JP2019503662A - プロテアーゼ基質を同定するためのシステムおよび方法 - Google Patents

プロテアーゼ基質を同定するためのシステムおよび方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、プロテアーゼを、第１のアレイおよび第２のアレイのうちの１つと接触させるステップであって、各アレイが、複数の同一の特徴を有し、各特徴が、固体支持体に結びついた少なくとも１つの配列を含む、ステップを含む、プロテアーゼに対する基質を同定する方法を提供する。少なくとも１つの配列は、レポーターに結びついたプロテアーゼ基質候補を含む。本方法は、検出可能な要素をアレイのそれぞれと接触させて、検出可能な要素がレポーターに結合し、検出可能な要素が第１および第２のアレイ内のレポーターのそれぞれと結合したことに起因する第１および第２のシグナルを検出するのを可能にするステップをさらに含む。本方法は、第１のシグナルと第２のシグナルを比較して、第１のシグナルと第２のシグナルの差異を識別し、少なくとも１つのプロテアーゼ基質候補をプロテアーゼに対する基質として同定するステップをさらに含む。【選択図】図１

Description

本発明は、プロテアーゼ酵素、より具体的には、ペプチドマイクロアレイを使用したプロテアーゼ基質の発見に関する。
タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、細胞内および細胞外のシグナル伝達、異化、ならびにその他の酵素機能を含む様々な細胞のプロセスを制御する。ＰＴＭの例として、タンパク質分解、リン酸化、およびその他の化学修飾が挙げられる。ＰＴＭは、転写および翻訳よりも急速にタンパク質機能を改変することができるので、ＰＴＭは生物学的応答において重要な役割を果たしている。例えば、血液凝固、補体活性化、および卵母細胞の表層反応は、タンパク質分解性の切断によるタンパク質活性化が関わる生物学的応答である。これまでに配列決定された複雑なゲノム内のタンパク質コーディング配列のうち、約２％がプロテアーゼをコードするものと見積もられている。このような酵素の基質特異性を理解すれば、生物学的経路の手がかりが得られる。さらに、所与のプロテアーゼに対する基質を同定すれば、クリニックおよびそれ以外において有望な用途を有し得る極めて特異性の高いプロテアーゼ阻害剤の創出が可能になる。
また、プロテインキナーゼは、多くの細胞プロセスにおいても役割を果たしている。プロテインキナーゼは、修飾のため様々なアミノ酸を標的とする広くクラス分けされるタンパク質である（例えば、チロシン、ヒスチジン、およびセリン−トレオニンの各キナーゼ）。キナーゼにより標的とされるペプチド配列が同定されれば、臨床的に重要で、競合的であり、おそらくは不可逆的なキナーゼの阻害剤として役に立ち得る基質模倣化合物を設計する道が開ける。
その他のＰＴＭ、例えばリン酸化、およびグリコシル化等とは異なり、タンパク質分解は、修飾されたタンパク質の富化を可能にする固有のケミカルハンドルを生成しない。すなわち、タンパク質分解は、その他のＰＴＭの場合のように建設的であるのとは逆に破壊的である。したがって、プロテアーゼを同定するためのアプローチ、およびその基質レパートリーは、「デグラドミクス」と呼ばれる研究分野に発展した。現在のところ、プロテアーゼ基質を同定するためのいくつかの方法が存在する。このような方法として、一次元および二次元電気泳動、ならびにＮ末端同定法が挙げられる。これらの方法と関連したいくつかの欠点として、潜在的基質候補のライブラリーが大きいと、そのスクリーニングが不可能であること、検出に必要な化学修飾の収率が低いこと、バックグラウンドが高いこと、および偽陽性結果が生じることが挙げられる。プロテアーゼ基質を同定するための既存の方法は、極めて豊富なタンパク質分解生成物に引きずられて偏りが生ずること、および質量分析のマッチングに頼らざるを得ないことからも制約を受ける。
いくつかの方法は、天然源中に存在するプロテアーゼ基質の発見を目的とする。例えば、全細胞ライセートは、プロテアーゼを認識するための空間的レイアウトを構築するために、２−Ｄゲル電気泳動で処理され得る。Ｂｒｅｄｅｍｅｙｅｒ，Ａ．らの、（２００４年）Ａ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ、ＰＮＡＳ、１０１巻：１１７８５頁を参照。その他の方法は、人工的基質と関係する。Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．らの、（２０００年）Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、ＰＮＡＳ、９７巻：７７５４号を参照。この方法は、固体支持体上で合成され、プロテアーゼ基質の複合混合物を作製するために溶液中に放出されるペプチドの開裂可能なライブラリーと関係する。プロテアーゼ基質は、宿主細胞の集団をプロテアーゼ発現プラスミド、および切断時に蛍光を発する能力を有する基質候補をコードするプラスミドのライブラリーと共に、ｉｎ ｖｉｖｏで同時トランスフェクトすることによっても識別可能である。Ｋｏｓｔａｌｌａｓ Ｇ．らの、（２０１１年）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｗｈｏｌｅ−Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ、６巻（１）：ｅ１６１３６頁．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１６１３６．を参照。その他の方法は、プロテアーゼ基質の配列および構造的特徴を識別するためのサポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムを利用するｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの基質の探索と関係し、例えば、Ｂａｒｋａｎ，Ｄ．ら、（（２０１０年）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２６巻：１７１４頁）を参照。ただし、これまでに記載した通り、プロテアーゼ基質を同定するための上記方法は、スループットが低く、時間がかかり、一般的に非効率的であるおそれがある。
したがって、プロテアーゼ基質の同定および成熟のための改善した方法およびシステムに対する必要性が存在する。
本発明は、プロテアーゼ基質を同定するためのシステムおよび方法を提供することにより、上記欠点を克服する。
本開示の１つの実施形態に基づき、プロテアーゼに対する基質を同定する方法は、以下のステップを含む：ａ）プロテアーゼを、第１のアレイおよび第２のアレイのうちの１つと接触させるステップであって、第１のアレイおよび第２のアレイのそれぞれが、複数の特徴を有し、第１のアレイおよび第２のアレイが同一の複数の特徴を有し、各特徴が固体支持体に結びついた少なくとも１つの配列を含み、前記少なくとも１つの配列がレポーターに結びついたプロテアーゼ基質候補を含む前記ステップ；ｂ）検出可能な要素を第１のアレイおよび第２のアレイのそれぞれと接触させて、第１のアレイおよび第２のアレイのそれぞれの特徴において、前記検出可能な要素が前記少なくとも１つの配列内のレポーターに結合可能にするステップ；ｃ）前記検出可能な要素が、第１のアレイのそれぞれの特徴において、前記少なくとも１つの配列内のレポーターに結合することに起因する第１のシグナル、および前記検出可能な要素が、第２のアレイのそれぞれの特徴において、前記少なくとも１つの配列内のレポーターに結合することに起因する第２のシグナルを検出するステップ；ｄ）第１のアレイとの結合に起因する第１のシグナルと、第２のアレイとの結合に起因する第２のシグナルとを比較して、第１のシグナルと第２のシグナルとの差異を識別するステップ；ならびにｅ）ステップｄ）でプロテアーゼに対する基質として識別された特徴において、少なくとも１つのプロテアーゼ基質候補を同定するステップ。
一態様では、レポーターは、ペプチドエピトープであり、および検出可能な要素は、ペプチドエピトープに対して特異的な抗体である。
別の態様では、レポーターは、タンパク質に対するペプチドバインダーであり、および検出可能な要素は、ペプチドバインダーが特異的に結合するタンパク質である。
なおも別の態様では、プロテアーゼ基質候補は、天然および非天然アミノ酸から選択されるコア配列を含む。
また別の態様では、コア配列は、約５〜約１５個のアミノ酸を有する。
さらなる態様では、検出可能な要素は、ストレプトアビジンであり、ならびにペプチドバインダーは、ＷＴＨＰＱＦＥ、ＤＹＬＡＥＹＨＧＧ、ＹＥＲＰＧＷＫＬＳ、ＰＡＰＡＷＡＨＧＧ、ＮＳＦＤＥＷＬＱＫ、ＷＴＨＰＱＦＥＱＫ、ＡＤＹＬＡＥＹＨＧＧ、ＹＥＲＰＧＷＫＬＧＴ、ＤＰＡＰＡＷＡＨＧＧ、およびＮＳＦＤＤＷＬＡＫＧＧからなる群から選択される。
