JP2019506150A - 改善されたタンパク質発現株 - Google Patents

Abstract

本発明は、所望のタンパク質を産生するための、改良された宿主株を提供する。
【選択図】なし

Description

本願は米国特許仮出願第６２／２７０７６２号（２０１５年１２月２２日出願）及び米国特許仮出願第６２／２７８７２８号（２０１６年１月１４日出願）に基づく優先権の利益を主張する。また、本願は欧州特許出願第１６１５２９７７．１号（２０１６年１月２７日出願）に基づく優先権の利益も主張する。前記各出願はその内容全体が引用により本願に組み込まれる。

本願は紙媒体及びコンピューター読み取り可能な形態の配列表を含む。斯かる紙媒体及びコンピューター読み取り可能な形態の配列表は、本願明細書の一部であり、或いは引用により本願に組み込まれる。

本発明は主に、親株よりも実質的に高いレベルでタンパク質を発現する真菌株の開発に関する。

約３０年もの間、所望の異種タンパク質は微生物により産生されてきた。しかし、必要なコーディング配列を導入して発現を得たとしても、商業生産用にプロセスを最適化するためには、まだ達成すべきことが多く残っている。関心を集める領域の１つとして、株の改善、即ち、タンパク質をより高い収量又はより良い純度で産生できる宿主微生物の株の探索又は作製が挙げられる。

産生量を向上する上で、良好な発現系を設計したら、次はコーディング配列のコピー数を増加させ、或いはｍＲＮＡの量又は安定性を上昇させ、或いはタンパク質の折り畳み及び／又は分泌を向上させ、或いはタンパク質の分解を低減するべく試みるであろう。しかし、所望される発現増強の効果がみられるのは、阻害因子を標的とした場合のみである。

従って必要となるのは、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質の産生量の増加を可能とする宿主株である。本発明者等は、驚くべきことに、Ｎｏｔ４（別名ＭＯＴ２）を変異させることで、斯かる産生量の増大が達成されることを見出した。

Ｎｏｔ４はユビキチン連結酵素であり、Ｃｃｒ４−Ｎｏｔ複合体の一部である。Ｃｃｒ４−Ｎｏｔ複合体は真核細胞において保存されており、酵母では本複合体は９つのコアサブユニット：Ｃｃｒ４、Ｃａｆ１、Ｃａｆ４０、Ｃａｆ１３０、Ｎｏｔ１、Ｎｏｔ２、Ｎｏｔ３、Ｎｏｔ４、及びＮｏｔ５からなる（Collart, 2003, Global control of gene expression in yeast by the Ccr4-Not complex. Gene 313: 1-16; Bai et al., 1999, The CCR4 and Caf1 proteins of the Ccr4-Not complex are physically and functionally separated from Not2, Not4, and Not5. Mol. Cell. Biol. 19: 6642-6651）。本複合体が環境からシグナルを識別すると共に、あらゆるレベルの遺伝子発現を纏め上げて、斯かるシグナルに効率的に反応するための、中心的な交換機として機能すると考えられている（Collart, 2012, The Ccr4-Not complex.遺伝子 492(1): 42-53）。Ｎｏｔタンパク質（Ｎｏｔ１、Ｎｏｔ２、Ｎｏｔ３、Ｎｏｔ４）は、転写調節への広範な関与が推測されるＲＮＡポリメラーゼII複合体の構築に必要であると考えられている（Collart, 1994, Not1(cdc39), Not2(cdc36), Not3, and Not4 encode a global-negative regulator of transcription that differentially affects tata-element utilization. Genes & Development 8(5): 525-537; Collart, 2012, 上述）。

最近では共結晶構造から、Ｃｃｒ４−Ｎｏｔ複合体の骨格タンパク質であるＮｏｔ１のＨＥＡＴ繰り返し領域に、Ｎｏｔ４のＣ末端領域が巻き付いている様子が示唆されている（Bhaskar, 2015, Architecture of the ubiquitylation module of the yeast Ccr4-Not complex. Structure 23(5): 921-8）。

本発明は、
ａ．改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、又は
ｂ．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベル、又は
ｃ．改変されたＮｏｔ４遺伝子又はそのホモログ、又は
ｄ．Ｎｏｔ４遺伝子又はそのホモログの改変された発現レベル
を有する真菌宿主細胞を提供する。

また、本発明は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む真菌宿主細胞の培養物であって、当該真菌宿主細胞がＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された活性レベルを有することを特徴する、培養物を提供する。

更に、本発明は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質を、真菌宿主細胞により産生する方法を提供する。

本発明は、真菌宿主細胞による所望のポリペプチドの産生量を改変する方法を提供する。

また、本発明は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質を提供する。所望のタンパク質としては、アルブミン、或いはその変異体、断片、及び／又は融合体が好ましい。

更に、本発明は、斯かる所望のタンパク質を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。

また、本発明は、患者を治療する方法であって、斯かる組成物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。

更に、本発明は、真菌宿主細胞を調製する方法を提供する。

また、本発明は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログであって、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を含むと共に、配列番号２の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０から選択される１又は２以上の位置に対応する位置に、変異を含むＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを提供する。

更に、本発明は、本発明のＮｏｔ４変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

本明細書に記載の態様は、実施例及び／又は好適な態様の欄にのみ記載されたものも含め、他の任意の態様と組み合わせることが可能である。但し、斯かる組合せが不適切である旨を明示した場合を除く。

図１は、２０種のアミノ酸の分類及び相互関係を示すベン図である。 図２は、プラスミドｐＤＢ５４３８の構成を示す。 図３は、プラスミドｐＤＢ２２４４の構成を示す。「ｒＨＡ」は組換ヒトアルブミンを意味し、「ＦＬ」はリーダー配列である。 図４は、プラスミドｐＤＢ２３０５の構成を示す。「ｍＦＬ」はリーダー配列である。 図５は、プラスミドｐＤＢ３０２９の構成を示す。「Ｉｎｖ」はリーダー配列である。 図６は、プラスミドｐＤＢ５９１２の構成を示す。「ｍＦＬ」はリーダー配列である。 図７は、プラスミドｐＤＢ３９３６の構成を示す。「ｍＦＬ」はリーダー配列である。

定義
アルブミン：「アルブミン」という語は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡドメインと同一及び／又は極めて類似の三次構造を有すると共に、ＨＳＡ又はその関連ドメインと類似の特性を有するタンパク質を意味する。類似の三次構造とは、例えば、親アルブミンと同一の分類に属する種のアルブミンの構造である。アルブミンの主な特性としては、ｉ）血漿の量を調節する能力（膨脹活性）、ii）約１９日±５日という長い血漿半減期、iii）ｇｐ６０、別名アルボンディン（albondin）への結合能、iv）ＦｃＲｎへの結合能、ｖ）リガンド結合能、例えば内因性分子、例えば酸性親油性化合物、例えばビリルビン、脂肪酸、ヘミン、及びチロキシンへの結合能（Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695の表１も参照：本文献は引用により本明細書に組み込まれる）、及びvi）酸性又は電気陰性の性質を有する小型有機化合物、例えば薬物、例えばワルファリン、ジアゼパム、イブプロフェン、及びパクリタキセルへの結合能（Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695の表１も参照：本文献は引用により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。あるタンパク質又は断片をアルブミンと特定する上で、これらの特性の全てが満たされる必要はない。例えば、ある断片が特定のリガンドや有機化合物への結合に関与するドメインを含まないの場合、斯かる断片の変異体はこれらの特性の全ては有さないものと推測される。

アレル変異体：「アレル変異体」という語は、同一の染色体座を占める一遺伝子が有する２又はそれ以上の択一的形態の各々を意味する。アレル変異は天然において変異を通じて発生し、従って個体集団内における多型を生じうる。遺伝子変異はサイレントである（コードされるポリペプチドには変化が生じない）場合もあるが、従ってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列にも変化が生じる場合もある。あるポリペプチドのアレル変異体とは、遺伝子のアレル変異体によりコードされるポリペプチドである。

ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という語は、真核細胞又は原核細胞から得られる成熟後のスプライスされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ内に存在するイントロン配列を有さない。ｍＲＮＡの前駆体たる初期一次ＲＮＡ転写生成物は、スプライシングを含む一連の工程を経て、成熟後のスプライスされたｍＲＮＡとなる。

コーディング配列：「コーディング配列」という語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列は通常はオープンリーディングフレームによって定められる。オープンリーディングフレームは開始コドン、例えばＡＴＧ、ＧＴＧ、又はＴＴＧから始まり、停止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡで終わる。コーディング配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組合せの何れであってもよい。

調節配列：「調節配列」という語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各々の調節配列は、前記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、また、他の調節配列に対して、固有（即ち、同一の遺伝子に由来）するものであってもよく、外来（即ち、異なる遺伝子に由来）するものであってもよい。斯かる調節配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、転写ターミネーター等が挙げられる。調節配列としては少なくともプロモーターと、転写及び翻訳の停止シグナルとが含まれていればよい。前記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコーディング領域に対する調節配列の連結を容易とするべく、特定の制限部位を導入する目的で、調節配列にリンカーを設けてもよい。

発現：「発現」という語には、ポリペプチドの産生に関与する一連の工程が含まれる。斯かる工程としては、これらに限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。

発現カセット：「発現カセット」という語は、ポリペプチドをコードすると共に、その発現を可能とする上流及び下流の調節配列を更にコードするポリヌクレオチドを意味する。

発現宿主：「発現宿主」という語は、所望のタンパク質、特に異種タンパク質を発現する宿主細胞を意味する。

発現ベクター：「発現ベクター」という語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むと共に、その発現を可能とする調節配列と作動式に連結された、直鎖状又は環状のＤＮＡ分子を意味する。

断片：「断片」という語は、成熟ポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシ末端、及び／又は、成熟ポリペプチドの内部領域から、１又は２以上の（数個の）アミノ酸が欠失されてなるポリペプチドを意味する。断片は、あるポリペプチドに由来する単一の中断のない配列であってもよいが、ポリペプチドの異なる部位に由来する２又はそれ以上の配列を含んでいてもよい。アルブミンに関して言えば、断片のサイズは約２０アミノ酸残基以上、好ましくは３０アミノ酸残基以上、より好ましくは４０アミノ酸残基以上、より好ましくは５０アミノ酸残基以上、より好ましくは７５アミノ酸残基以上、より好ましくは１００アミノ酸残基以上、より好ましくは２００アミノ酸残基以上、より好ましくは３００アミノ酸残基以上、より一層好ましくは４００アミノ酸残基以上、最も好ましくは５００アミノ酸残基以上である。好ましい態様では、断片はアルブミンの１又は２以上のドメインに相当する。本発明において好ましいアルブミンのドメインとしては、配列番号６のアミノ酸残基１〜１９４±１〜１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインＩに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％、又は１００％の同一性を有するドメイン；配列番号６のアミノ酸残基１９２〜３８７±１〜１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインIIに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％、又は１００％の同一性を有するドメイン；及び、配列番号６のアミノ酸残基３８１〜５８５±１〜１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインIIIに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％、又は１００％の同一性を有するドメイン；並びに、これらのドメインのうち１又は２以上（数個）、例えばドメインＩ及びII、ドメインII及びIII、又はドメインＩ及びIIIが、互いに連結されてなるものが挙げられる。なお、アルブミンのドメイン間の正確な境界を定める、一般に認められた基準は存在しないため、前記の範囲は互いに重複していてもよく、ドメインのＮ末端及び／又はＣ末端において、各々±１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５アミノ酸、好ましくは±１〜１５アミノ酸、より好ましくは±１〜１０アミノ酸、最も好ましくは±１〜５アミノ酸の違いがあってもよい。惹いては、各ドメインの長さに最大３０アミノ酸、好ましくは最大２０アミノ酸、より好ましくは最大１０アミノ酸のばらつきがあってもよい。また、複数のドメイン間の境界上に存在するアミノ酸残基が何れのドメインに属するかには、幾分の意見の相違があるかもしれない。同様の理由により、アルブミンドメインのアミノ酸残基に関して、前述の数とは異なる文献が存在する可能性もある。しかし、当業者であれば、斯かる文献の教示及び上記の教示を勘案することで、どのようにアルブミンドメインを特定するかを理解するであろう。非ヒトアルブミンの対応するドメインについては、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）、好ましくはバージョン３．０.０以降、より好ましくはバージョン５．０.０以降のNeedleプログラムにより実行されるNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）により、ＨＳＡとのアラインメントを行うことで決定できる。使用される任意パラメーターは、例えばギャップオープンペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）が０．５、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。利用可能な他のアラインメントツールとしては、例えば本明細書に記載のMUSCLEが挙げられる。なお、DockalとKjeldsenとではドメインの定義が異なる場合がある：Dockal et al（The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310）によるＨＳＡのドメインの定義は、ドメインＩが配列番号６のアミノ酸１〜１９７、ドメインIIが配列番号６のアミノ酸１８９〜３８５、ドメインIIIが配列番号６のアミノ酸３８１〜５８５である。Kjeldsen et al（Protein Expression and Purification, 1998, Vol 13: 163-169）によるＨＳＡのドメインの定義は、ドメインＩが配列番号６のアミノ酸１〜１９２、ドメインIIが配列番号６のアミノ酸１９３〜３８２、ドメインIIIが配列番号６のアミノ酸３８３〜５８５である。各ドメインはそれ自体２つの相同のサブドメイン、即ち１〜１０５と１２０〜１９４、１９５〜２９１と３１６〜３８７、及び３８８〜４９１と５１２〜５８５からなり、これらはそれぞれ残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Glu２９２〜Va１３１５、及びGlu４９２〜Ala５１１を含む柔軟なサブドメイン間リンカー領域により連結されてなる。

従って、本発明では以下のようにドメインを定義することが好ましい。まず、アミノ酸番号は配列番号６（ＨＳＡ）に対応する。しかし、当業者であれば、これらの番号を用いて、他のアルブミン配列における対応するドメインを特定することが可能である。ドメインＩは、アミノ酸１から開始してもよく、しなくてもよく、アミノ酸１９２、１９３、１９４、１９５、１９６又は１９７の何れか、好ましくはアミノ酸１９２、１９４又は１９７の何れかで停止してもよく、しなくてもよい。ドメインIIは、アミノ酸１８９、１９０、１９１、１９２又は１９３、好ましくはアミノ酸１８９、１９２又は１９３の何れかで開始してもよく、しなくてもよく、アミノ酸３８２、３８３、３８４、３８５、３８６又は３８７、好ましくはアミノ酸３８２、２８５又は３８７の何れかで停止してもよく、しなくてもよい。ドメインIIIは、アミノ酸３８１、３８２又は３８３、好ましくはアミノ酸３８１又は３８３で開始してもよく、しなくてもよく、アミノ酸５８５で停止してもよく、しなくてもよい。非ヒトアルブミンのドメインのアミノ酸長及び／又は残基数は、ＨＳＡのドメインと同一でも異なってもよい。例えば、１又は２以上（数個）の他のアルブミン、断片、誘導体、変異体、及び／又は融合体について、ＨＳＡのドメイン１、２及び／又は３に対応するドメインを特定するために、多重アラインメント又はペアワイズアラインメントを作成してもよい。

融合パートナー：本明細書を通じて、融合パートナーとは、アルブミン或いはその変異体及び／又は断片と遺伝子工学的に連結されていてもよい非アルブミン部分を意味する。

異種タンパク質：異種タンパク質とは、宿主細胞により天然では産生されないタンパク質であって、好ましくは選択マーカー（例えば抗生物質抵抗性マーカー、栄養要求性選択マーカー等）、シャペロン、ＦＬＰ、ＲＥＰ１、又はＲＥＰ２等のタンパク質を含まないタンパク質を意味する。

宿主細胞：「宿主細胞」という語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターの形質転換（transformation）、トランスフェクション（transfection）、形質導入（transduction）等を許容しうる任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という語は、複製時に生じた変異により親細胞との同一性が失われた親細胞の任意の子孫を包含する。

成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という語は、翻訳及び任意の翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等を経たポリペプチドの最終形態を意味する。ヒトアルブミンの成熟配列を配列番号６に、未成熟形態の例を配列番号８にそれぞれ示す。

成熟ポリペプチドコーディング配列：「成熟ポリペプチドコーディング配列」という語は、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。ヒトアルブミンの成熟ポリペプチドコーディング配列の例を配列番号５に、ヒトアルブミンの未成熟形態のコーディング配列の例を配列番号７にそれぞれ示す。

ミュータント：「ミュータント」（mutant）という語は、変異体（variant）をコードするポリヌクレオチドを意味する。

核酸コンストラクト：「核酸コンストラクト」という語は、天然遺伝子から単離され、或いは核酸セグメントを含むように改変され、天然では存在しない形態となった、或いは合成された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子であって、１又は２以上の調節配列を含むものをいう。

