JP2019511209A - 原発性胃腺癌の体細胞プロモーター特性を明らかにするエピゲノムプロファイリング - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、その内容を参照によりその全体を本明細書に援用する、2016年2月16日に出願されたシンガポール出願第10201601142V号の優先権の利益を主張するものである。
以下は、本発明の記述を理解するのに役立ち得る幾つかの定義である。これらは、一般的な定義として意図され、本発明の範囲をこれらの用語のみに限定するものでは決してなく、以下の記述の更なる理解のためのものである。
方法及び材料
一次組織試料及び細胞系
一次患者試料は、SingHealth組織貯蔵所から得られ、機関研究倫理審査委員会から認可を受け、患者のインフォームドコンセントに署名がなされた。この研究に使用される「正常」(非悪性)試料とは、胃から、腫瘍から遠い部位から収集され、外科的評価で腫瘍も腸上皮化生/異形成も目に見える証拠がない試料を指す。腫瘍試料は、凍結切片によって>60%腫瘍細胞を含むことが確認された。FU97、IM95、MKN7、OCUM1及びRERF−GC−1B細胞系を、Japan Health Science Research Resource Bankから得た。AGS、KATOIII及びSNU16、Hs1.Int及びHs738.St/Int胃腸線維芽細胞系をAmerican Type Culture Collectionから得た。NCC−59、NCC−24及びSNU−1967及びSNU−1750をKorean Cell Line Bankから得た。YCC3、YCC7、YCC21、YCC22は、Yonsei Cancer Centre、韓国から供与された。HFE145細胞は、Dr.Hassan Ashktorab、ハワード大学から供与された。GES−1細胞は、Dr.Alfred Cheng、Chinese University of Hong Kongから供与された。細胞系同定(identifies)は、ANSI/ATCC ASN−0002−2011ガイドラインを用いたSTR DNAプロファイリングによって確認された。本発明者らの研究では、ICLAC(http://iclac.org/databases/cross−contaminations/)によって一般に誤認された細胞系として示されたMKN7細胞は、Japanese Collection of Research Bioresources Cell BankにおけるMKN7参照プロファイルと完全に一致した(100%)。すべての細胞系は、MycoAlert(商標)Mycoplasma Detection Kit(Lonza)及びMycoSensor qPCR Assay Kit(Agilent Technologies)によって評価して、マイコプラズマ汚染が陰性であった。健康なドナーからのPBMCをプロトコルCIRB Ref No.2010/720/Eに従って収集した。
Nano−ChIP−Seqを後述するように行った。
新鮮凍結癌及び正常組織をかみそりの刃を用いて液体窒素中で切り裂いて、約5mgサイズの小片を各ChIP用に得た。組織片を1%ホルムアルデヒド/PBS緩衝剤中で10分間室温で固定した。グリシンを最終濃度125mMまで添加して固定を停止した。組織片をTBSE緩衝剤で3回洗浄した。細胞系の場合、100万個の新しい収集細胞を1%ホルムアルデヒド/培地緩衝剤中で10分間(min)室温で固定した。グリシンを最終濃度125mMまで添加して固定を停止した。固定細胞をTBSE緩衝剤で3回洗浄し、遠心分離した(5,000r.p.m.、5min)。
ペレット化細胞及び微粉砕組織を100μlの1%SDS溶解緩衝剤に溶解し、Bioruptor(Diagenode)を用いて超音波処理して300〜500bpにした。ChIPを以下の抗体を用いて行った:H3K4me3(07−473、Millipore);H3K4me1(ab8895、Abcam);H3K27ac(ab4729、Abcam)。
ChIP及び入力DNAの回収後、全ゲノム増幅をWGA4キット(Sigma−Aldrich)及びBpmI−WGAプライマーを用いて行った。増幅されたDNAをPCR精製カラム(QIAGEN)を用いて精製し、BpmI(New England Biolabs)を用いて消化して、WGAアダプターを除去した。
増幅DNA30ngを各配列決定ライブラリ調製(New England Biolabs)に使用した。8つのライブラリを多重化し(New England Biolabs)、Hiseq2500配列決定装置(Illumina)の2レーン上で平均深さ2000〜3000万読み取り/ライブラリまで配列を決定した。
細胞を1%ホルムアルデヒドを用いて10分間室温で架橋し、グリシンを最終濃度0.2Mまで添加して停止した。クロマチンを抽出し、超音波処理して、約500bpの断片にした。EZH2抗体(カタログ#5246、Cell Signaling)をクロマチン免疫沈降(ChIP)に使用した。クロマチン免疫沈降DNA30ngを各配列決定ライブラリ調製(New England Biolabs)に使用した。ライブラリをHiseq2500(Illumina)で配列決定した。免疫沈降前の細胞からの入力DNAを使用して、ChIP−seqピーク抽出を規準化した。配列決定前に、qPCRを使用して、正及び負の対照ChIP領域が線形範囲で増幅されたことを検証した。配列決定読み取りをヒトゲノム参照hg19に対してBurrows−Wheeler Aligner(BWA)(バージョン0.7)「aln」アルゴリズムを用いてマッピングした。読み取り統計をsamtoolsのmapstatを用いて作成した。本発明者らは、読み取りをそれらのマッピング品質(MAPQ≧10)に基づいて選別し、一義的にマッピングされた読み取りを用いて、MACS2によりピーク抽出を行った。
ChIP濃縮評価
本発明者らは、ChIPライブラリ品質(H3K27ac、H3K4me3及びH3K4me1)を2つの異なる方法で評価した。まず、本発明者らは、ChIP品質、特にH3K27ac及びH3K4me3を、タンパク質コード遺伝子の注釈付きプロモーターにおけるそれらの濃縮レベルを調べることによって推定した。具体的には、本発明者らは、高発現タンパク質コード遺伝子の転写開始点(TSS、+/−500bp)周囲の入力及び入力補正ChIPシグナルの中央読み取り密度を計算した。各試料について、本発明者らは、次いで、ChIPと入力の読み取り密度比をデータ品質の代わりとして比較して、ChIP/入力比が2倍を超える試料のみを保持した。この基準を用いると、すべてのH3K4me3及びH3K27ac試料(GC株及び一次試料)は、2倍を超える濃縮を示し、濃縮が成功したことを示した。次に、本発明者らは、ChIPライブラリの濃縮が成功したか不十分かを示す、ChIP−seq品質管理及びプロトコル最適化のためのソフトウェアCHANCE(ChIp−seq ANalytics and Confidence Estimation)を使用した。CHANCE評価によって、本発明者らの研究における大多数(81%)の試料の濃縮に成功したことを確認した。両方の方法で評価した各ライブラリの品質状態を表1に報告する。