一態様では、検出可能な要素は、蛍光基を含有する。
別の態様では、少なくとも１つの配列は、式：
［Ｒ１］−［Ｌ１］−［Ｚ１］−［Ｘ１］−［Ｚ２］−［Ｌ２］
を有し、
式中、Ｒ１はレポーターペプチドであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれスペーサーであり、Ｚ１およびＺ２は、０〜約３個のアミノ酸を有するペプチド配列からそれぞれ独立に選択され、ならびにＸ１は、約５〜約１５個のアミノ酸の定義された配列を有するペプチドである。
また別の態様では、Ｒ１はストレプトアビジンにより結合したペプチド配列であり、Ｌ１およびＬ２のうちの少なくとも１つは６−ヘキサン酸スペーサーであり、ならびにＺ１およびＺ２のペプチド配列は、グリシンおよびセリンのうちの少なくとも１つを含む。
一態様では、Ｌ２は、固体支持体に結びついている。
本開示の別の実施形態に基づけば、トロンビンプロテアーゼに対するペプチド基質は、配列番号１〜配列番号９からなる群から選択される配列を含む。
本開示のなおも別の実施形態に基づけば、マトリプターゼプロテアーゼに対するペプチド基質では、該ペプチド基質は、配列番号１０〜配列番号２８からなる群から選択される配列を含む。
本開示のなおも別の実施形態に基づけば、プロテアーゼに対する基質を同定するためのペプチドマイクロアレイは、複数の特徴を備え、各特徴は、固体支持体に結びついた少なくとも１つの配列を有し、該配列は、プロテアーゼ基質ペプチド候補およびレポーターペプチドを含む。
一態様では、プロテアーゼ基質ペプチド候補およびレポーターペプチドは、スペーサーを介して連結している。
別の態様では、スペーサーは、オレイン酸を含む。
なおも別の態様では、スペーサーは、ヘキサン酸のポリマーである。
さらなる態様では、プロテアーゼ基質ペプチド候補は、５〜１５個のアミノ酸を含む。
また別の態様では、レポーターペプチドとして、ストレプトアビジン結合配列が挙げられる。
一態様では、少なくとも１つの配列は、式：
［Ｒ１］−［Ｌ１］−［Ｚ１］−［Ｘ１］−［Ｚ２］−［Ｌ２］
を有し、
式中、Ｒ１はレポーターペプチドであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれスペーサーであり、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ０〜約３個のアミノ酸を有するペプチド配列から独立に選択され、ならびにＸ１は約５〜約１５個のアミノ酸の定義された配列を有するペプチドである。
本開示のさらなる実施形態に基づけば、プロテアーゼに対する基質を同定する方法は、以下のステップを含む：ａ）プロテアーゼを、複数の特徴を有する第１のアレイと接触させるステップであって、各特徴が固体支持体に結びついた少なくとも１つの配列を含み、前記少なくとも１つの配列が、プロテアーゼ基質候補がタンパク質分解性の消化を受けた際に検出可能なシグナルを生成する能力を有する検出可能な要素と結びついた前記プロテアーゼ基質候補を含む前記ステップ；ｂ）１つまたは複数の特徴において、前記プロテアーゼ基質候補のタンパク質分解性の消化に起因するシグナルを検出するステップ；ｃ）シグナルが、プロテアーゼに対する基質としてステップｂ）において検出されている特徴において、前記プロテアーゼ基質候補を同定するステップ。
本開示は、ペプチドマイクロアレイを使用してプロテアーゼ基質を同定する方法をさらに提供する。１つの実施形態では、本発明は、プロテアーゼを、複数のアドレス可能な特徴を含む第１の固体支持体と接触させるステップであって、各特徴がプロテアーゼ基質候補ペプチドおよびレポーターペプチドを含有する前記ステップ；第１の固体支持体の特徴において、検出可能な要素を第１の固体支持体と接触させて、検出可能な要素がレポーターペプチドと結合するのを可能にするステップ；第２の固体支持体の特徴において、検出可能な要素を、第１の固体支持体と同一であるが、プロテアーゼと接触していない第２の固体支持体と接触させて、検出可能な要素がレポーターペプチドと結合するのを可能にするステップ；第１および第２の固体支持体の特徴において、検出可能な要素とレポーターペプチドとの結合に起因するシグナルを検出するステップ；第１および第２の固体支持体との結合に起因するシグナルを比較して、第１の固体支持体ではなく第２の固体支持体中に存在するシグナルを識別するステップ；欠損している特徴において、プロテアーゼに対する基質としてプロテアーゼ基質候補ペプチドを同定するステップを含む、プロテアーゼに対する基質を同定する方法である。レポーターペプチドは、エピトープであり得るが、また検出可能な要素は、当該エピトープに対して特異的な抗体であり得る。レポーターペプチドは、タンパク質に対するペプチドバインダーであり得るが、また検出可能な要素は、ペプチドバインダーが特異的に結合するタンパク質である。ペプチドバインダーは、２０１４年１２月１９日出願の米国特許出願番号第１４／５７７，３３４号に記載の方法により選択され得る。検出可能な要素は、ストレプトアビジンであり得るが、またストレプトアビジンバインダーは、ＷＴＨＰＱＦＥ、ＤＹＬＡＥＹＨＧＧ、ＹＥＲＰＧＷＫＬＳ、ＰＡＰＡＷＡＨＧＧ、ＮＳＦＤＥＷＬＱＫ、ＷＴＨＰＱＦＥＱＫ、ＡＤＹＬＡＥＹＨＧＧ、ＹＥＲＰＧＷＫＬＧＴ、ＤＰＡＰＡＷＡＨＧＧ、およびＮＳＦＤＤＷＬＡＫＧＧからなる群から選択され得る。検出可能な要素は、蛍光基を含み得る。
別の実施形態では、本発明は、アドレス可能な特徴を含むプロテアーゼに対する基質を同定するためのマイクロアレイであり、各特徴はプロテアーゼ基質候補ペプチドおよびレポーターペプチドを含有する。プロテアーゼ基質候補ペプチドおよびレポーターペプチドは、スペーサー、例えば、オレイン酸を含むスペーサー、例えば、ヘキサン酸のポリマーを介して連結し得る。プロテアーゼ基質候補ペプチドは、５〜１５個のアミノ酸を含み得る。レポーターペプチドは、ストレプトアビジン結合配列であり得る。
別の実施形態では、本発明は、以下のステップを含む方法により同定されるプロテアーゼに対する基質である：プロテアーゼを複数のアドレス可能な特徴を含む第１の固体支持体と接触させるステップであって、各特徴がプロテアーゼ基質候補ペプチドおよびレポーターペプチドを含有する前記ステップ；第１の固体支持体の特徴において、検出可能な要素を第１の固体支持体と接触させて、検出可能な要素がレポーターペプチドに結合するのを可能にするステップ；第２の固体支持体の特徴において、検出可能な要素を、第１の固体支持体と同一であるが、プロテアーゼと接触していない第２の固体支持体と接触させて、検出可能な要素がレポーターペプチドに結合するのを可能にするステップ；第１および第２の固体支持体の特徴において、検出可能な要素がレポーターペプチドに結合することに起因するシグナルを検出するステップ；第１および第２の固体支持体との結合に起因するシグナルを比較して、第１の固体支持体ではなく第２の固体支持体中に存在するシグナルを識別するステップ；欠損している特徴において、プロテアーゼに対する基質としてプロテアーゼ基質候補ペプチドを同定するステップ。
別の実施形態では、本発明は、以下のステップを含むプロテアーゼに対する基質を同定する方法である：プロテアーゼを、複数のアドレス可能な特徴を含む固体支持体と接触させるステップであって、各特徴がプロテアーゼ基質候補ペプチド、およびプロテアーゼ基質候補ペプチドがタンパク質分解性の消化を受けた際に検出可能なシグナルを生成する能力を有する検出可能な要素を含有する前記ステップ；１つまたは複数の特徴において、プロテアーゼ基質候補ペプチドのタンパク質分解性の消化に起因するシグナルを検出するステップ；シグナルが、プロテアーゼに対する基質として検出された特徴において、プロテアーゼ基質候補ペプチドを同定するステップ。
別の実施形態では、本発明は、以下のステップを含むプロテアーゼに対して少なくとも２つの異なる親和性を有する基質を同定する方法である：第１セットの条件下で、プロテアーゼを、複数のアドレス可能な特徴を含む固体支持体と接触させるステップであって、各特徴が、プロテアーゼ基質候補ペプチドおよびプロテアーゼ基質候補ペプチドがタンパク質分解性の消化を受けた際に検出可能なシグナルを生成する能力を有する検出可能な要素を含有する前記ステップ；第１セットの条件下、１つまたは複数の特徴において、プロテアーゼ基質候補ペプチドのタンパク質分解性の消化に起因するシグナルを検出するステップ；第１の親和性を有するプロテアーゼに対する基質として、ステップｂでシグナルが検出された特徴において、プロテアーゼ基質候補ペプチドを同定するステップ；第２セットの条件下で、プロテアーゼを、第１のステップと同一の固体支持体と接触させるステップ；第２セットの条件下、１つまたは複数の特徴において、プロテアーゼ基質候補ペプチドのタンパク質分解性の消化に起因するシグナルを検出するステップ；第２の親和性を有するプロテアーゼに対する基質としてプロテアーゼ基質候補ペプチドを同定するステップ。