作動式に連結された：「作動式に連結された」という語は、ポリヌクレオチドのコーディング配列に対して調節配列が適切な位置に配置され、調節配列によってコーディング配列の発現が誘導されるように構成されることをいう。

親又は親アルブミン：「親」又は「親アルブミン」という語は、本発明のアルブミン変異体を産生するべく改変を加える元のアルブミンを意味する。親は天然（野生型）ポリペプチドでもそのアレルでもよく、その変異体でもよい。好ましい態様では、親アルブミンは野生型アルブミン、より好ましくは配列番号８に開示のヒト由来の野生型アルブミン（UNIPROT: P02768.2）又はその成熟配列（配列番号６）である。他の野生型アルブミンとしては、表１に示す非網羅的なリストから選択することができる。

好ましくは、親アルブミンは成熟アルブミンである。他の態様では、親アルブミンは、配列番号６に対して少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％同一であると共に、アルブミン、例えばＨＳＡの主な特性の少なくとも１つを維持するか、又は、類似の三次構造を有するものをいう。アルブミンの主な特性は、Sleep, 2015, “Albumin and its application in drug delivery”, Expert Opinion on Drug Delivery 12(5): 793-812に要約されている。

配列同一性：２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の間の類似度は「配列同一性」（sequence identity）というパラメーターを用いて記載される。

本発明の目的において、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）、好ましくはバージョン５．０.０以降を用いて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）により決定される。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）が０．５、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。Needleの「最長同一性」（longest identity）と付された出力値（-nobrief オプションを用いて得られる）を、配列同一性として使用する。これは以下のように計算される。

本発明の目的において、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の間の配列同一性は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 同上）、好ましくはバージョン５．０.０以降を用いて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, 同上）により決定される。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）が０．５、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。Needleの「最長同一性」（longest identity）と付された出力値（-nobrief オプションを用いて得られる）を、配列同一性として使用する。これは以下のように計算される。

変異体：「変異体」（variant）という語は、親ポリペプチド、例えばアルブミンに由来するポリペプチドであって、１又は２以上（数個）の位置に、改変、即ち置換、挿入、及び／又は欠失を有するものを意味する。置換（substitution）とは、ある位置を占めるアミノ酸が、異なるアミノ酸で置き換えられることを意味し、欠失（deletion）とは、ある位置を占めるアミノ酸が取り除かれることを意味し、挿入（insertion）とは、ある位置を占めるアミノ酸の隣に１〜３アミノ酸が付け加えられることを意味する。改変されたポリペプチド（変異体）は、人為的な介入により、親ポリペプチド、例えばアルブミンをコードするポリヌクレオチド配列に修飾を加えることにより得ることができる。変異体アルブミンは、配列番号６に対して、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％同一である。また、親アルブミン、例えばＨＳＡの、主要な特性の少なくとも１つ又は類似の三次構造を維持していてもよく、いなくてもよい。一般に、ＨＳＡの変異体又は断片は、ＨＳＡと比較して少なくとも１０％（好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）のリガンド結合活性（例えばビリルビン結合性）を有すると共に、ＨＳＡと比較して重量対重量比率で少なくとも５０％（好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％）の膨脹活性を有する。アルブミン、アルブミン変異体、又はアルブミンの断片の膨脹活性、別名コロイド浸透圧は、Hoefs, J.C. (1992) Hepatology 16:396-403に記載の方法で決定することができる。ビリルビン結合性は、例えばＨＳＡを基準とした５２７ｎｍの蛍光増強により測定することができる。ビリルビン（１．０ｍｇ）を５０μＬの１Ｍ ＮａＯＨに溶解させ、脱塩水で１．０ｍＬに希釈する。ビリルビンのストックを、蛍光光度計のキュベット内で１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡで希釈し、０．６ｎｍｏｌビリルビン／ｍＬとする。励起波長４４８ｎｍ、発光波長５２７ｎｍ（スリット幅１０ｎｍ）で蛍光を測定し、ＨＳＡ：ビリルビン比０〜５ｍｏｌ：ｍｏｌの範囲に亘ってＨＳＡで較正する。変異体は、そのＦｃＲｎ結合親和性及び／又は血漿半減期が、親アルブミンと比較して改変されていてもよい。

変異体Ｎｏｔ４タンパク質の場合も、活性がアルブミン活性ではなく、Ｎｏｔ４活性であることを除いては、同様の原理を適用することができる。

変異体ポリペプチド配列は、天然に見出されないものであることが好ましい。

ベクター：「ベクター」（vector）という語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、これと作動式に連結された、その発現を誘導する調節配列とを含む、直鎖状又は環状のＤＮＡ分子を意味する。ベクターにはプラスミドが含まれる。ベクターには発現ベクターが含まれる。

野生型：「野生型」（wild-type：ＷＴ）アルブミンという語は、天然で動物又はヒトに見出されるアルブミンと同一のアミノ酸配列を有するアルブミンを意味する。配列番号６はヒト野生型アルブミンの例である。「野生型」（ＷＴ）ヒトアルブミン（ＨＳＡ）の配列は、GenBank登録番号AAA98797.1として参照可能である（Minghetti et al. “Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within q11-22 of chromosome 4”, J. Biol. Chem. 261 (15), 6747-6757 (1986)）。野生型アルブミンの例を表１（上掲）に示す。

アミノ酸位置を指定する際の規則
本発明の目的においては、配列番号２に開示されるポリペプチドを用いて、Ｎｏｔ４タンパク質のホモログ中の対応するアミノ酸残基を決定する。Ｎｏｔ４タンパク質のホモログのアミノ酸配列を、配列番号２に開示されるポリペプチドとアラインし、このアラインメントに基づいて、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）、好ましくはバージョン５．０.０以降を用いて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）により、配列番号２に開示されるポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号をを決定することができる。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）が０．５、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。

Ｎｏｔ４タンパク質のホモログ中の対応するアミノ酸残基の特定は、幾つかのコンピュータープログラム、例えば、これらに限定されるものではないが、MUSCLE（multiple sequence comparison by log-expectation；バージョン３．５以降；Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797）、MAFFT（バージョン６．８５７以降； Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900）、及びClustalWを用いたEMBOSS EMMA（１．８３以降；Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680）により、それぞれのデフォルトパラメーターを用いて、複数のポリペプチド配列のアラインメントを作成することにより決定することができる。

本発明のポリペプチドを記述するに当たり、参照の便宜のために、以下に説明する命名法を採用する。一般に許容されているIUPACの一文字又は三文字のアミノ酸略称を用いる。

置換。アミノ酸置換の場合、以下の命名法を用いる：元のアミノ酸、位置、置換後のアミノ酸。従って、位置２２６のトレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表す。多重変異は加算記号（「＋」）で区切って示す。例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）で、位置４１１のセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）で、それぞれ置換することを表す。

欠失。アミノ酸欠失の場合、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、＊。従って、位置１９５のグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表す。多重欠失は加算記号（「＋」）で区切って、例えば「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」の用に表す。

挿入。上述のように、挿入には、ある位置を占めるアミノ酸（「所定の（或いは「元の」）アミノ酸」、「Ｘ」）のＮ側（「上流」、「Ｘ−１」）に対するものと、Ｃ側（「下流」、「Ｘ＋１」）に対するものとが挙げられる。

元のアミノ酸（‘Ｘ’）のＣ側（「下流」、「Ｘ＋１」）へのアミノ酸挿入の場合、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と記す。アミノ酸の多重挿入の場合は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；等］と記す。例えば、位置１９５のグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と記す。

このような場合、挿入された複数のアミノ酸残基は、挿入されたアミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対して、小文字を付して区別する。上記の例の場合、その順番は以下のとおりとなる。

元のアミノ酸（Ｘ）のＮ側（「上流」、「Ｘ−１」）に対するアミノ酸挿入の場合、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、挿入されたアミノ酸、元のアミノ酸。従って、位置１９５のグリシン（Ｇ）の前へのリシン（Ｋ）（Ｋ）の挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＬｙｓＧｌｙ」又は「Ｇ１９５ＫＧ」と記す。アミノ酸の多重挿入の場合は、［元のアミノ酸、位置、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；等、元のアミノ酸］と記す。例えば、位置１９５のグリシンの前へのリシン（Ｋ）及びアラニン（Ａ）の挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＬｙｓＡｌａＧｌｙ」又は「Ｇ１９５ＫＡＧ」と記す。

このような場合、挿入された複数のアミノ酸残基は、挿入されたアミノ酸残基に続くアミノ酸残基の位置番号に対して、ダッシュ付きの小文字を付して区別する。上記の例の場合、その順番は以下のとおりとなる。

多重改変。多重改変を含むポリペプチドは、加算記号（「＋」）で区切って示す。例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、位置１７０のアルギニンをチロシンで、位置１９５のグリシンをグルタミン酸で、それぞれ置換することを表す。

異なる改変。ある位置に複数の異なる改変を導入可能な場合には、これらの異なる改変をコンマで区切って示す。例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、位置１７０のアルギニンをチロシン又はグルタミン酸で置換することを示す。即ち、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、以下の変異体を表す：「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。

本発明の詳細な説明
本発明の第一の側面は、
ａ．改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、又は
ｂ．改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル、又は
ｃ．改変されたＮｏｔ４遺伝子又はそのホモログ、又は
ｄ．Ｎｏｔ４遺伝子又はそのホモログの改変された発現レベル
を有する真菌宿主細胞を提供する。

Ｎｏｔ４は別名ＭＯＴ２ともいう。改変されたＮｏｔ４タンパク質とは、例えば参照Ｎｏｔ４タンパク質、例えば野生型Ｎｏｔ４タンパク質、例えば配列番号２と比較して、改変されたＮｏｔ４タンパク質をいう。好ましくは、改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログは、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性、より好ましくは配列番号２に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、又は少なくとも９９．９％の同一性を有する。より好ましくは、改変されたＮｏｔ４タンパク質は、配列番号４を含むか、配列番号４からなる。

Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変されたレベルとは、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された発現レベル、又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された活性レベルであることが好ましい。前記低減されたレベルとは、参照真菌宿主細胞、例えばＮｏｔ４タンパク質が配列番号２を含み、又は配列番号２からなる真菌宿主細胞と比較して、低減されたレベルであることが好ましい。参照真菌宿主のＮｏｔ４タンパク質は、例えば野生型Ｎｏｔ４配列、例えば配列番号２である。適切な参照真菌宿主細胞としては、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｓ２８８Ｃ又はＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＸＹ１が挙げられる。Ｓ２８８Ｃは遺伝子型ＭＡＴα ＳＵＣ２ ｇａｌ２ ｍａｌ２ ｍｅｌ ｆｌｏ１ ｆｌｏ８−１ ｈａｐ１ ｈｏ ｂｉｏ１ ｂｉｏ６を有する。ＤＸＹ１は遺伝子型ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３：ｙａｐ３を有する（Kerry-Williams et al. (1998) Yeast 14:161-169）。他の適切な参照真菌宿主細胞としては、Ｎｏｔ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを除いて、宿主細胞と同一である細胞が挙げられる。例えば、参照のＮｏｔ４遺伝子が野生型（例えば配列番号１）であってもよく、参照のＮｏｔ４遺伝子が野生型Ｎｏｔ４タンパク質（例えば配列番号２）であってもよく、参照によりコードされるＮｏｔ４タンパク質が野生型（例えば配列番号２）であってもよい。本発明の宿主細胞は、Ｎｏｔ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質若しくはそのホモログを除いて、親株と同一であることが好ましい。参照真菌宿主を、「対応する」（corresponding）真菌宿主と呼ぶ場合もある。参照真菌宿主は、例えば親真菌宿主である。

Ｎｏｔ４タンパク質の低減されたレベル、又は、Ｎｏｔ４タンパク質の活性レベルは、例えばＮｏｔ４遺伝子を変異又は欠失させて、変異Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを産生させ、或いはＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを完全に消失させることにより；当該遺伝子のオープンリーディングフレームを除去又は改変することにより；Ｎｏｔ４遺伝子の調節配列、例えばプロモーター配列及び／又はターミネーター配列を除去又は改変することにより；適切な干渉ＲＮＡ、例えばアンチセンスｍＲＮＡを導入して、Ｎｏｔ４遺伝子の転写を阻害又は低減することにより；適切な転写活性化遺伝子を導入、制御、又は修飾することにより；又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルを阻害する剤を導入することにより、達成することができる。タンパク質のレベル及びタンパク質の活性を測定する方法は、本技術分野では周知である。

Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベルは、レベルの低減であってもよい。即ち、親又は参照真菌宿主細胞、例えば野生型真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルに対して、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％から、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％の低減であってもよい。真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された活性レベルは、例えば参照真菌宿主細胞、例えば上述の親真菌宿主細胞又は野生型真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルと比較して、そのレベルが低減されている。従って、宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルは、参照真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの最大９５％、例えば参照真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの最大９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は最大１０％である。Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルは、ゼロ又は実質的にゼロとなるまで低減されてもよい。

Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された発現レベル（量）は、レベルの低減であってもよい。即ち、参照真菌宿主細胞、例えば野生型真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルに対して、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％から、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％の低減であってもよい。真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された発現レベルは、例えば参照真菌宿主細胞、例えば上述の親真菌宿主細胞又は野生型真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルと比較して、そのレベルが低減されている。従って、宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルは、参照真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルの最大９５％、例えば参照真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルの最大９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は最大１０％である。Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルは、ゼロ又は実質的にゼロとなるまで低減されてもよい。

真菌宿主細胞は、機能的なＮｏｔ４遺伝子若しくはそのホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質若しくはそのホモログを欠失していてもよい。例えば、真菌宿主細胞は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された発現レベル、又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された活性レベルを生じうるよう改変されたＮｏｔ４遺伝子を含んでいてもよい。真菌宿主細胞は、Ｎｏｔ４遺伝子又はそのホモログを、例えば欠失により欠いていてもよく、及び／又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを欠いていてもよい。

改変されたＮｏｔ４タンパク質、又はそのホモログは、そのＮｏｔ１タンパク質、又はそのホモログとの相互作用が改変されるように、変異されていてもよい。例えば、Ｎｏｔ４タンパク質、又はそのホモログのＮ末端領域が変異されることで、例えば配列番号２の位置４２６〜４３９に対応するアミノ酸を含むαヘリックスが改変されてもよい。

即ち、本発明は、野生型Ｎｏｔ４タンパク質（例えば配列番号２）と野生型Ｎｏｔ１タンパク質（例えば配列番号９）との間の相互作用と比較して、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログのＮｏｔ１との相互作用、例えば疎水性相互作用が弱められてなる、真菌宿主細胞を提供する。

真菌宿主細胞は、配列番号２の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０から選択される位置に対応する位置、好ましくは：
配列番号２の位置４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、又は４３９、好ましくは４２９、４３０、４３４、又は４３７、最も好ましくは位置４２９に対応する位置；
配列番号２の位置４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０、好ましくは４６３、４６４、又は４６６に対応する位置；又は、
配列番号２の位置４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、又は４５６、好ましくは４４２、４４５、４４７又は４５２に対応する位置
から選択される位置に対応する位置に変異を含む、改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを有していてもよい。

ここでの変異としては、例えば１又は２以上（例えば数個）の位置における置換、挿入、及び／又は欠失である。中でも置換が好ましい。

真菌宿主細胞は、改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログをコードするポリヌクレオチド配列、例えば配列番号３を含んでいてもよい。遺伝子コードの縮重ゆえに、所望の改変Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログをコードするポリヌクレオチド配列としては、複数の異なるポリヌクレオチド配列が存在する。

真菌宿主細胞は、改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを含んでいてもよい。ここで変異としては、配列番号２を基準とした、あるアミノ酸の置換、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択される非保存アミノ酸への置換が挙げられる。

アミノ酸は種々の周知の群へと分類可能である。即ち、一部のアミノ酸は他のアミノ酸よりも相互の関連性が強い。本明細書で使用する場合、「保存アミノ酸置換」（conservative amino acid substitution）とは、同一群内で行われる置換であって、通常はタンパク質の機能に実質的な影響を与えない置換を意味する。「保存置換」とは、例えば図１の群内で行われる置換を意図した語である。図１は、保存のレベルを可視化した一体系を表すベン図である。一般に、低保存の置換とは、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸との間に、多数の境界（線）ｈが存在するような置換である。「置換アミノ酸置換」としては、例えば以下に示す同一の群内での置換が挙げられる。
芳香族アミノ酸：Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙ；
脂肪族アミノ酸：Ｉ、Ｌ、Ｖ；
疎水性アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ；
荷電アミノ酸：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ等：
正荷電アミノ酸：Ｈ、Ｋ、Ｒ；
負荷電アミノ酸：Ｄ、Ｅ；
極性アミノ酸：Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ；
小型アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｖ等：
超小型アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ。