正常及びGC試料にわたって統合されたすべてのH3K4me3領域のH3K4me3:H3K4me1比を計算することによって、プロモーター(H3K4me3 hi/H3K4me1 lo)領域を同定した。本発明者らは、腫瘍試料と正常試料の間の上位100種の異なるプロモーターの平均シグナルに基づいて80%検出力及び10%第一種の過誤(http://powerandsamplesize.com/)を達成するのに必要な試料サイズを推定した。この結果、推奨試料サイズは11(平均)となり、本発明者らの研究において満たされた(16N/T)。正常試料とGC試料の両方においてH3K4me3:H3K4me1比<1の領域を更なる分析から除外した。この研究で行われたすべての分析では、プロモーター領域は、H3K4me3 hi/me1 lowシグナルを示すゲノム位置として定義され、すべての後続の分析では、H3K4me3シグナルが比較されたのは、この予め定義されたH3K4me3 hi/me1 lowサブセット内のみであった。H3K27acデータを相関分析に使用した。結腸癌株のH3K4me3データ(fastqs)を公開データベースからダウンロードした−ENCODEからのHct116及びCaco2、並びにGSE36204からのV503及びV400。GC試料と正常試料のプロモーターシグナルを比較するために、本発明者らは、chipseqシグナルの読み取り数マトリックスを用いたDESeq2及びedgeR bioconductorパッケージを使用して、複製情報に合わせて調節した。倍率変化が1.5を超える(FDR0.1)領域を有意差として選択した。FC1.5及びq<0.1の基準は、ChIP−seqプロファイルをDESeq2及びedgeRを用いてやはり同様の閾値を用いて比較した以前の文献に基づいた。DESeq2によって同定されたかなり改変されたプロモーターは、edgeRによって見いだされた改変プロモーターとほぼ完全に重複した。DESeq2読み取り数の正規化log変換を使用して、PCA及びヒートマップをプロットした。
RNA−seqデータをEuropean Genome−phenome Archiveから受託番号EGAS00001001128で得た。データをまずTopHat v2.0.12を用いてGENCODE v19転写物注釈に整列させて処理した。Cufflinks2.2.0を使用して、FPKM存在量基準を作成した。新規転写物の同定のために、参照転写物注釈を使用せずにCufflinksを使用した。次いで、転写物をすべてのGC及び正常試料にわたって統合し、GENCODE注釈と比較して、新規転写物をCuffmerge2.2.0を用いて同定した。深度の深い鎖特異的RNA配列決定も10個の追加の一次試料に対して行った。全RNAをQiagen RNeasy Miniキットを用いて抽出し、RNA−seqライブラリをIllumina Stranded Total RNA Sample Prep Kit v2(Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア、USA)Ribo−Zero Goldオプション(Epicentre、マディソン、ウィスコンシン、USA)及び1ug全RNAを用いて製造者の指示に従って構築した。配列決定をペアエンド101bp読み取りオプションを用いて行った。TCGAデータセットをTCGA Data Portal(https://tcga−data.nci.nih.gov/tcga)からfastqファイルの形でダウンロードし、次いでTopHat v2.0.12を用いてGENCODE v19転写物注釈に整列させた。プロモーター関連RNA発現を分析するために、TCGA試料(腫瘍及び正常)からのRNA−seq読み取りを、全プロモーター、増大体細胞プロモーター及び損失体細胞プロモーターを含めて、発見試料におけるエピゲノムプロファイリングによって最初に定義されたプロモーター領域のゲノム位置に対してマッピングした(本文の図1参照)。これらのエピゲノムによって定義されたプロモーター領域に位置するRNA−seq読み取りを、次いで、定量化し、プロモーター長さ(キロベース)及び全ライブラリサイズによって規準化し、発現の倍率変化を腫瘍試料グループと正常TCGA試料グループの間で計算した。プロモーター遺伝子座の長さを、ピーク抽出プログラムCCAT v3.0.(190)によって同定されたH3K4me3領域の開始と停止ゲノム座標の間の塩基対(bp)の数として定義した。選択的プロモーターによって駆動される転写物のアイソフォームレベル定量化を、cufflinks(FPKM)、Kallisto(TPM)及びMISO(アイソフォーム中心分析)を用いて行った。各アイソフォームの割当数をDESeq2によって規準化した。
胃腫瘍及び対応正常胃組織のゲノムDNAを抽出し(QIAGEN)、Illumina HumanMethylation450 BeadChips(HM450)を用いたDNAメチル化プロファイリングのために処理した。メチル化β値を計算し、バックグラウンドをmethylumi R BioConductorパッケージを用いて補正した。規準化をBMIQ法(R中のwateRmelonパッケージ)を用いて行った。CpG島の位置をUCSCゲノムブラウザからダウンロードした。プロモーター遺伝子座とCpG島の少なくとも1bpの重複を、BEDTools intersectを用いて確認した。各グループ(全プロモーター、増大体細胞プロモーター及び損失体細胞プロモーター)について、本発明者らは、予測プロモーター領域に重複するプローブを特定し、平均ベータ値差を計算した。2標本ウィルコクソン検定を行った。
全生存期間を成果の測定基準としたカプラン−マイヤー生存率分析を使用した。ログ−ランク検定を使用して、カプラン−マイヤー分析の有意性を評価した。
遺伝子セット濃縮分析をMsigDBを用いてC2セットの精選遺伝子に対する体細胞プロモーターに関連する遺伝子の重複を計算することによって行った。
90個の結腸直腸癌(CRC)試料及び60個の正常結腸上皮試料のペプチドレベル質量分析データを、Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium(NCI/NIH)によって作成されたCPTACポータルからダウンロードした。(https://cptac−data−portal.georgetown.edu/cptac)。スペクトルカウントをIDPickerのidQueryツールを用いて抽出した。線形モデル(limma R)を変位値規準化及びlog2変換スペクトルカウントにフィッティングすることによって、差次的に発現するペプチドを同定した。GC細胞系質量分析法では、AGS、GES−1、SNU1750及びMKN1細胞を、プロテアーゼ阻害剤を補充したRIPA緩衝剤で抽出した。各生物学的四つ組(すなわち、1つの細胞系当たり4つの複製物)のタンパク質抽出物150μgを12%NuPAGE Novel Bis−Trisプレキャストゲル(Thermo Scientific)上で分離した。ゲル内消化の場合、試料を2つの画分に分離し、10mM DTT中で1時間56℃で還元し、続いて55mMヨードアセトアミド(Sigma)を用いて45分間暗所でアルキル化した。トリプシン消化をトリプシン2μgを含む50mM炭酸水素アンモニウム緩衝剤(Promega)中で37℃で終夜行った。ペプチドをStageTipsで脱塩し、Q Exactive HF質量分析計に連結されたEASY−nLC 1200システム(Thermo Fisher Scientific)上のナノフロー液体クロマトグラフィによって分析した。ReproSil−Pur C18−QAQ 1.9μm樹脂(Dr Maisch)を所内充填したC18逆相カラム(長さ25cm、内径75μm)でペプチドを分離した。カラムをEasy Flex Nano Sourceに搭載し、カラムオーブン(Sonation)によって40℃で温度制御した。流量225nl/minの0.5%ギ酸中の2〜40%アセトニトリルの225min勾配を使用した。噴霧電圧を2.4kVに設定した。Q Exactive HFを1回のMSフルスキャンにつきTOP20 MS/MSスペクトル取得法で操作した。MSスキャンを分解能60,000で行い、MS/MSスキャンを分解能15,000で行った。データ解析では、生のファイルをMaxQuantバージョン1.5.2.8を用いてUNIPROT注釈付きヒトタンパク質データベースに対して処理した。カルバミドメチル化を固定修飾として設定し、メチオニン酸化及びタンパク質N−アセチル化を可変修飾とみなした。検索結果を偽陽性率0.01で選別するMaxQuantで処理した。実行オプションとLFQ定量化の適合を作動させた。LFQ強度を潜在的混入物、逆タンパク質(reverse proteins)について選別し、log2変換した。次いで、それらを、オープンソースソフトウェアPerseus(0.5幅、1.8ダウンシフト)を用いて帰属させ、線形モデル(limma R)を用いてフィッティングした。
