JP2019511240A5

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Publication number: JP2019511240A5
Application number: JP2018554450A
Authority: JP
Filing date: 2017-04-13
Publication date: 2020-05-14
Anticipated expiration: 2037-04-13

Description

本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかとなる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、前記導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、
（ｂ）前記セーフハーバー遺伝子座に二本鎖切断を作製して前記セーフハーバー遺伝子座中への前記導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と
を単離されたヒト神経幹細胞中に導入することであって、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成すること
を含む方法。
（項目２）
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記単離されたヒト神経幹細胞が初代神経幹細胞を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記単離されたヒト神経幹細胞が、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記導入遺伝子が、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記タンパク質が、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＡＢＣＤ１（副腎白質ジストロフィー）、ＧＦＡＰ（アレキサンダー病）、ＣＹＰ２７Ａ１（脳腱黄色腫症）、ＡＲＳＡ（異染性白質ジストロフィー）、ＰＬＰ１（ペリツェウス・メルツバッハー病）、ＡＳＰＡ（カナバン病）、ＥＩＦ−２Ｂ（白質の消失を伴う白質脳症）、ＰＨＹＨ（レフサム病１型）、ＰＥＸ７（レフサム病２型）、ＰＰＴ１（乳児性神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、ＴＰＰ１（遅発型小児性ＮＣＬ）、ＣＬＮ３（若年性ＮＣＬ）、ＣＬＮ６（成人ＮＣＬ）、ＣＬＮ５（フィンランド遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＣＬＮ６（遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＭＳＦＤ８（セロイドリポフスチン症、神経性、７）、ＣＬＮ８（セロイドリポフスチン症、神経性、８）、ＣＴＳＤ（セロイドリポフスチン症、神経性、１０）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＰＯＬＧ（アルパース病）、ＴＡＺ（バース症候群）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＳＬＣ２０Ａ２（ファール症候群）、ＰＤＥ（網膜色素変性症）、ＳＭＮ１（脊髄性筋萎縮症）、ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経失調症）、ＭｅＣＰ２（レット症候群）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（チモシー症候群）、ＡＴＸＮ３（マチャド・ジョセフ病）、およびＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障）からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記タンパク質が、前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞によって分泌される、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記導入遺伝子が、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記神経保護または神経再生タンパク質が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−２（ＮＴ−２）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン−６、保存ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、エフリン、セマフォリン、その他の神経新生因子、その他の神経栄養因子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記神経保護または神経再生タンパク質が分泌タンパク質である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記ドナー鋳型が異種プロモーターを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ドナー鋳型の前記異種プロモーターが、誘導性プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列がＲＮＡを含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、または前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくは前記トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を前記ヒト神経幹細胞中に導入することをさらに含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡが、前記セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および前記Ｃａｓポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｃａｓポリペプチドのバリアントが、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、項目１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはこれらの組合せにおける修飾を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記リボース基における前記修飾が、前記リボース基の２’位における修飾を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記リボース基の２’位における前記修飾が、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記リン酸基における前記修飾がホスホロチオエート修飾を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル、３’−ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’−Ｏ−メチル、３’−チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドであり、かつ／または前記第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドである、項目１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの約１０％から約３０％が修飾ヌクレオチドであり、かつ／または前記第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの約１％から約１０％が修飾ヌクレオチドである、項目１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、またはＨＢＢ遺伝子を含む、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
導入することがエレクトロポレーションを含む、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ドナー鋳型が選択マーカーをさらに含む、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記選択マーカーが、中枢神経系の細胞では発現されないマーカーを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記選択マーカーが細胞表面タンパク質である、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、これらのバリアント、これらの断片、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞による前記選択マーカーの発現に基づいて前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を精製することをさらに含む、項目２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記精製された遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を増殖させることをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
項目１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞。
（項目３５）
項目３４に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（項目３６）
それを必要とするヒト対象における神経変性疾患または神経学的損傷を予防または治療する方法であって、
前記ヒト対象に有効量の項目３５に記載の医薬組成物を投与すること
を含む方法。
（項目３７）
白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および網膜変性疾患からなる群から選択される神経変性疾患の治療用である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
クラッベ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、副腎脊髄ニューロパチー、アレキサンダー病、脳腱黄色腫症、異染性白質ジストロフィー、カナバン病、白質の消失を伴う白質脳症、副腎白質ジストロフィー、レフサム病、およびゼノベファントーシスからなる群から選択される白質ジストロフィーの治療用である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
脊髄損傷、外傷性脳損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の急性炎症、ＣＮＳの慢性炎症、虚血、および卒中からなる群から選択される神経学的損傷の治療用である、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞が前記対象に対して自己である、項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞が前記対象に対して同種である、項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
投与することが、注射または外科的移植によって投与することを含む、項目３６から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、前記導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、
（ｂ）ＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）単離されたヒト神経幹細胞と
を含むキット。
（項目４４）
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目４３に記載のキット。
（項目４５）
前記単離されたヒト神経幹細胞が初代神経幹細胞を含む、項目４３または４４に記載のキット。
（項目４６）
前記単離されたヒト神経幹細胞が、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される、項目４３または４４に記載のキット。
（項目４７）
前記導入遺伝子が、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする、項目４３から４６のいずれか一項に記載のキット。
（項目４８）
前記導入遺伝子が、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする遺伝子を含む、項目４３から４６のいずれか一項に記載のキット。
（項目４９）
前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列がＲＮＡを含む、項目４３から４８のいずれか一項に記載のキット。
（項目５０）
ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、または前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくは前記トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目４３から４９のいずれか一項に記載のキット。
（項目５１）
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡが、前記セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および前記Ｃａｓポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片を含む、項目５１に記載のキット。
（項目５３）
前記Ｃａｓポリペプチドのバリアントが、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む、項目５２に記載のキット。
（項目５４）
前記ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、項目５１から５３のいずれか一項に記載のキット。
（項目５５）
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル、３’−ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’−Ｏ−メチル、３’−チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目５４に記載のキット。
（項目５６）
前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、またはＨＢＢ遺伝子を含む、項目４３から５５のいずれか一項に記載のキット。
（項目５７）
前記ドナー鋳型が選択マーカーをさらに含む、項目４３から５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目５８）
遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成するための説明書をさらに含む、項目４３から５７のいずれか一項に記載のキット。
（項目５９）
導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットを含む遺伝子改変されたヒト神経幹細胞であって、前記導入遺伝子カセットがセーフハーバー遺伝子座内に位置する、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞。
（項目６０）
潜在的な治療用分子を同定または開発する方法における、項目３４もしくは５９に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞、または項目１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用。
（項目６１）
前記潜在的な治療用分子が、ヒト神経幹細胞および／またはヒト神経幹細胞の分化した子孫の増殖および／または生存能力を促進する分子である、項目６０に記載の使用。
（項目６２）
研究における、項目３４もしくは５９に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞、または項目１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用。

