JP2019505573A - 薬剤としての使用のため、特にパーキンソン病の治療のための新規二環式化合物 - Google Patents

薬剤としての使用のため、特にパーキンソン病の治療のための新規二環式化合物 Download PDF

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Abstract

本発明は、式（Ａ）で表される基本構造を有する新規小分子化合物に関し、式中、特定の例示的な実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ６およびＲ７の一方は、Ｈ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＮＲ９ ２から選択され、他方は、−ＣＯＮＲ９ ２および−ＣＯＮＲ１１Ｒ９から選択され、ここでＲ９およびＲ１１は、それぞれ、（おそらく多重）置換されたアルキルおよびＨまたはアルキルである。本発明の化合物は、酵素カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）を阻害し、低いオフターゲットプロフィールを示す。前記化合物は、薬剤としての使用のため、特にパーキンソン病の予防または治療における使用のために提供される。
【化１】

（Ａ）

Description

本発明は、薬剤としての使用のため、特にパーキンソン病の予防または治療における使用のための新規小分子化合物に関する。
過去５０年間にわたって、脳における神経伝達物質の分解に関与するマグネシウム依存性酵素であるカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）は、様々な末梢および中枢神経系障害の治療のための魅力的な標的となってきた。この酵素は、２つの形態、すなわち可溶性形態（Ｓ−ＣＯＭＴ）および膜結合形態（ＭＢ−ＣＯＭＴ）で存在し、遍在的に発現される。
ドーパミンの前駆体であるレボドパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）および芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）阻害剤とＣＯＭＴ阻害剤との同時投与は、インビボでのＬ−ＤＯＰＡの半減期を増加させる。したがって、ＣＯＭＴ阻害剤はパーキンソン病の補助療法の候補物質である。臨床的に関連するＣＯＭＴ阻害剤は、ニテカポン（ＯＲ−４６２）、エンタカポン（ＯＲ−６１１）、トルカポン（Ｒｏ４０−７５９２）、ネビカポン（ＢＩＡ３−２０２）およびオピカポン（ＢＩＡ９−１９６７）に例示される。これまでのところ、ＣＯＭＴ阻害剤の唯一の臨床応用は、第ＩＩＩ相臨床試験中であるエンタカポンおよびオピカポンを使用したＬ−ＤＯＰＡおよびＡＡＤＣ阻害剤との同時投与である。他の阻害剤は、効果の欠如または安全性の懸念のいずれかのために中止されたかまたは市場から撤収された。
中枢および末梢の両方に作用するトルカポンの使用は、いくつかの症例で重篤な肝毒性を引き起こした。主として末梢に作用するエンタカポンは、より好ましい毒性プロフィールを有するが、バイオアベイラビリティの問題を抱える。
本発明の目的は、副作用（肝毒性）が減少し、効力が増大した新規ＣＯＭＴ阻害剤を提供することである。この目的は、独立請求項の主題によって達成される。
用語および定義
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「置換された」という用語は、化学的部分に関連して使用される場合、化学的部分の１または数個の水素原子が、水素以外の置換原子または−Ｄ（重水素）、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、＝Ｏ、−ＯＨ、−ＯＲ、＝Ｓ、−ＳＨ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３Ｒ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２Ｒ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨＲ、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＯＰＯ３ ２−、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＯＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＣＮＯ、−ＮＣＯ、−ＣＮＳ、−ＳＣＮ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２Ｆ［式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、５〜１０員のアリールもしくはヘテロアリールである］、ならびにＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＦから選択される２〜２５個の原子と任意の適切な量のＨ原子から成る置換基部分［ここで置換基部分は２９〜４００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する］から選択される置換基部分で置換されていることを意味する。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「アルキル」という用語は、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素置換基を指す。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２，２−メチルペンチル、２，３−メチルペンチル等が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素置換基を指す。アルケニルは、直鎖状であっても分枝状であってもよい。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和炭化水素置換基を指す。アルキニルは、直鎖状であっても分枝状であってもよい。一例は、エチニル（ＣＣＨ）基である。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「ヘテロアルキル」という用語は、少なくとも１つの炭素が酸素原子、硫黄原子または窒素原子で置換された、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素置換基を指す。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「シクロアルキル」という用語は、飽和環状炭化水素置換基を指す。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「複素環式アルキル」という用語は、少なくとも１つの炭素が酸素、窒素または硫黄原子で置換された飽和環式基を指す。飽和複素環置換基の例には、モルホリン、ピペラジン、ピロリジン、チオラン、テトラヒドロフラン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、チアゾリジン、ピペリジン、オキサン基等が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「アリール」という用語は、環状芳香族炭化水素置換基を指す。
「ヘテロアリール」という用語は、少なくとも１つの炭素原子が酸素、窒素または硫黄原子で置換されたアリール化合物を指す。アリールまたはヘテロアリール置換基の例には、ベンゼン、ピリジン、ピロール、キノロン、イミダゾール、トリアジン、ピラジン、ピリミジン、ピラダジン、チアジン、ジオキシン、テトラゾール、トリアゾール、チアジアゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾール、フラン等が含まれるが、これらに限定されない。
発明の説明
本発明の第一の態様によれば、一般式（Ａ）：

（Ａ）、
［式中、
−Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ２から選択され；
−Ｒ２は、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−ＯＲ１１、−ＳＯ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＲ１１、−ＳＯ２−ＮＲ１１ ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ２−ＯＲ１１、−ＣＮ、−ＣＯＲ１１、−ＣＯ２Ｒ１１、−ＣＯＮＨＲ１１、−ＣＯＮＲ１１ ２、−ＣＦ３およびハロゲンから選択され；
−Ｒ３は、Ｈ、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−ＯＲ１１、−ＳＯ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＲ１１、−ＳＯ２−ＮＲ１１ ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ２−ＯＲ１１、−ＣＮ、−ＣＯＲ１１、−ＣＯ２Ｒ１１、−ＣＯＮＨＲ１１、−ＣＯＮＲ１１ ２、−ＣＦ３およびハロゲンから選択され；
−Ｒ４およびＲ５は、−Ｈ、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換または非置換Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＮＯ２から独立して選択され；
‐Ｒ６およびＲ７の一方は、−ＣＯＮＲ９Ｒ１１、−ＣＯＮＲ９ ２、−ＣＯＲ９、−ＣＯＯＲ９、−ＳＯ２−ＯＨ、−ＳＯ２Ｒ９、−ＳＯ２−ＯＲ９、−ＳＯ２−ＯＲ１１、−ＳＯ２ＮＨＲ１１、−ＳＯ２ＮＲ９Ｒ１１、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＦ３および−ＳＯ２ＮＲ９ ２から選択され；
‐Ｒ６およびＲ７の他方は、Ｈ、−ＣＯＮＨ２、ＣＯＯＨ、−ＳＯ２−ＯＨ、−ＳＯ２ＮＨ２、−Ｙ−Ｒ９、−Ｙ−Ｒ９ ２および−Ｒ９から選択され、
ここで、
−Ｒ９はＲ１０−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり；
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＲ１１−、−Ｏ−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−、−ＯＣＯＮＲ１１−および−ＯＣＯＯ−から選択され；
−ｎは、０、１、２、３および４から選択される整数であり、
‐それぞれのＲ１０は、他のＲ１０とは独立して、置換または非置換Ｃ１−Ｃ８アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ８アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ８アルキニル、置換または非置換Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルおよび置換または非置換５〜１０員アリールまたはヘテロアリールから選択され；ならびに
−それぞれのＲ１１は、他のＲ１１とは独立して、Ｈまたは非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルである］
によって特徴付けられる化合物が提供される。
特定の実施形態では、Ｒ７は、−ＣＯＮＲ１１Ｒ９、−ＣＯＮＲ９ ２、−ＣＯＲ９、−ＣＯＯＲ９、−ＳＯ２−ＯＨ、−ＳＯ２Ｒ９、−ＳＯ２−ＯＲ９、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＲ９、−ＳＯ２ＮＲ１１Ｒ９および−ＳＯ２ＮＲ９ ２から選択される電気陰性の電子求引性基であり、Ｒ９は、式の描画に見られるように分子の「右側」部分に立体障害を与え、したがって、上記のＲ９について定義した任意の形態を自由にとることができる。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨである。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨである。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ６はＨ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＮＲ９ ２から選択され、ここでＲ９は上記で定義したのと同じ意味を有する。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９ ２および−ＣＯＮＲ１１Ｒ９から選択され、ここでＲ９およびＲ１１は上記で定義したのと同じ意味を有する。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ６はＨ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＮＲ９ ２から選択され、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９ ２および−ＣＯＮＲ１１Ｒ９から選択され、ここでＲ９およびＲ１１は上記で定義したのと同じ意味を有する。
特定の実施形態では、ｎは０である。
特定の実施形態では、ｎは１である。
特定の実施形態では、ｎは２である。
特定の実施形態では、Ｒ６は−ＣＯＮＲ１１Ｒ１１であり、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ここでそれぞれのＲ１１は、他のＲ１１とは独立して、Ｈまたは非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、Ｒ９は上記で定義したのと同じ意味を有する。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ６は−ＣＯＮＲ１１Ｒ１１であり、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ここでそれぞれのＲ１１は、他のＲ１１とは独立して、Ｈまたは非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、Ｒ９は上記で定義したのと同じ意味を有する。
特定の実施形態では、Ｒ６およびＲ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびに
−Ｒ９はＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ６およびＲ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびに
−Ｒ９はＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである。
特定の実施形態では、Ｒ６は−ＣＯＮＲ１１ ２であり、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびに
−Ｒ９はＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ６は−ＣＯＮＲ１１ ２であり、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびに
−Ｒ９はＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである。
特定の実施形態では、Ｒ６はＨであり、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびに
−Ｒ９はＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ６はＨであり、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびに
−Ｒ９はＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである。
特定の実施形態では、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびに
−Ｒ９は（ＣＨ２）４−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換メチルまたはエチルである。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ６はＨであり、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびに
−Ｒ９は（ＣＨ２）４−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換メチルまたはエチルである。
特定の実施形態では、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はＨであり、Ｒ６は−ＣＯＮＥｔ２であり、Ｒ７は−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびに
−Ｒ９は（ＣＨ２）４−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換メチルまたはエチルである。
特定の実施形態では、化合物は、
・Ｎ２，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−テトラエチル−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２，３−ジカルボキサミド（Ａ１）

