎ１およびｎ２は、それぞれ、１〜１０の整数である。
  2. 前記 Ｍｍｏｔｉｆ２は、 ＡＸＧＨＡ（配列番号３）を含み、 Ｘは、システイン以外のアミノ酸残基であることを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  3. 前記 Ｍｍｏｔｉｆ１またはＭｍｏｔｉｆ２のＸは、セリン（Ｓ）、グリシン（ Ｇ ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リジン（Ｋ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から構成された群から選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  4. 前記構造式（１）で表されるモチーフは、配列番号５〜１０４から構成された群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  5. 前記モチーフは、抗体の重鎖Ｃ−末端に導入されることを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  6. 前記リンカーは、モチーフに結合する反応性官能基、アミノ酸および自己切断スペーサを含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  7. 前記薬物は、マイタンシノイド、オーリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、１−（２クロロエチル）−１，２−ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラミシン、エトポシド、６−メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキサン、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、ミトマイシンＡ、ミトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、核酸分解酵素、細菌や動植物由来の毒素、シスプラチン、イリノテカン、パクリタキセルおよびドセタキセルから選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  8. 前記抗体は、単クローン抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体から構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  9. 前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭから構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  10. 前記抗体は、癌特異抗原、細胞表面受容体タンパク質、細胞表面タンパク質、膜貫通タンパク質、シグナル伝逹タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達または分化に関する分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関する分子、血管形成に関する分子、または血管新生に関する分子に対する結合能と特異性を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  11. 前記抗体は、
    （１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形態形成タンパク質受容体−ＩＢ型、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００１２０３）；
    （２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００３４８６）；
    （３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回の膜貫通上皮抗原、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０１２４４９）；
    （４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ３６１４８６）；
    （５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核細胞強化因子、メソテリン、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００５８２３）；
    （６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体族３４（リン酸ナトリウム）、構成員２、第ＩＩ型ナトリウム−依存性ホスフェート輸送体３ｂ、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００６４２４）；
    （７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７個のトロンボスポンジンリピート（第１型および類似第１型）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＢ０４０８７８）；
    （８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８O１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＹ３５８６２８）；
    （９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＹ２７５４６３）；
    （１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０１７７６３）；
    （１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回の膜貫通上皮抗原２、６回の膜貫通前立腺タンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ４５５１３８）；
    （１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一時的受容体潜在的カチオンチャネル、Ｍ亜族、構成員４、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０１７６３６）；
    （１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌腫−由来成長因子、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００３２０３またはＮＭ＿００３２１２）；
    （１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバールウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２ＧｅｎＢａｎｋ承認番号Ｍ２６００４）；
    （１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（イムノグロブリン−関連ベータ）、Ｂ２９、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０００６２６）；
    （１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼ固定タンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿０３０７６４）；
    （１７）ＨＥＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号Ｍ１１７３０）；
    （１８）ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から選択されるＥｒｂＢ受容体；
    （１９）ＮＣＡ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号Ｍ１８７２８）；