cDNA末端の5’迅速増幅(5’RACE)を5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends、バージョン2(Invitrogen、18374−058)を用いて行った。手短に述べると、SuperScript(商標)II逆転写酵素、及び各遺伝子の遺伝子特異的プライマー1を用いた各逆転写反応に全RNA2μgを使用した。cDNA合成後、リボヌクレアーゼ混合物(リボヌクレアーゼH及びリボヌクレアーゼT1)を使用して、RNAを分解した。次いで、第1の鎖cDNAをS.N.A.P.カラムで精製し、dCTP及びTdTを末端につないだ。dC末端cDNAを短縮アンカープライマー及び入れ子状態の遺伝子特異的プライマー2を用いてGo Taq(登録商標)Hot Start Polymerase(Promega、M5001)によって増幅した。続いて、一次PCR産物を短縮汎用増幅プライマー(AUAP:abridged universal amplification primer)及び遺伝子特異的プライマー3を用いて再増幅した。ゲル電気泳動を行った。TA Cloning Kit(Invitrogen、K2020)を用いたクローニングのために、目的のPCRバンドを切り出し、精製した。最小の12個の独立したコロニーを単離し、精製プラスミドDNAをABI 3730 DNA分析計(Applied Biosystems)で双方向に配列決定した(表2)。KATOIII細胞由来の野生型及び変異METをコードする完全長cDNAのPCR増幅によってMET転写物の構築物を生成した。野生型及び変異RASA3完全長転写物をNCC59細胞からPCR増幅した。cDNA断片を、(Wanjin Hong、Institute of Molecular and Cell Biology、シンガポールから供与されたPromegaのpCI−Neoベクターから改変された)pCI−Puro−HAベクター中にクローン化した。プラスミドをLipofectamine 3000(Thermo Scientific)を用いて細胞系に一過性導入した。
3×105個のHEK293細胞を播き、Lipofectamine 3000(Thermo Scientific)を用いて遺伝子導入した。細胞を、ヒトHGF(R&D systems、100ng/ml)を0、15及び30分間添加する前に16時間血清不足にし、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(Roche)を含む冷たいTriton−X100溶解緩衝剤(50mM Tris pH8.0、150mM NaCl、1%Triton X−100)を用いて氷上ですぐに収集した。タンパク質濃度をPierce BCAタンパク質アッセイ(Thermo Scientific)によって測定した。細胞溶解物を95℃で10分間SDS試料緩衝剤中で加熱し、各細胞溶解物20μg/ウェルを添加した。タンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を4時間室温で以下の抗体と一緒にインキュベートすることによってウエスタンブロット法を行った:Met&βアクチン(Santa Cruz)、p−MET(Y1234/1235&Y1349)、pSTAT3(S727&Y705)、STAT3、ERK、p−ERK、Gab1、pGab1(Y627)(Cell Signaling)。膜を二次抗体中で1:3,000で1時間室温でインキュベートし、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity基質(Thermo Scientific)と一緒にChemiDoc(商標)MP Imaging System(BIORAD)を用いて現像した。ウエスタンブロットバンドをImage Labソフトウェア(BIORAD)を用いて定量化した。実験を3つ組で繰り返した。
3×103個のGES1、SNU1967及びAGS細胞を、96ウェルプレートの10%ウシ胎仔血清を含む培地中で培養し、終夜放置して付着させた。翌日(0日目)、細胞にLipofectamine 3000(Thermo Scientific)を用いて野生型及び変異RASA3構築物を一過性導入した。構築物の量は、AGSの場合40ng/ウェル、GES1及びSNU1967細胞の場合100ng/ウェルであった。導入から24〜120時間後、細胞増殖をWST−8アッセイ(Cell Counting Kit−8、Dojindo)によって測定した。WST−8溶液10uL/ウェルを添加し、加湿恒温器中で2時間インキュベーション後に吸光度読み取りを450nmで測定した。
2種のRASA3 siRNAを使用して、NCC24細胞中のRASA3 SomT転写物の発現を抑制した(hs.Ri.RASA3.13.1 TriFECTa(登録商標)Kit DsiRNA Duplex(Integrated DNA Technologies)、及びSilencer(登録商標)Select Pre−Designed siRNA s355(Life Technologies))。NCC24細胞に上記2種のsiRNA又は非標的対照(ON−TARGETplus Non−targetingプール、Dharmacon)を最終濃度100nMで48時間導入し、続いてqPCR及びウェスタン検証及び遊走/浸潤アッセイを行った。
細胞遊走能力を求めるために、RASA3野生型及び変異体導入AGS及びGES1、SNU1967及びAGS、並びにsiRNA処理NCC24細胞を、Corning Costar 6.5mm Transwellと8.0μm Pore Polycarbonate Membrane Inserts(3422、Corning、NY、USA)を用いて試験した。2.5×104個のAGS細胞及び2×104個のGES1細胞、3×104個のSNU1967細胞及び5×104個のNCC24細胞を0.1ml無血清RPMI培地に懸濁させ、Transwellインサートの上に添加した。10%FBSを含む0.6ml RPMIを底部ウェルに化学誘引物質として添加した。5%CO2恒温器中で37℃で24時間インキュベーション後、細胞を3.7%ホルムアルデヒドで固定し、100%メタノールで透過処理した。非遊走細胞を、膜の上面から綿棒でこすり取った。遊走細胞を0.5%クリスタルバイオレットで染色した。遊走細胞数をImageJソフトウェアを用いて計算される遊走細胞の総面積対Transwellメンブレンの面積として表した。細胞浸潤アッセイでは、上記Transwellインサートを使用前に0.1ml(300μg/mL)Corning Matrigelマトリックス(354234、Corning、NY、USA)で2〜4時間37℃で被覆した。すべての後続ステップを遊走アッセイ手順と同一にした。