（Ａ１）、
・（３−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−カルボニル］−エチル−アミノ］プロピルアセタート）（Ａ２）

（Ａ２）、
・Ｎ２−（６−アミノヘキシル）−Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−トリエチル−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２，３−ジカルボキサミド（Ａ４）

（Ａ４）、
・Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−トリエチル−６，７−ジヒドロキシ−Ｎ２−［４−［メチル（ペンタノイル）アミノ］ブチル］−５−ニトロ−ナフタレン−２，３−ジカルボキサミド（Ａ５）

（Ａ５）、
・ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［６−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−

（Ａ６）、
・４−［４−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−カルボニル］−エチル−アミノ］ブチル−メチル−アミノ］−４−オキソ−ブタン酸（Ａ８）

（Ａ８）、
・Ｎ２−［４−［４−アミノブタノイル（メチル）アミノ］ブチル］−Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−トリエチル−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２，３−ジカルボキサミド（Ａ９）

（Ａ９）、
・ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［４−［４−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−

（Ａ１０）、
・Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−トリエチル−６，７−ジヒドロキシ−Ｎ２−［４−［［６−（２−メトキシフェニル）−６−オキソ−ヘキサノイル］−メチル−アミノ］ブチル］−５−ニトロ−ナフタレン‐２，３−ジカルボキサミド（Ａ１１）

（Ａ１１）および
・ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［１−シクロヘキシル−２−［４−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−カルボニル］−エチル−アミノ］ブチル−メチル−アミノ］−２−オキソ−エチル］カルバマート（Ａ１３）

（Ａ１３）から選択されて提供される。
本発明の別の態様によれば、一般式（Ｂ）

（Ｂ）、
［式中、
−Ｒ８は、Ｃ、Ｓ、Ｎ、Ｏ、ＮＲ１１およびＣＲ１１から選択され；
−Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ９およびＲ１１は、上記で定義したのと同じ意味を有する］
によって特徴付けられる化合物が提供される。
特定の実施形態では、
−Ｒ１は−ＯＨであり、
−Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、および
−Ｒ８はＳであり；
ならびにＲ９は上記で定義したのと同じ意味を有する。
特定の実施形態は、式（Ｂ２）、（Ｂ４）、（Ｂ５）、（Ｂ６）、（Ｂ８）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ１１）または（Ｂ１３）のいずれか１つを特徴とする。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の上記で開示した態様および実施形態のいずれか１つに従う化合物は、薬剤としての使用のために提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の上記で開示した態様および実施形態のいずれか１つに従う化合物は、パーキンソン病、アルツハイマー病、多剤耐性結核および肥満関連障害を含む群から選択される状態の予防または治療において使用する薬剤としての使用のために提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、パーキンソン病、アルツハイマー病、多剤耐性結核および肥満関連障害を含む群から選択される状態の予防または治療における使用のための、本発明の上記で開示した態様および実施形態のいずれか１つに従う化合物を含有する剤形が提供され、ここで前記剤形は吸入または経口投与に適し、特に、前記剤形は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、粉末、溶液、懸濁液またはシロップである。
本発明のさらに別の態様によれば、パーキンソン病、アルツハイマー病、多剤耐性結核および肥満関連障害を含む群から選択される状態の予防または治療における使用のための、ＨＩＢＣＨに結合しないことを特徴とする、ＣＯＭＴの阻害剤が提供される。
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の項目に開示される：
項目１：一般式（Ｂ）：

（Ｂ）、
［式中、
−Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ２から選択され；
−Ｒ２は、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−ＯＲ１１、−ＳＯ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＲ１１、−ＳＯ２−ＮＲ１１ ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ２−ＯＲ１１、−ＣＮ、−ＣＯＲ１１、−ＣＯ２Ｒ１１、−ＣＯＮＨＲ１１、−ＣＯＮＲ１１ ２、−ＣＦ３およびハロゲンから選択され；
−Ｒ３は、Ｈ、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−ＯＲ１１、−ＳＯ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＲ１１、−ＳＯ２−ＮＲ１１ ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ２−ＯＲ１１、−ＣＮ、−ＣＯＲ１１、−ＣＯ２Ｒ１１、−ＣＯＮＨＲ１１、−ＣＯＮＲ１１ ２、−ＣＦ３およびハロゲンから選択され；
−Ｒ８は、Ｃ、Ｓ、Ｎ、Ｏ、ＮＲ１１およびＣＲ１１から選択され；
−Ｒ９はＲ１０−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり；
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＲ１１−、−Ｏ−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−、−ＯＣＯＮＲ１１−および−ＯＣＯＯ−から選択され；
−ｎは、０、１、２、３および４から選択される整数であり、
‐それぞれのＲ１０は、他のＲ１０とは独立して、置換または非置換Ｃ１−Ｃ８アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ８アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ８アルキニル、置換または非置換Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルおよび置換または非置換５〜１０員アリールまたはヘテロアリールから選択され；ならびにそれぞれのＲ１１は、他のＲ１１とは独立して、Ｈまたは非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルである］
によって特徴付けられる化合物。
項目２：項目１の一般式（Ｂ）によって特徴付けられる化合物であって、式中、
−Ｒ１は−ＯＨであり、
−Ｒ２は−ＮＯ２であり、Ｒ３はＨであり、
−Ｒ８はＳであり、
およびＲ９は項目１で定義したのと同じ意味を有する、
化合物。
項目３：ｎが０である、項目１または２に記載の化合物。
項目４：ｎが１である、項目１または２に記載の化合物。
項目５：ｎが２である、項目１または２に記載の化合物。
項目６：ｎが３である、項目１または２に記載の化合物。
項目７：項目１〜６のいずれか１つに記載の化合物であって、式中、
−Ｒ９はＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである、
化合物。
項目８：項目１〜７のいずれか１つに記載の化合物であって、式中、
−Ｒ９は（ＣＨ２）４−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
−Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
−ｎは１または２であり、
−Ｒ１０は、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
−Ｒ１１は、非置換メチルまたはエチルである、
化合物。
さらなる実施形態は以下の式である：