或いは、「保存置換」としては、例えば以下の群内での置換が挙げられる。
脂肪族側鎖を有するアミノ酸：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ；
芳香族側鎖を有するアミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ；
硫黄含有側鎖を有するアミノ酸：Ｃ、Ｍ；
脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸：Ｓ、Ｔ；
塩基性側鎖を有するアミノ酸：Ｋ、Ｒ、Ｈ；
酸性アミノ酸及びそれらのアミド誘導体：Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ。

置換は、本技術分野で公知の技術、例えば米国特許第４，３０２，３８６号公報（引用により本明細書に組み込まれる）に記載の部位特異的突然変異誘発法により作成することができる。

非保存アミノ置換とは、例えば、ある群から別の群への置換、例えば芳香族側鎖を有する群から脂肪族側鎖を有する群への置換を意味する。

配列番号２の位置４２９に対応する位置の変異は、天然アミノ酸、例えばＦから、非天然アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、又はＩ、より好ましくはＶ、Ｌ又はＩ、最も好ましくはＩへの置換であってもよい。非保存アミノ酸への置換であってもよい。脂肪族アミノ酸への置換であってもよい。特に好ましい置換はＦからＩへの置換である。

配列番号２の位置４３０に対応する位置の変異は、天然アミノ酸、例えばＬから、任意の非天然アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹへの置換であってもよい。非保存アミノ酸への置換であってもよい。

位置４３４に対応する位置の変異は、天然アミノ酸、例えばＬから、任意の非天然アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹへの置換であってもよい。非保存アミノ酸への置換であってもよい。

配列番号２の位置４３７に対応する位置の変異は、天然アミノ酸、例えばＬから、任意の非天然アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹへの置換であってもよい。非保存アミノ酸への置換であってもよい。

改変されたＮｏｔ４タンパク質は、配列番号２のＦ４２９に対応する位置に、変異を有することが好ましい。

改変されたＮｏｔ４タンパク質は、配列番号４を含む、或いは配列番号４からなることが好ましい。即ち、変異Ｆ４２９Ｌを含むことが好ましい。

或いは、改変されたレベルが、レベルの上昇であってもよい。Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの上昇したレベル又は上昇した活性は、所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の産生量を低減する可能性が高い。斯かる産生量の低減は、例えば所望のタンパク質が宿主細胞の生存性にとって有害である場合等に望ましい。上昇したレベルとは、例えば参照宿主、例えば親宿主を基準として、少なくとも１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、又は２００％のレベルとなることが挙げられる。

真菌宿主細胞は、組換真菌宿主細胞であってもよい。

真菌宿主細胞は、酵母又は糸状菌であってもよい。本明細書で使用する場合、「真菌」（fungi）には、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、及び接合菌門（Zygomycota）（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKの定義による）が含まれると共に、卵菌類（Oomycota）（Hawksworth et al., 1995, 同上, page 171にて列記）及びあらゆる栄養胞子形成菌類（Hawksworth et al., 1995, 同上）も含まれる。

好ましい側面では、真菌宿主細胞は、酵母細胞である。本明細書で使用する場合、「酵母」（yeast）には、子嚢胞子形成酵母（エンドミセス：Endomycetales）、担子胞子形成酵母、及び、不完全菌類に属する酵母（分芽菌：Blastomycetes）が挙げられる。斯かる酵母の分類は将来変更される可能性もあるため、本発明の目的においては、Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No: 9, 1980)の記載に基づいて酵母を定義するものとする。

より好ましい側面では、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイウェロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）細胞である。

より好ましい側面では、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロミセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、又はヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）宿主が特に好ましい。

Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の遺伝子型の特徴のうち１又は２以上を有していてもよく、いなくてもよい：ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、ｐｍｔ１：：ＵＲＡ３（国際公開第２０１４／１３８３７１号：引用により本明細書に組み込まれる）、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＢＸＰ１０。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、ＭＡＴａを含むことが好ましい。

Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の遺伝子型のうち１又は２以上を含んでいてもよく、いなくてもよい：ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２；更にＰＤＩ１、ＵＲＡ３及びＹＩｐｌａｃ２１１がＰＤＩ１遺伝子座に組み込まれたもの（Finnis et al 2010, Microbial Cell Factories 9:87）、例えば Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９。

Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の遺伝子型のうち１又は２以上を含んでいてもよく、いなくてもよい：ＭＡＴα、ｌｅｕ２、ｐｅｐ４−３、例えばFinnis et al 1993, Eur. J. Biochem, 212: 201-210に記載のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＭＴ３０２／２８Ｂ。

Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の遺伝子型を含んでいてもよく、いなくてもよい： MATα、SUC２、gal２、mal２、mel、flo１、flo８-１、hap１、ho、bio１、bio６（Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43）、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｓ２８８Ｃ。

好ましいＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主株は、以下の全てを含むか、以下の全てからなる：ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、及びｐｍｔ１：：ＵＲＡ３。

他の好ましいＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の全てを含むか、以下の全てからなる：ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、更にＰＤＩ１、ＵＲＡ３及びＹＩｐｌａｃ２１１がＰＤＩ１遺伝子座に組み込まれたもの。

他の好ましいＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の全てを含むか、以下の全てからなる：ＭＡＴα、ＳＵＣ２、ｇａｌ２、ｍａｌ２、ｍｅｌ、ｆｌｏ１、ｆｌｏ８−１、ｈａｐ１、ｈｏ、ｂｉｏ１、ｂｉｏ６。

他の好ましいＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の全てを含むか、以下の全てからなる：ＭＡＴα、ｌｅｕ２、ｐｅｐ４−３。

宿主は、倍数体、二倍体、又は単数体である。単数体又は二倍体の酵母宿主が好ましく、中でも好ましいのは単数体である。

宿主交配型としては、例えばＭＡＴａ又はＭＡＴα（Ｍａｔ−アルファ）が挙げられる。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、ヒトアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体をコードするプラスミドを含むことが好ましい。

「糸状菌」（filamentous fungi）には、真菌類（Eumycota）及び卵菌類（Oomycota）亜区分のあらゆる糸状形態が含まれる（Hawksworth et al., 1995, 同上の定義による）。糸状菌（filamentous fungi）の特徴は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類から構成される菌糸壁（mycelial wall）である。栄養成長は菌糸伸長によって行われ、炭素異化は偏性好気性である。対称的に、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等による栄養成長は、単細胞性葉状体の出芽によって行われ、炭素異化としては発酵の場合もある。

好ましい糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞は、Acremonium、Aspergillus、Aureobasidium、Bjerkandera、Ceriporiopsis、Chrysosporium、Coprinus、Coriolus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Phlebia、Piromyces、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trametes、又はTrichodermaを含んでもよく、含まなくてもよい。

真菌宿主細胞は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。所望のタンパク質は、異種タンパク質であることが好ましい。異種タンパク質とは、天然では宿主細胞によって産生されないタンパク質である。好ましくは、例えば選択マーカー、例えば抗生物質抵抗性マーカー又は栄養要求性マーカー、シャペロン、ＦＬＰ又はＦＲＴ等を含まないことが好ましい。

真菌宿主細胞は発現宿主であってもよい。真菌宿主細胞は発現カセットを含んでいてもよく、これは例えば所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードしていてもよい。斯かる発現カセットは、例えばベクター、例えばプラスミドの中に存在していてもよい。真菌宿主細胞は発現ベクターを含んでいてもよい。

所望のタンパク質は、植物性タンパク質若しくは動物性タンパク質又はそれらの変異体であってもよく、なくてもよい。所望のタンパク質は、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン（antistasin）、ダニ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小モジュラー免疫医薬^{(登録商標)}（「ＳＭＩＰ」）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、Kunitzドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号に記載のもの、アルブミン融合体を有するものも含む）、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、インターフェロンα（アルファ）種及び亜種、インターフェロンβ（ベータ）種及び亜種、インターフェロンγ（ガンマ）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦ_Ax１５、ＩＬ−１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣体、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣体、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン（cyanovirin）−Ｎ、５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエクステンジン（exendin）−４、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（ベータ）、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前駆体及び活性型を含む）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand's）因子、アルファ_１−抗トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘ及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、代謝生成物、抗生物質、又は上記の何れかの変異体若しくは断片の配列を含んでいてもよく、いなくてもよい。

当該変異体は、上記のタンパク質のうち１又は２以上に対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有することが好ましい。

好ましい所望のタンパク質は、血清タンパク質、例えばアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体であってもよく、なくてもよい。斯かるアルブミンは、配列番号６に対して、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９８．２、９８．４、９８．６、９８．８、９９、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、又は９９．９から、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９８．２、９８．４、９８．６、９８．８、９９、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９、又は１００％の配列同一性を有することが好ましい。中でも、前記アルブミンは、配列番号６を含み、又は配列番号６からなることが最も好ましい。

アルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体は、配列番号６の位置Ｋ５７３に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを、より好ましくは、配列番号６の位置Ｋ５７３に対応する位置にＰ、Ｈ、Ｗ又はＹを含んでいてもよく、いなくてもよい。特に、アルブミン変異体は、配列番号６に対して少なくとも９５％の同一性（より好ましくは少なくとも９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有すると共に、配列番号６の位置５７３に対応する位置にＰを含むことが好ましい。

他の好ましいアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体としては、国際公開第２０１１／０５１４８９号、国際公開第２０１１／１２４７１８号、国際公開第２０１２／０５９４８６号、国際公開第２０１２／１５０３１９号、国際公開第２０１４／０７２４８１号、国際公開第２０１３／１３５８９６号、国際公開第２０１５／０３６５７９号、国際公開第２０１０／０９２１３５号、国際公開第２０１３／０７５０６６号、国際公開第２０１４／１７９６５７号、国際公開第２００９／１２６９２０号、国際公開第２０１０／０５９３１５号、国際公開第２０１１／１０３０７６号、国際公開第２０１２／１１２１８８号、及び国際公開第２０１５／０６３６１１号（各々引用により本明細書に組み込まれる）に記載のもの、並びにその断片又は融合体が挙げられる。

斯かるアルブミンは、アルブミン又はその変異体の断片であってもよく、なくてもよい。

斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体は、親アルブミン、或いはその断片及び／又は融合体と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性がより強められ、又は弱められてなる（好ましくは、より強められてなる）。

斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体のＦｃＲｎ（例えばｓｈＦｃＲｎ）に対するＫＤは、対応するＨＳＡ又はそのコンジュゲートのＫＤよりも低くてもよい。アルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体のＦｃＲｎに対するＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．９未満、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．５未満、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．１未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．０５未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．０２未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．０１未満、最も好ましくは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．００１未満であることが好ましい（ここで×は倍数を表す）。ＫＤが低いほど結合親和性は強くなる。

斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体のＦｃＲｎに対するＫＤは、対応するＨＳＡ又はそのコンジュゲートのＫＤよりも高くてもよい。アルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体のＦｃＲｎに対するＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×２以上、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×５以上、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×１０以上、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×２５以上、最も好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×５０以上であることが好ましい。斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体は、ＦｃＲｎに対して全く結合しなくてもよい。ＫＤが高いほど結合親和性は弱くなる。

ＫＤを決定及び／又は比較する際には、以下のパラメーターのうち１又は２以上（例えば数個）（好ましくは全て）を用いてもよい。
機器： Biacore 3000 instrument（GE Healthcare）。
フローセル：cm5センサーチップ。
ＦｃＲｎ：ヒトＦｃＲｎ、好ましくは可溶性ヒトＦｃＲｎ、任意によりタグを連結。タグの例としてはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ）、最も好ましくはＨｉｓ、例えばベータ−２−ミクログロブリンのＣ末端に６つのヒスチジン残基を付加。
ＦｃＲｎの量：１２００〜２５００ＲＵ。
結合化学：アミンカップリング化学（例えば機器メーカーが提供するプロトコールの記載に準拠）。
結合方法：カップリングは、例えば１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０（GE Healthcare）中２０μｇ／ｍＬのタンパク質を注入して実施する。ラニングバッファー及び希釈用バッファーとしては、リン酸緩衝液（６７ｍＭ リン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）、ｐＨ５．５を使用すればよい。表面の再生は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）、ｐＨ７．４（Biacore AB）を注入して行えばよい。
試験分子（例えばＨＳＡ又は変異体）の注入量：２０〜０．０３２μＭ。
注入流速：定速、例えば３０μＬ／ｍＬ。
注入温度：２５℃。
データ評価用ソフトウェア：BIAevaluation 4.1ソフトウェア（Biacore AB）。

斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体の血漿半減期は、親アルブミン、或いはその断片及び／又は融合体と比較してより長く、又はより短くてもよいが、より長いことが好ましい。

血漿半減期は、適切な個人において、インビボで決定するのが理想的である。しかし、動物又はヒトで実験を行うと、時間及び費用が掛かる上に、倫理的な懸念が避けられない。よって、血漿半減期が延長又は短縮されたことを確認するためには、インビトロアッセイを用いることが望ましい。アルブミンのその受容体（ＦｃＲｎ）への結合は、血漿半減期にとって重要な因子であること、また、受容体結合性と血漿半減期との相関によれば、アルブミンのその受容体への親和性が高いほど、血漿半減期は長くなることが知られている。従って、本発明では、アルブミンのＦｃＲｎへの親和性が高いほど、血漿半減期が延長されており、アルブミンのその受容体への親和性が低いほど、血漿半減期が短縮されていると判断ことができる。

アルブミンのその受容体ＦｃＲｎへの結合は、親和性という言葉と、「より強い」（stronger）又は「より弱い」（weaker）という表現を用いて表すことができる。即ち、ＦｃＲｎに対する親和性がＨＳＡよりも強い分子は、ＨＳＡよりもＦｃＲｎへの結合性が強く、ＦｃＲｎに対する親和性がＨＳＡよりも弱い分子は、ＨＳＡよりもＦｃＲｎへの結合性が弱いと判断ことができる。「結合親和性」（binding affinity）という言葉に替えて、「結合係数」（binding coefficient）という言葉を用いてもよい。

「血漿半減期がより長い」又は「血漿半減期がより短い」という記載、及び類似の表現は、対応する親又は参照又は対応するアルブミン分子との対比に基づくものと解すべきである。即ち、本発明の変異体アルブミンに関して、血漿半減期がより長いとは、斯かる変異体が、本明細書に記載の改変を有する他は同一の配列を有する対応するアルブミンと比較して、より長い血漿半減期を有することを意味する。

斯かるアルブミン、或いはその変異体及び／又は断片は、遺伝子工学的に融合パートナーと連結されていてもよく、いなくてもよい。融合パートナーは、非アルブミンタンパク質であることが好ましい。融合パートナーは、例えばアルブミンのＮ’末端又はＣ’末端に連結される。アルブミン部分とパートナー部分との間には、１又は２以上のスペーサーアミノ酸が存在していてもよい。融合パートナーは、アルブミン配列内に挿入されていてもよい。融合パートナーは、例えば少なくとも５アミノ酸長、例えば少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は少なくとも１００アミノ酸長である。斯かる融合パートナーの最大長は、例えば３５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００アミノ酸長である。

融合体タンパク質は、１又は２以上の融合パートナーを有していてもよい。これらは例えばアルブミンのＮ’又はＣ’末端に連結され、或いはアルブミン配列内に挿入される。融合体タンパク質は、１又は２以上（例えば数個、例えば２、３、４又は５）コピーの同一の融合パートナーを有していてもよく、２種又はそれ以上の異なるパートナーを有していてもよい。斯かる融合パートナーは、例えば上述した所望のタンパク質又は異種タンパク質の中から選択される。

好ましい融合体タンパク質は、ＧＬＰ−１活性を有するポリペプチド、例えば国際公開第２０１４／１３８３７１号（引用により本明細書に組み込まれる。特に第１３、１４、２６、３４〜３７ページを参照）に記載のものを含んでいてもよい。例えば、好ましい融合体タンパク質は、ＨＳＡ（配列番号６）、或いはＨＳＡの変異体及び／又は断片が、１コピーのＧＬＰ類似物（例えば配列番号１０）と遺伝子工学的に連結されたものを含んでいてもよく、ＨＳＡ（配列番号６）、或いはＨＳＡの変異体及び／又は断片が、ＧＬＰ類似物のタンデムリピート（例えば配列番号１１）と遺伝子工学的に連結されたものを含んでいてもよい。例えば、融合体タンパク質は、配列番号１２（アルビグルチド：albiglutide）を含んでいてもよく、配列番号１２からなるものでもよい。

