JP2019510814A

JP2019510814A - アルギン酸硫酸エステルおよびヒトパピローマウイルスによる疾患の予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるその使用

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Publication number: JP2019510814A
Application number: JP2018565449A
Authority: JP
Inventors: ▲華▼▲詩▼ 管; 世欣王; ▲偉▼ 王; 春霞李; ▲鵬▼▲麗▼ 李; 洪光王; 萱夏; ▲曉▼霜 ▲張▼
Original assignee: Marine Biomedical Research Institute Of Qingdao Co Ltd; Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Marine Biomedical Research Institute Of Qingdao Co Ltd; Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2016-03-03
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2019-04-18
Anticipated expiration: 2037-02-28
Also published as: EP3424512A4; WO2017148363A1; US20190343870A1; JP6661800B2; EP3424512B1; CN105748506A; EP3424512A1; US11213544B2; CN105748506B

Abstract

ヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって。前記アルギン酸硫酸エステルはアルギン酸のＣ２およびＣ３位に硫酸エステル基を導入した硫酸化多糖類化合物で、重量平均分子量が６〜１００ｋＤａで、ポリマンヌロン酸の含有量が５〜９５％で、ポリグルクロン酸の含有量が５〜９５％で、硫酸基置換度が５〜１５％である。
【選択図】図５

Description

本発明は、医薬の技術分野に関し、具体的に、アルギン酸硫酸エステルおよびヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるその使用に関する。

ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ、ＨＰＶ）は性交渉によって感染する、よく見られる病原体として、現代人の命を脅かす主なウイルスの一つである。ＨＰＶは１００超の種類があり、多くの病変につながり、そのうち、疾患を起こすのは主に高リスク群の１３種類と低リスク群の５種類である。高リスク群ＨＰＶの感染は一部の肛門・生殖器のような部位の腫瘍の発生とある程度関連し、中でも、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８型の長期感染はすでに子宮頸癌の発生の要因の一つと実証された。現在、ＨＰＶ対する特効薬が市販されておらず、ＨＰＶワクチンは主に性経験のない女性に適用される。そのため、新規な抗ＨＰＶ特効薬の研究・開発は非常に有意義である。

ＨＰＶの増殖は上皮細胞の分化に依存するため、体外では基本的に生存することができない。現在、偽型ウイルスの構成はＨＰＶ感染の模擬に最も有効な方法とされている。ＨＰＶは哺乳動物細胞においてカプシドタンパク質Ｌ１、Ｌ２を発現するが、この２種類のタンパク質は体外でウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅ、ＶＬＰ）に自己集合してウイルスゲノムまたは外因性遺伝子をパッケージングする能力を有し、天然ウイルスと構造および免疫原性が一致する偽型ウイルス（ＰｓＶ）になる。米国ＮＩＨのＢｕｃｋ教授らは国際的に権威ある雑誌「Journal of Virology，79(5)2839-2846，2005」でＰｓＶの非特異的にＤＮＡをパッケージングできる特性を利用し、ＨＰＶのＬ１、Ｌ２遺伝子のプラスミドをレポーター遺伝子のプラスミドとともに哺乳動物細胞に共形質移入し、レポーター遺伝子のプラスミドをパッケージングした偽型ウイルス粒子に組み立てることを報告した。当該方法によって構築される偽型ウイルスは、力価が高く、かつ試験の操作が簡単で、結果は信頼性がある。そのため、当該ＨＰＶ偽型ウイルスシステムはいま幅広く抗ＨＰＶワクチンおよび薬物の選別と同定に使用されている。また、ＨＰＶで形質転換された細胞、たとえばＨｅｌａ細胞やＣａｓｋｉ細胞などは、抗ＨＰＶ薬物の選別および薬効学的評価にも使用される。

子宮頸癌は最も見られる婦人科の悪性腫瘍の一つで、近年発症率が年々上昇し、発症の年齢が低くなってきた。研究では、子宮頸のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の持続感染または反復感染は子宮頸の上皮内腫瘍および子宮頸癌の主な危険因子であることが示され、近年子宮頸ＨＰＶ感染は幅広く注目され、大量の研究では、高リスク群ＨＰＶの感染は子宮頸の前癌病変および子宮頸癌の発生の要因で、女性の命と健康を大いに脅かすことが実証され、子宮頸癌の発生および再発を予防し、疾患の進行を阻止するにはＨＰＶを除去することが肝心である。ＨＰＶはエンベロープのない小ＤＮＡウイルスで、その発癌性の高さによって、高リスク群と低リスク群に分かれる。高リスク群はＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８などを含み、主にＣＩＮＩＩ、ＩＩＩおよび子宮頸癌を引き起こす。高リスク群ＨＰＶが子宮頸に感染すると、ウイルスＤＮＡがランダムに宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ、自己複製を抑制する発現断片のＥ２遺伝子が欠失し、Ｅ６、Ｅ７癌遺伝子が過剰発現し、Ｅ６、Ｅ７癌原タンパク質はそれぞれ宿主細胞における腫瘍抑制因子ｐ５３、ｐＲｂと結合し、腫瘍抑制因子を不活性化させる。癌原遺伝子が活性化し、癌抑制遺伝子が不活性化することで、子宮頸の上皮細胞が悪性転化する。長年の臨床研究で、ＨＰＶ感染は子宮頸癌および子宮頸の上皮内腫瘍の要因であることがすでに明らかになった。第２世代のハイブリッドキャプチャー（ＨＣＩＩ）は現在米国ＦＤＡによって認可された唯一のＨＰＶのＤＮＡ検出技術で、同時に１３種類のＨＰＶ高リスク群を検出することができ、遺伝子を増幅する必要がなく、陰性予測値が９９％と高い。