本発明につながる実験作業において、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の２つの小分子を、トルカポンおよびエンタカポンと比較するためのリードＣＯＭＴ阻害剤として合成した（図１）。本発明者らは、トルカポン、エンタカポンならびにＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の誘導体によるＣＯＭＴの阻害を比較した（図９）。結果は、側鎖が、ＣＯＭＴ阻害を損なうことなく変化し得ることを示す。
続いて、トルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の４つの化合物をオフターゲット結合に関して比較した。
共通の治療標的を持つ構造的に関連する阻害剤は、オフターゲット結合の差異によって引き起こされる潜在的な毒性の問題に関して異なり得る。トルカポンの肝毒性作用の根底にある原因は、酵素３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素（ＨＩＢＣＨ、ＣＡＳ ＮＯ ９０２５−８８−１）へのそのオフターゲット結合であり得る。ＨＩＢＣＨ酵素は、バリンの異化経路において３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからＣｏＡを除去することによって毒性のメタクリリル−ＣｏＡの蓄積を防止するために重要であり、ヒト肝臓における酵素活性の低下は肝硬変および肝細胞癌と相関しており、メタクリリル−ＣｏＡを処理する能力の低下は肝不全を導き得ることを示唆する。したがって、ＨＩＢＣＨの阻害は、細胞毒性であるメタクリリル−ＣｏＡの蓄積をもたらす。トルカポン特異的なオフターゲットとしてのこのタンパク質の同定は、肝臓におけるトルカポン誘導性毒性作用についての新規な可能性のある説明を提供する。ＨＩＢＣＨに結合する場合、トルカポンは、２つの芳香族部分が互いに傾斜した立体配座をとる。対照的に、ＣＰＴ−４０１およびエンタカポンは相対的な平面性を特徴とする。したがって、これらのＨＩＢＣＨへの結合が防止される。
カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ、ＥＣ ２．１．１．６）は、可溶性形態（Ｓ−ＣＯＭＴ）および膜結合形態（ＭＢ−ＣＯＭＴ）の２つの形態で存在する。サイトゾルタンパク質として、Ｓ−ＣＯＭＴはほとんどの組織で主要な形態であり、内在性および生体異物性カテコールの不活性化においてより重要な役割を果たす。ラットとヒトのＣＯＭＴは８１％の配列同一性を共有し、どちらも構造的に高度に保存されたＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼフォールドファミリーに属する。本発明の主な焦点はヒトにおける新規ＣＯＭＴ阻害剤の効力であるので、組織内で過剰発現させた組換えヒトＣＯＭＴタンパク質（実験手順参照）を阻害アッセイで使用した。以前に記述されているアッセイ法（Ｋｕｒｋｅｌａ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４．３３１（１）：１９８−２００）を適用し、Ｓ−（５−アデノシル）−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）の存在下での反応混合物中の基質エスクレチンのスコポレチンへのメチル化を蛍光定量的に測定した。
図２は、化合物ＣＰＴ−４０１（Ａ１）、ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）のＣＯＭＴ阻害曲線を示す。トルカポンおよびエンタカポンを参照として阻害アッセイに含めた。ラット肝ホモジネートにおいてエンタカポンは１６０ｎＭのＩＣ５０を有し、トルカポンは３６ｎＭのＩＣ５０を有することが報告された（Ｋｉｓｓ，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１４．５７（２１）：８６９２−７１７）。使用されたアッセイでは、トルカポンは、やはり、ヒト組換えＣＯＭＴに関してインビトロ実験条件下でエンタカポンより強力であることが認められ、ＩＣ５０値はそれぞれ、トルカポンについては５３ｎＭおよびエンタカポンについては３８６ｎＭであった。アッセイにおいて、リード化合物ＣＰＴ−４０１（Ａ１）はトルカポンと類似の活性を示し、ＩＣ５０は５４ｎＭであり、ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）は１７９ｎＭのＩＣ５０を示した。したがって、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）によるＣＯＭＴの阻害は、トルカポンの阻害と同様であった。ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）は、エンタカポンより高いが、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびトルカポンより有意に低いＣＯＭＴ阻害を示した（図２参照）。
副作用は、多くの場合、薬剤の他のタンパク質へのオフターゲット結合によって引き起こされる。エンタカポンと比較してトルカポンの重篤な副作用は、トルカポンと特定のタンパク質との相互作用に起因する可能性が高いが、エンタカポンは相互作用しない。したがって、本発明者らは、示差競合捕獲化合物質量分析（ｄＣＣＭＳ）を用いて、トルカポンと相互作用するがエンタカポンとは相互作用しないタンパク質を同定した。詳細については実験項を参照されたい。
酵素３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ加水分解酵素（ＨＩＢＣＨ）は、トルカポンおよびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）に結合するが、エンタカポンおよびＣＰＴ−４０１（Ａ１）には結合しないことが同定された（図５、図６）。これは、２つの分子対の共通の構造的特徴によって説明することができる：トルカポンおよびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）は、２つの芳香族部分が互いに傾斜した立体配座をとる。この立体配座はＨＩＢＣＨ結合ポケットにきっちりと適合する（データは示していない）。エンタカポン、さらにそれ以上にＣＰＴ−４０１（Ａ１）は、全体的な平面立体配座をとる傾向があるか、またはこれに限定される。
本発明者らは、トルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）のミトコンドリア細胞毒性を比較した。トルカポンおよびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）のミトコンドリア細胞毒性は、エンタカポンおよびＣＰＴ−４０１（Ａ１）の細胞毒性よりも有意に高いことが実証された（図７）。
本発明の化合物である新規ＣＯＭＴ阻害剤ＣＰＴ−４０１（Ａ１）は、トルカポンと比較して低いオフターゲット結合およびエンタカポンと比較して高い効力を示す。したがって、これは、低いミトコンドリア細胞毒性を有する強力な新規ＣＯＭＴ阻害剤であり、パーキンソン病の治療のための有望な化合物である。
本発明の化合物の他の適応症は、アルツハイマー病、多剤耐性結核ならびに肥満および代謝疾患である。
ＣＯＭＴの阻害に加えて、エンタカポンおよびトルカポンは、α−シヌクレインモノマーの凝集を阻害することが示されている。これは、パーキンソン病の治療における第二の有益な効果を構成する。
ＣＯＭＴ阻害剤であるエンタカポンおよびトルカポンは、Ａβ４２プロトフィブリルの成熟アミロイドフィブリルへの凝集を、おそらくプロトフィブリルとの直接相互作用によって、阻害することも示されている（Ｄｉ Ｇｉｏｖａｎｎｉ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１０ Ｍａｙ １４；２８５（２０）：１４９４１−５４）。したがって、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）は、アルツハイマー病の治療および予防のために使用し得る。
ＣＯＭＴ阻害剤であるトルカポンおよびエンタカポンは、既存の結核薬が標的とする酵素、エノイル−アシル輸送タンパク質レダクターゼ（ＩｎｈＡ）に結合し、これを阻害することが示されている（Ｋｉｎｎｉｎｇｓ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｊｕｌ；５（７）：ｅ１０００４２３）。ＩｎｈＡは、ＩＩ型脂肪酸の生合成およびその後の細菌細胞壁の構築に必須である。イソニアジドおよびエチオナミドのような既存の結核薬は、同じ標的に結合するが、全く異なる化学構造を有し、重篤な副作用を引き起こし得る。さらに、これらの薬剤に対する細菌耐性機構がますます観察されている。したがって、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）は、多剤耐性（ＭＤＲ）および超多剤耐性（ＸＤＲ）結核の治療に使用し得る。
ＣＯＭＴ阻害剤であるエンタカポンは、脂肪塊および肥満関連遺伝子産物（ＦＴＯ）に結合し、これを阻害することが示されている。エンタカポンの投与は、トリグリセリド合成の減少、体重減少および血清コレステロールレベルの低下をもたらす（国際公開第２０１４／０８２５４４号）。したがって、ＣＴＰ−４０１（Ａ１）は肥満治療に使用し得る。
実験項：
合成：
別段の記載がない限り、すべての反応は、アルゴン下に乾燥ガラス器具中で実施した。市販の高品位試薬および溶媒を、受領したままでそれ以上精製することなく使用した。カラムクロマトグラフィは、予め充填された「ＧｒａｃｅＲｅｓｏｌｖ（商標）シリカ」カラムを固定相として使用して、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ．の「ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ」Ｃｏｍｐａｎｉｏｎシステムで実施した。ＭＰＬＣ精製は、Ｂｕｅｃｈｉシステム（ＢｕｅｃｈｉコントロールユニットＣ−６２０；２つのＢｕｅｃｈｉポンプモジュールＣ−６０５；カラム−オムニフィット（２３０×１５ｍｍ）；固定相−ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ Ｂ ２５−４０μｍ；Ｂｕｅｃｈｉ ＵＶ光度計Ｃ−６３５；ＢｕｅｃｈｉフラクションコレクタＣ−６６０；移動相Ａ：０．１％ＡｃＯＨ（ミリポアグレード）；移動相Ｂ：ＭｅＣＮ（ｐｒｅｐｓｏｌｖグレード）で実施した。ＬＣ−ＭＳは、ＥＳＩイオン源を介してＢｒｕｋｅｒ ａｍａＺｏｎ Ｓｐｅｅｄイオントラップに接続されたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳ ＨＰＬＣで行った。ＬＣ法：化合物を２０％ＭｅＣＮ中で約５μＭに希釈し、その５０μＬを注入した。試料をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ＰＦＰカラム（５０×２ｍｍ、３μｍ、１００Å）上で、５．５分で１０％〜１００％Ｂの直線勾配で分離した。移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨ（ミリポアグレード）；移動相Ｂ：ＭｅＣＮ（ＬＣ ＭＳグレード）。ＢｒｕｋｅｒのＡｖａｎｃｅ ４００（４００ＭＨｚ）で、プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルおよび炭素核磁気共鳴（１３Ｃ ＮＭＲ）スペクトルを記録した。化学シフトは、１Ｈ ＮＭＲについてｄ−ＤＭＳＯ（δ２．５０）およびＣＤＣｌ３（δ７．２７）に対してｐｐｍで報告する。
２つの新規阻害剤ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の合成を、それぞれスキーム１および２に示す。
化合物ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）は、市販の３，４−ジヒドロキシ−５−ニトロベンズアルデヒド１を用いたアルキルチアゾリジン−２，４−ジオン誘導体３のピペリジン促進縮合反応（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／１４２３０３号）によって入手可能であった（スキーム１）。
スキーム１ 新規ＣＯＭＴ阻害剤ＣＰＴ−２１２の合成。試薬および条件：（ａ）臭化エチル、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、２３℃、４日間、８９％；（ｂ）ピペリジン、ＭｅＯＨ、８０℃、１７時間、６６％。