全RNAを3つの独立した実験からQiagen RNAeasyミニキットを用いて製造者の指示に従って抽出した。RNAをImprom−IITM Reverse Transcriptase(Promega)を用いて逆転写した。実時間PCRをQuantifast SYBR Green PCRキット(Qiagen)を用いてApplied Biosystems HT7900 Real Time PCR System上で3つ組で行った。倍率変化をDelta Ct法によって計算し、βアクチンに対して規準化した。プライマー配列は以下の通りである。βアクチン:F−5’TCCCTGGAGAAGAGCTACG 3’(SEQ ID NO:1843)、R−5’GTAGTTTCGTGGATGCCACA3’(SEQ ID NO:1844);RASA3 SomT:F−5’TTGTGAGTGGTTCAGCGGTA3’(SEQ ID NO:1845)、R−5’TCAAGCGAAACCATCTCTTCT3’(SEQ ID NO:1846)。
GES1細胞にRASA3 CanT、RASA3 SomT又は空ベクターを48時間導入した。細胞をFBS含有培地中のタンパク質のために収集し、又は収集前に終夜の血清不足、続いて30分間の血清刺激に供した。プロテアーゼ阻害剤カクテル(Nacalai Tesque)を含む氷冷溶解緩衝剤(Active RAS Pull−down and Detection Kit)を用いてタンパク質を抽出した。活性RAS画分をActive RAS Pull−down and Detection Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いて製造者の指示に従って得た。全RASを対応する細胞全体のタンパク質溶解物中で測定した。βアクチンを添加対照として使用した。タンパク質濃度をPierce BCAタンパク質アッセイ(Thermo Scientific)によって測定した。SDS試料緩衝剤を溶解物に添加し、100℃で5分間煮沸した。試料を4〜15%Mini−Protean TGXゲル(Biorad)の各ウェルに添加し、半乾燥ブロッティングシステム(Biorad)を用いてPVDF膜に移した。抗RAS(1/200希釈、Active RAS Pull−down and Detection Kit中で供給)、又は5%乳−PBST中のB−アクチン(1/5000希釈、Sigma A5316)を用いて4℃で終夜膜を調べた。二次抗マウス抗体(LNA931、Amersham)を1/2000希釈で1時間室温で使用した。膜をAmersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagentを用いて現像し、Chemidoc Imagingシステム(Biorad)を用いて画像化した。
改変ペプチドは、選択的プロモーターの使用における体細胞変化から生じる変異N末端タンパク質配列として定義された。以下のフィルターを適用して改変ペプチドのプールを選択した−i)選択的RNA−seq発現対標準RNA−seq発現の少なくとも1.5の倍率変化、ii)遺伝子座1つ当たり1つのみの標準及び1つの選択的アイソフォーム、iii)注釈付き転写物が、Gencodeによってコードされたタンパク質として確認される。標準プロモーターは、不変H3K4me3ピークを示す領域として定義された。ヒトプロテオームからのランダムペプチドをGencodeコーディング転写物のアミノ酸配列から生成した。N末端ペプチド増大は、選択的転写物が標準転写物に比べて異なる翻訳タンパク質配列をもたらすと予測される異なる5’領域に関連する場合として認識された。各N末端改変タンパク質の場合、本発明者らは、9量体ペプチドの結合をNetMHCpan 2.8を用いてIC≦50nmの厳格な閾値を用いて評価して、強いMHC結合剤を特定した。N末端増大ペプチドを同じ遺伝子のタンパク質構築データに対してマッピングして、タンパク質発現を評価した。抗原予測をOptiTypeを用いて予測された13種のGC試料のHLAタイプに対して行った。OptiTypeによって提供される参照配列に整列させる読み取りを前もって選別するためのアライナとしてBWA memを使用した以外は、OptiTypeを初期設定パラメータで実行した。被覆の不十分な3つの試料及びミスマッチの不対読み取りを分析から除外した。東南アジアの集団における流行が増加している11種のHLA−A、HLA−B及びHLA−C対立遺伝子変異体(HLA−A*02:07/HLA−A*11:01/HLA−A*24:02/HLA−A*33:03/HLA−A*24:07、HLA−B*13:01/HLA−B*40:01/HLA−B*46:01、HLA−C*03:04/HLA−C*07:02/HLA−C*08:01)をAllele Frequency Net Database(http://www.allelefrequencies.net)から得た。
局所免疫細胞溶解活性をグランザイムA(GZMA)及びパーフォリン(PRF1)の発現によって評価した。腫瘍含有量を2つのアルゴリズム、すなわちASCAT(79)(異常細胞画分)及びESTIMATE(腫瘍純度)を用いて推定した。SGシリーズの発現データをダウンロードし(GSE15460)、「affy」Rパッケージ中の堅牢なマルチアレイ平均アルゴリズムを用いて規準化し、log2変換した。SGシリーズ用のAffymetrix SNP Array 6.0データをGSE31168及びGSE85466からダウンロードした。TCGA STAD試料の変異頻度を、TCGA STAD刊行物データ(https://tcga−data.nci.nih.gov/docs/publications/stad_2014/)から、「ミスセンス」変異体分類で選別されたレベル2精選MAFファイル(QCv5_blacklist_Pass.aggregated.capture.tcga.uuid.curated.somatic.maf)を用いてダウンロードした。TCGA STAD試料(TPM)の発現データをkallistoアルゴリズムを用いて計算した。TCGA胃癌(STAD)の生のSNP Array 6.0.CELファイルをGDCデータポータル(https://gdc−portal.nci.nih.gov/)からダウンロードした。このデータセットへのアクセスは、dbGaP証明書及びeRA commonsによって発行されたIDを用いて得られた。TCGA STADの事前計算ESTIMATEスコアをhttp://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/からダウンロードし、式cos(0.6049872018+0.0001467884×ESTIMATEスコア)を用いて腫瘍純度に変換した。ACRGシリーズの前処理された発現データをGSE62254からダウンロードし、事前計算ASCATスコアを共同研究者(JL)から得た。細胞溶解性マーカーの発現をスプライン回帰モデルを用いてミスセンス変異及び腫瘍純度頻度(purity frequencies)に合わせて調節した。
15種の代表的選択的プロモーターに対する1セットのペプチドをGenScript(GenScript)から購入した。各選択的プロモーターに対するペプチドプールのペプチド配列及び組成を表3に記載する。ヒトアクチンの対照ペプチドプールをJPTから購入した(PM−ACTS、PepMix(商標)Human (Actin) JPT)。末梢血単核球(PBMC)を8つのPBMC試料がHLAタイプである9名の健康なボランティアから得た(表3)。