子宮頸ＨＰＶの予防・治療について、欧米などの先進国では予防性ワクチンが国の定期接種ワクチンは入っており、我が国でもＩＩ期臨床試験に入ったが、予防性ワクチンはすべての高リスク群ＨＰＶの種類に対応できず、かつすでに関連する型に感染した女性には治療作用がない。治療性ワクチンはＨＰＶに感染した人に使用され、まだ研究・開発中で、大規模で臨床に使用されていない。しかし、ワクチンの安全性や免疫原性などの問題は改善の余地がある。物理的治療および手術治療はＨＰＶウイルスに感染して子宮頸の前癌病変が発生した患者に適用されるが、手術後もＨＰＶの持続感染が存在する可能性がある。子宮頸ＨＰＶの治療に対する研究は主に抗ウイルス薬物、免疫増強剤および外用製剤の研究・開発に集中され、そして大きな突破が得られたが、実際に人体臨床試験に使用される時、効果が満足できず、臨床ではまだ有効な予防と治療の手段がない。子宮頸のＨＰＶ感染の薬物治療は通常インターフェロン、たとえば辛復寧（組替えヒトインターフェロン−α２ｂ陰道発泡カプセル）が使用され、理論上標的細胞における酵素活性を有する抗ウイルスタンパク質の生成を誘導することによって、ウイルス核酸の複製と転写を抑制するが、その治療効果と毒性・副作用ははまだ異論がある。

そのため、すぐ有効に感染者のＨＰＶウイルスを除去すると、異なる程度で子宮頸の上皮細胞の前癌病変および子宮頸癌を阻止することができる。しかし、現在、ＨＰＶ感染を治療する特効薬はまだない。

本発明は、ヒトパピローマウイルスによる病症を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用を提供し、実験によってアルギン酸硫酸エステルがＨＰＶ感染に強い抑制作用を有し、ヒトパピローマウイルスによる病症を予防および治療する薬物に開発する技術的将来性があることを証明した。

上記発明の目的を実現するために、本発明は以下の技術方案によって実現する。

本発明は、ヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用を提供する。

さらに、前記アルギン酸硫酸エステルはアルギン酸のＣ２およびＣ３位に硫酸エステル基を導入した硫酸化多糖類化合物で、重量平均分子量が６〜１００ｋＤａで、ポリマンヌロン酸の含有量が５〜９５％で、ポリグルクロン酸の含有量が５〜９５％で、硫酸基置換度が５〜１５％である。

さらに、前記アルギン酸硫酸エステルの製造方法は、反応器にホルムアミドを入れた後、ゆっくりクロロスルホン酸を入れ、そしてオリゴアルギン酸を入れ、オリゴアルギン酸とホルムアミドの質量比は１：４〜１２で、オリゴアルギン酸とクロロスルホン酸の質量比は１：１〜３で、上記成分を混合してなる混合物を５０〜９０℃で撹拌しながら１〜５ｈ反応させ、反応終了後、アルコールで沈殿させ、ろ過、洗浄し、沈殿を収集し、沈殿を水で溶解させた後、ゆっくり水酸化ナトリウム溶液を入れて塩に転化させ、ｐＨが８〜１０になるように溶液を調整し、溶液を活性炭素で脱色し、メタノールまたはエタノールで結晶を沈殿させ、乾燥して前記アルギン酸硫酸エステルを得る方法である。

さらに、前記ヒトパピローマウイルスによる病症は、子宮頸癌、尋常性疣贅、扁平疣贅、尖形コンジローム、食肉加工業者乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症、ボウエノイド丘疹症、喉頭乳頭腫およびコンジローマを含む。

さらに、前記アルギン酸硫酸エステルは、ＨＰＶ偽型ウイルスの侵入に対する強い抑制作用を有し、かつ投与量依存性を有し、前記アルギン酸硫酸エステルは４８ｈの作用後完全にＨＰＶ感染を抑制する作用を有する。

さらに、前記アルギン酸硫酸エステルは、ＨＰＶの発病要素であるＥ６遺伝子の発現に抑制作用を有する。

さらに、前記アルギン酸硫酸エステルは、ＨＰＶの病原タンパク質Ｅ６およびＥ７の発現に抑制作用を有する。

さらに、前記アルギン酸硫酸エステルは、水溶性基剤または脂溶性基剤と配合してアルギン酸硫酸エステルを含む外用剤形になり、前記剤形は膣坐剤、発泡坐剤、膣発泡カプセル、膣軟カプセル、膣発泡錠、ゲル剤および海綿坐剤を含む。

さらに、前記水溶性基剤はグリセロゼラチン、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンモノステアレート、ポロキサマーのうちの１種または複数種で、前記脂溶性基剤はカカオ脂、半合成または全合成脂肪酸グリセリドである。

さらに、前記アルギン酸硫酸エステルは、水溶性基剤または脂溶性基剤と配合してアルギン酸硫酸エステルを含む剤形になり、前記剤形は軟膏、リニメント剤、塗膜剤、クリーム剤、チンキ剤、ローション剤、パップ剤、スプレー剤及びエアゾール剤を含む。