二環式ニトロカテコールＣＰＴ−４０１（Ａ１）は、市販の３，４−ジメトキシ安息香酸４から出発する８つの合成工程で合成した（スキーム２）。
化合物４を、その後の酸性条件下でのホルムアルデヒドとの環化反応および還元的開環によってビスアルコール６に変換した（Ｍａｚｉａｎｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１，４２（６），１０１７−１０２０）。１，２−ビス（クロロメチル）−４，５−ジメトキシベンゼンから出発し、続いて酢酸で二重置換し、けん化する代替的な経路は、より実用的であるように思われるが、収率がより低かった。ビスアルコール６のスワーン酸化は良好な収率でビスアルデヒド７を生じたが、二酸化マンガン促進酸化は主にラクトン５を生成した。次いで、ビスアルデヒド７を、テトラブロミド８および無水マレイン酸との環化反応を介して三環式化合物９に変換した（ＭｃＯｍｉｅ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９７３，４１６−４１７）。無水物９をジメチルアミンで開環してモノアミド中間体を形成し、潜在的なカップリング試薬のスクリーニングにより、ＨＡＴＵが両方の合成工程にわたって６２％でビスアミド１０を生成し、優れていることが示された。三臭化ホウ素促進二重エーテル開裂は１１を生成し（Ｎａｉｔｏ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，１９９１，３９（７），１７３６−１７４５）、これを、１つのニトロ基の選択的導入によってニトロカテコールＣＰＴ−４０１（Ａ１）に変換した（Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４３（５），８３５−８４４）。後者の変換では、硝酸とＡＣＮの両方が予想されたように作用しないと思われ、２，３，５，６−テトラブロモ−４−メチル−４−ニトロシクロヘキサ−２，５−ジエノンは主に二重ニトロ副生成物を生じた。試薬の量を慎重に滴定すると、最終的には適度の収率で所望の生成物が得られた。ＣＰＴ−４０１（Ａ１）の構造は、二次元ＮＭＲ分光法および質量分析法によって確認することができた。
スキーム２ 新規ＣＯＭＴ阻害剤ＣＰＴ−４０１（Ａ１）の合成。試薬および条件：（ａ）ホルムアルデヒド、ＨＣｌ（ガス）、７０℃、４日間、９３％；（ｂ）ＬｉＡｌＨ４、ＴＨＦ、６６℃、４時間、７７％；（ｃ）塩化オキサリル、ＤＭＳＯ、ＴＥＡ、ＤＣＭ、−７８℃、１０５分→２３℃、６０分、７５％；（ｄ）ＰＢｒ５、ベンゼン、２３℃、１７時間、４１％（ｅ）無水マレイン酸、ＮａＩ、ＤＭＦ、７０℃、４８時間、６９％；（ｆ）ジエチルアミン、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、２３℃、４８時間、６２％；（ｇ）ＢＢｒ３、ＤＣＭ、０℃、２０分→２３℃、６０分、９８％；（ｈ）２，３，５，６−テトラブロモ−４−メチル−４−ニトロシクロヘキサ−２，５−ジエノン、ジエチルエーテル、２３℃、６０分、５５％。
化合物３ 乾燥ＤＭＦ（１１．４ｍＬ）中のチアゾリジン−２，４−ジオン２（５００ｍｇ；４．２７ｍｍｏｌ）および臭化エチル（４６５ｍｇ；４．２７ｍｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡ（２．２３ｍＬ；１２．８１ｍｍｏｌ）で処理し、２３℃で１７時間撹拌した。ＴＬＣは不完全な変換を示したので、別のバッチの臭化エチル（４６５ｍｇ；４．２７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２３℃でさらに３日間撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物をＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ、９９／１〜３／１）で精製して化合物３（５５０ｍｇ；３．７９ｍｍｏｌ；８９％）を無色液体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．９４（ｓ，２Ｈ），３．６９（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．２０（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）。
化合物ＣＰＴ−２１２（Ｂ１） 乾燥ＭｅＯＨ（２．５ｍＬ）中の３，４−ジヒドロキシ−５−ニトロベンズアルデヒド１（１８５ｍｇ；１．０１ｍｍｏｌ）および化合物３（１４８ｍｇ；１．０２ｍｍｏｌ）の溶液をピペリジン（１５５μＬ；１．５７ｍｍｏｌ）で処理し、８０℃で１７時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液で２回洗浄した。有機層をＭｇ２ＳＯ４で乾燥し、すべての溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をＭｅＯＨから再結晶化させて、ニトロカテコールＣＰＴ−２１２（２０７ｍｇ；０．６７ｍｍｏｌ；６６％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０．８５（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．７６（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），６．０９（ｓ，１Ｈ），３．８３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．２８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：ｒｔ＝３．２７ｍｉｎ；３０８．８３［Ｍ−Ｈ］−；６４０．９２［２Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ］−。
化合物５ ０℃で、ＨＣｌガスをホルムアルデヒド（水中３７％；９０ｍＬ；１．２ｍｏｌ）の溶液に３０分間通気し、３，４−ジメトキシ安息香酸４（１０ｇ；５４．９ｍｍｏｌ）を添加して、ＨＣｌガスを懸濁液に通気し続けながら、反応混合物を７０℃に加熱した。３日後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、水（２００ｍＬ）を添加した。ＮＨ３水溶液の添加によってｐＨをｐＨ＝７に調整した。固体生成物を濾過によって分離し、減圧下で乾燥して、ラクトン５（９．８８ｇ；５０．９ｍｍｏｌ；９３％）をオフホワイト色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）：δ７．２６（ｓ，１Ｈ），７．２３（ｓ，１Ｈ），５．２７（ｓ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ）。
化合物６ 乾燥ＴＨＦ（１７０ｍＬ）中のラクトン５（７．０ｇ；３６．０ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の水素化アルミニウムリチウム（３．６７ｇ；１０８ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下した。反応混合物を６６℃で４時間撹拌した。０℃に冷却した後、引き続いて水（７ｍＬ）および５Ｍ ＮａＯＨ溶液（７ｍＬ）を添加して、反応を注意深く停止させた。濾過後に固体を廃棄し、すべての溶媒を減圧下で除去した。水を添加し、生成物をＤＣＭで十分に抽出した。合わせた有機層をＭｇ２ＳＯ４で乾燥し、ＤＣＭを減圧下で除去して、アルコール６（５．５ｇ；２７．７ｍｍｏｌ；７７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）：δ６．９８（ｓ，２Ｈ），４．９９（ｂｒ，ｓ，２Ｈ），４．４７（ｓ，４Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ）。
化合物７ −７８℃で、乾燥ＤＣＭ（２５ｍＬ）中のアルコール６（２．２ｇ；１１．１ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥ＤＣＭ（５５ｍＬ）中の塩化オキサリル（１．９４ｍＬ；２２．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（３．４７ｍＬ；４８．８ｍｍｏｌ）の予め撹拌した溶液に添加し、−７８℃で４５分間撹拌した。トリエチルアミン（２１．８４ｍＬ；１５５ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を−７８℃でさらに６０分間撹拌し、次いで２３℃に温め、さらに６０分間撹拌した。水（２００ｍＬ）の添加によって反応を注意深く停止させ、生成物をＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を塩化アンモニウム溶液で洗浄し、Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で除去して、アルデヒド７（１．６２ｇ；８．３６ｍｍｏｌ；７５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）：δ１０．５２（ｓ，２Ｈ），７．５４（ｓ，２Ｈ），３．９４（ｓ，６Ｈ）。
化合物８ 乾燥ベンゼン（５５ｍＬ）中のアルデヒド７（１．６ｇ；８．２４ｍｍｏｌ）の溶液をペンタブロモホスホラン（８．８７ｇ；２０．６ｍｍｏｌ）で処理し、２３℃で１７時間撹拌した。１％ＫＯＨ溶液（５０ｍＬ）の添加によって反応を注意深く停止させた。層を分離し、水層をＤＣＭで２回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥して、すべての溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ、９／１〜１／１）によって精製して、臭化物８（１．６１ｇ；３．３４ｍｍｏｌ；４１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．１０（ｂｒ，ｓ，４Ｈ），３．９３（ｓ，６Ｈ）。
化合物９ 乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の臭化物８（１．６ｇ；３．３２ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（０．７８ｇ；７．９７ｍｍｏｌ）の溶液をヨウ化ナトリウム（２．３４ｇ；１５．６１ｍｍｏｌ）で処理し、７０℃で４８時間撹拌した。水（１００ｍＬ）および飽和Ｎａ２ＳＯ３溶液（２０ｍＬ）の添加によって反応を停止させた。濾過および減圧下での乾燥後、固体生成物９（５９１ｍｇ；２．２９ｍｍｏｌ；６９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）：δ８．５２（ｓ，２Ｈ），７．７６（ｓ，２Ｈ），３．９７（ｓ，６Ｈ）。
化合物１０ 乾燥ＤＭＦ（２００μＬ）中の三環式化合物９（１７１ｍｇ；０．６６２ｍｍｏｌ）の溶液をジエチルアミン（１５２μＬ；１．４６ｍｍｏｌ）で処理し、２３℃で１時間撹拌した。ＨＡＴＵ（３０２ｍｇ；０．８０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２３１μＬ；１．３２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌を２３℃で４８時間続けた。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物をＭＰＬＣ（水／アセトニトリル、４／１〜１／１）で精製してビスアミド１０（１５８ｍｇ；０．４０９ｍｍｏｌ；６２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５９（ｓ，２Ｈ），７．１０（ｓ，２Ｈ），４．０１（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，４Ｈ），３．３１（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，４Ｈ），１．２４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），１．１０（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ）。