上記およびその他の態様、ならびに本発明の長所は、下記の説明から明らかとなる。説明では、本明細書の一部をなす添付図面を参照しているが、そこでは、本発明の好ましい実施形態が説明目的で提示される。ただし、そのような実施形態は必ずしも本発明の範囲全体を表しているわけではなく、したがって本発明の範囲を解釈するには、特許請求の範囲および本明細書が参照される。
図１Ａは、本開示に基づき、プロテアーゼ基質を同定するためのマイクロアレイについて、その単一の特徴に関する説明図である。図１Ｂは、本開示に基づき、プロテアーゼ基質を同定するためのマイクロアレイについて、その単一の特徴に関する特別な実施例の説明図である。特徴として、５−ｍｅｒコア配列を含むプロテアーゼ基質候補、およびストレプトアビジンバインダーペプチドとして例示するレポーター要素が挙げられる。 プロテアーゼとしてトロンビンを用いた、図１Ｂに基づくペプチドの特徴の切断結果を示す散布図である。縦軸は、トロンビンによる処理無し（ＵＴ）ペプチドマイクロアレイに由来する特徴に結合したＣｙ５標識ストレプトアビジンにより生成された蛍光シグナルに対する、トロンビンによる処理有り（Ｔ）ペプチドマイクロアレイに関する特徴に結合したＣｙ５標識ストレプトアビジンにより生成された蛍光シグナルの比を示す一方、横軸は、トロンビンで処理した特徴に関する蛍光シグナルのみを示す。 トロンビン切断効率と基質候補ペプチドの５−ｍｅｒコア配列内の所定のアミノ酸数について、それらの間の関連性を示す図である。データは、アミノ酸をアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびアスパラギン（Ｎ）として表わす。例えば、上段左側の第１のパネルは、５−ｍｅｒコア配列内のアラニン残基（０〜３）の数の関数として切断効率の対数を示す。 トロンビン切断効率と基質候補ペプチドの５−ｍｅｒコア配列内の所定のアミノ酸数について、それらの間の関連性を示す図である。データは、アミノ酸をプロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）として表わす。例えば、上段左側の第１のパネルは、５−ｍｅｒコア配列内のプロリン残基（０〜３）の数の関数として切断効率の対数を示す。 トロンビンによる５−ｍｅｒペプチドの切断結果をさらに表す図２の散布図であり、ペプチド内のアルギニン（Ｒ）含有量（０〜３残基）を強調的に表示する。 トロンビンによる５−ｍｅｒペプチドの切断結果をさらに示す図２の散布図であり、ペプチド内のリジン（Ｋ）含有量を強調的に表示する。 これまでに記載されているトロンビン基質および本開示に基づく新規同定されたトロンビン基質のリストを比較した図である。パネルＡ〜Ｃは、Ｇａｌｌｗｉｔｚ Ｍ．ら、（２０１２年）、Ｔｈｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ、７巻（２）：ｅ３１７５６から転載。パネルＤは、本開示の方法を通じて同定されたペプチド配列のリストである。 プロテアーゼのマトリプターゼによる、図１Ｂに基づくペプチドの特徴の切断結果を示す散布図である。縦軸は、マトリプターゼによる処理有りペプチドマイクロアレイ上の特徴に結合したＣｙ５−標識ストレプトアビジンにより生成された蛍光シグナルに対する、処理無し（ＵＴ）ペプチドマイクロアレイ上の特徴に結合したＣｙ５−標識ストレプトアビジンにより生成された蛍光シグナルの比を示す一方、横軸は、処理無しの特徴に関する蛍光シグナルのみを示す。
Ｉ．定義
本明細書で用いる場合、用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」とは、アミノ酸から構成される有機化合物を意味し、隣接した残基のカルボキシル基とアミノ基の間のペプチド結合により、共に接合したアミノ酸の直線状または環状の鎖で構成され得る。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」とは、より短いポリペプチド、すなわち、５０個未満のアミノ酸残基から構成される有機化合物を意味する。
用語「天然アミノ酸」とは、標準的な遺伝子コードによりコードされ、およびタンパク質に一般的に見出され、およびタンパク質生合成で使用される２０種類のアミノ酸のうちの１つ、ならびに翻訳の間にタンパク質に組み込まれ得るその他のアミノ酸（ピロリジンおよびセレノシステインを含む）を意味する。２０種類の天然アミノ酸として、ヒスチジン、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、アルギニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、およびリジンが挙げられる。
用語「非天然アミノ酸」とは、標準的な遺伝子コードによりコードされる、または翻訳の間にタンパク質に組み込まれるアミノ酸に該当しない有機化合物を意味する。非天然アミノ酸として、アミノ酸またはアミノ酸の類似体、例えば、アミノ酸のＤ−アイソステレオマー（Ｄ−アミノ酸）、アミノ酸のβ−アミノ類似体、シトルリン、ホモシトルリン、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ホモプロリン、オルニチン、４−アミノ−フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グリシン、ノルロイシン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、α−アミノ酪酸、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、２−アミノイソ酪酸、α−アミノイソ酪酸、２−アミノインダン−２−カルボン酸、セレノメチオニン、デヒドロアラニン、ランチオニン、γ−アミノ酪酸、およびアミン窒素がモノまたはジ−アルキル化されたその誘導体が挙げられる。
用語「マイクロアレイ」、または「ペプチドマイクロアレイ」、または単に「アレイ」とは、固体または半固体支持体表面上にある特徴（オリゴペプチド）の二次元配置を意味する。単一のマイクロアレイ、または場合によっては、複数のマイクロアレイ（例えば、３、４、５個、またはそれ超のマイクロアレイ）が、１つの固体支持体に位置し得る。マイクロアレイのサイズは、１つの固体支持体上のマイクロアレイの数に依存する。固体支持体１個当たりのマイクロアレイの数が多くなるほど、固体支持体に収まるにはアレイは小さくならなければならない。アレイは、任意の形状で設計され得るが、好ましくは四角形または長方形として設計される。既製タイプの製品は、「マイクロアレイスライド」と呼ばれる固体または半固体支持体上のオリゴペプチドマイクロアレイである。
用語「特徴」とは、マイクロアレイ表面上の定義された領域を意味する。特徴は、生体分子、例えば本発明の文脈においてペプチド等を含む。１つの特徴は、異なる特性、例えばその他の特徴と比較して異なる配列または配向等を有する生体分子を含み得る。特徴のサイズは、２つの因子：ｉ）アレイ上の特徴の数（アレイ上の特徴の数が多いほど、１つの特徴それぞれは小さくなる）；およびｉｉ）１つの特徴の発光に使用される、個別にアドレス可能なアルミニウムミラー要素により決定される。１つの特徴の発光に使用されるミラー要素の数が多いほど、１つの特徴それぞれは大きくなる。アレイ上の特徴の数は、マイクロミラーデバイス中に存在するミラー要素（ピクセル）の数により限定され得る。例えば、Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ社製の最新技術分野のマイクロミラーデバイスは、現在のところ、４．２百万ミラー要素（ピクセル）を備え、したがって、そのような代表的なマイクロアレイ内の特徴の数は、この数により限定される。ただし、Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ社製のマイクロミラーデバイスは、代表的な目的について提示されるに過ぎず、より高密度のアレイも利用可能である、または利用可能となるものと理解すべきである。
用語「固体または半固体支持体」とは、有機分子が結合形成を通じて繋ぎ止められ得る、または電子的もしくは静的相互作用、例えば特異的官能基を通じた共有結合もしくは複合体形成等を通じて吸収され得る表面領域を有するあらゆる固体材料を意味する。支持体は、材料の組合せ、例えばガラス上のプラスチック、ガラス上のカーボン等であり得る。機能的表面は、単純な有機分子であり得るが、コポリマー、デンドリマー、分子ブラシ等を含んでもよい。