さらに、前記剤形に、さらに、硬化剤、増稠剤、乳化剤、吸収促進剤、着色剤、酸化防止剤または防腐剤のうちの１種または複数種が添加されており、
前記硬化剤は白蝋、セチルアルコール、ステアリルアルコールのうちの１種または複数種から選ばれ、
前記増稠剤は水添ヒマシ油、グリセリンモノステアレート、ステアリン酸アルミニウムのうちの１種または複数種から選ばれ、
前記乳化剤は石けん、アラビアゴム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムのうちの１種または複数種から選ばれ、
前記吸収促進剤はツイン８０および／またはＡｚｏｎｅから選ばれ、前記着色剤はアマランス、洋紅、レモンイエロー、可溶性インジゴ、オレンジＧ、エオシン、フクシン、ブルー、スダンブルーのうちの１種または複数種から選ばれ、
前記酸化防止剤は亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、クエン酸、ｔ−ブチル−ｐ−ヒドロキシアニソール、ｔ−ブチル−ｐ−クレゾールのうちの１種または複数種から選ばれ、
前記防腐剤はパラベン類、安息香酸、ソルビン酸、エタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコールのうちの１種または複数種から選ばれる。

本発明の利点と技術効果は、アルギン酸硫酸エステルは褐藻由来のアルジネートから分解、化学修飾を経て得られる硫酸化多糖類薬物で、毒性・副作用が小さく、薬剤耐性が生じにくい。本発明は、細胞培養技術、偽型ウイルスモデル、免疫学技術および分子生物学技術を総合的に利用してアルギン酸硫酸エステルの抗ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の薬物効果を組織的観察を行ったが、その主な内容は（一）アルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ偽型ウイルスの侵入過程に対する抑制作用、（二）ＨＰＶで形質転換された子宮頸癌細胞でアルギン酸硫酸エステルのＨＰＶの複製に対する干渉作用である。実験結果から、（１）アルギン酸硫酸エステルは、ＨＰＶ偽型ウイルスの侵入過程に強い抑制作用を有し、かつ投与量に依存し、４８ｈの作用後完全にＨＰＶ感染を抑制する作用を有することが示された。（２）アルギン酸硫酸エステルは、ＨＰＶで形質転換されたＨｅｌａ細胞とＣａｓｋｉ細胞のいずれにおけるウイルスのＥ６遺伝子の発現にも抑制作用を有し、かつ投与量に依存し、（３）アルギン酸硫酸エステルは、ＨＰＶで形質転換されたＨｅｌａ細胞とＣａｓｋｉ細胞のいずれにおけるウイルスのＥ６とＥ７タンパク質の発現にも抑制作用を有し、かつ投与量に依存する。

このように、本発明は組織的科学実験によって前記アルギン酸硫酸エステルは抗ヒトパピローマウイルスの薬物および健康食品に開発することができ、優れた市場の将来性があることが証明された。

前記アルギン酸硫酸エステルのＨｅｌａ細胞とＣａｓｋｉ細胞に対する毒性の検出結果である。２９３Ｔ／１７細胞におけるＨＰＶ１６および１８の外被プラスミドとＧＦＰレポータープラスミドとの共形質移入である。ＨＰＶ１６および１８の偽型ウイルス粒子の透過型電子顕微鏡写真である。インターフェロン、カラギーナンのＨＰＶ１６偽型ウイルス粒子の感染に対する抑制作用である。前記アルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ偽型ウイルスの感染に対する抑制作用の投与量と効果の関係である。前記アルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ偽型ウイルスの感染に対する抑制作用の時間と効果の関係である。前記アルギン酸硫酸エステルのＨＰＶのＥ６遺伝子の発現に対する抑制作用である。前記アルギン酸硫酸エステルのＨＰＶのＥ６とＥ７タンパク質の発現に対する抑制作用である。

以下、図面および具体的な実施例を合わせて本発明の技術方案をさらに詳しく説明する。

［一．アルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ偽型ウイルスの侵入過程に対する抑制作用］
（一）２９３Ｔ／１７細胞およびＨｅｌａ／Ｃａｓｋｉ細胞：
２９３Ｔ／１７細胞はレンチウイルスで形質転換された胚胎腎臓細胞で、ＳＶ４０ウイルスのＴ抗原を構成的に発現することができ、本発明においてパッケージング細胞系として使用された。ＨｅＬａ細胞は正常の子宮頸細胞がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ１８）で形質転換された癌細胞で、本発明においてＨＰＶ偽型ウイルスの侵入対象とされた。２９３Ｔ／１７細胞にＨＰＶカプシドタンパク質のプラスミドを形質移入してから４８時間後、細胞を分解させて偽型ウイルスの粗製液を収集し、精製してＨＰＶ偽型ウイルス粒子を得た。ＨＰＶ偽型ウイルス粒子でＨｅｌａ細胞に侵入させ、同時に薬物を入れて処理することによって、薬物のウイルスの侵入過程に対する抑制作用を確認した。

（二）被験薬物および薬物投与量の決定：
本発明に係るアルギン酸硫酸エステルはオリゴアルギン酸のＣ２およびＣ３位に硫酸エステル基（−ＯＳＯ_３−）を導入した硫酸化多糖類化合物で、重量平均分子量が６〜１００ｋＤａで、ポリマンヌロン酸（Ｍ断片）の含有量が５〜９５％で、ポリグルクロン酸（Ｇ断片）の含有量が５〜９５％で、硫酸基置換度が５〜１５％である。