Claims

遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、前記導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、
（ｂ）前記セーフハーバー遺伝子座に二本鎖切断を作製して前記セーフハーバー遺伝子座中への前記導入遺伝子の挿入を誘発することができるＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と
を単離されたヒト神経幹細胞中に導入することであって、それによって遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成すること
を含む方法。
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記単離されたヒト神経幹細胞が初代神経幹細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
前記単離されたヒト神経幹細胞が、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される、請求項１または２に記載の方法。
前記導入遺伝子が、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記タンパク質が、ＧＡＬＣ（クラッベ病）、ＡＢＣＤ１（副腎白質ジストロフィー）、ＧＦＡＰ（アレキサンダー病）、ＣＹＰ２７Ａ１（脳腱黄色腫症）、ＡＲＳＡ（異染性白質ジストロフィー）、ＰＬＰ１（ペリツェウス・メルツバッハー病）、ＡＳＰＡ（カナバン病）、ＥＩＦ−２Ｂ（白質の消失を伴う白質脳症）、ＰＨＹＨ（レフサム病１型）、ＰＥＸ７（レフサム病２型）、ＰＰＴ１（乳児性神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ））、ＴＰＰ１（遅発型小児性ＮＣＬ）、ＣＬＮ３（若年性ＮＣＬ）、ＣＬＮ６（成人ＮＣＬ）、ＣＬＮ５（フィンランド遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＣＬＮ６（遅発型小児性バリアントＮＣＬ）、ＭＳＦＤ８（セロイドリポフスチン症、神経性、７）、ＣＬＮ８（セロイドリポフスチン症、神経性、８）、ＣＴＳＤ（セロイドリポフスチン症、神経性、１０）、ＵＢＥ３Ａ（アンジェルマン症候群）、ＰＯＬＧ（アルパース病）、ＴＡＺ（バース症候群）、ＧＬＡ（ファブリー病）、ＳＬＣ２０Ａ２（ファール症候群）、ＰＤＥ（網膜色素変性症）、ＳＭＮ１（脊髄性筋萎縮症）、ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経失調症）、ＭｅＣＰ２（レット症候群）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（チモシー症候群）、ＡＴＸＮ３（マチャド・ジョセフ病）、およびＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障）からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、請求項５に記載の方法。
前記タンパク質が、前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞によって分泌される、請求項５または６に記載の方法。
前記導入遺伝子が、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記神経保護または神経再生タンパク質が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−２（ＮＴ−２）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン−６、保存ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、エフリン、セマフォリン、その他の神経新生因子、その他の神経栄養因子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
前記神経保護または神経再生タンパク質が分泌タンパク質である、請求項８に記載の方法。
前記ドナー鋳型が異種プロモーターを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナー鋳型の前記異種プロモーターが、誘導性プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを含む、請求項１１に記載の方法。
前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列がＲＮＡを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、または前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくは前記トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を前記ヒト神経幹細胞中に導入することをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡが、前記セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および前記Ｃａｓポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む、請求項１４に記載の方法。
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片を含む、請求項１５に記載の方法。
前記Ｃａｓポリペプチドのバリアントが、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む、請求項１６に記載の方法。
前記ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはこれらの組合せにおける修飾を含む、請求項１８に記載の方法。
前記リボース基における前記修飾が、前記リボース基の２’位における修飾を含む、請求項１９に記載の方法。
前記リボース基の２’位における前記修飾が、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
前記リン酸基における前記修飾がホスホロチオエート修飾を含む、請求項１９に記載の方法。
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル、３’−ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’−Ｏ−メチル、３’−チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
前記第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドであり、かつ／または前記第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くが修飾ヌクレオチドである、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの約１０％から約３０％が修飾ヌクレオチドであり、かつ／または前記第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの約１％から約１０％が修飾ヌクレオチドである、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、またはＨＢＢ遺伝子を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
導入することがエレクトロポレーションを含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
前記ドナー鋳型が選択マーカーをさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
前記選択マーカーが、中枢神経系の細胞では発現されないマーカーを含む、請求項２８に記載の方法。
前記選択マーカーが細胞表面タンパク質である、請求項２８または２９に記載の方法。