PBMCを1μM CFSE(Life Technologies、Thermo Fisher Scientific)で標識し、密度200,000細胞/ウェルで完全培地(RPMI 1640培地(Gibco、Thermo Fisher Scientific)、15mM HEPES(Gibco)、1%非必須アミノ酸(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)、2mM L−グルタミン(Gibco)、50μM β2−メルカプトエタノール(Sigma、Merck)及び10%熱失活FCS(Hyclone)を含むcRPMI)中で5日間培養した。各選択的プロモーターの個々のペプチドプールを培養開始時に各ペプチドについて濃度1μg/mlで添加した。5日目の最後に、細胞をLIVE/DEAD(登録商標)定着性近IR死細胞染色キット(Life Technologies)で染色し、CD4−BUV737(BD)、CD8−PacificBlue(BD)、CD3−PE(BioLegend)、CD19−PE/TexasRed(Beckman)及びCD56−APC(BD)で標識した。CFSE希釈によるT細胞増殖の分析をLSRII(BD)を用いたフローサイトメトリーによって行った。さらに、磁気ビーズベースのサイトカイン多重分析(ヒトサイトカインパネル1、Millipore、Merck)を細胞培養上清に対して行い、分泌サイトカインレベルを測定した。
RASA3 WT及び変異体タンパク質配列の免疫原性を試験するために、CD14+単球をHLA−A*02:06ドナーから磁気ビーズ(Miltenyi、ドイツ)を用いたポジティブ選択によって単離した。樹状細胞をGM−CSF(1000IU/ml)及びIL−4(400IU/ml)によって生成させ、TNF(10ng/ml)、IL−1b(10ng/ml)、IL−6(10ng/ml)(Miltenyi、ドイツ)及びPGE2(1μg/ml)(Stemcell Technologies、カナダ)によって24時間更に成熟させた。次いで、同じドナーからのT細胞と1:5の比で共培養する前に、WT RASA3又は変異RASA3を発現するAGS細胞溶解物でDCを24時間刺激した。DCと5日間共培養した後、T細胞をCD3磁気ビーズ(Miltenyi、ドイツ)を用いたポジティブ選択によって単離し、WT又は変異RASA3を発現するAGS細胞と20:1の比で2日間共培養した。上清を収集し、IFN−γ放出をELISA(R&D、USA)によって測定した。
Nanostring nCounter Reporter CodeSetをSGシリーズ試料上の95種の遺伝子(GCにおける83種の上方制御及び11種の下方制御)及び5種のハウスキーピング遺伝子(広範な発現範囲にわたるAGPAT1、CLTC、B2M、POL2RL及びTBP)に対して設計した。各遺伝子に対して、本発明者らは、a)選択的プロモーター位置の5’末端、b)(GC試料と正常試料の両方における等しい濃縮のプロモーター領域、又は最長タンパク質コード転写物によって定義された)標準プロモーターの5’末端、及びc)共通下流プローブを標的にした3種のプローブを設計した。販売業者によって提供されたnCounterソフトウェア(nSolver)をデータ解析に使用した。生のカウントを各CodeSetに含まれる内部正対照プローブの幾何平均を用いて規準化した。
体細胞プロモーター変化を示す領域において過剰提示される繰り返しエレメントファミリーを、UCSC Table BrowserからのRepeatMasker注釈を用いて同定した(GRCh37/hg19)。「不明」、「単純_繰り返し」及び「サテライト」注釈を繰り返しセットから選別した。繰り返しエレメントは、それらがプロモーターと最低50%重複した場合にのみ含まれた。繰り返しエレメントファミリーの濃縮をBenjamini−Hochberg FDR補正を用いた二項検定によって評価し、全プロモーター領域をバックグラウンドとして使用した。
ゲノム全体及び組織特異的機能スコアをそれぞれGenoCanyon(http://genocanyon.med.yale.edu/GenoCanyon_Downloads.html、バージョン1.0.3)及びGenoSkyline(http://genocanyon.med.yale.edu/GenoSkyline)からダウンロードした。重複をbedtools IntersectBedを用いて計算し、各注釈のない体細胞プロモーターにわたる機能スコアを計算した。
237種のTFの転写因子結合部位をReMapデータベース、ENCODEの公開データベース、及び別の公開Chip−seq TFBSデータセットから得た。重複を体細胞プロモーターセットに対して計算し、カウントした。相対濃縮スコアを(#状態及び重複特徴の塩基(bases in state and overlap feature))/(#ゲノム中の塩基)と[(#塩基重複特徴)/(#ゲノム中の塩基)×(#状態の塩基(bases in state))/(#ゲノム中の塩基)]の比として計算した。
IM95を選択的EZH2阻害剤GSK126(Selleck、USA)で濃度5uMで処理した。細胞増殖をGSK126処理後の96ウェルプレート中でCellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)によって3つの独立した実験でモニターした。RNA−seq分析では、全RNAをQiagen RNAeasyミニキットを用いて製造者の指示に従って抽出した。細胞をGSK126(Selleck、USA;DMSO溶解)で濃度5uMで処理した。対照細胞を同じ濃度のDMSO(0.1%)で処理した。プロモーター遺伝子座のRNAseq示差分析を、featureCountsを用いて推定されたH3K4me3領域に位置する読み取り数に対してedgeRを用いて行った。RNAseq遺伝子レベル示差分析をcuffdiff2.2.1を用いて行った。
受託コード:この研究のためのゲノムデータをNational Center for Biotechnology GEOデータベースに受託番号GSE51776及びGSE75898(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=kfoxqeamzfetpal&acc=GSE75898)で寄託した。
GCにおけるエピゲノムプロモーター変化の特定
NanoChIP−seqを用いて、本発明者らは、17のGC、対応正常胃粘膜(34個の試料)及び13のGC細胞系にわたる3種のヒストン修飾標識(H3K4me3、H3K27ac及びH3K4me1)の特性を明らかにし、110のエピゲノムプロファイルを作成した(表1及び4に臨床及び配列決定測定基準を示す)(図1a)。Nano−ChIPseqデータの品質管理を2つの独立した方法で行った:公知のプロモーターにおけるChIP濃縮、並びにChIP−seq品質管理及び検証ツールCHANCE(CHip−seqANalytics and Confidence Estimation)の使用。高発現タンパク質コード遺伝子に関連する1,000種のプロモーターにおけるNano−ChIPseq読み取り密度の比較によって、すべてのH3K27ac及びH3K4me3ライブラリにおける濃縮の成功を確認した。CHANCE分析によっても、試料の大多数(81%)の濃縮の成功が明らかになった(表1)。本発明者らは、以前にも、Nano−ChIPシグナルが直交ChIP−qPCR結果と良好な一致を示すことを明らかにした。
4つの証拠が、H3K4me3 hi/H3K4me1 lo領域の大部分を真のプロモーターとして裏付けている。第1に、H3K4me3 hi/H3K4me1 lo領域は、公知のGENCODE転写開始点(TSS)の1kb上流のゲノム位置に高度に濃縮された(図7)。第2に、TSS領域においては、H3K4me3シグナルは、プロモーターに関連することが以前に報告された古典的な歪曲二峰性強度パターンを示した(図7)。第3に、Epigenomic Roadmap(EpiRd)15状態モデルによって定義された領域と重複するときには、本発明者らは、他の組織に比べて胃腸組織において、近位プロモーター状態(TSS/転写部位に隣接する領域)においてH3K4me3 hi/H3K4me1 lo領域の有意な濃縮を認めた(図7)。第4に、CAGE(CAP分析遺伝子発現:CAP analysis gene expression)は、遺伝子プロモーターを5’mRNAデータを用いてマッピングするのに使用される専用のトランスクリプトーム配列決定法である。FANTOM5コンソーシアムのCAGEデータとの統合によって、H3K4me3 hi/H3K4me1 lo領域と堅牢なCAGEタグクラスターが81%重複することが明らかになった。(図7)。