本実施例で使用されたアルギン酸硫酸エステルの調製方法は具体的に以下の通りである。スルホン化オートクレーブに５００ｋｇのホルムアミドを入れ、ゆっくり１３５ｋｇのクロロスルホン酸を滴下し、酸の滴下が終了後５０ｋｇのオリゴアルギン酸を入れ、続いて７０℃に昇温させ、３ｈ反応させた。反応終了後、アルコールで沈殿させ、沈殿を洗浄し、沈殿を水で溶解させ、ゆっくり水酸化ナトリウム溶液を滴下して転化させ、ｐＨが８に低下したら、活性炭素で脱色し、アルコールで結晶を沈殿させてアルギン酸硫酸エステルを得た。

その調製過程の反応式は以下の通りである。

薬物投与量の決定は衛生と計画生育委員会の「新薬（西洋薬）臨床前指導原則集（薬学、薬理学、毒理学）》」の規定に従い、まず薬物のＨｅｌａ細胞およびＣａｓｋｉ細胞に対する毒性を確認し、無毒性濃度（ＴＤ５０）を算出し、無毒性濃度から２倍希釈で得られる５つの濃度の薬液で抗ウイルス実験を行った。試験は、まず適量のアルギン酸硫酸エステルを取って培地で１００ｍｇ／ｍｌにし、Ｈｅｌａ細胞またはＣａｓｋｉ細胞を接種して２４時間後、それぞれ１０、５、２．５、１．２５、０．６２５ｍｇ／ｍｌの計５つの作用最終濃度に希釈し、９６ウェルプレートに入れ、各濃度に３ウェルずつで、別途に無薬物細胞対照を設け、３７℃で４８時間インキュベートした後、顕微鏡で細胞の病変を観察し、そしてＭＴＴ法で生存細胞数を評価し、各濃度の薬物の細胞増殖に対する抑制率を計算し、ＲｅｅｄＭｅｕｅｎｃｈ法で半数中毒濃度（ＴＤ_５０）を計算し、無毒性投与量（ＴＤ_０）を決定した。

TD₅₀=Antilog[B+(50−＜50％抑制百分率) × C/(＞50％抑制百分率-＜50％抑制百分率)]
（A=log>50％抑制百分率 B=log<50％抑制百分率 C=A-B）
結果を図１に示す。試験を３回繰り返したところ、前記アルギン酸硫酸エステルのＨｅｌａ細胞に対する平均半数中毒濃度は４．０４４ｍｇ／ｍｌで、最大無毒性投与量は０．５ｍｇ／ｍｌで、アルギン酸硫酸エステルのＣａｓｋｉ細胞に対する平均半数中毒濃度は８．４７３ｍｇ／ｍｌであった。

（三）実験方法および結果：
１．２９３Ｔ／１７細胞およびＨｅｌａ／Ｃａｓｋｉ細胞の培養：
細胞がコンフルエントに生長した培養瓶に０．２５％パンクレアチンを入れ、３７℃で１分間消化させ、培地を入れて軽く混ぜ、１：３で希釈して継代し、２日コンフルエントになり、細胞カウンターに入れ、１０万個細胞／ｍＬに調製し、細胞培養プレートに接種し、９６ウェルプレートは各ウェルに０．１ｍｌずつで、６ウェルプレートは各ウェルに１ｍｌずつで、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養し、細胞が単層に生長したら実験を行った。

２．プラスミドの形質移入およびＨＰＶ偽型ウイルス粒子の獲得：
あらかじめ７５ｃｍ^２の培養瓶に７百万の２９３Ｔ／１７細胞を敷き、１６時間後形質移入させた。細胞が４０％程度のコンフルエントになった時、形質移入を行うことが好ましい。まず、３８μｇＨＰＶカプシドタンパク質プラスミドとＧＦＰレポータープラスミを２ｍｌＯｐｔｉＭＥＭに混合し、別途に８５μｌリポソームＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を２ｍｌＯｐｔｉＭＥＭに混合した。それぞれ室温で１０分間インキュベートした後、相応するＤＮＡおよびリポソームを混合し、さらに室温で２０分間以上インキュベートした。そのままＤＮＡ−リポソームの混合液を細胞に入れ、３７℃で一晩インキュベートした。２日目の朝、新鮮なＤＭＥＭ培地に替え、注意して軽く培養瓶の細胞のない側から２０ｍｌの培地を入れた後、３７℃で続いて３０時間培養し、形質移入後の全過程は４８ｈであった。形質移入から４８時間後細胞を収集し、溶液に１／２０体積の１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最終体積０．５％）を添加し、０．１％Ｂｅｎｚｏｎａｓｅおよび０．１％ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ試薬を添加した。その後、この細胞分解液を３７℃で２４時間熟成させ、最後に細胞分解液を分けて−８０℃で冷凍保存して使用に備えた。

偽型ウイルスの組立具合および収集されたウイルス粒子の具体的な構造を確認するために、透過型電子顕微鏡でその微細構造を観察した。ＨＰＶは正２０面体で、直径は４５〜５５ｎｍで、エンベロープでパッケージングされていない。図３に示すように、Ｐ１６またはＰ１８をＧＦＰとともに組み立てた後の粒子の直径は約４５ｎｍで、天然のウイルス粒子に基本的に近く、Ｌ１とＬ２で成熟のウイルス粒子を組み立てることができることが説明された。