本明細書で用いる場合、用語「スペーサー」とは、１つまたは複数の化学物質、ポリマーまたは、その組合せを意味するが、天然アミノ酸を含まない。
ＩＩ．説明
本発明は、酵素基質モチーフを同定するために、ペプチドライブラリーをスクリーニングする方法に関する。いくつかの実施形態では、酵素はプロテアーゼであるが、一方、その他の実施形態では、酵素は、プロテインキナーゼである。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、マイクロアレイ等の固体支持体に結合している。ペプチドマイクロアレイを形成する方法は、当技術分野において公知である。ペプチドアレイを生成する特定の方法は、事前に組み立てられたペプチドをスポットするステップ、または膜上で試薬をスポットすることによるｉｎ−ｓｉｔｕ合成を含む（米国特許第６，３７５，９０３号を参照）。より高い密度のペプチドアレイを生成するのに使用される公知のその他の方法は、フォトリソグラフィー技術と関係し、その場合、所望のバイオポリマーの合成デザインは、光等の電磁放射に曝露された際に、次の各アミノ酸に対して結合部位を放出する好適な感光性保護基（ＰＬＰＧ）により制御される（Ｆｏｄｏｒら、（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６４巻：５５５〜５５６頁；Ｆｏｄｏｒら、（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：７６７〜７７３頁）。２つの異なるフォトリソグラフィー技術が、当技術分野において公知である。第１は、合成表面の特定の領域に光を誘導してＰＬＰＧの局所的な脱保護を有効にするのに使用されるフォトリソグラフィーマスクである。このような「マスク」法は、基質と嵌合し、基質とマウントの間にリアクタースペースを提供するマウント（「マスク」）を利用するポリマー合成を含む。米国特許第５，１４３，８５４号および同第５，４４５，９３４号を参照。第２のフォトリソグラフィー技術は、いわゆるマスクレスフォトリソグラフィーであり、その場合、マイクロミラーデバイス等のデジタルプロジェクション技術により、光は合成表面の特定領域に誘導されて、ＰＬＰＧの局所的脱保護が有効となる（Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．、１７巻（１９９９年）、９７４〜９７８頁）。そのような「マスクレス」アレイを合成すれば、時間および費用のかかる露光マスクの製造に対する必要性が取り除かれる。本発明の方法で利用されるペプチドマイクロアレイは、上記方法のいずれか、または２０１４年１２月１９日出願の「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｅｒｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題する米国特許出願番号第１４／５７７，３３４号において、本発明者らによりこれまでに記載された方法を含む、当技術分野において公知の任意のその他の方法により合成され得る。
１．アレイの特徴
いくつかの実施形態では、本開示は、固体支持体上に配置されたアレイ状のペプチドの特徴を使用することを含む。アレイ上の各特徴は、定義された位置と配列を有する。さらに、各特徴は、因子、例えば所与の特徴内の開始反応部位の数、全配列に対する反応部位の変換割合（％）、および合成の忠実度等に応じて、１つまたは複数の同一の配列を含み得る。例えば、ペプチドアレイ上の仮想的な特徴は、固体支持体上の定義された座標に１０μｍ×１０μｍの四角形を備え得る。特徴の例は、面積１０μｍ２当たり推定１０６個の反応部位をさらに有し、これにより特徴内での最大１０６個の同一の配列が合成できるようになる。別の態様では、配列は、任意の数の異なる化学的構成ブロック、例えばアミノ酸（例えば、天然および非天然アミノ酸）、リンカーまたはスペーサー、蛍光物質等、およびその組合せを含み得る。
図１Ａに戻り、特徴の例１００は、固体支持体１０２と結びついた配列１０１を含む。簡略化のために、ペプチドの特徴１００は、固体支持体１０２と結びついた、または結合した単一の配列１０１を含むように例示されている；ただし、ペプチドの特徴１００は、固体支持体１０２上のペプチドの特徴１００により定義される領域内に複数の同一の配列１０１を含むように合成され得ると認識される。配列１０１は、第１のスペーサー１０６を介して固体支持体１０２に結びついたプロテアーゼ基質候補１０４を含む。基質１０４は、第２のスペーサー１０８を介してレポーター１１０とさらに結びついている。図１Ａに示す説明図において、レポーター１１０は、検出可能な要素１１４と相互作用し、それに結合する能力を有する結合部分１１２を含む。例えば、レポーター１１０は、ペプチド配列であり得、結合部分１１２は、結合モチーフを提示するペプチド配列内のアミノ酸のサブセットであり得、検出可能な要素１１４は、ペプチド配列の結合モチーフと特異的に結合する蛍光標識された抗体であり得る。
説明的な実施形態では、基質１０４は、個々のモノマーユニット１１８から構成されるコア配列１１６を含む。コア配列１１６は、１つまたは複数の追加のモノマーユニット１２０とさらに隣接する。１つの実施形態では、コア配列１１６は、定義されたアミノ酸配列を有する５−ｍｅｒペプチドであり、またコア配列１１６は、ランダムな配列または定義された配列を有する３−ｍｅｒアミノ酸配列（すなわち、モノマー１２０）と各端部において隣接する。まとめとして、固体支持体１０２と結びついた配列１０１の端部から始まり、配列１０１は、第１のスペーサー１０６、１つまたは複数のモノマーユニット１２０、モノマーユニット１１８から構成されるコア配列１１６、１つまたは複数のモノマーユニット１２０、第２のスペーサー１０８、および検出可能な要素１１４と相互作用する能力を有するレポーター１１０を含む。
本開示の１つの実施形態では、特徴１００は、プロテアーゼ基質の同定に有用である。例えば、コア配列１１６が所定のプロテアーゼに対する基質である場合、特徴１００がプロテアーゼ切断に適する条件下でプロテアーゼにより処理されると、コア配列１１６は切断され、これにより固体支持体１０２からレポーター１１０が分離する（例えば、プロテアーゼは隣接したモノマー１１８間のペプチド結合を破壊して、レポーター１１０が固体支持体１０２ともはや結びつけない、さもなければ結合できないようにする）。対照的に、コア配列１１６がプロテアーゼに対する基質でない場合には、特徴１００がプロテアーゼで処理されても、コア配列は切断されず、これによりレポーター１１０と固体支持体１０２の間の結びつき（すなわち、コア配列１１６）はそのまま残る。したがって、プロテアーゼ処理後、レポーター１１０が、特徴１００（および配列１０１）が配置された固体支持体１０２上の定義された場所において検出される場合、コア配列１１６はプロテアーゼにより切断されない可能性が高い。ただし、レポーター１１０が特徴１００の場所において検出されない場合、コア配列１１６は切断された可能性が高く、したがってコア配列１１６は、プロテアーゼに対する基質である可能性が高い。本開示のこのようなおよびその他の態様は、少なくとも下記の実施例セクションを含む本明細書においてより詳細に記載されている。
ここで図１Ｂに戻り、プロテアーゼ基質を同定するための特徴の特別な例が示される。図１Ｂに示す通り、各特徴１５０は、固体支持体１５２と結びつき、レポーターとさらに結びついた固有のプロテアーゼ基質候補を含む１つまたは複数の配列を含む。図１Ｂでは、レポーターは、アーキティピカル「ＨＰＱ」結合モチーフを含むストレプトアビジン結合ペプチド配列により例示される。ただし、本発明の範囲は、その他のペプチド結合配列を含む。本発明の範囲は、非ペプチドベースレポーターであるその他のレポーターも含む。例えば、図１Ｂに示す例示的なストレプトアビジン結合ペプチド配列は、ビオチン分子と置換し得る。本発明の範囲は、レポーターペプチドが省略され、また検出可能な要素がスペーサー、または候補ペプチド配列そのものにコンジュゲートしているような実施形態をさらに含む。なおもその他の検出スキームも、本開示の範囲に含まれる。