斯かるアルブミン、変異体、或いはその断片及び／又は融合体の産生に特に適した真菌宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、アスペルギルス（Aspergillus）（国際公開第０６／０６６５９５号）、クルイウェロミセス（Kluyveromyces）（Fleer, 1991, Bio/technology 9: 968-975）、ピチア（Pichia）（Kobayashi, 1998, Therapeutic Apheresis 2: 257-262）、及びサッカロミセス（Saccharomyces）（Sleep, 1990, Bio/technology 8: 42-46）が挙げられる。これらの文献は、各々引用により本明細書に組み込まれる。

所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）は、分泌タンパク質であってもよく、なくてもよい。即ち、宿主細胞によりコードされるタンパク質は、シグナルペプチド（文献によっては「リーダー配列」と記載される場合もある）を含んでいてもよく、いなくてもよい。通常、タンパク質が宿主細胞から分泌される際に、シグナルペプチド配列はタンパク質から切断されるため、最終的な（成熟）タンパク質は、シグナルペプチド配列を含まない。適切なシグナルペプチド配列の例を以下に挙げる。シグナルペプチドは、プロペプチドを含んでいてもよく、いなくてもよい。

或いは、所望のタンパク質は、細胞内タンパク質であってもよく、なくてもよい。

所望のタンパク質は、プラスミドによりコードされるものであってもよく、なくてもよい。

所望のタンパク質は、染色体核酸によりコードされるものであってもよく、なくてもよい。

適切なプラスミドとしては、２ミクロンファミリープラスミド、例えば国際公開第２００６／０６７５１１号（引用により本明細書に組み込まれる。特に強調すべきは「２ミクロンファミリープラスミド」（“The 2μm-family plasmids”、第４６〜６１ページ）と題された項目である。）に記載のものが挙げられる。２ミクロンファミリープラスミドと総称される斯かるプラスミドとしては、チゴサッカロミセス・ルーキシィ（Zygosaccharomyces rouxii）（旧来の分類はチゴサッカロミセス・ビスポラス（Zygosaccharomyces bisporus））由来のｐＳＲ１、ｐＳＢ３、及びｐＳＢ４、チゴサッカロミセス・バイリィ（Zygosaccharomyces bailii）由来のプラスミドｐＳＢ１及びｐＳＢ２、チゴサッカロミセス・フェルメンタティ（Zygosaccharomyces fermentati）由来のプラスミドｐＳＭ１、クルイベロミセス・ドロソフィラルム（Kluyveromyces drosphilarum）由来のプラスミドｐＫＤ１、ピチア・メンブラネファシエンス（Pichia membranaefaciens）由来の未だ命名されていないプラスミド（「ｐＰＭ１」）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の２μｍプラスミド（例えば国際公開第２００６／０６７５１１号の図１に示す）及び変異体（例えばＳｃｐ１、Ｓｃｐ２、及びＳｃｐ３）が挙げられる（Volkert, et al., 1989, Microbiological Reviews 53: 299; Murray et al., 1988, J. Mol. Biol. 200: 601; Painting, et al., 1984, J. Applied Bacteriology 56: 331）。

２ミクロンファミリープラスミドは、通常は少なくとも３つのオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含む。これらのＯＲＦは各々、２ミクロンファミリープラスミドを多重コピープラスミドとして安定的に維持する機能を有するタンパク質をコードする。これら３つのＯＲＦによりコードされるタンパク質は、ＦＬＰ、ＲＥＰ１、及びＲＥＰ２と記される。２ミクロンファミリープラスミドが、ＦＬＰ、ＲＥＰ１、及びＲＥＰ２をコードするこれら３つのＯＲＦの全てを含んでいない場合には、欠落しているタンパク質をコードするＯＲＦを、他のプラスミド又は染色体組み込みにより、トランスで補う必要がある。

好ましいプラスミドとしては、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来の２ミクロンプラスミドが挙げられる。これは所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードすることが好ましい。

Ｎｏｔ４タンパク質、及び／又は、所望の（例えば異種の）タンパク質が、１又は２以上の調節配列と作動式に連結されたヌクレオチド配列によってコードされてもよい。この場合、斯かる調節配列は、これと適合する条件下で、適切な宿主細胞によるコーディング配列の発現を誘導するように構成される。

斯かるポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するように、種々の方法で改変されてもよい。発現ベクターによっては、斯かるポリヌクレオチドをベクターへ挿入する前に、これを改変することが望ましい、或いは必要である場合がある。組換ＤＮＡ法を用いたポリヌクレオチドの改変技術は、本技術分野では公知である。

調節配列としては、プロモーターが挙げられる。これは、斯かるポリヌクレオチドを発現させるべく、宿主細胞により認識されるポリヌクレオチドである。プロモーターは、斯かるポリペプチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。斯かるプロモーターは、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってよい。例としては、ミュータント、切断型、及びハイブリッドプロモーターが挙げられる。また、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。

糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を誘導する適切なプロモーターの例としては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミナーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）中性アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）耐酸性アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）、又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオーズリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、フザリウム・ヴェネナタム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ヴェネナタム（Fusarium venenatum）Daria（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ヴェネナタム（Fusarium venenatum）Quinn（国際公開第００／５６９００号）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテアーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ベータ−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドラーゼII、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼ III、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼ I、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ベータ-キシロシダーゼ、並びにＮＡ２ ｔｐｉプロモーター（アスペルギウス（Aspergillus）中性アルファアミラーゼ遺伝子由来の改変プロモーターであって、その非翻訳リーダーがアスペルギウス（Aspergillus）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーで置換されてなるもの；非限定的な例としては、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）中性アルファアミラーゼ遺伝子由来の改変プロモーターであって、その非翻訳リーダーアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーで置換されたもの）；並びにそのミュータント、切断型、及びハイブリッドプロモーターの遺伝子から得られるプロモーターが挙げられる。

酵母宿主において有用なプロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞における他の有用なプロモーターとしては、Romanos et al., 1992, 同上に記載のものが挙げられる。

調節配列としては、転写ターミネーターも挙げられる。これは、転写を終了するために、宿主細胞によって認識される配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に、作動式に連結される。宿主細胞において機能しうる任意のターミネーターを用いることができる。

糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において好ましいターミネーターとしては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）アルファ-グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。

酵母宿主細胞において好ましいターミネーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）cytochrome C（CYC１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセルアルデヒドー３ーリン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞において有用な他のターミネーターとしては、Romanos et al., 1992, 同上に記載のものが挙げられる。

調節配列としては、ｍＲＮＡ安定化領域も挙げられる。これは、プロモーターの下流且つ遺伝子のコーディング配列の上流に配置され、遺伝子の発現を増強する。

調節配列としては、リーダーも挙げられる。これは、宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に、作動式に連結される。宿主細胞において機能しうる任意のリーダーを用いることができる。

糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において好ましいリーダーとしては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。

酵母宿主細胞に適したリーダーとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ-１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒドー３ーリン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが挙げられる。

調節配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。これは、ポリペプチドエンコーディング配列の３’末端に作動式に連結され、転写の際に宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡ配列に対してポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される配列である。宿主細胞において機能しうる任意のポリアデニル化配列を用いることができる。

糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において好ましいポリアデニル化配列としては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）アルファ-グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。

酵母宿主細胞において有用なポリアデニル化配列としては、Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990に記載のものが挙げられる。

調節配列としては、シグナルペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、ポリペプチドのＮ末端に連結され、ポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導する、シグナルペプチドをコードする配列である。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端は、ポリペプチドをコードするコーディング配列のセグメントに、翻訳リーディングフレームにおいて連結された、天然のシグナルペプチドコーディング配列を含んでいてもよい。或いは、コーディング配列の５’末端は、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコーディング配列を含んでいてもよい。コーディング配列が天然のシグナルペプチドコーディング配列をふくまない場合には、外来のシグナルペプチドコーディング配列が必要である。或いは、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来のシグナルペプチドコーディング配列によって、天然のシグナルペプチドコーディング配列をそのまま置換してもよい。しかし、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導しうる、任意のシグナルペプチドコーディング配列を用いることができる。

糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において有効なシグナルペプチドコーディング配列としては、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼV、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ、及びリゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテアーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング配列が挙げられる。

酵母宿主細胞、例えばアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体の産生のための酵母宿主細胞において好ましいシグナルペプチドとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子の遺伝子から得られるシグナルペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼの遺伝子から得られるシグナルペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＫＥＸ２の遺伝子から得られるシグナルペプチド、例えば配列番号１３を含む、又は配列番号１３からなるもの、又は、改変されたＫＥＸ２シグナルペプチド配列、例えば配列番号１４を含む、又は配列番号１４からなるものが挙げられる。

特に好ましいシグナルペプチドとしては：国際公開第９０／０１０６３号（引用により本明細書に組み込まれる）に教示される、交配因子アルファシグナルペプチド配列とヒトアルブミンシグナルペプチド配列との融合体を含むシグナルペプチド（斯かるシグナルペプチド配列の例を配列番号１５に示す）；配列番号１６のペンタペプチドモチーフを含むシグナルペプチド（ここでペンタペプチドモチーフは、シグナルペプチド配列の疎水性ドメインに、例えば未成熟タンパク質の−１０〜−２５の位置に存在する（ここで位置−１は、成熟配列の第一のアミノ酸のＮ末端に直接隣接するシグナルペプチド配列のアミノ酸を指し、或いはプロペプチドを含むシグナルペプチド配列の場合、位置−１は、プロペプチドの第一のアミノ酸のＮ末端に直接隣接するシグナルペプチド配列のアミノ酸を指す））（斯かるシグナルペプチド配列の例は、国際公開第２００４／００９８１９号（引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている）；配列番号１６のペンタペプチドモチーフを含むように改変されたアルブミンシグナルペプチド（ペンタペプチドモチーフがシグナルペプチド配列の疎水性ドメイン内に存在していてもよい）（斯かる改変されたシグナルペプチド配列の例を配列番号１７に示す）（ここで斯かるペンタペプチドモチーフは、インベルターゼシグナルペプチド内に挿入されて、改変されたインベルターゼシグナルペプチドを生成するように構成されてもよい（改変されたインベルターゼシグナルペプチドの例を配列番号３５及び配列番号３６に示す））；又は配列番号１６のペンタペプチドモチーフを含むと共に、シグナルペプチド配列のＣ’末端にプロペプチドを含むように改変されたアルブミンシグナルペプチド（ここでペンタペプチドモチーフは、シグナルペプチド配列の疎水性ドメイン内に配置されてもよい）（斯かる改変されたシグナルペプチド配列の例を、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０に示す）が挙げられる。

例えば、アルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体の発現の場合、配列番号１５、配列番号２０、及び配列番号３６を含む、又はこれらからなるシグナルペプチドが特に好ましい。

他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos et al., 1992, 同上に記載されている。

調節配列としては、プロペプチドコーディング配列も挙げられる。これは、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードする配列である。その結果として生じるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によってはチモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、触媒又は自己触媒作用によってプロポリペプチドからプロペプチドが切断されると、活性ポリペプチドに転換される。プロペプチドコーディング配列としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子の遺伝子から得られるものが挙げられる。

シグナルペプチド及びプロペプチド配列がともに存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのＮ末端に隣接して配置され、シグナルペプチド配列はプロペプチド配列のＮ末端に隣接して配置される。

宿主細胞の増殖に伴いポリペプチドの発現を調節する調節配列を追加することも望ましい。調節系の例としては、調節性化合物の存在等の化学的又は物理的な刺激に応答して、遺伝子の発現を開始又は停止する系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系を使用することができる。糸状菌（filamentous fungi）では、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアルファ-アミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）グルコアミラーゼプロモーターを使用することができる。調節配列の他の例としては、遺伝子の増幅を可能とするものが挙げられる。真核系では、これらの調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子や、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子等が挙げられる。これらの例では、前記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、斯かる調節配列と作動式に連結されることになる。

宿主株 は、１又は２以上のシャペロンタンパク質を発現又は過剰発現してもよく、しなくてもよい。例としては、国際公開第２００５／０６１７１８号、国際公開第２００６／０６７５１１号、国際公開第２００６／１３６８３１号、又は国際公開第２０１４／１３８３７１号に記載のものが挙げられる。これらは何れも引用により本明細書に組み込まれる。例えば、宿主株は、以下の遺伝子のうち１又は２以上を過剰発現してもよく、しなくてもよい：ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１、ＵＢＩ４、及びＨＡＣ１、又は切断型イントロン欠失ＨＡＣ１（Valkonen et al., 2003, Applied Environ. Micro., 69: 2065）、並びにＴＩＭ９、ＰＡＭ１８（別名ＴＩＭ１４）、及びＴＣＰ１（別名ＣＣＴ１）、或いはこれらの変異体。中でも、ＰＤＩ１（配列番号２１）又はその変異体若しくは断片、及び／又は、ＥＲＯ１（配列番号２２）又はその変異体若しくは断片の過剰発現が好ましい。過剰発現としては、宿主細胞におけるシャペロンの天然レベルでの発現と比較して、シャペロンの発現が少なくとも２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００％増加することが挙げられる。過剰発現はシャペロン量の増加に相当してもよく、或いはシャペロン活性に相当してもよい。過剰発現は、例えばシャペロンをコードする遺伝子のコピー数を増加させることにより、例えば当該遺伝子を２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のコピー数で含む宿主細胞を提供すること等により達成される。変異体シャペロンは、元のシャペロンに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有することが好ましい。斯かる変異体は、シャペロンの機能的な活性を維持していることが好ましい。

宿主細胞は、プロテアーゼ又はその断片及び／又は変異体をコードする少なくとも１つの異種核酸を含んでいてもよく、いなくてもよい。宿主細胞は、プロテアーゼ、例えばカルシウム依存性セリンプロテアーゼ、例えばキラー発現プロテアーゼ（Killer expression protease：Ｋｅｘ２ｐ）、又はその断片及び／又は変異体等をコードする核酸を少なくとも１つ、含んでいてもよく、いなくてもよい。プロテアーゼ変異体又は断片は機能的である、例えば認識配列Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｘ又はＬｙｓ−Ａｒｇ／Ｘのカルボキシ末端で、ポリペプチドを切断する能力を有することが好ましい。ＫＥＸ２ヌクレオチド配列は配列番号２３を含み、或いは配列番号２３からなっていてもよく、Ｋｅｘ２ｐタンパク質は配列番号２４を含み、或いは配列番号２４からなっていてもよい。ＫＥＸ２及びＫｅｘ２ｐの変異体は、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４と、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有していてもよい。ＫＥＸ２は過剰発現されていてもよく、いなくてもよい。

宿主細胞、最も好ましくはＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）は、ＰＤＩ１及び／又はＥＲＯ１を過剰発現し、Ｋｅｘ２ｐをコードする核酸を少なくとも１つふくむことが好ましい。

Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログをコードするヌクレオチド配列、及び所望のタンパク質は、本技術分野で公知の任意の突然変異誘発法、例えば部位特異的突然変異誘発法、合成遺伝子構築法、半合成遺伝子構築法、ランダム突然変異誘発法、シャッフリング等により調製することができる。

部位特異的突然変異誘発法は、親をコードするポリヌクレオチド内の１又は２以上の所定の部位に、１又は２以上の（例えば数個の）変異を導入する技術である。

部位特異的突然変異誘発法は、インビトロにおいて、所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより達成することができる。また、部位特異的突然変異誘発法は、インビトロにおいて、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド内の一部位を制限酵素で切断した後、前記ポリヌクレオチド内に変異を含むオリゴヌクレオチドを連結することを含むカセット突然変異誘発法により達成することもできる。通常は、プラスミドとオリゴヌクレオチドとを同一の制限酵素で切断することにより、プラスミド及び挿入物に粘着末端を形成し、相互に連結を可能とすることが好ましい。例えばScherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955；及びBarton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966等を参照のこと。

部位特異的突然変異誘発法は、本技術分野で公知の方法により、インビボデ達成することもできる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号公報；Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776；Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290；及びCalissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16等を参照のこと。

本発明では任意の部位特異的突然変異誘発法を使用できる。ポリペプチドの調製に使用可能なキットは多数市販されている。

合成遺伝子構築法は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を設計し、インビトロで合成することを含む。遺伝子合成には多数の技術を用いることができる。例としては、Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054)が記載する多重マイクロチップ系技術や、光プログラム可能なマイクロ流通チップを用いてオリゴヌクレオチドの合成及び組み立てを行う類似の技術が挙げられる。

単一又は多重のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入は、既知の突然変異誘発法、組換法、及び／又は、シャッフリング法を実施し、続いて関連するスクリーニング方を実施することにより、作製及び検証することができる。例としては、Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号に記載の方法が挙げられる。使用可能な他の方法としては、エラー許容性（error-prone）ＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えばLowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号公報；国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域特異的突然変異誘発法（Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145；Ner et al., 1988, DNA 7: 127）等が挙げられる。