３．ＨＰＶ偽型ウイルス感染モデルの構築：
Ｈｅｌａ細胞を１０万個細胞／ｍＬで９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養し、１００倍に希釈されたＨＰＶ偽型ウイルス粒子混合液をＨｅｌａ細胞に５０μｌ入れ、同時に無毒性濃度から２倍希釈で得られた５つの濃度（１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５、７．８μｇ／ｍｌ）のアルギン酸硫酸エステル薬液を入れ、各濃度に３ずつで、そしてウイルス対照ウェルを設け、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した。その後、培養液を捨て、ＰＢＳで２回洗浄した。そのまま蛍光顕微鏡で観察し、投与群とブランク対照群の細胞蛍光値の強さを比較し、そして撮影してＩｍａｇｅＪソフトで陽性細胞数（Ｎ）および平均光密度値（ＡＯＩ）を分析し、両者を掛け算して相対感染総量（ＲＡ＝Ｎ×ＡＯＩ）を得、感染抑制率（％）を計算した。
ＨＰＶの感染抑制率＝（ＲＡ_対照−ＲＡ_サンプル）／ＲＡ_対照

陽性薬物のインターフェロンα／２ｂおよび化合物のカラギーナンを対照として使用した。結果は図４に示すように、ウイルス群では蛍光信号が強く、陽性薬物のＩＦＮ−α／２ｂ（２．４ｍｇ／ｍｌ，３×１０^６Ｕ）を入れた後、蛍光強度が弱くなり、ＩＦＮ−α／２ｂが偽型ウイルスの発現を抑制したことが説明された。Ｉｏｔａ−カラギーナン（１００μｇ／ｍｌ）を入れた後蛍光強度が顕著に弱くなった。カラギーナンは現在報告されたＨＰＶ偽型ウイルス粒子を抑制する強力な化合物であるため、ＨＰＶ偽型ウイルス感染モデルの構築に成功し、糖類化合物の選別に適することが十分に説明された。

４．アルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ偽型ウイルスの感染に対する抑制作用の投与量と効果の関係の研究：
Ｈｅｌａ細胞を１０万個細胞／ｍＬで９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養し、１００倍に希釈されたＨＰＶ偽型ウイルス粒子混合液をＨｅｌａ細胞に５０μｌ入れ、同時に異なる濃度のアルギン酸硫酸エステル（７．８〜１２５μｇ／ｍｌ）を入れ、ＨＰＶ偽型ウイルス侵入に対するその抑制作用を研究したが、各濃度に３ずつで、そしてウイルス対照ウェルを設け、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。その後、培養液を捨て、ＰＢＳで２回洗浄した。そのまま蛍光顕微鏡で観察し、投与群とブランク対照群の細胞蛍光値の強さを比較した。

実験結果から、濃度が３１．２５μｇ／ｍｌ以上の場合アルギン酸硫酸エステルはほとんど完全にＧＦＰ蛍光の発現が抑制され、７．８μｇ／ｍｌの場合まだ蛍光の発現が抑制されたが、陽性細胞数の変化が大きくなかったことが示された。これによってアルギン酸硫酸エステルがＨＰＶ１６偽型ウイルス粒子の侵入過程に対して強い抑制作用を示し、低い濃度（１５．６２５μｇ／ｍｌ）でもその抑制率が７３．８％と高かったことが説明された。結果は図５および表１−１に示すようである。

４．アルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ偽型ウイルスの感染に対する抑制作用の時間と効果の関係の研究：
Ｈｅｌａ細胞を１０万個細胞／ｍＬで９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養し、１００倍に希釈されたＨＰＶ偽型ウイルス粒子混合液をＨｅｌａ細胞に５０μｌ入れ、同時に２５０μｇ／ｍｌのアルギン酸硫酸エステル薬液を入れ、各濃度に３ずつで、そしてウイルス対照ウェルを設け、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターでそれぞれ２４、４８、７２、９６時間培養した。その後、培養液を捨て、ＰＢＳで２回洗浄した。２００μＬＰＢＳを入れてそのまま蛍光顕微鏡で観察し、投与群とブランク対照群の細胞蛍光値の強さを比較した。

実験結果は図６に示すように、２４ｈではＧＦＰ蛍光が発現されなかった以外、アルギン酸硫酸エステル（２５０μｇ／ｍｌ）は４８、７２、９６時間のいずれでもＨＰＶ１６偽型ウイルス粒子感染過程に対する強い抑制作用を示し、抑制率が１００％と高く、かつ薬物効果が低下するという現象がなかった。これによってアルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ感染に対する抑制作用は主にウイルス感染の早期で生じ、かつ治療効果が長持ちすることが説明された。

［二．ＨＰＶで形質転換された子宮頸細胞を利用したアルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ複製に対する干渉作用の測定］
（一）子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞とＣａｓｋｉ細胞：
ＨＰＶ１８で形質転換されたＨｅｌａ細胞とＨＰＶ１６で形質転換されたＣａｓｋｉ細胞はいずれもＨＰＶのＥ６とＥ７タンパク質を発現することができる。Ｈｅｌａ細胞とＣａｓｋｉ細胞の培養過程において異なる濃度の被験薬物を入れ、異なる培養時間の細胞を収集して分解させた後、細胞におけるＥ６遺伝子の全ＲＮＡを抽出して半定量ＲＴ−ＰＣＲを行ってアルギン酸硫酸エステルのＨＰＶのＥ６遺伝子の発現に対する抑制作用を検出し、細胞を分解させた後、ウエスタンブロットを行ってアルギン酸硫酸エステルのＨＰＶのＥ６とＥ７タンパク質の発現に対する抑制作用を検出することによって、薬物のウイルス複製に対する干渉効果を確認した。