マイクロアレイの特徴１５０内では、プロテアーゼ基質候補は、長さが約５〜１５個のアミノ酸のペプチドである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ基質候補は、５−ｍｅｒペプチドである。任意選択的に、ペプチドは、より長い、例えば、長さが最大１１個のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、アレイ上のペプチドは、標準遺伝子コードによりコードされる天然アミノ酸のみを使用して合成される。非天然アミノ酸ならびにペプチド結合を形成する能力を有するその他の分子も利用可能である。２０種類すべて、または２０種類よりも少なくても、例えば、１８種類の天然アミノ酸のみであっても利用可能である。いくつかの実施形態では、アレイは、システイン（Ｃｙｓ）およびメチオニン（Ｍｅｔ）を含まない、１８種類の天然アミノ酸を使用して合成される。なおもその他の実施形態では、アレイ上のペプチド配列は、あらゆる二量体、または同一のアミノ酸からなるより長いリピートをさらに除外する。なおもその他の実施形態では、アレイ上のペプチド配列は、試験プロテアーゼに対して特異性を有することが公知の配列をさらに除外する。そのように除外する目的は、基質であることがすでに公知の配列を回避し、新規基質の発見を促進することにある。このような除外は、試験プロテアーゼが有する既知の基質との解離定数（ＫＤ）が非常に低いとき、特に有利である。例として、配列ＨＰＱおよびＨＰＭを選択するのを回避するために、本発明の方法に基づくアレイはアミノ酸配列ＨＲ、ＲＨ、ＨＫ、ＫＨ、ＲＫ、ＫＲ、ＨＰ、およびＰＱを除外する。この例に基づき、当業者は、特定のプロテアーゼ基質に対する候補をアレイから除外するための配列を選択することができる。
１つの例では、ペプチドアレイは、各特徴が完全長ペプチドをもたらすことができる最大１０７個の反応部位を有する、最大２．９×１０７個の特徴を有し得る。より小型またはより大型のアレイも設計可能である。例えば、システインを除くすべての天然アミノ酸を使用するすべての有望な５−ｍｅｒペプチドの網羅的なリストを提示するアレイは、２，４７６，０９９（約２．５×１０６）個のペプチドを有する。特定のアミノ酸およびアミノ酸二量体を除外するアレイは、約１Ｍ（１０６）個のペプチドを有し得る。マスクレスアレイ合成（ＭＡＳ）の場合、アレイ上の特徴の数は、使用されるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の寸法および全特徴数に対応し得る。１つの例では、１０８個のマイクロミラーを有するＤＭＤが、最大１０８個の特徴を調製するのに利用可能である。
２．レポーター
本発明の方法では、マイクロアレイ上の特徴は、レポーターペプチドとコンジュゲートした、または結びついたプロテアーゼ基質候補ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、レポーターペプチドは、検出可能な要素が特異的に結合するアミノ酸配列である。検出可能な要素−レポーター配列の対の例として、抗体−エピトープ、およびタンパク質−ペプチドバインダーの対が非限定的に挙げられる。特異的エピトープに対する抗体が、当技術分野において公知の任意の方法に基づき生成され得る。特定のペプチドに対する市販の抗体も利用可能である。したがって任意の適するエピトープ−抗体の対が、本発明の文脈において、レポーターシステムとして利用可能である。
その他の実施形態では、レポーターペプチドは、検出可能な要素に直接コンジュゲートしている。そのような実施形態では、レポーターペプチドは、検出可能な要素を含めるのに配列に依存しない構造的な役割を果たす。レポーターペプチドは省略され得るが、その場合、検出可能な要素は候補基質ペプチドに直接またはリンカーを介してコンジュゲートしている。マイクロアレイ上のペプチドの特徴に直接コンジュゲートした検出可能な要素は、蛍光分子または検出可能なシグナルを発する能力を有する任意の分子であり得る。シグナルは、定常的（例えば、放射性標識、蛍光レポーター色素）、または条件的（例えば、レポーター色素として機能する後に添加される蛍光アクセプター色素に、蛍光エネルギーを移す蛍光ドナー色素）であり得る。
なおもその他の実施形態では、レポーターペプチドは、省略され得るが、その場合、蛍光物質が、プロテアーゼ基質候補ペプチドのＮ末端に直接付加可能である。プロテアーゼ消化後のシグナルの損失が、試験プロテアーゼに対する基質として候補を識別するのに利用可能である。
３．プロテアーゼ耐性レポーター
いくつかの実施形態では、レポーターペプチドは、プロテアーゼ耐性の追加の特性を有する。いくつかの事例では、試験プロテアーゼは、レポーターペプチド配列の少なくとも一部に対して特異性を思いがけず有する可能性があり、したがって実験デザインを阻害する。そのような潜在的問題に対処するために、レポーターペプチド配列は、タンパク質分解に対して耐性を有するように設計され得る。例えば、レポーターペプチド配列は、タンパク質に通常見出されないアミノ酸（例えばＤ−アミノ酸等）を含み得る。その他の実施形態では、アミノ酸は、化学修飾を有する場合があり、そのような修飾アミノ酸を含有するペプチドは、タンパク質分解性の消化を排除する。一般的に、レポーターペプチド配列のタンパク質分解を防止するが、検出可能な要素による同定、または検出可能な要素により検出可能なシグナルの放出をなおも妨害しない化学修飾のいずれも、本発明の範囲内にある。この実施形態の変形形態では、レポーター配列は、ペプチド配列ではなく、レポーター配列の必要な構造的特性を有するオリゴマーまたはポリマーであり、すなわち、検出可能な要素または検出可能な要素による特異的認識を支援するが、プロテアーゼ消化に対して耐性を有する。
標的ペプチドに特異的に結合するペプチドバインダーは、２０１４年１２月１９日出願の米国特許出願番号第１４／５７７，３３４号のＳｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｅｒｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓにおいて本発明者らによりこれまでに記載された方法を含む、当技術分野において公知の任意の方法により識別され得る。
いくつかの実施形態では、レポーターペプチド配列は、スペーサー（時にリンカーと呼ばれる）を介してペプチド配列候補と連結することができる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１つまたは複数のカルボン酸分子、例えば、ヘキサン酸から構成される。当業者は、ヘキサン酸が属する、脂肪族側鎖を備えたカルボン酸の属において、化学的特性の類似性および互換性を認識する。さらに、脂肪族側鎖を備えたカルボン酸と類似した化学的特性および立体的特徴を備えたその他の化合物が、カルボン酸の代わりに利用可能である。リンカーは任意選択的である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼペプチド候補およびレポーターペプチドは、例えば、ペプチド結合を介して直接連結し得る。
いくつかの実施形態では、レポーター配列は、検出可能な要素として使用するのに好適および好都合な、タンパク質に特異的に結合するペプチドバインダー配列である。例えば、レポーター配列は、ストレプトアビジンが検出可能な要素であるストレプトアビジン−結合配列であり得る。いくつかの実施形態では、ストレプトアビジン−結合配列は、ＷＴＨＰＱＦＥＱＫである。その他の実施形態では、その他のストレプトアビジン−結合配列、例えば、ＷＴＨＰＱＦＥ、ＤＹＬＡＥＹＨＧＧ、ＹＥＲＰＧＷＫＬＳ、ＰＡＰＡＷＡＨＧＧ、ＮＳＦＤＥＷＬＱＫ、ＷＴＨＰＱＦＥＱＫ、ＡＤＹＬＡＥＹＨＧＧ、ＹＥＲＰＧＷＫＬＧＴ、ＤＰＡＰＡＷＡＨＧＧ、またはＮＳＦＤＤＷＬＡＫＧＧが使用される。このような配列のより長いまたはより短いバージョンまたは置換されたバージョンも、ストレプトアビジンに対して十分な親和性を有する限り利用可能である。
その他の実施形態では、レポーター配列は、ヘキサ−ヒスチジン配列（６Ｈｉｓ）であり、また検出可能な要素は、蛍光物質にコンジュゲートしたニッケル（ＩＩ）−ニトリロトリ酢酸系（Ｎｉ２＋−ＮＴＡ）、例えば、（Ｎｉ２＋−ＮＴＡ）２−Ｃｙ３である。Ｚｈａｏ，Ｃ．ら、（２０１０年）．Ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９９巻（２）：２３７〜４５を参照。なおもその他の実施形態では、レポーター配列は、エピトープタグであり、すなわち、高親和性抗体が検出可能な要素として使用するのに利用可能であるレポーターペプチド配列である。エピトープタグのいくつかの例として、Ｍｙｃ−タグ（ｃ−Ｍｙｃに由来する）、ＨＡ−タグ（インフルエンザ赤血球凝集素に由来する）、および人工的なＦＬＡＧ−タグ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．ら、（１９８８年）、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０）：１２０４頁）が挙げられる。
４．プロテアーゼ基質候補