化合物１１ ０℃で、乾燥ＤＣＭ（１６ｍＬ）中のビスアミド１０（１５８ｍｇ；０．４０９ｍｍｏｌ）の溶液をＢＢｒ３溶液（ＤＣＭ中１Ｍ；２．０４ｍＬ；２．０４ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を０℃で２０分間撹拌し、２３℃に温め、さらに６０分間撹拌した。すべての揮発性物質を窒素気流によって除去し、粗生成物をＭＰＬＣ（水／アセトニトリル、４／１〜１／９）で精製してビスアミド１１（１４３ｍｇ；０．３９９ｍｍｏｌ；９８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）：δ９．７３（ｂｒ，ｓ，２Ｈ），７．５０（ｓ，２Ｈ），７．１７（ｓ，２Ｈ），３．３７（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），３．１５（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），１．０９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ），１．０４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８．１１（ｂｒ，ｓ，２Ｈ），６．８３（ｓ，２Ｈ），３．５４（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ），３．２７（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ），１．２５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ），１．０７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ）。
化合物ＣＰＴ−４０１（Ａ１） 続いて、乾燥ジエチルエーテル（２ｍＬ）中のビスアミド１１（１５．０ｍｇ；０．０４２ｍｍｏｌ）の溶液を乾燥ジエチルエーテル（１ｍＬ）中の２，３，５，６−テトラブロモ−４−メチル−４−ニトロシクロヘキサ−２，５−ジエノン（９．８１ｍｇ；０．０２１ｍｍｏｌ）の溶液で３回処理し、２３℃で２０分間撹拌した。ＴＬＣは完全な変換を示したので、すべての揮発性物質を窒素気流で除去し、粗生成物をＭＰＬＣ（水／アセトニトリル、９／１〜３／１）で精製してニトロカテコールＣＰＴ−４０１（９．２ｍｇ；０．０２３ｍｍｏｌ；５５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１２．５５（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），８．７６（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｓ，１Ｈ），７．５０（ｓ，１Ｈ），３．５５−３．３２（ｍ，４Ｈ），３．２９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），１．２４（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ），１．１６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．１２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：ｒｔ＝２．６６ｍｉｎ；３３０．９８［Ｍ−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２］＋；４０４．０７［Ｍ＋Ｈ］＋；８０７．１５［２Ｍ＋Ｈ］＋；８２９．２７［２Ｍ＋Ｎａ］＋。
ＣＣＭＳによるＣＯＭＴ阻害剤のオンターゲットおよびオフターゲットタンパク質の同定
洗練された実験設定でのトルカポンの特異的結合剤を、はるかに大きなセットの複製試料にわたる、いわゆる示差競合実験、用量依存性ＣＣＭＳ実験および質量分析データの改善された分析を用いて分析した。この試験の焦点は、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２由来の全細胞溶解物に関するものであった。先に報告したように、カテコール部分はＣＯＭＴ結合ポケットを標的とすると予想され、一方、トルカポンのベンジル側はタンパク質の外側に突出し、カテコール基と反対の方向を向いている。
薬剤の異なる部分は、細胞タンパク質と異なる相互作用を生じ、異なる応答を誘導し得る。そのため、捕獲化合物骨格に対するトルカポン選択性機能についての２つの結合点をこの試験で使用した（ＣＰＴ−２２４：活性Ｔｃｐ−ＣＣおよびＣＰＴ−２２０：不活性Ｔｃｐ−ＣＣ、図３）。活性方向では、捕獲化合物は公知の標的ＣＯＭＴと特異的に相互作用できるはずであり、他の方向では、まだ一部のオフターゲットタンパク質との相互作用が存在し得る。
ＣＯＭＴに対する捕獲化合物の活性を試験するために、組織内で発現させた組換えヒトＣＯＭＴタンパク質に対するＣＯＭＴ阻害アッセイを実施した。
予想されたように、トルカポンがカテコール部分を介して連結された反対方向の捕獲化合物（ＣＰＴ−２２０）は、ＣＯＭＴに親和性を有していなかった。標的と自由に相互作用できるにニトロカテコール部分を残して、トルカポンのベンジル部分を介して結合された捕獲化合物（ＣＰＴ−２２４）は、組換えヒトＣＯＭＴに対して６４８ｎＭのＩＣ５０を示し、これは親分子と比較して約１０倍の活性低下に相当する。
肝臓癌由来細胞系ＨｅｐＧ２においてＣＣＭＳ実験を行うことにより、小型ＣＯＭＴ阻害剤のタンパク質相互作用プロフィールを検討した。特異的に相互作用するタンパク質の濃縮および単離を、１μＭの濃度の不活性捕獲化合物（ＣＰＴ−２２０）および活性捕獲化合物（ＣＰＴ−２２４）を用いて実施した。示差競合対照実験において、過剰の各遊離小型ＣＯＭＴ阻害剤（トルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１））を添加して、５０μＭの最終濃度の特異的結合剤に関して捕獲化合物と競合させた。捕獲され、トリプシン処理されたタンパク質を、高分解能ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐハイブリッド質量分析計を用いて同定した。９９％を超える確率で同定されたタンパク質および９５％の確率を有する少なくとも２つのユニークペプチドだけを、十分な信頼度で同定されたと見なした。競合対照実験では、特異的結合部位に関して対応するＣＣと競合する過剰の各遊離薬剤を添加した。
予想されたように、ＣＯＭＴは不活性捕獲化合物（ＣＰＴ−２２０）では同定されず、３つのタンパク質は本発明者らの基準を満たし、４つの異なる競合物質すべてと競合し、これらのタンパク質は、ピリドキサールキナーゼ（ＰＤＸＫ）、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＢ１０（ＡＫＲ１Ｂ１０）およびプロテインＮｉｐＳｎａｐホモログ３Ａ（ＮＩＰＳＮＡＰ３Ａ）である（表１）。活性捕獲化合物（ＣＰＴ−２２４）を適用すると、本発明者らの基準を満たし、４つの異なる競合物質すべてと競合した他の３つのタンパク質（キヌレニン‐オキソグルタル酸トランスアミナーゼ３（ＣＣＢＬ２）、１，２−ジヒドロキシ−３−ケト−５−メチルチオペンテンジオキシゲナーゼ（ＡＤＩ１）およびグルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＧＣＤＨ）、表１）と共に、ＣＯＭＴは最も堅固に同定されたタンパク質であった。
主な関心は、活性トルカポン捕獲化合物を使用した場合に異なる競合特異性を示すタンパク質にあり、このいわゆる示差競合ｄＣＣＭＳは、この小分子ＣＯＭＴ阻害剤の毒性を引き起こす潜在的オフターゲットの同定を可能にした。実験において、タンパク質ＨＩＢＣＨは、本発明者らが４つの競合物質を用いて特異的に同定したタンパク質を比較した場合、ユニークな捕獲パターンを示す。ＨＩＢＣＨは、トルカポンを競合物質として使用した場合に特異的に同定されたが、エンタカポンの存在下では競合は観察されなかった。興味深いことに、ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）を競合物質として使用した場合、ＨＩＢＣＨは特異的に競合し、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）を使用した場合は競合が観察されなかった。図５Ａは、４つの異なるＣＯＭＴ阻害剤を用いたＨＩＢＣＨ強度の捕獲パターンを示す。
ＨＩＢＣＨに結合する小分子の検証
トルカポンのＨＩＢＣＨへの結合をさらに調べるために、用量依存性捕獲を実施した。５μＭ〜４０ｎＭの種々の濃度のＣＰＴ−２２０またはＣＰＴ−２２４および競合物質としてトルカポンまたはＣＰＴ−４０１（Ａ１）を使用した用量依存性捕獲実験の結果を図５Ｂに示す。予想されたように、ＣＯＭＴタンパク質は、最高濃度のＣＰＴ−２２０（５μＭ）での弱い非特異的相互作用を除いて、活性方向の捕獲化合物でのみ再び捕獲され、両方の競合物質（トルカポンおよびＣＰＴ−４０１（Ａ１））との完全な競合が観察された。ＨＩＢＣＨタンパク質については異なる方向で同じことが観察され、ＨＩＢＣＨは不活性方向のトルカポン−ＣＣ（ＣＰＴ−２２０）では同定されなかった。対照的に、ＨＩＢＣＨは、活性方向のトルカポン−ＣＣ（ＣＰＴ−２２４）のみと競合し、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）とは競合しなかった。この実験における結合強度の明確な用量依存性および一貫した競合パターンは、ｄＣＣＭＳアッセイの妥当性をさらに強化する。
捕獲化合物の独特の特徴は、捕獲化合物と標的タンパク質との間での共有結合の形成であり、標的タンパク質の係合は、標的タンパク質の同じ結合ポケットに結合する小分子の存在下で競合された。本発明者らは、ＨｅｐＧ２溶解物における捕獲アッセイ、続いて抗ＨＩＢＣＨおよび抗ＣＯＭＴウェスタンブロットを実施し、質量分析非依存性読み取り法によってこれらのタンパク質に対する種々の競合物質の結合プロフィールを調べた。図６Ａは、ＨＩＢＣＨがＣＰＴ−２２４によって捕獲され、トルカポンまたはＣＰＴ−２１２（Ｂ１）を競合物質として使用した場合は捕獲が消失したが、エンカカポンまたはＣＰＴ−４０１（Ａ１）では消失しなかったことを示す。さらに、ＣＰＴ−２２４のＨＩＢＣＨへの直接架橋は、ＣＣの架橋後の標的タンパク質のビオチン化を検出するストレプトアビジンウェスタンブロットによって確認された（図６Ｂ）。ＣＯＭＴウェスタンブロットを用いて同じ実験を行った（図６Ｃ）。ＣＯＭＴへの結合は、活性捕獲化合物を用いたアッセイでのみ観察され、トルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）、ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の４つの小分子のいずれかを競合物質として使用した場合はシグナルが消失し、また、４つの競合物質の存在下ではＣＯＭＴのビオチン化も消失した（図６Ｄ）。この観察は、トルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）がすべて強力なＣＯＭＴ阻害剤であり、ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）のＨＩＢＣＨへの結合がトルカポンのＨＩＢＣＨへの結合と同じ結合ポケットで起こり得ることを確認する、質量分析データセット（図５Ａおよび５Ｂ）と非常に良好に相関する。
この仮説を検証するために、ＣＯＭＴおよびＨＩＢＣＨに対する４つの小分子すべてのドッキング実験を行った。２つの新規ＣＯＭＴ阻害剤、ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）およびＣＰＴ−４０１（Ａ１）は、ＣＯＭＴの結合ポケット（活性部位）に適合する。対照的に、トルカポンおよびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）のような屈曲構造だけがＨＩＢＣＨの提案された小分子結合ポケット内に深く「もぐり込む」ことができ、カテコールが触媒性グルタミン酸側鎖と相互作用するが、エンタカポンおよびＣＰＴ−４０１（Ａ１）は、ドッキングがカテコール部分の位置に関して制限された場合でも、小分子結合ポケットにもぐり込まない。これは、２つの分子対の共通の構造的特徴によって説明することができる：トルカポンおよびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）は、２つの芳香族部分が、ＨＩＢＣＨの小分子結合ポケットにきっちりと適合する、互いに対して傾斜した立体配座をとる。しかし、他の２つの阻害剤、エンタカポンおよびＣＰＴ−４０１（Ａ１）は、全体的な平面立体配座をとる傾向があるか、さらにはこの立体配座を獲得するように限定される。