（二）実験方法および結果：
１．Ｈｅｌａ細胞とＣａｓｋｉ細胞の培養：
Ｈｅｌａ細胞またはＣａｓｋｉ細胞がコンフルエントに生長した培養瓶に０．２５％パンクレアチンを入れ、３７℃で３〜５分間消化させ、培地を入れて混ぜ、１：３で希釈して継代し、２日コンフルエントになり、細胞カウンターに入れ、１０万個細胞／ｍＬに調製し、細胞培養プレートに接種し、９６ウェルプレートは各ウェルに０．１ｍｌずつで、６ウェルプレートは各ウェルに１ｍｌずつで、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養し、細胞が単層に生長したら実験を行った。

２．薬物のＨｅｌａ細胞とＣａｓｋｉ細胞の培養におけるＨＰＶのＥ６遺伝子の発現に対する抑制作用：
（１）Ｈｅｌａ細胞とＣａｓｋｉ細胞におけるＨＰＶのＲＮＡ抽出：
１０万個細胞／ｍＬで６ウェルプレートに１ｍｌ／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養し、無毒性濃度から２倍希釈で得られた３つの濃度（０．５、０．２５、０．１２５μｇ／ｍｌ）のアルギン酸硫酸エステル薬液を入れ、各濃度に３ずつで、そして細胞対照ウェルＭを設け、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した。その後、培養液を捨て、ＰＢＳで２回洗浄した。各ウェルにＴｒｉｚｏｌを約２ｍｌずつ入れ、十分に均質化させ、室温で５ｍｉｎ置き、完全に分解させた。４℃で１２，０００ｒｍｐで５ｍｉｎ遠心し、上清を吸い取り、未分解の沈殿を捨てた。Ｔｒｉｚｏｌ細胞分解液１ｍｌあたりに２００μｌのクロロホルムを入れ、逆さにして十分に混合した後室温で１５ｍｉｎ置いた。４℃で１２，０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心した。上層の水相を吸い取ってＤＥＰＣ水処理された無ＲＮａｓｅのｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心管に置いた。１：１の比率で水相とイソプロパノールを均一に混合し、室温で５〜１０ｍｉｎ置いた。４℃で１２，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、ＲＮＡが管底に沈殿した。１ｍｌの７０％エタノールを入れ、温和に振とうして沈殿を懸濁させた。４℃で８，０００ｒｍｐで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨てた。室温で５〜１０ｍｉｎ干し、水相のイソプロパノール沈殿１ｍｌあたりに２０μｌＤＥＰＣ水でＲＮＡを溶解させた。−８０℃の低温冷蔵庫で冷凍保存した。

（２）アルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ形質転換細胞におけるＥ６遺伝子の作用の半定量ＲＴ−ＰＣＲ検出：
抽出された全ＲＮＡを逆転写させ、ＯｌｉｇｏｄＴを逆転写プライマーとして使用し、反応系は２０μｌ（４μｌの５×ＲＴＢｕｆｆｅｒ、１μｌのＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘＩ，１μｌのＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ（５０ｕＭ）、５μｌの全ＲＮＡ、９μｌの無ＲＮＡ酵素を含む水）で、逆転写条件は３７℃、１５ｍｉｎ、９４℃、１０ｓであった。その後、ＰＣＲ反応を行い、プライマーは上海生工合成のＨＰＶのＥ６遺伝子に対する特異的プライマーで、反応系は３０μｌ（３μｌの１０×ＰｙｒｏｂｅｓｔＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、２．５μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．６μｌずつのＥ６遺伝子の上流と下流のプライマー（２０ｍＭ）、３μｌの逆転写ｃＤＮＡ産物、０．３μｌのＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ、２０μｌの無菌水を含む）であった。ＰＣＲ増幅循環条件は、９４℃で２ｍｉｎ、３０サイクルの９４℃で４０ｓ、５４℃で４０ｓ、７２℃で４０ｓの反応を行い、７２℃で２ｍｉｎ伸長させた。ＲＴ−ＰＣＲ増幅後、Ｅ６を目的遺伝子とし、β−アクチンを内部参照とし、アガロースゲル電気泳動によってＥ６の遺伝子レベルにおける変化を検出し、そして定量分析を行った。ソフトによってＤＮＡに対して半定量を行い、ブランク対照のＥ６／アクチン比を１とし、その後各投与ウェルのＥ６／アクチンをそれぞれ対照ウェル（比が１である）と比較し、最終に各投与濃度のＥ６遺伝子の相対発現レベル（ＲＦ）を得、抑制率を計算した。
ＨＰＶのＥ６遺伝子発現抑制率＝（ＲＦ_対照−ＲＦ_サンプル）／ＲＦ_対照

実験結果を図７および表１−２に示す。実験結果から、アルギン酸硫酸エステルの各薬物群のいずれでもＨｅｌａ細胞におけるＨＰＶ１８の主な発病要素であるＥ６遺伝子発現に対する抑制作用を示し、高投与量（０．５ｍｇ／ｍｌ）群で抑制率が最高の８５％で、中投与量（０．２５ｍｇ／ｍｌ）群でその次の７４％で、アルギン酸硫酸エステルの低投与量（０．１２５ｍｇ／ｍｌ）群でＣａｓｋｉ細胞におけるＨＰＶ１６のＥ６遺伝子発現に対する抑制作用が最高の７０％で、高投与量（０．５ｍｇ／ｍｌ）群でその次の４８％であった。