図１Ｂに示す通り、各ペプチドの特徴１５０は、プロテアーゼ基質候補ペプチドを含む。該特徴内のプロテアーゼ基質候補ペプチドは、長さ５個のアミノ酸であっても、またはそれより長くてもよい。いくつかの実施形態では、アレイ合成期間中に、ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、または両方の端部において、１つまたは複数のアミノ酸により延長され得る。そのような延長は、２またはそれ超のアミノ酸の混合物が、組み込みに用いられる「ウォブル合成」であり得る。いくつかの実施形態では、「ウォブル混合物」は、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）を３：１の比で含有する。その他の例では、ウォブル混合物は、等しい濃度（例えば、等しい比）のＧ、Ｓ、アデニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）、および／または等しい濃度（例えば、等しい比）のアミノ酸Ｌ、Ａ、Ｄ、リジン（Ｋ）、Ｔ、グルタミン（Ｑ）、Ｐ、Ｆ、Ｖ、チロシン（Ｙ）を含有する。本実施形態では、得られたプロテアーゼ基質候補ペプチドは、ランダムおよび指向性合成アミノ酸の組合せを有する。例えば、図１に示す通り、アレイ上の候補ペプチドは、フォーマット：ＺＺＺＺＺ−５ｍｅｒ−ＺＺＺＺＺを有する１５−ｍｅｒであり得、式中Ｚは、特定のウォブル混合物に由来するアミノ酸である。
５．切断
本発明は、固体支持体（例えば、マイクロアレイ）上に存在するプロテアーゼ基質候補ペプチドの集団の中からプロテアーゼ基質ペプチドを切断するステップを含む方法である。本方法は、プロテアーゼ基質候補ペプチドを有する固体支持体を、試験プロテアーゼが酵素的に活性な条件の下で、試験プロテアーゼに曝露するステップを含む。そのような条件の下で、候補中の基質ペプチドは切断を受ける一方、非基質ペプチドは、固体支持体上にそのまま留まる。当業者は、同一のプロテアーゼであっても、各基質について異なる活性、すなわち、異なる動力学的特性（ＫＤ）を有し得ると認識する。同様に、同一のプロテアーゼであっても、プロテアーゼが最大活性を発揮するような好ましい反応条件を有する可能性がある。条件は、反応バッファーの温度、ｐＨ、および組成により特徴付けられる。したがって、本発明の範囲には、プロテアーゼ基質候補ペプチドを有する固体支持体を、切断とプロテアーゼに対して好ましい基質とあまり好ましくない基質の識別とを可能にする様々な反応条件の下で試験プロテアーゼに曝露するステップが含まれる。
本発明は、固体支持体（例えば、マイクロアレイ）上に存在するプロテアーゼ基質候補ペプチドの集団の中のどのペプチドが切断されたか識別するステップを含む方法である。いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質分解性の切断生成物を取り除く、１つまたは複数の洗浄ステップを含む。残存（未切断）ペプチドの識別では、検出可能な要素または検出可能な要素のような別のものを利用する。そのために、方法は、試験プロテアーゼにすでに曝露された固体支持体を、検出可能な要素と接触させるステップを含む。検出可能な要素は、タンパク質分解性の切断が生じなかった特徴中においてのみ検出可能なシグナルを生成する。このような特徴においてのみ、無変化の候補ペプチド、およびつながったレポーター配列が固体支持体上になおも存在する。検出可能な要素（例えば、蛍光分子または検出可能なシグナルを発する能力を有するあらゆる分子）がマイクロアレイ上で候補ペプチドに直接コンジュゲートしているようないくつかの実施形態では、同様に、シグナルはタンパク質分解性の切断が生じなかった特徴中においてのみ検出される。
方法は、検出可能な要素との接触前に試験プロテアーゼに曝露されないことを除き、同じように処理される、第１のマイクロアレイと同一の第２のマイクロアレイを分析するステップをさらに含む。例えば、第２のマイクロアレイは、任意選択的に、プロテアーゼを含有しない同一のプロテアーゼバッファー溶液に曝露され、また第１のマイクロアレイと同一の条件下でインキュベートされ得る。第１のアレイではなく、第２のアレイ上で検出された特徴内の候補ペプチド配列が、試験プロテアーゼに対する基質として同定される。
６．基質の識別
いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドマイクロアレイを使用してプロテアーゼ基質を同定する方法である。方法は、試験プロテアーゼを、アドレス可能な特徴を有する第１の固体支持体（例えばマイクロアレイ等）と接触させるステップを含み、各特徴はプロテアーゼ基質候補ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、各特徴は、候補ペプチド配列とコンジュゲートした、または結びついたレポーターペプチド配列をさらに含む。さらなる実施形態では、各特徴は、検出可能な要素が結合可能なレポーターペプチド配列の代わりに検出可能な要素を含む。
方法は、第１の固体支持体上のレポーターペプチド配列の存在を検出することにより、試験プロテアーゼへの曝露後に、第１の固体支持体上の未切断ペプチド配列の存在を検出するステップをさらに含む。該ステップは、レポーターペプチド配列に結合することにより、または特徴内のペプチドが切断を受けなかった場合に限り、シグナルの放出を引き起こす別の機構により、検出可能なシグナルの放出を可能にする条件下で、第１の固体支持体を検出可能な要素と接触させるステップを含む。本方法は、プロテアーゼで処理されなかった、第２の固体支持体上のペプチド配列の存在を検出するステップをさらに含む。本方法は、第１および第２の固体支持体の検出結果を比較して、第１ではなく第２の固体支持体上に存在するプロテアーゼ基質候補ペプチドを同定するステップをさらに含む。そのようなペプチドは、プロテアーゼにより切断を受けて第１の固体支持体から離れ、したがってプロテアーゼ基質ペプチドとして同定される。
７．基質を同定するためのアレイおよびシステム
いくつかの実施形態では、本発明は、プロテアーゼに対する基質を同定するためのマイクロアレイである。マイクロアレイは、アドレス可能な特徴を含み、各特徴は、固体支持体と結びつき、レポーターペプチド配列とさらに結びついた固有のプロテアーゼ基質候補ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、プロテアーゼに対する基質を同定するシステムである。該システムは、少なくとも２つのマイクロアレイを含み、各マイクロアレイは、アドレス可能な特徴を含み、各特徴は、固体支持体と結びつき、レポーターペプチド配列とさらに結びついた、または検出可能な要素に直接結びついた固有のプロテアーゼ基質候補ペプチドを含有する。該システムは、分離した検出可能な要素も含み得る。いくつかの実施形態では、検出可能な要素は直接検出可能であり、またその他の実施形態では、検出可能な要素は、間接的に検出可能、例えば、検出可能な基質にコンジュゲートした二次抗体を用いて検出可能である。いくつかの実施形態では、システムは、マイクロアレイ上の特定のアドレス可能な特徴の存在を検出するための検出手段をさらに含み得る。例えば、検出可能な要素が、蛍光基または蛍光標識を含む、またはそれにコンジュゲートしている場合、該標識は、蛍光スキャナーにより検出可能である。その他の標識および対応する検出方法として、化学発光、比色定量、またはオートラジオグラフィーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、システムは、２つのマイクロアレイのうちの一方に存在するが他方において欠損している特徴を識別するために、マイクロアレイのそれぞれにおいて検出された特徴の集団を比較する計算処理手段をさらに含む。マイクロアレイスライドをスキャンした後、スキャナーは、スキャンされたマイクロアレイスライド上の各蛍光スポットの解釈を可能にする２０ビット、１６ビット、または８ビットの数値画像を記録する。いくつかの実施形態では、結果は定性的である、すなわち、検出可能な要素は、候補ペプチドが消化されたことまたは消化されなかったことに対応して存在するまたは存在しないとして検出される。計算処理手段は、シグナルと第１のマイクロアレイおよび第２のマイクロアレイ上の対応するペプチド配列の関係を関連付け、ならびに第１ではなく第２のマイクロアレイ上に存在するペプチド配列を同定する能力を有する。いくつかの実施形態では、システムは、候補ペプチド配列が処理無しのマイクロアレイ上で検出され、プロテアーゼ処理されたマイクロアレイ上では検出されない場合、プロテアーゼ基質配列として候補ペプチド配列を報告するための報告手段をさらに含む。
８．本開示に基づき同定されたプロテアーゼ基質