エピゲノムプロモーター変化と遺伝子発現の関係を探索するために、本発明者らは、同じ発見コホートからのRNA−seqデータを分析し(約10600万読み取り/試料)、エピゲノム誘導プロモーター領域に、又は直接下流に位置するRNA−seq転写物読み取りを定量化した。体細胞プロモーター領域を調べて(図2Aは、増大体細胞プロモーターの説明のための一例である)、本発明者らは、全プロモーター(P<0.001、図2B)又は不変プロモーター(P<0.001、図10)に比べて、GCの増大体細胞プロモーターにおける発現が有意に増加することを認め、損失体細胞プロモーターにおける発現が有意に減少することを認めた。別のタイプのエピジェネティック修飾のうち、以前の研究は、活性調節領域とDNAメチル化の相互関係も報告した。Infinium 450K DNAメチル化アレイを用いて、本発明者らは、体細胞プロモーター領域に重なる7,505個のCpG部位を同定した(増大体細胞プロモーターの場合5,213個の部位、損失体細胞プロモーターの場合2,292個の部位)。GCにおいて増大するプロモーターは、全プロモーターと比較して有意に低メチル化され(P<0.001、ウィルコクソン検定)、GCにおいて失われるプロモーターは高メチル化された(P<0.001、ウィルコクソン検定)(図2b、下)。DNAメチル化は一般に高CpG領域で起こるので、(56)本発明者らは、次いで、CpG島を有するプロモーターのみに注目した分析を繰り返した(「方法及び材料」)。最初の結果と同様に、GCにおいて増大するCpG島を有するプロモーターは、CpG島を有する全プロモーターに比べて有意に低メチル化され(P<0.001、ウィルコクソン検定)、GCにおいて失われるCpG島を有するプロモーターは高メチル化された(P<0.001、ウィルコクソン検定)(図11)。
体細胞プロモーターを参照Gencodeデータベース(V19)と比較することによって、本発明者らは、共通不変プロモーターが正常組織と腫瘍の両方に存在する(標準プロモーター)が、第2の腫瘍特異的プロモーターが後者に関与する(選択的プロモーター)状況として定義される、GCにおける選択的プロモーター(18%)の広範な使用を発見した。体細胞プロモーターの残りの82%は、単一の主要なアイソフォーム又は注釈のない転写物に対応した(後述)。選択的プロモーターの57%は、標準プロモーターの下流に生じた。複数のRNA−seq分析法を用いて、本発明者らは、選択的プロモーターによって駆動される転写物アイソフォームがGCにおいて同じ遺伝子中の標準プロモーターよりもかなり高度に過剰発現することを確認した(「方法及び材料」、図12)。例えば、GCにおいて過剰発現する転写因子HNF4αは、2種のプロモーター(P1及びP2)によって駆動される。HNF4α標準プロモーター(「P2」)においては、本発明者らは、GCと正常組織において等しいプロモーターシグナルを観察した。しかし、本発明者らは、さらに、GCにおいて転写開始点45kb下流における追加のプロモーターの増大も認めた(「P1」)。同様のHNF4α P1プロモーター増大は、GC細胞系においても認められ(図3a)、RNA−seq分析によってGCにおけるHNF4α P1アイソフォーム発現が裏付けられた。選択的プロモーターの使用は、循環腫瘍細胞の同定に頻繁に使用されるEpCAM遺伝子においても認められ、EpCAM転写物ENST00000263735.4の発現を引き起こした(図3b)。特に、HNF4α選択的アイソフォームとEpCAM選択的アイソフォームの両方は、それらの標準アイソフォームよりもかなり大きな癌過剰発現を示した(図12)。NKX6−3(FC1.83、q<0.05)及びGRIN2D(FC1.9、q<0.001)を含めて、腫瘍特異的選択的プロモーターに関連する別の遺伝子、初めて報告された多数。GC腫瘍特異的プロモーターの完全なリストを示す(表6)。
癌免疫編集は、発達中の腫瘍が、それらの免疫原性及び抗原性プロファイルを変えて、宿主免疫監視を逃れるプロセスである。癌免疫編集の機序は、PD−L1などの免疫チェックポイント阻害剤の上方制御を含めて、多様である。腫瘍免疫に対する体細胞プロモーターの潜在的寄与を探索するために、本発明者らは、CD8+細胞傷害性T細胞への抗原提示に必要である(IC50≦50nM、図4a)、GC特異的MHCクラスI HLA対立遺伝子と高い親和性で結合することが予測される体細胞プロモーター関連N末端ペプチドを特定した(表8及び9)。NetMHCpan−2.8アルゴリズムを用いた反復性体細胞プロモーター関連ペプチドの分析は、標準GCペプチド(平均36%対24%;P<0.01)、無作為に選択されたペプチド(P<0.001)、及びC末端ペプチド(P<0.01)を含めて、複数の対照ペプチド集団に比べて、高親和性MHC I結合の有意な濃縮を示した(図4Bは、組み合わせたHLA−A、B及びCを示し、図15AはHLA−Aのみのデータを示す)。高親和性体細胞プロモーター関連ペプチドの大部分は、N末端ペプチドのない体細胞転写物が腫瘍において正常組織よりも過剰発現する状況に対応した(78%損失;76/97高親和性ペプチド、図4C)。特に、N末端のない体細胞TSSによって駆動される転写物も、標準TSSによって駆動される転写物よりも腫瘍において有意に高度に過剰発現するので(P<0.05、ウィルコクソン片側検定)(図12)、こうしたシナリオは、腫瘍中のこれらのN末端免疫原性ペプチドの相対的欠乏を招くと予測される。興味深いことに、(エピゲノムデータの非存在下で)RNA−seqデータを単独で用いた類似のN末端分析によって、エピゲノム誘導N末端ペプチドが、RNA−seqのみで同定されたペプチドに比べて有意に高い予測免疫原性スコアを示すことが明らかになり(MHC提示に対して36.10%対27%、P=0.02、フィッシャー検定)、エピゲノム誘導プロモーター同定が、RNA−seqのみで誘導される分析に相補的価値を与え得ることを示唆している(図15)。
免疫応答を誘発するGC中で欠乏したN末端ペプチドの能力を機能的に試験するために、本発明者らは、T細胞増殖とサイトカイン産生の両方の複数エピトープ試験を可能にするハイスループットEPIMAX(EPItope MAXimum)プラットホームを用いて、インビトロアッセイを行った。まず、本発明者らは、健康なPBMC(末梢血単核球)ドナーのプールで高いHLA結合親和性を示すと予測されるN末端ペプチドを特定した。次に、15種の選択的プロモーター関連ペプチドを試験のために選択し、本発明者らは、各ペプチドに対してペプチドプールを作成し(表9及び10、「方法」)、次いでそれらを使用して、9名の健康なドナー由来のPBMCを刺激した。T細胞増殖及びサイトカイン産生レベルを測定し、対照ペプチドに対して評価した(表12)。全135回の曝露で(9名のドナーの各15種のペプチド)、本発明者らは、ドナーに依存する様式で複雑なTh1、Th2及びTh17分極を誘導する、79個のペプチドプール(58%;アクチンペプチドに対してFC≧2)(図4g)の強力なサイトカイン応答を認めた(図17)。