突然変異誘発／シャッフリング法を高スループット自動スクリーニング法と組み合わせ、宿主細胞が発現するクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出することもできる（Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子の宿主細胞殻の回収及び即時の配列決定は、本分野で標準的な方法により実施することができる。これらの方法により、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を、迅速に決定することが可能となる。

半合成遺伝子構築法は、合成遺伝子構築法、及び／又は、部位特異的突然変異誘発法、及び／又は、ランダム突然変異誘発法、及び／又は、シャッフリング法の各側面を組み合わせることにより実施することができる。半合成構築法は、合成されたポリヌクレオチド断片を用い、これをＰＣＲ技術と組み合わせたことを特徴とする方法である。従って、例えば遺伝子のある所定の領域を新規に（de novo）合成し、他の領域を部位特異的突然変異誘発プライマーを用いて増幅し、更に他の領域をエラー許容性（error-prone）ＰＣＲ又はエラー非許容性（non-error prone）ＰＣＲ増幅に供することができる。その後、ポリヌクレオチドのサブ配列をシャッフルしてもよい。

本発明の第二の側面は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、真菌宿主細胞の培養物であって、当該真菌宿主細胞が、改変された、例えば低減された、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル、又は、改変された、例えば低減された、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルを有する、培養物を提供する。本発明の第二の側面に係る真菌宿主細胞は、本発明の第一の側面について説明したものと同様である。

或いは、本発明の第二の側面は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、真菌宿主細胞の培養物であって、当該真菌宿主細胞が、上昇したＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル、又は、上昇したＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルを有する、培養物を提供する。斯かる本発明の第二の側面の代替例に係る真菌宿主細胞は、本発明の第一の側面について説明したものと同様である。斯かる例は例えば、宿主の生存性に害を及ぼす所望のタンパク質の産生に有用である。

本発明の第三の側面は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質を、真菌宿主細胞により産生する方法であって、本発明の第一の側面に係る真菌宿主細胞、又は、本発明の第二の側面に係る培養物を供し、前記真菌宿主細胞又はその培養物を培養して、前記所望のタンパク質を産生させることを含む、方法を提供する。斯かる方法を使用することで、例えば、真菌宿主細胞による所望のポリペプチドの産生量を改変することができる。ある例によれば、あるタンパク質の産生量を増加させることが望ましい。他の例によれば、あるタンパク質、例えば宿主細胞に対して毒性を有しうるタンパク質について、その産生量を低減することが望ましい。

斯かる所望のタンパク質は、宿主細胞から分泌されるものであってもよく、なくてもよいが、分泌タンパク質であることが好ましい。

宿主細胞は例えば、所望のタンパク質の産生に適した栄養培地中、本技術分野で公知の方法により培養することができる。例えば、斯かる細胞は、震盪フラスコ培養により、或いは小スケール又は大スケール発酵（例えば連続、バッチ、供給バッチ、又は固相発酵等）により、実験室又は工業用発酵漕により、適切な培地中、ポリペプチドの発現及び／又は単離を許容する条件下で培養することができる。培養は、例えば炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中、本技術分野で公知の方法を用いて実施することができる。適切な培地は、市販の製造業者から入手してもよく、（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ等で）公表されている組成に基づき調製してもよい。好ましい培地としては、実施例２に記載のＭＷ１１Ｄを含む培地が挙げられる。所望のタンパク質が栄養培地中に分泌される場合、所望のタンパク質を培地から直接回収してもよい。所望のタンパク質が分泌されない場合、例えば細胞溶解物から回収すればよい。

培養は小スケールでも大スケールでもよく、例えばマイクロタイタープレート スケール（例えば培養培地体積１０〜５００μＬ）、震盪フラスコスケール（例えば培養体積５〜１０００ｍＬ）、或いは発酵漕又は同等の系のスケール（例えば少なくとも培養体積５ｍＬ、より好ましくは少なくとも１、２、３、４又は５Ｌ、より好ましくは少なくとも１０、５０、１００Ｌから、例えば少なくとも５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００Ｌまで）のいずれでもよい。

培養は、例えば宿主細胞に適したｐＨで行うことができる。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）の場合、そのｐＨは５〜７、例えば５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、又は６．９から、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９又は７までの範囲とすることができる。好ましいｐＨ範囲は、約６．０から約６．４までの範囲である。

所望のタンパク質の検出は、所望のタンパク質に特異的な本技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。斯かる検出方法としては、これらに限定されるものではないが、特異抗体の使用や、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等が挙げられる。

好ましいＨＰＬＣとしては、ゲル浸透ＨＰＬＣ（ＧＰ−ＨＰＬＣ）が挙げられる。適切な装置としてはLC2010 ＨＰＬＣ系（Shimadzu）を用い、これにＵＶ検出器を装備し、Shimadzu VP7.3クライアントサーバーソフトウェアで制御したものが挙げられる。例えば注入量を７５μＬとし、これを７．８ｍｍ ｉｄ×３００ｍｍ長さのTSK G3000SWXＬカラム（Tosoh Bioscience）に、６．０ｍｍ ｉｄ×４０ｍｍ長さのＴＳＫ ＳＷガードカラム（Tosoh Bioscience）を組み合わせたものに導入する。試料のクロマトグラフ測定は、例えば２５ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ７．０中、１ｍＬ・分^−１で、稼働時間２０分間で実施することができる。試料の定量は、例えば２８０ｎｍでＵＶ検出を行い、ピーク面積を既知の濃度（例えば１０ｍｇ／ｍＬ）の組換ヒトアルブミン標準品と比較し、相対吸光係数で補正することにより行うことができる。

本方法は任意により、前記所望のタンパク質を回収することを含む。例としては、宿主細胞又は宿主細胞培養物から、例えば細胞培地又は細胞溶解物から、所望のタンパク質を単離してもよい。

所望のタンパク質の回収は、本技術分野で公知の方法を用いて実施しうる。例えば、所望のタンパク質の栄養培地からの回収は、従来の方法、例えばこれらに限定されるものではないが、収集、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸散、又は沈殿を用いて行うことができる。

本方法は任意により、前記所望のタンパク質を精製することを含む。所望のタンパク質の精製は、本技術分野で公知の種々の方法により実施しうる。例としては、これらに限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマト分画、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば予備的等電点電気泳動法）、示差溶解性（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、又は抽出法（例えばProtein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989）等を用いて、実質的に純粋な所望のタンパク質を得ることができる。

代替的な側面によれば、所望のタンパク質を回収する代わりに、所望のタンパク質を発現する本発明の宿主細胞を、所望のタンパク質の供給源として用いることもできる。

前記所望のタンパク質（例えば所望の異種タンパク質）を培養宿主細胞又は培地から精製する工程は、任意により細胞固定化、細胞分離、及び／又は、細胞破砕をふくんでいてもよい。但し、斯かる工程とは異なる他の少なくとも１つの精製工程、或いは細胞固定化、分離、及び／又は破砕の工程を含む。

細胞固定化技術、例えば細胞をアルギン酸ナトリウムビーズに内包させる技術は、本技術分野で公知である。同様に、細胞分離技術、例えば遠心分離、濾過（例えば直交流濾過）、膨張床（expanded bed）クロマトグラフィー等も、本技術分野で公知である。同様に、細胞破砕の方法、例えばビーズミル処理、超音波処理、酵素暴露等も、本技術分野で公知である。

他の少なくとも１つの精製工程は、タンパク質精製に適した工程であれば、本技術分野で公知の任意の工程を用いることができる。例えば、組換発現アルブミンの回収のための精製技術は、国際公開第２０１０／１２８１４２号、アルブミン特異性リガンド、例えば２−クロロ−４，６−ジ（２’−スルホアニリノ）−Ｓ−トリアジン等を用いた親和性精製；国際公開第９２／０４３６７号、マトリックス由来染料の除去；欧州特許出願第４６４５９０号公報、酵母由来色素の除去；欧州特許出願第３１９０６７号公報、アルカリ沈殿及びそれに続くアルブミンの親油性相への暴露；並びに、国際公開第９６／３７５１５号、米国特許第５７２８５５３号、及び国際公開第００／４４７７２号公報に記載の、完全精製工程等が挙げられる。これらは何れも引用により本明細書に組み込まれる。

アルブミン以外の他の所望のタンパク質も、斯かるタンパク質の精製に有用であることが知られている任意の技術を用いて、培地から精製することができる。

適切な方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は溶媒抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、濃縮、希釈、ｐＨ調節、透析濾過、限界濾過、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ、導電率調節等が挙げられる。

任意により、斯かる方法は、単離されたタンパク質を、商業的又は工業的許容しうるレベルに至るまで精製することを含んでいてもよい。商業的又は工業的許容しうるレベルの純度としては、例えば少なくとも０．０１ｇ・Ｌ^−１、０．０２ｇ・Ｌ^−１、０．０３ｇ・Ｌ^−１、０．０４ｇ・Ｌ^−１、０．０５ｇ・Ｌ^−１，０．０６ｇ・Ｌ^−１，０．０７ｇ・Ｌ^−１、０．０８ｇ・Ｌ^−１、０．０９ｇ・Ｌ^−１、０．１ｇ・Ｌ^−１、０．２ｇ・Ｌ^−１、０．３ｇ・Ｌ^−１、０．４ｇ・Ｌ^−１、０．５ｇ・Ｌ^−１、０．６ｇ・Ｌ^−１、０．７ｇ・Ｌ^−１、０．８ｇ・Ｌ^−１、０．９ｇ・Ｌ^−１、１ｇ・Ｌ^−１、２ｇ・Ｌ^−１、３ｇ・Ｌ^−１、４ｇ・Ｌ^−１、５ｇ・Ｌ^−１、６ｇ・Ｌ^−１、７ｇ・Ｌ^−１、８ｇ・Ｌ^−１、９ｇ・Ｌ^−１、１０ｇ・Ｌ^−１、１５ｇ・Ｌ^−１、２０ｇ・Ｌ^−１、２５ｇ・Ｌ^−１、３０ｇ・Ｌ^−１、４０ｇ・Ｌ^−１，５０ｇ・Ｌ^−１、６０ｇ・Ｌ^−１、７０ｇ・Ｌ^−１、８０ｇ・Ｌ^−１、９０ｇ・Ｌ^−１、１００ｇ・Ｌ^−１、１５０ｇ・Ｌ^−１、２００ｇ・Ｌ^−１，２５０ｇ・Ｌ^−１、３００ｇ・Ｌ^−１、３５０ｇ・Ｌ^−１、４００ｇ・Ｌ^−１、５００ｇ・Ｌ^−１、６００ｇ・Ｌ^−１、７００ｇ・Ｌ^−１、８００ｇ・Ｌ^−１、９００ｇ・Ｌ^−１、１０００ｇ・Ｌ^−１、又はそれ以上のタンパク質濃度が挙げられる。商業的又は工業的許容しうるレベルの純度としては、例えば単離タンパク質中に存在する他の物質（例えば１又は２以上（例えば数個）の夾雑物）の比率が、少なくとも例えば少なくとも５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、又は０．０００００１％未満、最も好ましくは０％のレベルで存在することが挙げられる。

斯かるタンパク質は、例えば少なくとも０．０１ｇ・Ｌ^−１、０．０２ｇ・Ｌ^−１、０．０３ｇ・Ｌ^−１、０．０４ｇ・Ｌ^−１、０．０５ｇ・Ｌ^−１，０．０６ｇ・Ｌ^−１，０．０７ｇ・Ｌ^−１、０．０８ｇ・Ｌ^−１、０．０９ｇ・Ｌ^−１、０．１ｇ・Ｌ^−１、０．２ｇ・Ｌ^−１、０．３ｇ・Ｌ^−１、０．４ｇ・Ｌ^−１、０．５ｇ・Ｌ^−１、０．６ｇ・Ｌ^−１、０．７ｇ・Ｌ^−１、０．８ｇ・Ｌ^−１、０．９ｇ・Ｌ^−１、１ｇ・Ｌ^−１、２ｇ・Ｌ^−１、３ｇ・Ｌ^−１、４ｇ・Ｌ^−１、５ｇ・Ｌ^−１、６ｇ・Ｌ^−１、７ｇ・Ｌ^−１、８ｇ・Ｌ^−１、９ｇ・Ｌ^−１、１０ｇ・Ｌ^−１、１５ｇ・Ｌ^−１、２０ｇ・Ｌ^−１、２５ｇ・Ｌ^−１、３０ｇ・Ｌ^−１、４０ｇ・Ｌ^−１，５０ｇ・Ｌ^−１、６０ｇ・Ｌ^−１、７０ｇ・Ｌ^−１、８０ｇ・Ｌ^−１、９０ｇ・Ｌ^−１、１００ｇ・Ｌ^−１、１５０ｇ・Ｌ^−１、２００ｇ・Ｌ^−１，２５０ｇ・Ｌ^−１、３００ｇ・Ｌ^−１、３５０ｇ・Ｌ^−１、４００ｇ・Ｌ^−１、５００ｇ・Ｌ^−１、６００ｇ・Ｌ^−１、７００ｇ・Ｌ^−１、８００ｇ・Ｌ^−１、９００ｇ・Ｌ^−１、１０００ｇ・Ｌ^−１、又はそれ以上の濃度濃度で供される。

所望のタンパク質を精製することにより、医薬的に許容可能なレベルの純度を達成することが好ましい。タンパク質が医薬的に許容可能なレベルの純度を有するとは、タンパク質が実質的に発熱物質を含まず、惹いては、タンパク質の活性とは関連しない医薬作用を引き起こすことなく、タンパク質の医薬有効量を投与できる濃度を意味する。

本方法は任意により、前記所望のタンパク質を、治療上許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療製剤を製造することを含む。

得られた所望のタンパク質は、その既知の用途のうち何れかに用いるものでもよく、用いなくともよい。斯かる用途の例としては、アルブミンの場合、患者に静脈内（ｉ．ｖ．）投与することにより、重傷の火傷、ショック及び貧血を治療することに加え、補充培養培地としての使用や、他のタンパク質の製剤の賦形剤としての使用が挙げられる。

本発明の方法により得られた治療的、診断的、工業的、家庭的、又は栄養的に有用な所望のタンパク質は、単独で供給又は投与してもよいが、１又は２以上の許容しうる担体又は希釈剤と組み合わせ、製剤（例えば医薬製剤、特に治療的及び／又は診断的に有用なタンパク質の場合）の形態とすることが好ましい。担体又は希釈剤が「許容しうる」とは、所望のタンパク質と適合しうると共に、需要者への投与を意図した製剤の場合、その受容者に有害でないことを意味する。通常、担体又は希釈剤は水又は食塩水であり、無菌で且つ発熱物質を含まない。

任意により、こうして製剤化されたタンパク質を単位投与形態として、例えば錠剤、カプセル、注射溶液等の形態で提供してもよい。

任意により、斯かる方法は更に、前記所望のタンパク質を単位投与形態として提供することを含む。

本発明の第四の側面は、所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の産生量を増加させる方法であって、本発明の第二の側面に係る方法を提供する。

また、本発明の第四の側面は、所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の産生量を増加させるための、本発明の第一の側面に係る宿主細胞、又は、本発明の第二の側面に係る培養物の使用を提供する。

産生量とは、溶液、例えば培養液や細胞溶解混合物等の中における、生成物、例えば所望のタンパク質等の量を意味する。産生量は、例えば参照宿主株からの産生量を１００％として、相対量として表してもよい。宿主株と比較する場合、所定の条件群の下で産生量を測定することが好ましい。絶対産生量は、例えばμＬ当たりｎｇ（ｎｇ／μＬ）又はＬ当たりｇ（ｇ／Ｌ）として表現することができる。

前記所望のタンパク質の産生量は、参照真菌宿主細胞、例えば野生型Ｎｏｔ４タンパク質、例えば配列番号２のタンパク質を有する真菌宿主細胞からの産生量と比較して、少なくとも２％高い、より好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高いことが好ましい。参照真菌宿主細胞は、配列番号２のＮｏｔ４タンパク質を有することが好ましい。

所望のタンパク質は、本発明の第一の側面について説明したとおりであり、特にアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体である。

本発明の第五の側面は、本発明の第二、第三又は第四の側面に係る方法により作製された所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）を提供する。

また、本発明は、本発明の第四の側面の所望のタンパク質を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。斯かる医薬組成物は、更に１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、例えば米国食品医薬品局又は欧州医薬品庁等の規制当局によって承認されたものを含んでいてもよい。更に、本発明は、患者を治療する方法であって、斯かる医薬組成物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。

本発明の第六の側面は、本発明の第一の側面に係る真菌宿主細胞、又は、本発明の第二の側面に係る培養物を調製する方法を提供する。斯かる方法は、（親）真菌宿主細胞を遺伝子工学的に改変することにより、結果として得られるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを改変し、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルを改変、例えば低減し、Ｎｏｔ４遺伝子又はそのホモログ又はその調節配列を改変し、或いは、Ｎｏｔ４遺伝子又はそのホモログの発現レベルを改変することを含む。活性及び／又は発現レベルの変異、欠失、及び修飾は、本発明の第一、第二、及び第三の側面について説明したとおりである。宿主細胞を改変する方法は、本技術分野で公知である。