４．薬物のＨｅｌａ細胞とＣａｓｋｉ細胞の培養におけるＨＰＶのＥ６とＥ７タンパク質の発現に対する抑制作用：
１０万個細胞／ｍＬで６ウェルプレートに１ｍｌ／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養し、２倍希釈で得られた３つの濃度（１．０、０．５、０．２５μｇ／ｍｌ）のアルギン酸硫酸エステル薬液を入れ、各濃度に３ずつで、そして細胞対照ウェルＭを設け、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した。その後、培養液を捨て、ＰＢＳで２回洗浄した。ＲＩＰＡ細胞分解液を氷浴において３０ｍｉｎ分解させ、細胞分解液を１．５ｍｌ遠心管に収集して４℃、１０，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して沈殿を除去し、上清を２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ仕込み緩衝液と混合した後沸騰水浴で５ｍｉｎ置き、冷却後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離した。その後ウエスタンブロット方法によってＨＰＶのＥ６とＥ７タンパク質の発現状況を検出したが、β−アクチンを内部参照とした。ＩｍａｇｅＪソフトによってタンパク質バンドに対して半定量を行い、ブランク対照のＥ６／アクチン比またはＥ７／アクチン比を１とし、その後各投与ウェルの比をそれぞれ対照ウェル（比が１である）と比較し、最終に各投与濃度のＥ６とＥ７タンパク質の相対発現レベル（ＲＬ）を得、抑制率を計算した。
ＨＰＶのＥ６またＥ７タンパク質発現抑制率＝（ＲＬ_対照−ＲＬ_サンプル）／ＲＬ_対照

実験結果は図８および表１−３に示すように、アルギン酸硫酸エステルの各薬物群のいずれでもＨＰＶの主な病原タンパク質であるＥ６のタンパク質発現に対する抑制作用を示し、１．０ｍｇ／ｍｌ投与量群で抑制率が最高の８６％で、中投与量（０．５ｍｇ／ｍｌ）群でその次の６５％で、アルギン酸硫酸エステルの高投与量（１．０ｍｇ／ｍｌ）群でＨＰＶのＥ７タンパク質発現に対する抑制作用を示し、抑制率が２２％であった。

本実施例は、実験によってアルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ偽型ウイルスの侵入過程に対する抑制作用およびアルギン酸硫酸エステルのＨＰＶ形質転換細胞培養における抗ＨＰＶ作用が証明され、アルギン酸硫酸エステルが抗ヒトパピローマウイルスの作用を有することが証明され、下記表に示すように、ヒトパピローマウイルスによる病症は表１−４に示すように、ヒトパピローマウイルスが子宮頸癌、尋常性疣贅、扁平疣贅、尖形コンジローム、食肉加工業者乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症、喉頭乳頭腫やコンジローマなどの病症を予防および治療する将来性があることが説明された。

［アルギン酸硫酸エステル坐剤の調製］
アルギン酸硫酸エステル坐剤の調製の原料は前記アルギン酸硫酸エステルの粉末、半合成脂肪酸グリセリドおよびグリセリンであった。具体的な調製工程は以下の通りである。

アルギン酸硫酸エステルと基剤を粉砕して１００メッシュの篩を通させ、基剤を水浴条件で溶融させた後、アルギン酸硫酸エステルを入れ、均一に撹拌した。温度を４０℃以下に低下させ、モデルに注ぎ、冷却して硬化させた後、溢れた部分をナイフで削り、坐剤モデルを開け、押し出して得た。

［アルギン酸硫酸エステル発泡坐剤の調製］
アルギン酸硫酸エステル発泡坐剤の調製の原料は前記アルギン酸硫酸エステルの粉末、ポリオキシエチレンステアレート、炭酸水素ナトリウム、流動パラフィンであった。具体的な調製工程は以下の通りである。

すべての補助剤を１０５℃で２ｈ乾燥し、細かく研磨して８０メッシュの篩を通させた。ポリオキシエチレンステアレートを取って８０℃恒温水浴に入れ、それを溶融させた後アルギン酸硫酸エステルを入れ、十分に均一に撹拌した後、発泡剤を入れて均一に混合し、さらに坐剤モデルに流動パラフィンを塗布し、上記混合物を熱いうちにモデルに注ぎ、それを十分に冷却した後溢れた部分を切り捨て、モデルから出して得た。

本発明は、試験データによって前記アルギン酸硫酸エステルが６〜１８ｋＤａの範囲内でいずれもＨＰＶ感染を抑制する作用を有することが証明され、試験によってアルギン酸硫酸エステルがヒトパピローマウイルスによる病症を治療する場合、その機能遺伝子が硫酸化されたＭ断片およびＧ断片で、大分子量のアルギン酸硫酸エステルは機能基の硫酸化Ｍ断片およびＧ断片段のオーバーラップ単位の増加であるため、アルギン酸硫酸エステルが１８〜１００ｋＤａの範囲内でもヒトパピローマウイルスによる病症を治療する作用を有することが証明された。