ＣＯＭＴ阻害剤の細胞毒性結果
以前の公表文献において、本発明者らは、エンタカポンのタンパク質結合剤の細胞分布はミトコンドリア機能への関連性を示さないが、トルカポンのタンパク質結合剤の大部分はミトコンドリア起源、特にミトコンドリア膜であると報告した（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ，２０１０．１１３（１）：２４３−５３）。細胞ベースのアッセイにおいて新規ＣＯＭＴ阻害剤の可能性のあるミトコンドリア毒性を評価するために、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＴｏｘＧｌｏ（商標）アッセイを実施し、ＨｅｐＧ２細胞をガラクトース含有培地またはグルコース含有培地で増殖させ、細胞のＡＴＰ含量の測定に基づいてミトコンドリア毒性を検出した。ＡＴＰ産生の減少は、ガラクトース含有培地での増殖のみに関連し、したがって、おそらくミトコンドリア機能不全の結果である。トルカポンおよびエンタカポンに加えて、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の２つの新しい小分子ＣＯＭＴ阻害剤を分析に含めた。上記で報告したように、これらは強力なＣＯＭＴ結合剤であるが、そのオフターゲットプロフィールに関して異なる。ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）のプロフィールはトルカポンのプロフィールに類似し、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）はエンタカポンのプロフィールに類似していた。
このアッセイの結果（図７）は、トルカポンに関して、グルコース培地と比較してガラクトース培地では４倍以上低いＩＣ５０値が観察されることを示し、これは、トルカポンがミトコンドリア毒性物質であることを示唆する。対照的に、エンタカポンについてははるかに小さい作用が認められた。これらの結果は、トルカポン標的タンパク質のミトコンドリア局在を明らかにした、本発明者らによって実施された以前の試験の所見をさらに支持する。興味深いことに、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）のミトコンドリア毒性を比較すると、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）についてのガラクトースおよびグルコース培地のＩＣ５０値の変化はＣＰＴ−２１２（Ｂ１）についての変化よりはるかに小さく、これは、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）のミトコンドリア毒性がＣＰＴ−２１２（Ｂ１）よりも低いことを示す。
ＣＯＭＴおよびＨＩＢＣＨの過剰発現
Ｈｉｓ−Ｓ−ＣＯＭＴ発現ベクターをＯｒｉｇｅｎｅ（ＮＭ＿００７３１０）から購入し、ＨＩＢＣＨのクローニングのためにＲＮｅａｓｙｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞から単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてこのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＨｅｐＧ２ ｃＤＮＡを鋳型として使用し、以下のプライマー：５’−ｇａｔｃｇａａｔｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｃｇｃｇａｇａｔｇ−３’（ＨＩＢＣＨ順方向）、５’−ｇａｔｃｃｔｃｇａｇｔｃａａａａｔｔｔｃａａａｔｃａｃｔｇｃｔｔｃｃｃａａａ−３’（ＨＩＢＣＨ逆方向）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を挿入した。以下のプライマー：５’−ｔｇａａｇｇｔｃｇｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔｔｇｇｔ−３’（Ｇ３ＰＤＨ順方向）および５’−ｃａｔｇｔｇｇｇｃｃａｔｇａｇｇｔｃｃａｃｃａｃ−３’（Ｇ３ＰＤＨ逆方向）を用いたＧ３ＰＤＨ ＰＣＲ反応を、対照として平行して行った。ＰＣＲ産物および制限産物を、ｐｅｑＧＯＬＤ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｐｅｑｌａｂ）を用いて精製した。ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素およびＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ Ｇｒｅｅｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下に、３７℃で２時間、ＰＣＲフラグメントおよび標的ベクター（ｐＥＴ２８ａ＋、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の制限を実施した。１時間４０分後、ＣＩＰ酵素をベクター反応に加え、３７℃でさらに２０分間インキュベートした。連結反応物をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて１６℃で一晩インキュベートした。Ｓ−ＣＯＭＴおよびＨＩＢＣＨを含むＤＮＡ構築物５００ｎｇをコンピテントＢＬ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換に使用し、組換えタンパク質の発現をＩＰＴＧによって誘導した。遠心分離（１５分、４０００ｇ、４℃）によって細胞を回収した。細胞を緩衝液（ＣＯＭＴ：５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、ＨＩＢＣＨ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ８．０）５ｍｌに再懸濁し、リゾチームおよびＤＮアーゼＩで処理し、続いて超音波処理することによって破壊した。続く遠心分離からの上清（サイトゾル画分）を、その後の実験におけるタンパク質源として使用した。
ＣＯＭＴ活性のマイクロプレートアッセイ
ＣＯＭＴ活性測定実験は、基本的に以前に記述されているように実施した（Ｋｕｒｋｅｌａ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４．３３１（１）：１９８−２００）。手短に述べると、エスクレチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および競合するカテコール基質をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、緩衝水溶液（１００ｍＭリン酸塩、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｌ−システイン、ｐＨ７．４）で反応混合物１００μｌ中２％の最終ＤＭＳＯ濃度に希釈した。すべての試薬を同じ緩衝液に溶解した。各試料について、阻害剤およびエスクレチン溶液を、黒色丸底９６ウェルプレートに３組重複してピペットで分注した。阻害剤またはＡｄｏＭｅｔを含まない対照を各マイクロプレートに含めた。プレートを氷上に置き、酵素を含むサイトゾル画分を１５μｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度になるように添加した。マイクロプレートを３７℃に置くことによって５分間のプレインキュベーションを開始し、１０μＭの最終濃度になるように３７℃でＡｄｏＭｅｔを添加することによって反応を開始させた。ＣＡＲＹ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計を用いて反応の開始時および６０分目に蛍光を測定した。励起波長および発光波長は、それぞれ３５５ｎｍおよび４６０ｎｍであった。酵素活性は、６０分目の蛍光からアッセイの開始時の蛍光を差し引くことによって評価し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて阻害曲線を作成した。
捕獲実験
ＡｄｏＭｅｔ ５μＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５×捕獲緩衝液（ｃａｐｒｏｔｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）２０μｌを補充した、ＨｅｐＧ２溶解物５００μｇ（ＩｎＶｉｖｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはヒト組換えＣＯＭＴ １μｇまたはヒト組換えＨＩＢＣＨタンパク質１μｇを用いて捕獲実験を実施し、総容量１００μｌで４℃にて３０分間、ＤＭＳＯまたは競合物質５０μＭと共にインキュベートした。捕獲化合物と共に４℃で１時間インキュベートした後、ｃａｐｒｏＢｏｘ（Ｃａｐｒｏｔｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を用いて試料に１０分間照射した。続いて、各々の反応に５×洗浄緩衝液（ＷＢ，ｃａｐｒｏｔｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）２５μＬを添加することによって緩衝液条件を調整した。次いで、試料をＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）５０μＬと共に回転ホイール上で４℃にて１時間インキュベートした。次いで、磁気ビーズ（ｃａｐｒｏｔｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する場合に生体分子の便利で効率的な単離のための装置であるｃａｐｒｏＭａｇを使用して、ＣＣ−タンパク質コンジュゲートを含むビーズを収集し、１×ＷＢ ２００μＬで最初に６回洗浄し、次にＭＳグレードの水で洗浄した。このビーズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはタンパク質消化とそれに続くＬＣ−ＭＳによるさらなる分析まで、脱イオン水中に４℃で保存した。
タンパク質消化および質量分析
タンパク質捕獲後、ストレプトアビジン磁気ビーズをＬＣ−ＭＳグレードの水（Ｆｌｕｋａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）２００μＬで２回洗浄した。トリプシン消化のために、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合したタンパク質を、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム９μＬおよびトリプシン１μＬ（０．５μｇ／μＬ）（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に温度制御されたシェーカーで３７℃にて１６時間インキュベートした。上清を取り出し、ｍｉＶａｃ ＤＮＡ真空遠心機（Ｇｅｎｅｖａｃ、ＵＫ）で蒸発乾固させ、質量分析に直接使用した。トリプシン消化物を、Ｐｒｏｘｅｏｎナノエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介してＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続されたＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏシステムで、オンラインナノリットル液体クロマトグラフィタンデム質量分析（ｎｌ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。クロマトグラフィ分離のために、試料を最初に逆相（ＲＰ）プレカラム（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００）に充填し、ＲＰ分析カラム（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８，Ｄｉｏｎｅｘ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分離した。質量分析をデータ依存モードで実施し、その後の衝突誘起解離（ＣＩＤ）フラグメンテーションでのフルスキャンのためにＯｒｂｉｔｒａｐ−ＭＳとＬＴＱ−ＭＳ／ＭＳ取得の間で自動切り替えを可能にした。ＯｒｂｉｔｒａｐアナライザでフルスキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ ３００〜２０００）を取得した。２０個の最も強いイオンを連続的に単離し、ＣＩＤを用いて線形イオントラップでフラグメント化した。