本発明の第七の側面は、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有すると共に、配列番号２の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０から選択される１又は２以上の位置、好ましくは（ａ）４２９、４３０、４３４、又は４３７；（ｂ）４６３、４６４又は４６６；又は（ｃ）４４２、４４５、４４７又は４５２から選択される１又は２以上の位置に対応する位置に変異を有する、Ｎｏｔ４タンパク質、又はそのホモログを提供する。配列番号２の位置４２９に対応する位置の変異が特に好ましい。

本発明の第七の側面に係るＮｏｔ４タンパク質は、例えば本発明の第一の側面について説明したとおりである。斯かるＮｏｔ４タンパク質は、配列番号４を含む、又は配列番号４からなることが好ましい。本発明の第七の側面のＮｏｔ４タンパク質は、単離されたタンパク質であってもよく、なくてもよい。

本発明の第八の側面は、本発明のＮｏｔ４変異体、例えば配列番号２の変異体であって、野生型Ｎｏｔ４タンパク質、例えば配列番号２、又はそのホモログをコードする宿主細胞と比べて、Ｎｏｔ４タンパク質の発現レベルが低減されてなる変異体若しくはそのホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質の活性レベルが低減されてなる変異体若しくはそのホモログをコードするポリヌクレオチドを提供する。斯かるＮｏｔ４タンパク質は、本発明の第一から第六の側面について説明したとおりである。

好ましいポリヌクレオチドとしては、変異Ｆ４２９Ｉ（配列番号４）を有するＮｏｔ４タンパク質が挙げられる。斯かるポリヌクレオチド配列の例は、配列番号３に供される。

また、本発明は例えば、本発明のＮｏｔ４変異体をコードするポリヌクレオチドと、これと作動式に連結された１又は２以上の調節配列とを含む核酸コンストラクトであって、前記調節配列が、適切な宿主細胞内で、且つ、前記調節配列と適合しうる条件下で、前記コーディング配列の発現を誘導するように構成された、核酸コンストラクトにも関する。適切な調節配列は、本発明の第一から第六の側面について説明したとおりである。斯かるポリヌクレオチドは、ベクター内に位置していてもよく、宿主細胞のゲノム内に位置していてもよい。

従って、本発明は、本発明のＮｏｔ４変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、並び、転写及び翻訳停止シグナルを含む組換ベクターにも関する。また、本発明は、Ｎｏｔ４をコードするポリヌクレオチドと、Ｎｏｔ４のレベル又はＮｏｔ４の活性を改変しうる、例えば低減しうる、１又は２以上（例えば数個）の調節配列とを含むベクターにも関する。種々のヌクレオチド及び調節配列を組み合わせることで、組換ベクター内に１又は２以上の有用な制限部位を組み込んでもよく、これにより、変異体をコードするポリヌクレオチドを、斯かる部位に挿入又は置換することが可能となる。或いは、ポリヌクレオチド又はそれを含む核酸コンストラクトを、適切な発現用ベクターに挿入することにより、斯かるポリヌクレオチドを発現させてもよい。ベクターを作製する際には、コーディング配列が発現用の適切な調節配列と作動式に連結されるように、コーディング配列をベクター内に配置する。

組換ベクターは、組換ＤＮＡ手順に簡便に供することができ、且つ、斯かるポリヌクレオチドの発現を生じさせることが可能な限り、任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）であってよい。ベクターの選択は、通常はベクターを導入する宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは直鎖状でも閉鎖環状プラスミドでもよい。

ベクターは自己複製ベクター、即ち染色体外に存在し、染色体複製とは独立に複製されるベクターであってもよい。その例としては、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体が挙げられる。ベクターは自己複製を行うための何らかの手段を含んでいてもよい。或いはベクターは、宿主細胞内に導入されるとゲノムに組み込まれると共に、導入された染色体と一緒に複製されるものであってもよい。更に、宿主細胞のゲノムに取り込まれるべきＤＮＡは、単一のベクター又はプラスミドにまとめて含まれていてもよく、２又はそれ以上のベクター又はプラスミドに分割して含まれていてもよい。更にはトランスポゾンを用いてもよい。

ベクターは、形質転換、トランスフェクト、形質導入等された細胞の選択を可能とする、１又は２以上の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーとしては、殺生物性、ウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求体に対する原栄養性等を提供する遺伝子生成物を発現する遺伝子が挙げられる。

斯かるベクターは、ベクターが宿主細胞のゲノム内に組み込まれること、又は、ベクターがゲノムとは独立に細胞内で自己複製することを可能とする要素を含むことが好ましい。

ベクターが宿主細胞ゲノム内に組み込まれるには、ベクターが相同又は非相同組換によりゲノム内に組み込まれるように、ポリヌクレオチド内の変異体をコードする配列、又は、ベクターの他の任意の要素の構成を設計してもよい。或いは、ベクターが（１又は２以上の）染色体内の（１又は２以上の）位置に対して、相同組換により正確に組み込まれるように、ベクターに追加のポリヌクレオチドを付与してもよい。正確な位置で組み込みが生じる確率を高めるべく、組み込みのための要素として、対応する標的配列に対して高い配列同一性を有する十分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、及び８００〜１０，０００塩基対の核酸を設けることで、相同組換の可能性を向上させることができる。斯かる組み込みのための要素は、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相同であれば、任意の配列とすることができる。更に、組み込みのための要素は、ポリヌクレオチドをコードする配列であってもよく、コードしない配列であってもよい。或いは、ベクターは、宿主細胞のゲノムに対して、非相同組換により組み込まれてもよい。

ベクターが自己複製を生じるように、所望の宿主細胞内での自律的複製を可能とする複製起点を、ベクターに含めてもよい。複製起点としては、細胞内で自己複製を媒介するよう機能しうる任意のプラスミド複製子が挙げられる。「複製起点」又は「プラスミド複製子」という語は、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。

酵母宿主細胞で使用可能な複製起点の例としては、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、及び、ＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せが挙げられる。

糸状菌（filamentous fungi）細胞で有用な複製起点の例としては、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１が挙げられる（Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67；Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175；国際公開第００／２４８８３号）。ＡＭＡ１遺伝子の単離、及び、当該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に開示の方法に従って行うことができる。

所望のタンパク質の産生を高めるために、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に２コピー以上導入してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、少なくとも１コピー分多い配列を宿主細胞のゲノム内に組み込むことにより、或いは、ポリヌクレオチドと共に増幅可能な選択マーカー遺伝子を導入し、その後に適切な選択物質の存在下で細胞を培養することで、増幅されたコピー数の選択マーカー遺伝子を含む細胞、惹いては増幅されたコピー数のポリヌクレオチドを含むを含む細胞を選択することにより、達成することができる。

上述の要素を連結して本発明の組換ベクターを構築するための手法は、当業者には既知である（例えばSambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照）。

好ましい態様

１．ａ．改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、又は
ｂ．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベル又は発現レベル、又は
ｃ．改変されたＮｏｔ４遺伝子又はそのホモログ、又は
ｄ．Ｎｏｔ４遺伝子又はそのホモログの改変された発現レベル
を有する真菌宿主細胞。

２．前記改変されたレベルが、低減されたレベルである、態様１の真菌宿主細胞。

３．前記改変されたレベルが、上昇したレベルである、態様１の真菌宿主細胞。

４．前記改変されたレベルが、参照真菌宿主細胞、例えば、
ａ．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログが、野生型Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログである真菌宿主細胞、
ｂ．Ｎｏｔ４タンパク質が配列番号２を含み、又は配列番号２からなる真菌宿主細胞、
ｃ．Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｓ２８８Ｃ、又は
ｄ．Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＸＹ１
のレベルに対して相対的に改変されたレベルである、前記の何れかの態様の真菌宿主細胞。

５．所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、例えば異種タンパク質を含む、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

６．前記所望のタンパク質が、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン（antistasin）、ダニ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小モジュラー免疫医薬^{(登録商標)}（「ＳＭＩＰ」）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、Kunitzドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号に記載のもの、アルブミン融合体を有するものも含む）、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、インターフェロンα（アルファ）種及び亜種、インターフェロンβ（ベータ）種及び亜種、インターフェロンγ（ガンマ）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦAx１５、ＩＬ−１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣体、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣体、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン（cyanovirin）−Ｎ、５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエクステンジン（exendin）−４、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（ベータ）、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前駆体及び活性型を含む）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand’s）因子、アルファ１−抗トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘ及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、代謝生成物、抗生物質、又は上記の何れかの変異体若しくは断片から選択される、態様５に係る真菌宿主細胞。

７．前記所望のタンパク質が、アルブミン、変異体、或いはその断片及び／又は融合体を含む、或いはアルブミン、変異体、或いはその断片及び／又は融合体からなる、態様５又は６に係る真菌宿主細胞。

８．前記のアルブミン或いはその変異体、断片及び／又は融合体が、配列番号６に対して、少なくとも７０％の同一性を有する、態様７に係る真菌宿主細胞。

９．前記のアルブミン或いはその変異体、断片及び／又は融合体が、配列番号６に対して、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する、態様７に係る真菌宿主細胞。

１０．前記のアルブミン或いはその変異体、断片及び／又は融合体が、配列番号６に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは配列番号６に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有すると共に、配列番号６の位置Ｋ５７３に対応する位置に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを含む、態様９に係る真菌宿主細胞。

１１．前記のアルブミン或いはその変異体、断片及び／又は融合体が、配列番号６の位置Ｋ５７３に対応する位置に、Ｐ、Ｈ、Ｗ又はＹを含む、態様１０に係る真菌宿主細胞。

１２．前記のアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体が、配列番号６に対して少なくとも９８％の同一性を有すると共に、配列番号６の位置Ｋ５７３に対応する位置にＰを含む、態様１１に係る真菌宿主細胞。

１３．前記融合体が融合パートナーを含むと共に、前記融合パートナーがアルブミン、或いはその変異体又は断片又は融合体ではない、態様５〜１２の何れかに係る真菌宿主細胞。

１４．前記融合体が融合パートナーを含むと共に、前記融合パートナーがモノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン（antistasin）、ダニ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小モジュラー免疫医薬^{(登録商標)}（「ＳＭＩＰ」）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、Kunitzドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号に記載のものインターフェロン、インターロイキン、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、インターフェロンα（アルファ）種及び亜種、インターフェロンβ（ベータ）種及び亜種、インターフェロンγ（ガンマ）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦAx１５、ＩＬ−１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣体、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣体、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン（cyanovirin）−Ｎ、５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエクステンジン（exendin）−４、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（ベータ）、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前駆体及び活性型を含む）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand’s）因子、アルファ１−抗トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘ及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、代謝生成物、抗生物質、又は上記の何れかの変異体若しくは断片から選択される、態様７〜１３の何れかに係る真菌宿主細胞。

１５．前記融合パートナーが、グルカゴン様タンパク質又はその類似物を含む、或いはグルカゴン様タンパク質又はその類似物からなる、態様１３又は１４に係る真菌宿主細胞。

１６．前記融合パートナーが、配列番号１０又は配列番号１１を含む、或いは配列番号１０又は配列番号１１からなる、態様１５に係る真菌宿主細胞。

１７．前記所望のタンパク質が、配列番号１２を含む、或いは配列番号１２からなる、態様５〜１６の何れかに係る真菌宿主細胞。

１８．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベル又は発現レベルが、親真菌宿主細胞、例えば野生型真菌宿主細胞における、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルに対して、相対的に改変された活性レベル又は発現レベルである、態様２〜１７の何れかに係る真菌宿主細胞。

１９．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが、親真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの９０％以下に低減されたレベルである、態様１８に係る真菌宿主細胞。

２０．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが、親真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの８０％以下に低減されたレベルである、態様１９に係る真菌宿主細胞。

２１．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが、親真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの７０％以下に低減されたレベルである、態様２０に係る真菌宿主細胞。

２２．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが、親真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの６０％以下に低減されたレベルである、態様２１に係る真菌宿主細胞。

２３．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが、親真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの５０％以下に低減されたレベルである、態様２２に係る真菌宿主細胞。

２４．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが、親真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの４０％以下に低減されたレベルである、態様２３に係る真菌宿主細胞。

２５．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが、親真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの３０％以下に低減されたレベルである、態様２４に係る真菌宿主細胞。

２６．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが、親真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの２０％以下に低減されたレベルである、態様２５に係る真菌宿主細胞。

２７．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが、親真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルに対して、実質的に０％まで低減されたレベルである、態様２６に係る真菌宿主細胞。

２８．前記宿主細胞が、機能的なＮｏｔ４遺伝子又はそのホモログ又は機能的なＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを欠失している、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

２９．前記宿主細胞が、Ｎｏｔ４遺伝子若しくはそのホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質若しくはそのホモログを欠失している、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

３０．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログとＮｏｔ１タンパク質又はそのホモログとの相互作用を改変するように、前記のＮｏｔ４遺伝子若しくはそのホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質若しくはそのホモログが変異されてなる、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

３１．前記のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログが、配列番号２の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０から選択される位置に対応する位置に変異を有する、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

３２．前記位置が、配列番号２の４２９、４３０、４３４、又は４３７に対応する位置から選択される、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

３３．前記位置が、配列番号２の４６３、４６４又は４６６に対応する位置から選択される、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

３４．前記位置が、配列番号２の４４２、４４５、４４７又は４５２に対応する位置から選択される、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

３５．前記変異が置換、好ましくは非保存アミノ酸である、態様３２〜３４の何れかに係る真菌宿主細胞。

３６．配列番号２の位置４２９に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩ、より好ましくはＩ、Ｌ又はＶ、最も好ましくはＩへの置換である、態様３１、３２又は３５に係る真菌宿主細胞。

３７．配列番号２の位置４２９に対応する位置の変異が、芳香族アミノ酸から脂肪族アミノ酸への置換である、態様３１、３２又は３５に係る真菌宿主細胞。

３８．前記Ｎｏｔ４タンパク質が、配列番号４を含む、或いは配列番号４からなる、態様３６又は３７に係る真菌宿主細胞。

３９．改変されたＮｏｔ４遺伝子、例えば配列番号４をコードするポリヌクレオチドを含む、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

４０．前記宿主細胞が、Ｎｏｔ４遺伝子若しくはそのホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質若しくはそのホモログを欠失してなる、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

４１．ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１、ＵＢＩ４、及びＨＡＣ１又は切断型イントロン欠失ＨＡＣ１、ＴＩＭ９、ＰＡＭ１８、ＴＣＰ１、又はその変異体からなるシャペロンのうち、１又は２以上が過剰発現されている、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

４２．ＫＥＸ２、又はその変異体若しくは断片が、発現又は過剰発現されている、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

４３．ＰＤＩ１又はその変異体が過剰発現されている、又は、ＥＲＯ１又はその変異体が過剰発現されている、態様４１又は４２に係る真菌宿主細胞。

４４．ＰＤＩ１又はその変異体が過剰発現されており、且つ、ＥＲＯ１又はその変異体が過剰発現されている、態様４１又は４２に係る真菌宿主細胞。

４５．ＰＤＩ１又はその変異体が過剰発現されており、且つ、ＫＥＸ２又はその変異体が発現又は過剰発現されている、態様４１又は４２に係る真菌宿主細胞。

４６．ＥＲＯ１又はその変異体が過剰発現されており、且つ、ＫＥＸ２又はその変異体が発現又は過剰発現されている、態様４１又は４２に係る真菌宿主細胞。

４７．ＰＤＩ１又はその変異体が過剰発現されており、且つ、ＥＲＯ１又はその変異体が過剰発現されており、且つ、ＫＥＸ２又はその変異体が発現又は過剰発現されている、態様４１〜４６の何れかに係る真菌宿主細胞。

４８．前記真菌宿主が酵母又は糸状菌である、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

４９．前記宿主細胞が、サッカロミセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイウェロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）である、前記の何れかの態様に係る真菌宿主細胞。

５０．サッカロミセス（Saccharomyces）が、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ダグラシー（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）であり、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、態様４９に係る真菌宿主細胞。

５１．所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、真菌宿主細胞の培養物であって、前記真菌宿主細胞がＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された活性レベルを有することを特徴とする、真菌宿主細胞の培養物。