前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、これらのバリアント、これらの断片、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞による前記選択マーカーの発現に基づいて前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を精製することをさらに含む、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
前記精製された遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を増殖させることをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞。
請求項３４に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
それを必要とするヒト対象における神経変性疾患または神経学的損傷を予防または治療するための、請求項３５に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および網膜変性疾患からなる群から選択される神経変性疾患の治療用である、請求項３６に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、クラッベ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、副腎脊髄ニューロパチー、アレキサンダー病、脳腱黄色腫症、異染性白質ジストロフィー、カナバン病、白質の消失を伴う白質脳症、副腎白質ジストロフィー、レフサム病、およびゼノベファントーシスからなる群から選択される白質ジストロフィーの治療用である、請求項３７に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、脊髄損傷、外傷性脳損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）の急性炎症、ＣＮＳの慢性炎症、虚血、および卒中からなる群から選択される神経学的損傷の治療用である、請求項３６に記載の医薬組成物。
前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞が前記対象に対して自己である、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記遺伝子改変されたヒト神経幹細胞が前記対象に対して同種である、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、注射または外科的移植によって投与されることを特徴とする、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（ａ）（ｉ）導入遺伝子を含む導入遺伝子カセット、および（ｉｉ）セーフハーバー遺伝子座の２つの非重複相同部分を含む２つのヌクレオチド配列であって、前記導入遺伝子カセットの５’末端および３’末端に位置するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型と、
（ｂ）ＤＮＡヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）単離されたヒト神経幹細胞と
を含むキット。
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４３に記載のキット。
前記単離されたヒト神経幹細胞が初代神経幹細胞を含む、請求項４３または４４に記載のキット。
前記単離されたヒト神経幹細胞が、体性幹細胞もしくは多能性幹細胞に由来するか、または体細胞集団からのダイレクトリプログラミングによって誘導される、請求項４３または４４に記載のキット。
前記導入遺伝子が、中枢神経系の遺伝的障害に関連するタンパク質をコードする、請求項４３から４６のいずれか一項に記載のキット。
前記導入遺伝子が、神経保護または神経再生タンパク質、そのバリアント、その断片、またはそのペプチド模倣体をコードする遺伝子を含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載のキット。
前記ＤＮＡヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列がＲＮＡを含む、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のキット。
ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡ、または前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡもしくは前記トランケート型ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４３から４９のいずれか一項に記載のキット。
前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓポリペプチドまたは前記Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡターゲティングＲＮＡが、前記セーフハーバー遺伝子座の一部分に相補的な第１のヌクレオチド配列および前記Ｃａｓポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列を含む、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはトランケート型ｓｇＲＮＡを含む、請求項５０に記載のキット。
前記Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９ポリペプチド、そのバリアント、またはその断片を含む、請求項５１に記載のキット。
前記Ｃａｓポリペプチドのバリアントが、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチドのバリアントを含む、請求項５２に記載のキット。
前記ｓｇＲＮＡまたはトランケート型ｓｇＲＮＡが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項５１から５３のいずれか一項に記載のキット。
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル、３’−ホスホロチオエートヌクレオチド（ＭＳ）、２’−Ｏ−メチル、３’−チオＰＡＣＥヌクレオチド（ＭＳＰ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５４に記載のキット。
前記セーフハーバー遺伝子座が、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、またはＨＢＢ遺伝子を含む、請求項４３から５５のいずれか一項に記載のキット。
前記ドナー鋳型が選択マーカーをさらに含む、請求項４３から５６のいずれか一項に記載のキット。
遺伝子改変されたヒト神経幹細胞を生成するための説明書をさらに含む、請求項４３から５７のいずれか一項に記載のキット。
導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットを含む遺伝子改変されたヒト神経幹細胞であって、前記導入遺伝子カセットがセーフハーバー遺伝子座内に位置する、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞。
潜在的な治療用分子を同定または開発する方法における、請求項３４もしくは５９に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞、または請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用。
前記潜在的な治療用分子が、ヒト神経幹細胞および／またはヒト神経幹細胞の分化した子孫の増殖および／または生存能力を促進する分子である、請求項６０に記載の使用。
研究における、請求項３４もしくは５９に記載の遺伝子改変されたヒト神経幹細胞、または請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、遺伝子改変されたヒト神経幹細胞の使用。