ＭａｘＱｕａｎｔ（ｗｗｗ．ｍａｘｑｕａｎｔ．ｏｒｇ，リリース１．４．０．８）で実装された検索エンジンＡｎｄｒｏｍｅｄａを使用して、すべてのＭＳ／ＭＳデータを分析した。６ｐｐｍの前駆体トレランス、０．５Ｄａのフラグメントイオントレランス、最大２回の切断ミスを許容する完全なトリプシン特異性および可変修飾としてメチオニン酸化を用いて、ヒトＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（リリース２０１５＿０２には２０２０３個の検討された配列エントリが含まれる）に対する自動データベース検索を実施した。最大偽発見率は、タンパク質およびペプチドレベルの両方で０．０１に設定し、最小ペプチド長として６アミノ酸が必要であった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実行間のアライメントのために、ラベルフリー定量オプションを選択した。ＭａｘＱｕａｎｔ分析の出力を、ｃａｐｒｏｔｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨで実施された標準化された手順に従って後処理してタンパク質強度を正規化し、その後倍数変化およびｐ値を計算した。
そのため、捕獲アッセイでＬＣ−ＭＳによって検出され、競合対照実験で有意に減少するタンパク質を特異的であると定義する。特異性は、アッセイと各タンパク質の競合との間の倍数変化によって定量化した。さらに、実験を４回重複して実施し、ｐ値を計算することによって有意性の決定を可能にした。
ＡＴＰｌｉｔｅ細胞毒性アッセイ
化合物トルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）のミトコンドリア毒性評価（Ｇｌｕ／Ｇａｌ）はＰｈａｒｍａｃｅｌｃｕｓ ＧｍｂＨによって実施された。簡単に述べると、グルコース培地（２２ｍＭグルコース、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む高グルコースＤＭＥＭ）またはガラクトース培地（１０ｍＭガラクトース、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む高グルコースＤＭＥＭ）で培養したＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートに添加した（１００μＬ、４×１０４細胞／ウェル）。薬剤処理のために、ＤＭＳＯ中で化合物原液を調製し、ウェルに添加して、示されている最終薬剤濃度を得た。発光ＡＴＰ検出試薬の添加後の各ウェルの最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％であった。合計１００μＬの発光ＡＴＰｌｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）検出試薬を各ウェルに添加した。プレートシェーカー上で簡単に混合した後、反応物を室温で２分間インキュベートし、２分後にＶｉｃｔｏｒ Ｘ５プレートリーダーを用いて発光を測定した。
ＴＭＲＥミトコンドリア膜電位アッセイ
ＴＭＲＥミトコンドリア膜電位アッセイのために、ＨｅｐＧ２細胞を種々の濃度の４つのＣＯＭＴ阻害剤で処理した。相対的な負電荷のために活性ミトコンドリアに容易に蓄積する、細胞透過性の正に荷電した赤橙色の色素であるＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル）を使用して、活性ミトコンドリアを標識した。４つのＣＯＭＴ阻害剤間でミトコンドリア膜電位状態の有意差が観察された（図９）。５０μＭの濃度で、化合物トルカポンおよびＣＰＴ２１２は、膜電位を未処理ＨｅｐＧ２細胞の２０〜３０％未満に抑制したが、化合物エンタカポンまたはＣＰＴ４０１を用いると、まだ５０％を超える膜電位が観察された。１００μＭの濃度のＣＰＴ２１２およびトルカポンは、膜電位を対照の０〜５％に低下させたが、ＣＰＴ４０１およびエンタカポンについては、この濃度で膜電位の４０〜５０％が残存した。データは、１０〜１００μＭの濃度でのミトコンドリア膜電位に関して、エンタカポンとＣＰＴ４０１との間、およびトルカポンとＣＰＴ２１２との間の密接な類似性を明らかにする。ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）は、活性ミトコンドリアに容易に蓄積する、正に荷電した蛍光色素ＴＭＲＥを用いて測定した。酸化的リン酸化のイオノホア脱共役剤であるＦＣＣＰを陽性対照として用いた。ＨｅｐＧ２細胞をμＣｌｅａｒ有底黒色９６ウェルプレート（約４×１０４細胞／ウェル）に播種した。集密に達した後、細胞を個々の規定最終濃度の４つのＣＯＭＴ阻害剤（トルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ４０１または３）で、３７℃および５％ＣＯ２で一晩処理した。培養培地を除去し、新鮮培地と交換し、ＴＭＲＥを２００ｎＭの最終濃度で培地に添加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、それぞれ５４９ｎｍおよび５７５ｎｍの励起フィルタおよび発光フィルタを備えたＣａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度を測定した。
計算方法
使用されているすべてのソフトウェアツールは、ＳＹＢＹＬｘ１．２パッケージ（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に含まれている。分子構造の調製のために、ケルセチン（ＱＵＥ）および（２Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸（ＨＩＵ）との複合体におけるヒトβ−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ加水分解酵素（ＨＩＢＣＨ＿ＨＵＭＡＮ）の原子座標をＰＤＢファイル３ＢＵＴから入手した。構造を、Ｐｒｅｐａｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎツールを使用して前処理し、ＭＭＦＦ力場、ＭＭＦＦ電荷およびＰｏｗｅｌｌ勾配アルゴリズム（ｒｍｓｄ ０．５）を用いて最小化した。最小化の間、すべての重原子を凍結した。ＱＵＥを除去して触媒部位にアクセスした。配位子構造は、Ｌｉｇａｎｄ Ｔｏｏｌを用いて２Ｄスケッチ（ＣｈｅｍＤｒａｗ）から得た：構造を標準化し、互変異性体を生成した（荷電原子の数＝４）。カテコールジアニオンを部分構造ＳＭＡＲＴＳフィルタ（Ｏ［−１］Ｃ：ＣＯ［−１］）で除去し、Ｃｏｎｃｏｒｄ Ｓｔａｎｄａｌｏｎｅを用いて互変異性体当り１つの３Ｄ構造を生成した。カテコールおよびニトロ基上の原子タイプは以下のように設定した：ＳＰＬスクリプトを使用して、Ｏ− −＞Ｏ．ｃｏ２；Ｎ−＞Ｎ．ｐｌ３。得られた構造を、デフォルト設定（Ｔｒｉｐｏｓ ＦＦ、ｒｍｓｄ＝０．０５）およびＧａｓｔｅｉｇｅｒ−Ｍａｒｓｉｌｉの電荷を使用して最小化した。ＨＩＢＣＨと、推定阻害剤であるトルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）およびＣＰＴ−４０１（Ａ１）との間の無制限のフレキシブルドッキングをＳｕｒｆｌｅｘ−Ｄｏｃｋで実施した。共結晶生成物ＨＩＵを抽出し、ＨＩＵに基づいてプロトモルを生成した。タンパク質の柔軟性（水素および重原子）を許容し、１０個の開始立体配座を生成した。それ以外は、デフォルト設定を使用した。ドッキングスコア、カテコール位置およびタンパク質に関して、１００ポーズをサンプリングし、検討した。トルカポンの最良ドッキングポーズをカテコールフラグメントの基礎として使用した。弱く制限されたフラグメント配置（ｃｐｅｎ＝１０）を用いてドッキングを繰り返した。
略語：
ＣＡＮ、硝酸第二セリウムアンモニウム；ＣＣ、捕獲化合物；ＣＣＭＳ、捕獲化合物質量分析法；ｄＣＣＭＳ、示差競合捕獲化合物質量分析法；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＰＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＨＡＴＵ、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート；ＴＥＡ、トリエチルアミン；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン。
トルカポン、エンタカポンおよび２つのリードＣＯＭＴ阻害剤ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の化学構造を示す。 トルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）によるヒト組換えＣＯＭＴの阻害を示す。 不活性（カテコール官能基を介した結合、ＣＰＴ−２２０）および活性（遊離カテコール官能基を有するベンジル基を介した結合、ＣＰＴ−２２４）方向のトルカポン捕獲化合物の化学構造を示す。 活性トルカポン捕獲化合物（ＣＰＴ−２２４）および不活性トルカポン捕獲化合物（ＣＰＴ−２２０）によるヒト組換えＣＯＭＴの阻害を示す。 平均ＭＳ／ＭＳおよびｄＣＣＭＳ実験で同定されたＨＩＢＣＨの正規化強度を含む示差競合捕獲化合物質量分析実験の結果を示す：Ａ：アッセイ；Ｃ１：競合物質としてのトルカポン；Ｃ２：競合物質としてのエンタカポン；Ｃ３：競合物質としてのＣＰＴ−４０１（Ａ１）；Ｃ４：競合物質としてのＣＰＴ−２１２（Ｂ１）。データは平均プラスＳＤである（ｎ＝４）。表は、異なる競合物質（Ｃ１：トルカポン、Ｃ２：エンタカポン、Ｃ３：ＣＰＴ−４０１（Ａ１）、Ｃ４：ＣＰＴ−２１２（Ｂ１））とＣＰＴ−２２４を用いた捕獲実験におけるＦＣおよびＨＩＢＣＨタンパク質のｐ値を示す。 ５μＭ〜４０ｎＭの種々の濃度のＣＰＴ−２２０またはＣＰＴ−２２４を用いた用量依存性捕獲実験を示す。左パネル：ＣＯＭＴタンパク質のＣＣＭＳ結果；右パネル：ＨＩＢＣＨタンパク質のＣＣＭＳ結果；アッセイ：ＣＰＴ−２２０またはＣＰＴ−２２４によるアッセイ；Ｃ１／Ｔｃｐ：ＣＰＴ−２２０またはＣＰＴ−２２４の存在下での競合物質としてのトルカポン；Ｃ３／ＣＰＴ−４０１：競合物質としてのＣＰＴ−４０１（Ａ１）。データは平均プラスＳＤである（ｎ＝４）。 示差競合捕獲化合物架橋後のウェスタンブロットによるＣＯＭＴおよびＨＩＢＣＨの検出を示す：Ｔｃｐ−ＣＣ（ＣＰＴ−２２４）は組換えＨＩＢＣＨ（左パネル）および組換えＣＯＭＴ（右パネル）を捕獲する。（Ａ）、抗ＨＩＢＣＨウェスタンブロットはＨＩＢＣＨタンパク質の同定を実証する。（Ｂ）、抗ストレプトアビジンウェスタンブロットは、ＣＰＴ−２２４とＨＩＢＣＨの架橋を実証する。反応は、ＴｃｐおよびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の存在下で競合したが、ＥｃｐおよびＣＰＴ−４０１（Ａ１）の存在下ではＨＩＢＣＨの競合は観察されなかった。（Ｃ）、抗ＣＯＭＴウェスタンブロットはＣＯＭＴタンパク質の同定を実証する。（Ｄ）、抗ストレプトアビジンウェスタンブロットは、ＣＰＴ−２２４とＣＯＭＴの架橋を実証する。反応は、Ｔｃｐ、Ｅｃｐ、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の存在下で競合した。 トルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−４０１（Ａ１）およびＣＰＴ−２１２（Ｂ１）を用いた細胞ベースのミトコンドリア毒性アッセイの結果を示す。ガラクトース含有培地での増殖に関連するＡＴＰ産生の減少は、ミトコンドリア機能不全を示す。Ｘ軸：ＡＴＰ濃度；Ｙ軸：試験化合物の濃度。 ＣＯＭＴ阻害剤の化学構造ならびに２μＭおよび０．１μＭ濃度でのＣＯＭＴ阻害アッセイの結果を示す。Ａ：トルカポン、エンタカポン。Ｂ：ＣＰＴ−４０１（Ａ１）の誘導体。Ｃ：ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）の誘導体。 ＴＭＲＥミトコンドリア膜電位試験を用いた、ＨｅｐＧ２細胞におけるミトコンドリア膜電位へのトルカポン、エンタカポン、ＣＰＴ−２１２（Ｂ１）またはＣＰＴ−４０１（Ａ１）の用量依存的作用（対照のパーセント）を示す。データは平均ＳＤである（ｎ＝６）。