５２．前記宿主細胞が、態様１〜５０の何れかに規定される宿主細胞である、態様５１の真菌宿主細胞の培養物。

５３．所望のタンパク質、例えば異種タンパク質を、真菌宿主細胞により産生する方法であって、
（ｉ）態様１〜５０の何れかに係る真菌宿主細胞、又は、態様５１若しくは５２に係る培養物を提供し、
（ii）前記真菌宿主細胞又はその培養物を培養して、前記所望のタンパク質を産生させ、
（iii）任意により前記所望のタンパク質を回収し、
（iv）任意により前記所望のタンパク質を精製し、
（ｖ）任意により前記所望のタンパク質を、治療上許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療製剤を製造し、
（vi）任意により前記所望のタンパク質を単位投与形態として提供する
ことを含む方法。

５４．所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の産生量を増加させる方法であって、
（ｉ）ａ．改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、又は
ｂ．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された（好ましくは低減された）活性レベル、又は
ｃ．改変されたＮｏｔ４遺伝子又はそのホモログ、又は
ｄ．改変された（好ましくは低減された）発現レベルのＮｏｔ４遺伝子又はそのホモログ
を有する真菌宿主細胞（例えば酵母又は糸状菌）を提供し、
（ii）前記宿主細胞を培養して前記所望のタンパク質を産生させ、
（iii）任意により前記所望のタンパク質を回収し、
（iv）任意により前記所望のタンパク質を精製し、
（ｖ）任意により前記所望のタンパク質を、治療上許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療製剤を製造し、
（vi）任意により前記所望のタンパク質を単位投与形態として提供する
ことを含む方法。

５５．前記所望のタンパク質の産生量が、参照真菌宿主細胞、例えば野生型Ｎｏｔ４タンパク質を有する真菌宿主細胞、例えば配列番号２を有する真菌宿主細胞からの産生量と比較して、少なくとも２％高い、態様５３又は５４に係る方法。

５６．前記産生量が、参照真菌宿主細胞からの産生量と比較して、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高い、態様５５に係る方法。

５７．前記所望のタンパク質の産生量が、参照真菌宿主細胞、例えば配列番号２のＮｏｔ４タンパク質を有する真菌宿主細胞による産生量と比較して、少なくとも２％高い、態様５５又は５６に係る方法。

５８．前記産生量が、参照真菌宿主細胞からの産生量と比較して、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高い、態様５７に係る方法。

５９．前記所望のタンパク質が、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン（antistasin）、ダニ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小モジュラー免疫医薬^{(登録商標)}（「ＳＭＩＰ」）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、Kunitzドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号に記載のもの、アルブミン融合体を有するものも含む）、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、インターフェロンα（アルファ）種及び亜種、インターフェロンβ（ベータ）種及び亜種、インターフェロンγ（ガンマ）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦAx１５、ＩＬ−１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣体、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣体、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン（cyanovirin）−Ｎ、５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエクステンジン（exendin）−４、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（ベータ）、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前駆体及び活性型を含む）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand’s）因子、アルファ１−抗トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘ及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、代謝生成物、抗生物質、又は上記の何れかの変異体若しくは断片から選択される、態様５３〜５８の何れかに係る方法。

６０．前記所望のタンパク質が、アルブミン、又はその変異体、断片及び／若しくは融合体を含み、或いはアルブミン、又はその変異体、断片及び／若しくは融合体からなる、態様５３〜５９の何れかに係る方法。

６１．前記アルブミン或いはその変異体、断片及び／又は融合体が、配列番号６に対して少なくとも７０％の同一性を有する、態様６０に係る方法。

６２．前記アルブミン或いはその変異体、断片及び／又は融合体が、配列番号６に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する、態様６１に係る方法。

６３．前記アルブミン或いはその変異体、断片及び／又は融合体が、配列番号６に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは配列番号６に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有すると共に、配列番号６の位置Ｋ５７３に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを含む、態様６２に係る方法。

６４．前記アルブミン或いはその変異体、断片及び／又は融合体が、配列番号６の位置Ｋ５７３に対応する位置にＰ、Ｈ、Ｗ又はＹを含む、態様６３に係る方法。

６５．前記アルブミン或いはその変異体、断片及び／又は融合体が、配列番号６に対して少なくとも９８％の同一性を有すると共に、配列番号６の位置Ｋ５７３に対応する位置にＰを含む、態様６４に係る方法。

６６．前記融合体が融合パートナーを含み、前記融合パートナーがアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体ではない、態様５３〜６５の何れかに係る方法。

６７．前記融合体が、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン（antistasin）、ダニ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小モジュラー免疫医薬^{(登録商標)}（「ＳＭＩＰ」）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、Kunitzドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号に記載のものインターフェロン、インターロイキン、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、インターフェロンα（アルファ）種及び亜種、インターフェロンβ（ベータ）種及び亜種、インターフェロンγ（ガンマ）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦAx１５、ＩＬ−１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣体、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣体、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン（cyanovirin）−Ｎ、５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエクステンジン（exendin）−４、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（ベータ）、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前駆体及び活性型を含む）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand’s）因子、アルファ１−抗トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘ及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、代謝生成物、抗生物質、又は上記の何れかの変異体若しくは断片から選択される融合パートナーを含む、態様５３〜６６の何れかに係る方法。

６８．前記融合パートナーが、グルカゴン様タンパク質又はその類似物を含む、或いはグルカゴン様タンパク質又はその類似物からなる、態様６７に係る方法。

６９．前記融合パートナーが、配列番号１０又は配列番号１１を含む、或いは配列番号１０又は配列番号１１からなる、態様６８に係る方法。

７０．前記所望のタンパク質が、配列番号１２を含む、或いは配列番号１２からなる、態様５３〜６９の何れかに係る方法。

７１．前記宿主細胞が、少なくとも１Ｌのスケールで培養される、態様５３〜７０の何れかに係る方法。

７２．前記宿主細胞が、少なくとも２Ｌのスケールで培養される、態様７１に係る方法。

７３．前記宿主細胞が、少なくとも５Ｌのスケールで培養される、態様７２に係る方法。

７４．前記宿主細胞が、少なくとも１０Ｌのスケールで培養される、態様７３に係る方法。

７５．前記宿主細胞が、少なくとも１０００Ｌのスケールで培養される、態様７４に係る方法。

７６．前記宿主細胞が、少なくとも５０００Ｌのスケールで培養される、態様７５に係る方法。

７７．前記所望のタンパク質が、真菌宿主細胞から分泌される、態様５３〜７６の何れかに係る方法。

７８．前記所望のタンパク質が、シグナルペプチドを含む未成熟タンパク質に由来する、態様７７に係る方法。

７９．前記シグナルペプチドが、配列番号１３の、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３５、又は配列番号３６を含む、或いはこれらの何れかの配列からなる、或いは、配列番号１６のペンタペプチドモチーフを含むシグナルペプチドである、態様７８に係る方法。

８０．前記シグナルペプチドが、配列番号１５を含む、或いは配列番号１５からなる、態様７９に係る方法。

８１．前記シグナルペプチドが、配列番号２０を含む、或いは配列番号２０からなる、態様７９に係る方法。

８２．前記シグナルペプチドが、配列番号３６を含む、或いは配列番号３６からなる、態様７９に係る方法。

８３．前記所望のタンパク質が、細胞内に存在する、態様５３〜７７の何れかに係る方法。

８４．態様５３〜８３の何れかに係る方法により製造される所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）。

８５．予防、治療、又は診断のための、態様８４に係る所望のタンパク質。

８６．態様８４又は８５に係る所望のタンパク質と、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物、例えば医薬組成物。

８７．態様８４若しくは８５に係る所望のタンパク質、又は、態様８６に係る組成物を、患者に投与することを含む治療方法。

８８．態様１〜５０の何れかに係る真菌宿主細胞、又は、態様５１若しくは５２に係る培養物を調製する方法であって、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルが低減されるように、（親）真菌宿主細胞を遺伝子工学的に改変することを含む方法。

８９．真菌宿主細胞による所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の産生量等を増加させるための、真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルを減少させる手段の使用であって、前記手段が：Ｎｏｔ４遺伝子を変異又は欠失させることにより、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを変異させ、又はＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを完全に欠失させる手段；前記遺伝子のオープンリーディングフレームを除去又は改変する手段；Ｎｏｔ４遺伝子の調節配列、例えばプロモーター配列及び／又はターミネーター配列を変異又は改変する手段；例えば適切な干渉ＲＮＡ、例えばアンチセンスｍＲＮＡを導入して、Ｎｏｔ４遺伝子の転写を阻害又は低減する手段；適切な転写活性化遺伝子を導入、制御、又は修飾する手段；或いは、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルを阻害する剤を導入する手段である、使用。

９０．配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有すると共に、配列番号２の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０から選択される１又は２以上の位置に対応する位置に変異を含む、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログ。

９１．前記位置が、配列番号２の４２９、４３０、４３４、又は４３７に対応する位置から選択される、態様９０に係るＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ。

９２．前記位置が、配列番号２の４６３、４６４又は４６６に対応する位置から選択される、態様９０に係るＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ。

９３．前記位置が、配列番号２の４４２、４４５、４４７又は４５２に対応する位置から選択される、態様９０に係るＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ。

９４．前記変異が置換であり、好ましくは非保存アミノ酸への置換である、態様９０〜９３の何れかに係るＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ。

９５．配列番号２の位置４２９に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩへの置換、より好ましくはＩ、Ｌ又はＶへの置換、最も好ましくはＩへの置換、態様９０又は９１に係るＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ。

９６．配列番号２の位置４２９に対応する位置の変異が、芳香族アミノ酸から脂肪族アミノ酸への置換である、態様９０又は９１に係るＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ。

９７．配列番号４を含む、或いは配列番号４からなる、態様９０、９１、９５又は９６の何れかに係るＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ。

実施例１：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＮｏｔ４遺伝子の変異
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９は遺伝子型ｃｉｒ° ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２ ｕｂｃ４ ｕｒａ３ ｙａｐ３：：ＵＲＡ３ ｌｙｓ２ ｈｓｐ１５０：ＬＹＳ２を有し、更にＰＤＩ１、ＵＲＡ３及びＹＩｐｌａｃ２１１がＰＤＩ１遺伝子座に組み込まれてなる（Finnis et al, 2010, Microbial Cell Factories 9: 87）。本発明者等は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９（アルブミンをコードするプラスミドで形質転換されたもの）が、その前駆体株、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＢ１と比較して、組換ヒトアルブミンをより高い産生量で産生できるとの知見を得た。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９の特性決定によれば、Ｎｏｔ４遺伝子内に一塩基ポリヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が存在することが判明した。このＳＮＰがＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９のタンパク質産生量向上に寄与しているか否かを決定するために、以下の手順に従って、このＳＮＰ（Ｔ１２８５Ａ、配列番号３）を野生型のもの（即ち位置１２８５がＴ、配列番号１）に戻した。これに伴い、ミュータントＮｏｔ４タンパク質（Ｉ４２９、配列番号４）も野生型（Ｆ４２９、配列番号２）に変更された。

サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＮｏｔ４遺伝子は染色体Ｖに存在する。ミュータントＮｏｔ４遺伝子内のＳＮＰ（Ｔ１２８５Ａ）を野生型のものに戻すべく、遺伝子断片をＮｏｔ４遺伝子座内に導入し、塩基１２８５ＡをＴに変更した。これにより、ミュータントＮｏｔ４タンパク質（位置４２９がＩ、配列番号４）が、野生型Ｎｏｔ４タンパク質（位置４２９がＦ、配列番号２）に変更された。

これを達成するために、まずＰＣＲにより、適切な選択マーカー（ＫａｎＭＸ）を、突然変異誘発単鎖化ＤＮＡプライマーを用いて増幅した。ここで使用したプライマーは、ＫａｎＭＸ遺伝子の５’及び３’末端を改変することにより、Ｎｏｔ４のオープンリーディングフレーム（配列番号２５）の下流の領域と同一のＤＮＡ配列を導入した、以下のプライマーＡ及びプライマーＢである。ＫａｎＭＸはジェネティシン（Geneticin：Ｇ４１８）に対する抵抗性を付与する。
プライマーＡ：
５’−ＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＣＡＣＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＧＧＴＡＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＣＣＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号２６）
プライマーＢ：
５’−ＡＴＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＧＴＡＡＣＧＡＧＴＡＡＡＴＡＧＡＣＴＡＴＡＣＴＧＧＴＡＴＡＴＧＣＴＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧ−３’（配列番号２７）

ＰＣＲ反応を実施してプラスミドｐＤＢ５４３８からＫａｎＭＸ遺伝子を増幅した（図１）。条件は以下のとおりとした。１００ｎｇのプラスミドｐＤＢ５４３８及び０．５μＭの各プライマーを用い、初回の変性は９８℃で３０秒とし、次いで９８℃で１０秒の変性、６３℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１．５分間の伸長からなるサイクルを３５サイクル行い、その後に７２℃で４分間の最終伸長を行ってから、４℃まで冷却した。以上の操作は、Applied Biosystems 2720サーマルサイクラー及びNEB Q5 Hot Start High-Fidelity ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲキット（M0493S）を使用し、総反応体積は５０μＬとし、製造メーカーの指示に従って実施した。

得られた生成物である５’−Ｎｏｔ４ ３’ＵＴＲ−ＫａｎＭＸ−Ｎｏｔ４ ３’ＵＴＲ−３’を、ゲル電気泳動で分析したところ、そのサイズは予想どおり約１．６ｋｂであった。このＰＣＲ増幅生成物を、QIAGEN QIAquick ＰＣＲ精製キットを使用し、製造メーカーの指示に従って精製した。精製生成物を用いて、Ｎｏｔ４が野生型（即ち配列番号１）であるＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）株の形質転換を行った。形質転換にはSigma Yeast形質転換キットを使用し、以下の点を除いては製造メーカーの指示に従って実施した。即ち、形質転換混合物を遠心分離した後、ペレットを１ｍＬ ＹＥＰＤ培地に再懸濁し、３ｍＬ ＹＥＰＤを含む３０ｍＬのSterilinチューブに移した。なお、ＹＥＰＤ（ｇ／Ｌ）の組成は以下の通り。１０ｇのBacto^{（登録商標）}酵母エキスTechnical、２０ｇのBacto^{（登録商標）}ペプトン、２０ｇのグルコース。

このチューブを震盪しながら（２００ｒｐｍ）３０℃で１６時間インキュベートした。その後、Sterilinチューブを３,０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを静かに除去した。次いでペレットを５００μＬの１Ｍソルビトールに再懸濁させた。約１５０μＬを新規調製したＧ４１８寒天プレート（Ｇ４１８最終濃度３００μｇ／ｍＬ）に播種し、寒天表面を下にして３０℃で５日間インキュベートした。なお、Ｇ４１８寒天プレートは以下のように調製した。０．１７ｇの酵母窒素ベース（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４非含有）、０．１ｇのグルタミン酸（一ナトリウム塩、Sigma G-1626）、０．０６９ｇのＣＳＭ−Ｌｅｕ粉末、１００ｍＬのＨ_２Ｏ（注射用無菌水、非発熱性、低張性）、及び１ｇのBacto寒天を、２００ｍＬ用のオートクレーブ済ガラス瓶に入れて混合した。その後ガラス瓶をスチーマーで１時間加熱し、次いで水槽で５５℃まで冷却した。０．６ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬジェネティシン（Geneticin：Ｇ４１８）及び４ｍＬの無菌５０％デキストロース（ｗ／ｖ）を加えて混合した。混合物のアリコートをペトリ皿に注いで静置した。

Ｇ４１８抵抗性形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これをテンプレートとして、プライマーＭＢＰ２６０及びＭＢＰ２６６を用いて第二のＰＣＲを行い、Ｎｏｔ４遺伝子の３’部分、Ｎｏｔ４ ３’ＵＴＲ、ＫａｎＭＸ遺伝子、及び下流配列を含む、５’−Ｎｏｔ４−Ｎｏｔ４ ３’ＵＴＲ−ＫａｎＭＸ−Ｎｏｔ４ ３’ＵＴＲ−３’断片（配列番号２８）を増幅した。
プライマーＭＢＰ２６０：
５’−ＴＧＣＡＡＧＡＴＧＴＡＴＡＧＣＴＣＡＧＧ−３’ （配列番号２９）
プライマーＭＢＰ２６６：
５’−ＴＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧ−３’ （配列番号３０）