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載する新規の方法により同定されるプロテアーゼに対するペプチド基質である。本方法は、１）プロテアーゼを、アドレス可能な特徴を有する第１の固体支持体（例えばマイクロアレイ等）と接触させるステップであって、前記固体支持体上に位置している各特徴は、プロテアーゼ基質候補ペプチドおよび候補ペプチド配列とコンジュゲートした、または結びついたレポーターペプチド配列を含む前記ステップ；２）第１の固体支持体を、検出可能な要素と接触させて、検出可能なシグナルを生成させるステップ；および３）第１の固体支持体上のレポーター配列の存在を検出するステップ；４）プロテアーゼと接触しなかった固体支持体を用いてステップ２）および３）を繰り返すステップ；５）第１ではなく第２の固体支持体上に存在する特徴を同定し、その特徴内のペプチドをプロテアーゼに対する基質として同定するステップを含む。
本明細書に記載するペプチド基質は、追加のプロテアーゼ基質ペプチドを取得するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ進化プロセス（例えば、米国特許出願番号第１４／５７７，３３４号に記載されるような）を施し得る。
９．基質の確認
いくつかの実施形態では、方法は、試験プロテアーゼに対する基質として同定された候補の確認をさらに含む。該確認は、試験プロテアーゼ、および追加の配列を備える、または備えない候補ペプチドを含めて実施される、ならびに溶液中で、または固体支持体上で実施される、競合的または非競合的なタンパク質分解アッセイを含み得る。
１０．特異的基質
いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドマイクロアレイを使用してトロンビンに対する基質を同定する方法である。いくつかの天然および合成トロンビン基質が記載されている。ＧａｌｌｗｉｔｚＭ．ら、（２０１２年）、Ｔｈｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ、７巻（２）：ｅ３１７５６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３１７５６。本発明の文脈において、該方法は、トロンビンをアドレス可能な特徴を有する第１の固体マイクロアレイと接触させるステップであって、各特徴が、トロンビン基質候補ペプチドを含む前記ステップを含む。いくつかの実施形態では、各特徴は、候補ペプチド配列とコンジュゲートした、または結びついたレポーターペプチド配列をさらに含む。方法は、第１のマイクロアレイ上のレポーター配列の存在を検出することにより、候補ペプチド配列の存在を検出するステップをさらに含む。該ステップは、第１のマイクロアレイを、それがレポーター配列に結合するのを可能にする条件下で検出可能な要素と接触させるステップを含む。未結合の検出可能な要素を任意選択的に除去した後、結合した検出可能な要素の存在が検出され、これによりトロンビンで処理した後に固体支持体上に残った各プロテアーゼ基質候補ペプチドの存在を検出する。いくつかの実施形態では、結合した検出可能な要素は、直接検出可能である。その他の実施形態では、検出可能な要素が、検出可能なシグナルを発する能力を有する別の分子と接触する。該方法は、検出可能な要素と接触させ、およびそれを検出する前にトロンビンに曝露されないことを除き、第１のマイクロアレイと同一であり、同一方式で処理される第２のマイクロアレイをさらに含む。第１のアレイではなく第２のアレイ上に存在するものとして検出された特徴内の候補ペプチド配列が、トロンビンプロテアーゼに対する基質として同定される。
１１．単一アレイ法
いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドマイクロアレイを使用してプロテアーゼ基質を同定する方法である。該方法は、試験プロテアーゼを、アドレス可能な特徴を有する単一の固体支持体（例えばマイクロアレイ等）と接触させるステップであって、前記固体支持体に位置する各特徴が、プロテアーゼにより切断された際に検出可能なシグナルを発する能力を有する検出可能な要素に直接コンジュゲートしたプロテアーゼ基質候補ペプチドを含む前記ステップを含む。検出可能な要素は、例えば、タンパク質分解性の消化の前に蛍光消光物質と対をなす蛍光レポーター色素であり得る。ペプチドが試験プロテアーゼによりタンパク質分解性の消化を受けた後に、消光分子がレポーター蛍光物質から分離し、蛍光が生ずるのを可能にする。切断が生じ、蛍光シグナルが検出される場合、そのような特徴内のプロテアーゼ基質候補がプロテアーゼ基質ペプチドとして同定される。
本実施形態では、同一の固体支持体（例えば、マイクロアレイ）は、プロテアーゼに対して様々な親和性を有する基質を識別するために、試験プロテアーゼに対して連続的に曝露され得る。固体支持体を、プロテアーゼ消化にとって最適とはいえない条件下でプロテアーゼに曝露することで、最高の親和性を有する基質の同定が可能となる。高親和性基質がタンパク質分解により固体支持体から除去された後、許容性が徐々に増し、より最適となるような異なる一連の条件下で固体支持体をプロテアーゼに曝露すれば、親和性が低くなる基質の分類について、その識別が可能になる。
いくつかの実施形態では、方法は、プロテアーゼ基質候補を含有する固体支持体をプロテアーゼと接触させること、および反応終了が検出可能なシグナルの放出により明らかになるタンパク質分解反応速度を経時的に測定することにより、プロテアーゼ基質候補の動力学的特性を決定するステップを含む。
実施例
下記の実施例は、説明的であるように意図されており、またいかなる場合においても制限するようには意図されない。
実施例１：トロンビン結合配列候補の同定
本開示に基づくマスクレスアレイ合成を使用してペプチドマイクロアレイを合成した。各マイクロアレイは、Ｎ末端からＣ末端の順番で、下記の構造を有する特徴を備えた：
ＷＴＨＰＱＦＥＱＫ−［６−ヘキサン酸］−［３Ｚ］−［５−ｍｅｒコア配列］−［３Ｚ］−［６−ヘキサン酸］−［固体支持体］（図１を参照）
３Ｚは、一連の３個の「Ｚ」アミノ酸を表し、Ｚは、５−ｍｅｒコア配列に対して溶解性および可撓性を付与する目的を有する１つまたは複数のアミノ酸の混合物を表す。一態様では、５−ｍｅｒコア配列に隣接するＺアミノ酸の数は、０〜３個のアミノ酸またはそれ超のアミノ酸まで変化し得る。本実施例では、Ｚは、Ｇｌｙ：Ｓｅｒが３：１の混合物であった。ただし、その他の実施例では、Ｚは、単にグリシンのみである（実施例２を参照）。別の態様では、各５−ｍｅｒ候補ペプチドの特徴を、事前に定義されたアミノ酸配列を用いて合成したが、固有のペプチドの特徴それぞれが有する定義されたアミノ酸配列は異なった。したがって、マイクロアレイ上の各場所にある５−ｍｅｒ候補のアミノ酸配列は既知であった。
２つの同一のマイクロアレイを実験で使用した。ペプチドの特徴を合成した後、１つのマイクロアレイを、ＥＭＤミリポア製トロンビン切断キット（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）を使用して、標準的な市販条件下、トロンビンプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．５）で処理した。トロンビン処理後、両方のアレイを、蛍光色素Ｃｙ５とコンジュゲートしたストレプトアビジンと結合させた。両方のアレイを蛍光に基づくスキャナープラットフォーム上でスキャンして、アレイ上の特徴毎に蛍光アウトプットを識別した。
試験アレイと対照アレイとを比較して、トップヒットを明らかにした（図２）。特に、処理有りアレイおよび処理無しアレイから得たデータを、処理有りの各ペプチドの特徴に関する蛍光シグナルと、それに対応する処理無しのペプチドの特徴に関する蛍光シグナルの比を、処理有りのペプチドの特徴から生じた蛍光シグナルの関数としてプロットすることにより分析した。処理有りの特徴と処理無しの特徴に関する蛍光シグナルの比が大きいが、処理後の蛍光シグナルが低いペプチドの特徴（例えば、図２の上部左隅）を、さらに調査を要するトップヒットとして識別した（表１）。トロンビン基質ペプチド内の各アミノ酸の存在についても分析した（図３および４）。所与の５−ｍｅｒコア配列内のアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）残基の合計数（０〜３）は、トロンビン切断と最も強い相関を示した。さらに、図２に示すデータについてアルギニンまたはリジン残基の数を可視化すると、図５および図６にそれぞれ示すように、アルギニンまたはリジン残基の数が類似した特徴について、独特のクラスタリングパターンが明らかとなった。
図７では、本発明の方法により同定されたトロンビン基質（パネルＤ）を、これまでに報告されたトロンビン基質（パネルＡ〜Ｃ、Ｇａｌｌｗｉｔｚ Ｍ．ら、（２０１２年）Ｔｈｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（２）：ｅ３１７５６より）と比較した。