体細胞プロモーター変化を推進する潜在的発癌機序を特定するために、本発明者らは、体細胞プロモーターのゲノム位置を83個の異なる組織由来の237種の転写因子の転写因子結合部位(TFBS:transcription factor binding sites)と交差させた。体細胞プロモーターを示す領域は、EZH2(P<0.01)及びSUZ12(P<0.01)結合に関連する領域がかなり濃縮され(図6a、表13)、より小さいコホートでの以前の知見を確認した。EZH2とSUZ12の両方は、GCを含めて多数の癌タイプで上方制御されるPRC2エピジェネティック制御因子複合体の成分である。これらの知見を検証するために、本発明者らは、次いで、HFE−145正常胃上皮細胞に対してEZH2 Chip配列決定を行った(「方法及び材料」)。以前の知見と一致して、本発明者らは、全プロモーターと比較して体細胞プロモーターにおけるEZH2結合部位のかなりの濃縮を認め(濃縮スコアは、全プロモーターの13に対して27、P<0.01)、このEZH2濃縮は、増大体細胞プロモーター(濃縮スコア28、P<0.01)と損失体細胞プロモーター(濃縮スコア24、P<0.01)を別々に分析したときに有意なままであった(図18)。
最後に、公知の遺伝子への両方の近接に関して改変体細胞プロモーターを分析すると、本発明者らは、体細胞プロモーターを注釈付きカテゴリと注釈のないカテゴリに分類することができた。注釈付きプロモーターは、公知のGencode転写開始点(TSS)の近く(<500bp)に位置するプロモーターとして定義され、注釈のないプロモーターとは、公知のGencodeTSSを欠くゲノム領域に位置するものを指す。非悪性組織中に存在するプロモーターの大部分、及び腫瘍と正常組織の間で不変のプロモーターも、前もって注釈の付けられたTSSの近くにマッピングされる(72%〜92%)。それに対して、プロモーターの41%しか注釈付きプロモーター位置に位置せず、残りの59%は、GencodeTSSから遠い、多くの場合において2〜10kb離れた、「注釈のない」位置に位置した(図6a)。
体細胞的に改変されたシス調節エレメントの特定、及びこれらのエレメントが癌関連遺伝子発現を誘導する仕方の理解は、重要な科学的目標である。ここで、本発明者らは、GCにおいて活性が変化する約2000種のプロモーターを定義し、GCにおける体細胞プロモーターが広範であることを示した。プロモーターは、基本転写因子を動員して転写を開始する近位シス調節エレメントとして標準的に定義される。しかし、コアプロモーターにおけるRNAポリメラーゼによるTSSの選択及び活性化は、多数の要因に依存する。コアプロモーターは、機能の異なる遺伝子間で分布が異なり、コアプロモーター領域のクロマチン分布及びエピジェネティック特性は、組織特異的にも異なり得る。同じ遺伝子内の複数の転写開始点の存在は、遺伝子発現を調節するスイッチとして作用し得る異なる5’UTRを有する異なる転写物アイソフォームを生成する可能性があり、選択的5’UTRの使用は、BRCA1、TGF−β、ERGなどの癌関連遺伝子の翻訳とタンパク質安定性の両方にも影響し得る。こうした知見は、特異的プロモーターエレメント活性が複雑であり、細胞の状況に依存し、下流の転写、翻訳及び機能的プロセスに影響することを示している。
Claims (49)
- 非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも1種のプロモーターの有無を決定する方法であって、
前記癌生体試料をヒストン修飾H3K4me3及びH3K4me1に特異的な少なくとも1種の抗体と接触させるステップ、
H3K4me3とH3K4me1のシグナル比が1を超える核酸を前記癌生体試料から単離するステップであって、前記単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも1個の領域を含む、ステップ、
前記単離した核酸中のH3K4me3の信号強度を検出するステップ、及び
前記H3K4me3の信号強度を非癌生体試料中のH3K4me3の信号強度と比較した変化に基づいて、前記癌生体試料中の少なくとも1種のプロモーターの有無を決定するステップ
を含む、方法。 - 前記癌及び非癌生体試料が、単細胞、多細胞、細胞の断片、体液又は組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記癌生体試料と非癌生体試料が同じ対象から得られる、請求項1から2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌生体試料と非癌生体試料が各々異なる対象から得られる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触させるステップが、前記ヒストン修飾に特異的な前記抗体を用いたクロマチンの免疫沈降を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌生体試料からの少なくとも1種のプロモーターを少なくとも1個の参照核酸配列に対してマッピングして、前記少なくとも1種のプロモーターに関連する遺伝子転写物を同定するステップを更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の参照核酸配列が、
i)注釈付きゲノム配列、
ii)新規トランスクリプトーム集合体、及び/又は
iii)非癌核酸配列ライブラリ若しくはデータベース
に由来する核酸配列を含む、請求項6に記載の方法。 - 前記H3K4me3の信号強度の変化が、前記非癌生体試料中のH3K4me3の信号強度の1.5倍を超えて増加又は減少する、請求項1に記載の方法。
- 前記非癌生体試料中のH3K4me3の信号強度の1.5倍を超えて増加するH3K4me3の信号強度の変化が、前記癌生体試料中の少なくとも1種の癌関連プロモーターの存在と相関する、請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の癌関連プロモーターの活性が、全プロモーター集団に比べたSUZ12又はEZH2結合部位の増加と相関する、請求項9に記載の方法。
- 前記SUZ12又はEZH2結合部位の増加が、前記少なくとも1種の癌関連プロモーターの活性の上方制御と相関する、請求項10に記載の方法。
- 前記SUZ12又はEZH2結合部位の増加が、前記少なくとも1種の癌関連プロモーターの活性の下方制御と相関する、請求項10に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のプロモーターが、公知の遺伝子転写物開始点から500bp以内に位置する標準プロモーターである、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子転写物開始点が、細胞型特定遺伝子、細胞接着遺伝子、細胞性免疫遺伝子、胃癌関連若しくは調節解除遺伝子、PRC2標的遺伝子又は転写因子の1種以上に関連する、請求項13に記載の方法。
- 前記遺伝子転写物開始点が癌遺伝子に関連する、請求項14に記載の方法。
- 前記遺伝子転写物開始点が、MYC、MET、CEACAM6、CLDN7、CLDN3、HOTAIR、PVT1、HNF4α、RASA3、GRIN2D、EpCAM及びそれらの組合せからなる群から選択される遺伝子に関連する、請求項13に記載の方法。
- 前記癌が胃癌又は結腸癌である、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のプロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが前記癌生体試料と前記非癌生体試料の両方に存在し、前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在しない、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のプロモーターが、遺伝子転写物開始点から500bpを超えて離れて位置する注釈のないプロモーターである、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌生体試料及び非癌生体試料中の前記少なくとも1種の選択的プロモーターの発現レベルを測定するステップであって、前記測定するステップがレポータープローブのデジタルプロファイリングを含む、ステップ、及び