ＰＣＲの材料、方法、及び条件は上述の通りである。生成物である５'-Ｎｏｔ４-Ｎｏｔ４ ３’ＵＴＲ−ＫａｎＭＸ-Ｎｏｔ４ ３’ＵＴＲ−３'をゲル電気泳動で分析し、予想どおりサイズが約３．３ｋｂであることを確認した。増幅ＰＣＲ生成物を、QIAGEN QIAquick ＰＣＲ精製キットを用い、製造メーカーの指示に従って精製した。精製生成物を用いて、上記の形質転換法によりＤＰ９［ｐＤＢ２３０５］の形質転換を行った。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９は、Ｎｏｔ４ ＳＮＰ（Ｔ１２８５Ａ、Ｆ４２９Ｉ）を含む株である。ｐＤＢ２３０５はヒトアルブミンをコードするプラスミドである（図３）。Ｇ４１８寒天プレートでの増生及び選択を上記手順に従い行った。抵抗性コロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＭＢＰ２６９及びＭＢＰ２８７を用いたＰＣＲにより、約４．５ｋｂの断片を増幅した。各サイクルの条件を、９８℃で１０秒の変性、６２℃で２０秒のアニーリング、及び７２℃で２．５分間の伸長に変更した他は、前記と同一のキット及び条件を用いた。
プライマーＭＢＰ２６９：
５’−ＡＴＡＡＡＡＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＣＧ−３’ （配列番号３１）
プライマーＭＢＰ２８７：
５’−ＣＡＡＣＡＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＡＧＴＧＧ−３’ （配列番号３２）

得られた生成物を上記に従って清浄化した。Life Technologies BigDyeTerminator v3.1 Cycleシークエンシングキットを用いて、製造メーカーの指示に従って生成物の配列決定を行った。総反応体積は５０μＬとし、清浄化された生成物５０ｎｇをテンプレートとし、１μＭのプライマー（ＭＢＰ２７４及びＭＢＰ２８２を４μＬ用いた。条件は以下の通りとした。初回変性は９６℃で１分間とした。続いて、９６℃で１０秒の変性、５０℃で５秒のアニーリング、６０℃で４分間の伸長からなるサイクルを２５回実施し、その後４℃まで冷却した。シークエンシング反応物を沈殿させ、HiDi（Applied BioSystems）に再懸濁し、Applied BioSystems 3130xl Genetic Analyserにより分析した。
プライマーＭＢＰ２７４：
５’−ＣＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＴＡＣＴＡＣＣ−３’ （配列番号３３）
プライマーＭＢＰ２８２：
５’−ＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＧＧＡＡＣＣ−３’ （配列番号３４）

配列決定分析の結果、３つの形質転換体が野生型のＴを位置１２８５に有していた（Ｆ４２９）。これらの株をＰＲＭ５と命名した。２つの形質転換体がAを位置１２８５に有していた（I４２９）。これらの株をＰＳＭ７と命名した。３つのＰＲＭ５形質転換体と２つのＰＳＭ７形質転換体を、０．５ｍＬ ＢＭＭＤ（アミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない０．１７％（ｗ／ｖ）酵母窒素源（Difco）、３７．８ｍＭの硫酸アンモニウム、３６ｍＭ クエン酸、１２６ｍＭのオルトリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ６．５）、２％（ｗ／ｖ）グルコース、ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整）を各ウェルに含む４８ウェルのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）で培養した（各形質転換体につき６つの重複実験）。このＭＴＰを、湿度室内で振盪（２００ｒｐｍ）しながら３０℃で４８時間インキュベートした。その後、各ウェルから５０μＬの細胞培養を、各ウェル０．４５ｍＬのＢＭＭＤを含む新たな４８ウェルのＭＴＰに移した。この新たなＭＴＰを、湿度室で振盪（２００ｒｐｍ）しながら３０℃で９６時間インキュベートした。

遠心分離で上澄みを単離し、組換アルブミンの生産性をＧＰ−ＨＰＬＣ分析により決定した。ＧＰ−ＨＰＬＣ分析は、LC2010 ＨＰＬＣ系（Shimadzu）にＵＶ検出器を装着したものを用い、Shimadzu VP7.3クライアントサーバーソフトウェアの制御下で行った。７．８ｍｍ ｉｄ×３００ｍｍ長さのTSK G3000SWXＬ カラム（Tosoh Bioscience）に、６．０ｍｍ ｉｄ×４０ｍｍ長さのTSK SW ガードカラム（Tosoh Bioscience）を組み合わせたものに、７５μＬを注入した。試料のクロマトグラムの取得は、２５ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ７．０を１ｍＬ・分−１で流通しながら、ランタイム２０分間で行った。試料の定量は、２８０ｎｍのＵＶ検出によりピーク面積を決定し、既知濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）の組換ヒトアルブミン標準との比を求め、それらの相対吸光係数に基づき補正を行った。

表２に示すように、このＳＮＰの存在により、平均アルブミン産生量は１８％増加していた。

この作業を更にＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）株を用いて繰り返した。簡単に述べると、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＢＸＰ１０の同じＳＮＰを野生型に戻した上で、ＢＸＰ１０（ＳＮＰを含む、即ちＢＳＭ６［ｐＤＢ２２４４］）のアルブミンの産生量を、ＳＮＰを野生型に戻したＢＸＰ１０株（ＢＲＭ４［ｐＤＢ２２４４］）のアルブミンの産生量と比較した。ＢＸＰ１０は遺伝子型ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、及びｐｍｔ１：：ＵＲＡ３を有する。

表３に示すように、このＳＮＰの存在により、アルブミン産生量は８％増加していた（各形質転換体につき６つの重複実験）。

実施例２：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＮｏｔ４遺伝子の変異により、１０Ｌスケールでの組換タンパク質の産生が増強された
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＰＲＭ５［ｐＤＢ２３０５］及びＰＳＭ７［ｐＤＢ２３０５］の生産性を、１０Ｌ発酵漕での増殖性に基づき検討した（Wigley et al (2007) Genetic Engineering News. 27(2):40-42）。発酵はＭＷ１１Ｄ培地を用い、以下の点を除いては、国際公開第９７／３３９７３号の実施例１の記載に従って実施した。即ち、MFCSソフトウェアの代わりにWonderware Supervisory Control and Data Acquisitionソフトウェアを用い、発酵容器を使用前にクエン酸で洗浄し、微量元素ストックとしてはＮａ_２ＭｏＯ_４・５Ｈ_２Ｏの代わりにＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏを含むものを用い、当初ｐＨをアンモニア溶液（比重０．９０１）でｐＨ６．０〜６．４に調整し、容器への無菌空気の初回導入を０．５ｖｖｍではなく約１．０ｖｖｍ（即ち１．０Ｌ）で行い、発酵時のエアフローの増加を２段階ではなく１段階で行い、約１．０ｖｖｍのエアフローを維持し、比増殖速度を約０．０６ｈ^−１とし、指数時定数（Ｋ）を０．０６で維持した。

組換アルブミン標準と比較した組換アルブミンの生産性をＧＰ−ＨＰＬＣにより決定した。上記条件下でのＰＳＭ７［ｐＤＢ２３０５］による組換アルブミンの生産性は、同一条件下で測定したＰＲＭ５［ｐＤＢ２３０５］による生産性と比較して、約１３％高かった（表４）。

この作業を更にＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＢＸＰ１０を用いて１０Ｌスケールで繰り返し、このＳＮＰを含むＢＸＰ１０（即ちＢＳＭ６［ｐＤＢ２３０５］）によるアルブミンの産生量を、このＳＮＰを野生型に戻したＢＸＰ１０株（ＢＲＭ４［ｐＤＢ２３０５］）によるアルブミンの産生量と比較した。

表５に示すように、このＳＮＰの存在により、アルブミン産生量は１５％上昇した（各形質転換体につき２つの重複実験）。

実施例３：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるＮｏｔ４遺伝子の欠失により、組換タンパク質の産生は増強された
ヒト血清アルブミンをコードするプラスミドｐＤＢ２２４４を含むサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＭＴ３０２／２８Ｂ ｃｉｒ°（MATα, leu2, pep4-3, Finnis et al 1993, Eur. J. Biochem, 212: 201-210）のＮｏｔ４遺伝子を欠失させた。欠失は、Ｎｏｔ４遺伝子をマーカーＫａｎＭＸで置換することにより実施した。その結果得られる株（ＭＴ３０２／２Ｂ Δｎｏｔ４）は、Ｎｏｔ４タンパク質の産生能を有さなかった。

これらの株ＭＴ３０２／２８Ｂ及び株ＭＴ３０２／２８Ｂ Δｎｏｔ４を培養し（各株につき８つの重複実験）、そのアルブミン生産性を実施例１の記載に従って決定した。表６に示すように、Ｎｏｔ４の欠失によりアルブミン産生量は６１％増加した。

実施例４： 変異 of the サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＮｏｔ４遺伝子の変異により、アルブミン融合体タンパク質（アルブミン−ＩＬ−１Ｒａ）及びｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）−ＦＬＡＧの発現が増強された
本実施例で発現されるタンパク質は、（ａ）ヒト血清アルブミンのＣ末端に遺伝子工学的にＩＬ−１Ｒａを連結したもの（配列番号３８）、及び、（ｂ）ｓｃＦｖ、ＦＩＴＣ８（Evans et al 2010, Protein Expression and Purification 73:113-124、及び本文献の引用文献16及び17を含む。これらの文献はその全てが引用により本明細書に組み込まれる。）のＣ末端にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を連結したもの（配列番号４０）である。

アルブミン−ＩＬ−１Ｒａの発現の準備として、プラスミドｐＤＢ３９３６（図７）を制限酵素Ａｃｃ６５Ｉ及びＢａｍＨＩで切断し、プラスミドｐＤＢ５９１２（アルブミン−ＩＬ−１Ｒａ発現カセットを含む）を酵素ＮｓｉＩ及びＰｖｕＩで切断した。ｐＤＢ５９１２のプラスミドマップを図６に示し、ＩＬ−１ＲａをコードするＤＮＡ配列を配列番号３７に示す。制限酵素及び緩衝剤はNew England Biolabsのものを用いた。両プラスミド消化産物を、QiagenＰＣＲ精製キットを用い、製造メーカーの指示に従って精製した。

ＰＲＭ５［ｐＤＢ２３０５］、ＰＳＭ７［ｐＤＢ２３０５］、ＢＲＭ４［ｐＤＢ２２４４］、及びＢＳＭ６［ｐＤＢ２２４４］という４つの株を、ＹＥＰＤ培地中、震盪フラスコにて培養し、プラスミド（ｐＤＢ２３０５又はｐＤＢ２２４４）を除去するために更に３回サブ培養した。最終培養物を希釈してＹＥＰＤ上にプレート化し、これらのプレートから単一コロニーをＹＥＰＤ上にパッチ化した。ＹＥＰＤパッチをＢＭＭＤプレートに移し、３０℃でインキュベートした。ＢＭＭＤで成長しない細胞を、プラスミドを有さない細胞として特定した。得られた酵母株を各々、形質転換に供した。形質転換は、Sigma Yeast形質転換キットを使用し、製造メーカーの指示に従って、プラスミドｐＤＢ３０２９（ｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）−ＦＬＡＧ発現用）（ｐＤＢ３０２９のプラスミドマップを図５に示し、ｓｃＦｖ−ＦＬＡＧをコードするＤＮＡ配列を配列番号３９に示す）、又はｐＤＢ３９３６及びｐＤＢ５９１２（ギャップ修復プラスミドｐＤＢ３９３６：ＧＲ：ｐＤＢ５９１２からのアルブミン−ＩＬ−１ＲＡ発現用）の精製された制限酵素消化物を用いて行った。細胞をＢＭＭＤ上にプレート化し、３０℃で５日間インキュベートした。各株６つの形質転換体を、各ウェルに０．５ｍＬ ＢＭＭＤを含む４８ウェルのＭＴＰで培養した。プレートは湿度室内で２００ｒｐｍの振盪下、３０℃で４８時間インキュベートした。次いでこのプレートの各培養物のうち５０μＬを新しいプレートに移し、４５０μＬ ＢＭＭＤ中でサブ培養した。このプレートのインキュベートは９６時間行った。

遠心分離により上澄みを単離し、実施例１と同様の手順で、組換タンパク質の生産性（アルブミン−ＩＬ−１Ｒａ又はＳｃＦｖ）をＧＰ−ＨＰＬＣにより決定した。

表７及び表８に示すように、このＳＮＰ（Ｆ４２９Ｉ）の存在によって、アルブミン−ＩＬ−１Ｒａの産生量は増加した。ＤＰ９由来株では、Ｎｏｔ４中にこのＳＮＰを含む株（ＰＳＭ７）の産生量は、野生型Ｎｏｔ４を有する株（ＰＲＭ５）（表７）の産生量と比較して８％高かった。ＢＸＰ１０由来株では、Ｎｏｔ４中にこのＳＮＰを含む株（ＢＳＭ６）の産生量は、野生型Ｎｏｔ４を有する株（ＢＲＭ４）の産生量と比較して２４％高かった（表８）。

表９及び表１０に示すように、このＳＮＰ（Ｆ４２９Ｉ）の存在により、ＳｃＦｖ−ＦＬＡＧの産生量が増加した。ＤＰ９由来株では、Ｎｏｔ４中にこのＳＮＰを含む株（ＰＳＭ７）の産生量は、野生型Ｎｏｔ４を有する株（ＰＲＭ５）の産生量と比較して１４％高かった（表９）。ＢＸＰ１０由来株では、Ｎｏｔ４中にこのＳＮＰを含む株（ＢＳＭ６）の産生量は、野生型Ｎｏｔ４を有する株（ＢＲＭ４）の産生量と比較して１９％高かった（表１０）。

Claims (17)

1. ａ．改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、又は
   ｂ．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベル、又は
   ｃ．改変されたＮｏｔ４遺伝子又はそのホモログ、又は
   ｄ．Ｎｏｔ４遺伝子、又はそのホモログの改変された発現レベル
   を有する真菌宿主細胞。
2. 前記改変されたレベルが低減されたレベルである、請求項１に記載の真菌宿主細胞。
3. 前記低減されたレベルが、参照真菌宿主細胞、例えばＮｏｔ４タンパク質が配列番号２を含み、又は配列番号２からなる真菌宿主細胞と比較して減少したレベルである、請求項２に記載の真菌宿主細胞。
4. 前記真菌宿主が酵母又は糸状菌である、請求項１〜３の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
5. 所望のタンパク質、例えば異種タンパク質、例えば血清タンパク質、好ましくはアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
6. 前記Ｎｏｔ４タンパク質が、配列番号２の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０から選択される位置に対応する位置、好ましくは４２９、４３０、４３４、又は４３７から選択される位置に変異を含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
7. 配列番号２の位置４２９に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩ、より好ましくはＩ、Ｌ又はＶ、最も好ましくはＩに対する置換である、請求項６に記載の真菌宿主細胞。
8. 配列番号２の位置４２９に対応する位置の変異がＦ４２９Ｉである、請求項６に記載の真菌宿主細胞。
9. 配列番号４をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜８の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
10. 前記宿主細胞が、Ｎｏｔ４遺伝子若しくはそのホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質若しくはそのホモログを欠失している、請求項１〜５の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
11. 前記宿主細胞が、サッカロミセス（Saccharomyces）例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項１〜１０の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
12. 所望のタンパク質、例えば異種タンパク質を、真菌宿主細胞により産生する方法であって、
    （ｉ）請求項１〜１１の何れか一項に記載の真菌宿主細胞を供し、
    （ii）前記真菌宿主細胞又はその培養物を培養して前記所望のタンパク質を産生させ、
    （iii）任意により前記所望のタンパク質を回収し、
    （iv）任意により前記所望のタンパク質を精製し、
    （ｖ）任意により前記所望のタンパク質を、治療上許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療製剤を製造し、
    （vi）任意により前記所望のタンパク質を単位投与形態として提供する
    ことを含む方法。
13. 所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の産生量を増加させる方法であって、
    （ｉ）ａ．改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、又は
    ｂ．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された（好ましくは低減された）活性レベル、又は
    ｃ．改変されたＮｏｔ４遺伝子又はそのホモログ、又は
    ｄ．Ｎｏｔ４遺伝子、又はそのホモログの改変された（好ましくは低減された）発現レベル
    を有する真菌宿主細胞（例えば酵母又は糸状菌）を供し、
    （ii）前記宿主細胞を培養して前記所望のタンパク質を産生させ、
    （iii）任意により前記所望のタンパク質を回収し、
    （iv）任意により前記所望のタンパク質を精製し、
    （ｖ）任意により前記所望のタンパク質を、治療上許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療製剤を製造し、
    （vi）任意により前記所望のタンパク質を単位投与形態として提供する
    ことを含む方法。
14. 前記所望のタンパク質の産生量が、参照真菌宿主細胞、例えば配列番号２のＮｏｔ４タンパク質を有する真菌宿主細胞による産生量と比べて、少なくとも２％高い、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記所望のタンパク質が、アルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体である、請求項１２〜１４の何れか一項に記載の方法。
16. 前記宿主細胞が、少なくとも５Ｌのスケールで培養される、請求項１２〜１５の何れか一項に記載の方法。
17. 真菌宿主細胞による所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の産生量を増加させるための、前記真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルを減少させる手段の使用。