このように、アルギン酸硫酸エステルは顕著に高リスク群ＨＰＶウイルスの存在量、子宮頸の臨床症状を完全し、子宮頸ＨＰＶ感染を治療する効果が顕著で、臨床における使用が安全で信頼性があり、毒性・副作用がなく、坐剤またはクリーム剤に開発して子宮頸癌および様々な皮膚疣贅の治療に使用することができる。

以上の実施例は本発明の技術方案を説明するためのもので、それを制限するものではない。前記実施例を参照して本発明を詳しく説明したが、当業者にとって、前記実施例に記載された技術方案に対して変更し、あるいはその一部の技術特徴に対して同等の入れ替えを行うことできるが、これらの変更または入れ替えは、相応する技術方案の本質を本発明で保護を要求される技術方案の趣旨と範囲を超えることはない。

Claims

ヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用。
請求項１に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記アルギン酸硫酸エステルはアルギン酸のＣ２およびＣ３位に硫酸エステル基を導入した硫酸化多糖類化合物で、重量平均分子量が６〜１００ｋＤａで、ポリマンヌロン酸の含有量が５〜９５％で、ポリグルクロン酸の含有量が５〜９５％で、硫酸基置換度が５〜１５％であることを特徴とする、使用。
請求項２に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記アルギン酸硫酸エステルの製造方法は、反応器にホルムアミドを入れた後、ゆっくりクロロスルホン酸を入れ、そしてオリゴアルギン酸を入れ、オリゴアルギン酸とホルムアミドの質量比は１：４〜１２で、オリゴアルギン酸とクロロスルホン酸の質量比は１：１〜３で、上記成分を混合してなる混合物を５０〜９０℃で撹拌しながら１〜５ｈ反応させ、反応終了後、アルコールで沈殿させ、ろ過、洗浄し、沈殿を収集し、沈殿を水で溶解させた後、ゆっくり水酸化ナトリウム溶液を入れて塩に転化させ、ｐＨが８〜１０になるように溶液を調整し、溶液を活性炭素で脱色し、メタノールまたはエタノールで結晶を沈殿させ、乾燥して前記アルギン酸硫酸エステルを得る方法であることを特徴とする、使用。
請求項１に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記ヒトパピローマウイルスによる病症は、子宮頸癌、尋常性疣贅、扁平疣贅、尖形コンジローム、食肉加工業者乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症、ボウエノイド丘疹症、喉頭乳頭腫およびコンジローマからなる群より選択されることを特徴とする、使用。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記アルギン酸硫酸エステルは、ＨＰＶ偽型ウイルスの侵入に対する強い抑制作用を有し、かつ投与量依存性を有し、前記アルギン酸硫酸エステルは４８ｈの作用後完全にＨＰＶ感染を抑制する作用を有することを特徴とする、使用。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記アルギン酸硫酸エステルは、ＨＰＶの発病要素であるＥ６遺伝子の発現に抑制作用を有することを特徴とする、使用。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記アルギン酸硫酸エステルは、ＨＰＶの病原タンパク質Ｅ６およびＥ７の発現に抑制作用を有することを特徴とする、使用。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記アルギン酸硫酸エステルは、水溶性基剤または脂溶性基剤と配合してアルギン酸硫酸エステルを含む外用剤形になり、前記剤形は膣坐剤、発泡坐剤、膣発泡カプセル、膣軟カプセル、膣発泡錠、ゲル剤および海綿坐剤からなる群より選択されることを特徴とする、使用。
請求項８に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記水溶性基剤はグリセロゼラチン、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンモノステアレート、ポロキサマーのうちの１種または複数種で、前記脂溶性基剤はカカオ脂、半合成または全合成脂肪酸グリセリドであることを特徴とする、使用。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記アルギン酸硫酸エステルは、水溶性基剤または脂溶性基剤と配合してアルギン酸硫酸エステルを含む製剤を形成し、前記製剤は、軟膏、リニメント剤、塗膜剤、クリーム剤、チンキ剤、ローション剤、パップ剤、スプレー剤及びエアゾール剤からなる群より選択されることを特徴とする、使用。
請求項８または１０に記載のヒトパピローマウイルスによる疾患を予防および治療する薬物と健康食品の製造におけるアルギン酸硫酸エステルの使用であって、前記剤形に、さらに、硬化剤、増稠剤、乳化剤、吸収促進剤、着色剤、酸化防止剤および防腐剤からなる群より選択される１種または複数種が添加されており、
前記硬化剤は白蝋、セチルアルコール、およびステアリルアルコールからなる群より選択される１種または複数種であり、
前記増稠剤は水添ヒマシ油、グリセリンモノステアレート、およびステアリン酸アルミニウムからなる群より選ばれる１種または複数種であり、
前記乳化剤は石けん、アラビアゴム、およびアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される１種または複数種であり、
前記吸収促進剤はツイン８０および／またはＡｚｏｎｅから選ばれ、前記着色剤はアマランス、洋紅、レモンイエロー、可溶性インジゴ、オレンジＧ、エオシン、フクシン、ブルー、およびスダンブルーからなる群より選ばれる１種または複数種であり、
前記酸化防止剤は亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、クエン酸、ｔ−ブチル−ｐ−ヒドロキシアニソール、およびｔ−ブチル−ｐ−クレゾールからなる群より選択される１種または複数種であり、
前記防腐剤はパラベン類、安息香酸、ソルビン酸、エタノール、ベンジルアルコール、およびフェネチルアルコールからなる群より選択される１種または複数種であることを特徴とする、使用。