Claims (15)

  1. 一般式（Ａ）、

    （Ａ）、
    ［式中、
    −Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ２から選択され；
    −Ｒ２は、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−ＯＲ１１、−ＳＯ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＲ１１、−ＳＯ２−ＮＲ１１ ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ２−ＯＲ１１、−ＣＮ、−ＣＯＲ１１、−ＣＯ２Ｒ１１、−ＣＯＮＨＲ１１、−ＣＯＮＲ１１ ２、−ＣＦ３およびハロゲンから選択され；
    −Ｒ３は、Ｈ、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−ＯＲ１１、−ＳＯ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＲ１１、−ＳＯ２−ＮＲ１１ ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ２−ＯＲ１１、−ＣＮ、−ＣＯＲ１１、−ＣＯ２Ｒ１１、−ＣＯＮＨＲ１１、−ＣＯＮＲ１１ ２、−ＣＦ３およびハロゲンから選択され；
    −Ｒ４およびＲ５は、−Ｈ、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換または非置換Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、−ＣＮおよび−ＮＯ２から独立して選択され；
    ‐Ｒ６およびＲ７の一方は、−ＣＯＮＲ９Ｒ１１、−ＣＯＮＲ９ ２、−ＣＯＲ９、−ＣＯＯＲ９、−ＳＯ２−ＯＨ、−ＳＯ２Ｒ９、−ＳＯ２−ＯＲ９、−ＳＯ２−ＯＲ１１、−ＳＯ２ＮＨＲ１１、−ＳＯ２ＮＲ９Ｒ１１、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＦ３および−ＳＯ２ＮＲ９ ２から選択され；
    ‐Ｒ６およびＲ７の他方は、Ｈ、−ＣＯＮＨ２、ＣＯＯＨ、−ＳＯ２−ＯＨ、−ＳＯ２ＮＨ２、−Ｙ−Ｒ９、−Ｙ−Ｒ９ ２および−Ｒ９から選択され、
    ここで、
    −Ｒ９はＲ１０−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり；
    −Ｙは、−ＣＯＮＲ１１−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＲ１１−、−Ｏ−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−、−ＯＣＯＮＲ１１−および−ＯＣＯＯ−から選択され；
    −ｎは、０、１、２、３および４から選択される整数であり、
    ‐それぞれのＲ１０は、他のＲ１０とは独立して、置換または非置換Ｃ１−Ｃ８アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ８アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ８アルキニル、置換または非置換Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキルおよび置換または非置換５〜１０員アリールまたはヘテロアリールから選択され；ならびに
    −それぞれのＲ１１は、他のＲ１１とは独立して、Ｈまたは非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルである］
    によって特徴付けられる化合物。
  2. Ｒ７が、−ＣＯＮＲ１１Ｒ９、−ＣＯＮＲ９ ２、−ＣＯＲ９、−ＣＯＯＲ９、−ＳＯ２−ＯＨ、−ＳＯ２Ｒ９、−ＳＯ２−ＯＲ１１、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨＲ１１、−ＳＯ２ＮＲ１１Ｒ９および−ＳＯ２ＮＲ９ ２から選択され、Ｒ９が上記で定義したのと同じ意味を有する、請求項１に記載の化合物。
  3. −Ｒ１が−ＯＨであり、
    −Ｒ２が−ＮＯ２であり、Ｒ３がＨであり、
    −Ｒ４およびＲ５がＨであり、
    −Ｒ６が、Ｈ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＮＲ９ ２から選択され、
    −Ｒ７が、−ＣＯＮＲ９ ２および−ＣＯＮＲ１１Ｒ９から選択され、
    Ｒ９およびＲ１１が上記で定義したのと同じ意味を有する、
    請求項１または２のいずれか一項に記載の化合物。
  4. ｎが０である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. ｎが１である、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
  6. ｎが２である、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. Ｒ６が−ＣＯＮＲ１１Ｒ１１であり、Ｒ７が−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ここで、
    −それぞれのＲ１１が、他のＲ１１とは独立して、Ｈまたは非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、および
    −Ｒ９が上記で定義したのと同じ意味を有する、
    請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
  8. Ｒ６およびＲ７が−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ならびにここで、
    −Ｒ９がＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
    −Ｙが、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
    −ｎが１または２であり、
    −Ｒ１０が、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、および
    −Ｒ１１が、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである、
    請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. Ｒ６が−ＣＯＮＲ１１ ２であり、Ｒ７が−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ここで、
    −Ｒ９がＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
    −Ｙが、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
    −ｎが１または２であり、
    −Ｒ１０が、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、ならびに
    −Ｒ１１が、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである、
    請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
  10. Ｒ６がＨであり、Ｒ７が−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ここで、
    −Ｒ９がＲ１１−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
    −Ｙが、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
    −ｎが１または２であり、
    −Ｒ１０が、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、ならびに
    −Ｒ１１が、非置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルである、
    請求項１から９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. Ｒ７が−ＣＯＮＲ９Ｒ１１であり、ここで、
    −Ｒ９が（ＣＨ２）４−（Ｙ−Ｒ１０）ｎであり、
    −Ｙが、−ＣＯＮＲ１１−、−ＮＲ１１ＣＯ−、−ＮＲ１１ＣＯＯ−および−ＮＲ１１ＣＯＮＲ１１−から選択され、
    −ｎが１または２であり、
    −Ｒ１０が、非置換または一置換Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−またはＣ４アルキルであり、
    −Ｒ１１が、非置換メチルまたはエチルである、
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
  12. 以下の式：
    ・Ｎ２，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−テトラエチル−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２，３−ジカルボキサミド（Ａ１）、
    ・（３−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−カルボニル］−エチル−アミノ］プロピルアセタート）（Ａ２）、
    ・Ｎ２−（６−アミノヘキシル）−Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−トリエチル−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２，３−ジカルボキサミド（Ａ４）、
    ・Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−トリエチル−６，７−ジヒドロキシ−Ｎ２−［４−［メチル（ペンタノイル）アミノ］ブチル］−５−ニトロ−ナフタレン−２，３−ジカルボキサミド（Ａ５）、
    ・ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［６−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−カルボニル］−エチル−アミノ］ヘキシル］カルバマート（Ａ６）、
    ・４−［４−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−カルボニル］−エチル−アミノ］ブチル−メチル−アミノ］−４−オキソ−ブタン酸（Ａ８）、
    ・Ｎ２−［４−［４−アミノブタノイル（メチル）アミノ］ブチル］−Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−トリエチル−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２，３−ジカルボキサミド（Ａ９）、
    ・ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［４−［４−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−カルボニル］−エチル−アミノ］ブチル−メチル−アミノ］−４−オキソ−ブチル］カルバマート（Ａ１０）、
    ・Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−トリエチル−６，７−ジヒドロキシ−Ｎ２−［４−［［６−（２−メトキシフェニル）−６−オキソ−ヘキサノイル］−メチル−アミノ］ブチル］−５−ニトロ−ナフタレン‐２，３−ジカルボキサミド（Ａ１１）および
    ・ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［１−シクロヘキシル−２−［４−［［３−（ジエチルカルバモイル）−６，７−ジヒドロキシ−５−ニトロ−ナフタレン−２−カルボニル］−エチル−アミノ］ブチル−メチル−アミノ］−２−オキソ−エチル］カルバマート（Ａ１３）
    から選択される化合物。
  13. 薬剤として使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物。
  14. パーキンソン病、アルツハイマー病、多剤耐性結核および肥満関連障害を含む群から選択される状態の予防または治療において使用する薬剤としての使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物。
  15. パーキンソン病、アルツハイマー病、多剤耐性結核および肥満関連障害を含む群から選択される状態の予防または治療に使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物を含有する剤形であって、吸入または経口投与に適しており、特に錠剤、カプセル、ロゼンジ、粉末、溶液、懸濁液またはシロップである、剤形。

JP2018551505A 2015-12-18 2016-12-19 薬剤としての使用のため、特にパーキンソン病の治療のための新規二環式化合物 Active JP7007292B2 (ja)

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EP15201180 2015-12-18
EP15201180.5 2015-12-18
EP16174650 2016-06-15
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