前記レポータープローブの前記デジタルプロファイリングに基づいて、前記非癌生体試料と比較した前記少なくとも1種の選択的プロモーターの発現差異レベルを決定して、非癌生体試料と比較した前記癌生体試料中の少なくとも1種の選択的プロモーターの有無を確認するステップ
を更に含む、請求項18に記載の方法。 - 前記測定するステップがNanoString(商標)プラットホームを用いて行われる、請求項20に記載の方法。
- 対象における癌の予後を判定する方法であって、
前記対象から得られる癌生体試料をヒストン修飾H3K4me3及びH3K4me1に特異的な少なくとも1種の抗体と接触させるステップ、
H3K4me3とH3K4me1のシグナル比が1を超える核酸を前記癌生体試料から単離するステップであって、前記単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも1個の領域を含む、ステップ、
前記単離した核酸中のH3K4me3の信号強度を検出するステップ、及び
前記H3K4me3の信号強度を参照核酸配列中のH3K4me3の信号強度と比較した変化に基づいて、前記癌生体試料中の少なくとも1種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップ
を含み、
前記癌生体試料中の少なくとも1種の癌関連プロモーターの有無が、前記対象における前記癌の予後を示している、
方法。 - 前記少なくとも1種の癌関連プロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが前記癌生体試料と前記参照核酸配列の両方に存在し、前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在しない、請求項22に記載の方法。
- 前記癌試料中の前記少なくとも1種の選択的プロモーターの有無が、前記対象における癌生存の予後不良を示している、請求項23に記載の方法。
- 前記癌生体試料及び前記参照核酸配列における前記少なくとも1種の選択的プロモーターの発現レベルを測定するステップであって、前記測定するステップがレポータープローブのデジタルプロファイリングを含む、ステップ、及び
前記レポータープローブの前記デジタルプロファイリングに基づいて、前記非癌生体試料と比較した前記少なくとも1種の選択的プロモーターの発現差異レベルを決定して、前記参照核酸配列と比較した前記癌生体試料中の少なくとも1種の選択的プロモーターの有無を確認するステップ
を更に含む、請求項23に記載の方法。 - 前記測定するステップがNanoString(商標)プラットホームを用いて行われる、請求項25に記載の方法。
- 対象における癌を検出するためのバイオマーカーであって、前記バイオマーカーが、非癌生体試料と比較して癌生体試料におけるH3K4me3の信号強度が変化した少なくとも1種のプロモーターを含む、バイオマーカー。
- 前記少なくとも1種のプロモーターが、全プロモーター集団に比べてEZH2結合部位の増加を含む、請求項27に記載のバイオマーカー。
- 前記少なくとも1種のプロモーターが低メチル化されている、請求項27に記載のバイオマーカー。
- 前記少なくとも1種のプロモーターが高メチル化されている、請求項27に記載のバイオマーカー。
- 前記少なくとも1種のプロモーターが、遺伝子転写物開始点から500bp未満離れて位置する標準プロモーターである、請求項27に記載のバイオマーカー。
- 前記遺伝子転写物開始点が、細胞型特定遺伝子、細胞接着遺伝子、細胞性免疫遺伝子、胃癌関連若しくは調節解除遺伝子、PRC2標的遺伝子又は転写因子の1種以上に関連する、請求項31に記載のバイオマーカー。
- 前記遺伝子転写物開始点が癌遺伝子に関連する、請求項31に記載のバイオマーカー。
- 前記遺伝子転写物開始点が、MYC、MET、CEACAM6、CLDN7、CLDN3、HOTAIR、PVT1、HNF4α、RASA3、GRIN2D、EpCAM及びそれらの組合せからなる群から選択される遺伝子に関連する、請求項31に記載のバイオマーカー。
- 前記少なくとも1種のプロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが癌試料と非癌試料の両方に存在し、前記選択的プロモーターが癌試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが癌試料にのみ存在しない、請求項27に記載のバイオマーカー。
- 前記少なくとも1種のプロモーターが、遺伝子転写物開始点から500bpを超えて離れて位置する注釈のないプロモーターである、請求項27に記載のバイオマーカー。
- 細胞中の少なくとも1種の癌関連プロモーターの活性を調節する方法であって、EZH2の阻害剤を前記細胞に投与するステップを含む、方法。
- 癌に対する対象の免疫応答を調節する方法であって、前記対象にEZH2の阻害剤を投与するステップを含み、前記EZH2が前記対象における少なくとも1種の癌関連プロモーターに関連する、方法。
- 前記EZH2の阻害剤が免疫原性N末端ペプチドの発現を調節する、請求項38に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の癌関連プロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが癌試料と非癌試料の両方に存在し、前記選択的プロモーターが癌試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが癌試料にのみ存在しない、請求項38又は39に記載の方法。
- 前記選択的プロモーターが転写物変異体に関連し、前記転写物変異体がN末端タンパク質変異体をコードする、請求項40に記載の方法。
- 前記N末端タンパク質変異体が、N末端切断型タンパク質又はN末端長鎖タンパク質である、請求項41に記載の方法。
- 前記EZH2の阻害剤がsiRNA又は小分子である、請求項38から42のいずれか一項に記載の方法。
- EZH2の阻害剤がGSK126である、請求項38から43のいずれか一項に記載の方法。
- 非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも1種の癌関連プロモーターの有無を決定する方法であって、
前記癌生体試料をヒストン修飾H3K4me3及びH3K4me1に特異的な少なくとも1種の抗体と接触させるステップ、
H3K4me3とH3K4me1のシグナル比が1を超える核酸を前記癌生体試料から単離するステップであって、前記単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも1個の領域を含む、ステップ、
前記単離した核酸中のH3K4me3の信号強度を読み深度20Mで検出するステップ、及び
前記H3K4me3の信号強度を非癌生体試料中のH3K4me3の信号強度と比較した変化に基づいて、前記癌生体試料中の少なくとも1種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップ
を含む、方法。 - 細胞中の少なくとも1種の癌関連プロモーターの活性の調節に使用するためのEZH2の阻害剤。
- 細胞中の少なくとも1種の癌関連プロモーターの活性の調節のための医薬品の製造におけるEZH2の阻害剤の使用。
- 癌に対する対象の免疫応答の調節に使用するためのEZH2の阻害剤であって、前記EZH2が前記対象における少なくとも1種の癌関連プロモーターに関連する、阻害剤。
- 癌に対する対象の免疫応答の調節のための医薬品の製造におけるEZH2の阻害剤の使用であって、前記EZH2が前記対象における少なくとも1種の癌関連プロモーターに関連する、使用。
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