実施例２：マトリプターゼ結合配列候補の同定
プロテアーゼであるマトリプターゼ（ＥＣ３．４．２１．１０９）に対する基質を同定することを目的として、実施例１と同様にペプチドマイクロアレイを合成した。１つの重要な相違点として、Ｚは、グリシンのみの解決法（glycine only solution）であったことが挙げられる（すなわち、３Ｚ＝ＧＧＧ）。
第１の（処理有り）マイクロアレイスライドを、アッセイバッファー（５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ９．０）中、０．０５２μｇ／μｌのｒｈマトリプターゼと結合させ、第２のマイクロアレイスライドを、アッセイバッファーのみと結合させた（すなわち、処理無し）。両方のマイクロアレイを、室温、終夜インキュベートした。
終夜インキュベーション後、１×トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中にマイクロアレイスライドを取り出し、１×ＴＢＳ中で３０秒間洗浄し、次に水で３０秒間洗浄した。
切断の検出では、マイクロアレイスライドを、ストレプトアビジン−Ｃｙ５バッファー：６４０μｌの１Ｍトリス−Ｃｌ，ｐＨ７．４、６．４ｍｌの５％アルカリ可溶性カゼイン、１６μｌのＴｗｅｅｎ２０、２５．２８のＨ２Ｏ、１５０μｌのストレプトアビジン−Ｃｙ５（１μｇ／μｌ）と結合させた。マイクロアレイスライドを、Ｃｙ５標識ストレプトアビジンの存在下で１時間インキュベートし、次に１×ＴＢＳ中で３０秒間洗浄し、水で１５秒間洗浄し、最終的にスピン乾燥した。
１μｍの分解能の蛍光スキャナー（Ｉｎｎｏｐｓｙｓ社）を用いて、１５％ＰＭＴ Ｃｙ５で、マイクロアレイスライドのスキャニングを実施した。
プローブを繰り返し行い、その平均値および標準誤差（ＳＥ）を両方のアレイについて計算した。処理有りの相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）に対する処理無しＲＦＵの比を計算し、ＳＥカットオフを、０．２０に設定した。
試験アレイと対照アレイとを比較して、トップヒットを明らかにした（図８）。特に、処理有りアレイおよび処理無しアレイから得たデータを、処理無しペプチドの各特徴に関する蛍光シグナルと、それに対応する処理有りペプチドの特徴に関する蛍光シグナルの比を、処理無しペプチドの特徴から生じた蛍光シグナルの関数としてプロットすることにより分析した。処理無しの特徴と処理有りの特徴に関する蛍光シグナルの比が大きいが、蛍光シグナルが高い処理無しペプチドの特徴（例えば、図８の上部右隅）を、さらに調査を要するトップヒットとして識別した。トップヒットには、表２に記載するマトリプターゼ基質モチーフが含まれた。特に、表２の配列は、各表の括弧内に示す全体的なプロテアーゼ基質候補のコア配列を表す。

Claims (15)

  1. プロテアーゼに対する基質を同定する方法であって、
    ａ．プロテアーゼを、第１のアレイおよび第２のアレイのうちの１つと接触させるステップであって、第１のアレイおよび第２のアレイのそれぞれが、複数の特徴を有し、第１のアレイおよび第２のアレイが同一の複数の特徴を有し、各特徴が固体支持体と結びついた少なくとも１つの配列を含み、前記少なくとも１つの配列がレポーターと結びついたプロテアーゼ基質候補を含む、前記ステップ、
    ｂ．検出可能な要素を第１のアレイおよび第２のアレイのそれぞれと接触させて、第１のアレイおよび第２のアレイのそれぞれの特徴において、前記検出可能な要素が前記少なくとも１つの配列内のレポーターに結合可能にするステップ、
    ｃ．前記検出可能な要素が、第１のアレイのそれぞれの特徴において、前記少なくとも１つの配列内のレポーターに結合することに起因する第１のシグナル、および前記検出可能な要素が、第２のアレイのそれぞれの特徴において、前記少なくとも１つの配列内のレポーターに結合することに起因する第２のシグナルを検出するステップ、
    ｄ．第１のアレイとの結合に起因する第１のシグナルと、第２のアレイとの結合に起因する第２のシグナルとを比較して、第１のシグナルと第２のシグナルとの差異を識別するステップ、および、
    ｅ．ステップｄ）でプロテアーゼに対する基質として識別された特徴において、少なくとも１つのプロテアーゼ基質候補を同定するステップ、
    を含む、前記方法。
  2. 前記レポーターが、ペプチドエピトープであり、前記検出可能な要素が、前記ペプチドエピトープに対して特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記レポーターが、タンパク質に対するペプチドバインダーであり、前記検出可能な要素が、前記ペプチドバインダーが特異的に結合するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記プロテアーゼ基質候補が、天然および非天然アミノ酸から選択されるコア配列を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記検出可能な要素が、ストレプトアビジンであり、前記ペプチドバインダーが、ＷＴＨＰＱＦＥ、ＤＹＬＡＥＹＨＧＧ、ＹＥＲＰＧＷＫＬＳ、ＰＡＰＡＷＡＨＧＧ、ＮＳＦＤＥＷＬＱＫ、ＷＴＨＰＱＦＥＱＫ、ＡＤＹＬＡＥＹＨＧＧ、ＹＥＲＰＧＷＫＬＧＴ、ＤＰＡＰＡＷＡＨＧＧ、およびＮＳＦＤＤＷＬＡＫＧＧからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  6. 前記検出可能な要素が、蛍光基を含有する、請求項１に記載の方法。
  7. 少なくとも１つの配列が、式：
    ［Ｒ１］−［Ｌ１］−［Ｚ１］−［Ｘ１］−［Ｚ２］−［Ｌ２］
    を有し、
    式中、Ｒ１はレポーターであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれスペーサーであり、Ｚ１およびＺ２は、０から約３個のアミノ酸を有するペプチド配列からそれぞれ独立に選択され、Ｘ１は、約５から約１５個のアミノ酸の定義された配列を有するペプチドである、
    請求項１に記載の方法。
  8. 配列番号１から配列番号９からなる群から選択される配列を含む、トロンビンプロテアーゼに対するペプチド基質。
  9. 配列番号１０から配列番号２８からなる群から選択される配列を含む、マトリプターゼプロテアーゼに対するペプチド基質。
  10. 複数の特徴を含むプロテアーゼに対する基質を同定するためのペプチドマイクロアレイであって、各特徴が、固体支持体と結びついた少なくとも１つの配列を有し、前記配列が、プロテアーゼ基質候補ペプチドおよびレポーターペプチドを含むペプチドマイクロアレイ。
  11. 前記プロテアーゼ基質候補ペプチドおよび前記レポーターペプチドが、スペーサーを介して連結する、請求項１０に記載のマイクロアレイ。
  12. 前記プロテアーゼ基質候補ペプチドが、５から１５個のアミノ酸を含む、請求項１０に記載のマイクロアレイ。
  13. 前記レポーターペプチドが、ストレプトアビジン結合配列である、請求項１０に記載のマイクロアレイ。
  14. 少なくとも１つの配列が、式：
    ［Ｒ１］−［Ｌ１］−［Ｚ１］−［Ｘ１］−［Ｚ２］−［Ｌ２］
    を有し、
    式中、Ｒ１はレポーターペプチドであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれスペーサーであり、Ｚ１およびＺ２は、０から約３個のアミノ酸を有するペプチド配列からそれぞれ独立に選択され、Ｘ１は約または正確に５個から約または正確に１５個のアミノ酸の定義された配列を有するペプチドである、
    請求項１０に記載のマイクロアレイ。
  15. プロテアーゼに対する基質を同定する方法であって、
    ａ．プロテアーゼを、複数の特徴を有する第１のアレイと接触させるステップであって、各特徴が固体支持体に結びついた少なくとも１つの配列を含み、前記少なくとも１つの配列が、プロテアーゼ基質候補がタンパク質分解性の消化を受けた際に検出可能なシグナルを生成する能力を有する検出可能な要素に結びついた前記プロテアーゼ基質候補を含むステップと
    ｂ．１つまたは複数の特徴において、前記プロテアーゼ基質候補のタンパク質分解性の消化に起因するシグナルを検出するステップと、
    ｃ．シグナルが、前記プロテアーゼに対する基質としてステップｂ）において検出されている特徴において、前記プロテアーゼ基質候補を同定するステップと、
    を含む方法。
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