    （２０）ＭＤＰ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＢＣ０１７０２３）；
    （２１）ＩＬ２０Ｒα（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ１８４９７１）；
    （２２）ブレビカン（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ２２９０５３）；
    （２３）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＭ＿００４４４２）；
    （２４）ＡＳＬＧ６５９（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＸ０９２３２８）；
    （２５）ＰＳＣＡ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＪ２９７４３６）；
    （２６）ＧＥＤＡ（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＹ２６０７６３）；
    （２７）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、ＮＰ＿４４３１７７．１）；
    （２８）ＣＤ２２（Ｂ−細胞受容体ＣＤ２２−Ｂイソ型、ＮＰ−００１７６２．１）；
    （２９）ＣＤ７９ａ（Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有的に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面で複合体を形成するＢ細胞特異的タンパク質であるＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、イムノグロブリン−関連アルファは、Ｂ細胞分化に関与する信号を伝達する、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００１７７４．１）；
    （３０）ＣＸＣＲ５（ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化したＧタンパク質カップリングされた受容体であるバーキットリンパ種受容体１は、リンパ球の移動および体液性免疫に作用し、ＨＩＶ−２感染に参加し、ＡＩＤＳ、リンパ種、骨髄腫および白血病の発病と関連があると思われる、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００１７０７．１）；
    （３１）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドに結合しＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示する、ＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００２１１１．１）；
    （３２）Ｐ２Ｘ５（細胞の他、ＡＴＰによってゲートされるイオンチャネルである、プリン性受容体Ｐ２Ｘリガンド−ゲートイオンチャネル５は、シナプス伝達および神経発生に関与することができ、その欠乏は、特発性排尿筋不安定の病態生理に寄与することができる、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００２５５２．２）；
    （３３）ＣＤ７２（Ｂ−細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００１７７３．１）；
    （３４）ＬＹ６４（ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）族の第Ｉ型膜タンパク質である、リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）は、Ｂ細胞活性化およびアポトーシスを調節し、これの機能喪失は、全身性エリテマトーデス患者の疾病活性増加と関連する、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿００５５７３．１）；
    （３５）ＦｃＲＨ１（Ｃ２型Ｉｇ−類似およびＩＴＡＭドメインを含有するイムノグロブリンＦｃドメインに対する推定的受容体であるＦｃ受容体様タンパク質１は、Ｂリンパ球分化に関与することができる、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿４４３１７０．１）；
    （３６）ＩＲＴＡ２（Ｂ細胞発生およびリンパ腫発生に作用することができる推定的免疫数溶体であるイムノグロブリン巨大族受容体転座関連２、転座による前記遺伝子脱調節はいくつかのＢ細胞悪性腫瘍で起こる、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＮＰ＿１１２５７１．１）；
    （３７）ＴＥＮＢ２（成長因子のＥＧＦ／ヘレグリン族およびホリスタチンと関連のある推定的膜貫通プロテオグリカン、ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ１７９２７４）；
    （３８）ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７（精巣腫瘍過発現タンパク質）；
    （３９）アンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＰＴＥＮ、ヒトカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ３）（前立腺癌で過発現するタンパク質）；
    （４０）ＣＤ２０；
    （４１）ＣＤ３０；
    （４２）ＣＤ３３；
    （４３）ＣＤ５２；
    （４４）ＥｐＣａｍ；
    （４５）ＣＥＡ；
    （４６）ｇｐＡ３３；
    （４７）Ｍｕｃｉｎｓ；
    （４８）ＴＡＧ−７２；
    （４９）炭酸脱水酵素ＩＸ（Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ）；
    （５０）ＰＳＭＡ；
    （５１）葉酸受容体（Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＦＯＬＲ 遺伝子により発現するタンパク質ファミリ。葉酸に高い結合力を有しており、５−メチルテトラヒドロ葉酸を細胞内に運搬する）；
    （５２）ガングリオシド（ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２）；
    （５３）糖水化物Ｌｅｗｉｓ−Ｙ；
    （５４）ＶＥＧＦ；
    （５５）ＶＥＧＦＲ；
    （５６）ａＶｂ３；
    （５７）ａ５ｂ１；
    （５８）ＥＲＢ３；
    （５９）ｃ−ＭＥＴ；
    （６０）ＥｐｈＡ３；
    （６１）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２；
    （６２）ＲＡＮＫＬ；
    （６３）ＦＡＰ；および
    （６４）Ｔｅｎａｓｃｉｎから構成された群から選択される一つ以上のターゲットに結合能を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  12. 前記抗体は、可変領域およびＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含み、または ＦａｂおよびＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃを含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  13. 前記薬物は、モチーフのシステインまたはＸに接合されることを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物接合体。
  14. 請求項１〜１３のいずれか一項による抗体−薬物接合体を含む癌の予防または治療用組成物。
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