JP2019503662A - プロテアーゼ基質を同定するためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示の1つの実施形態に基づき、プロテアーゼに対する基質を同定する方法は、以下のステップを含む:a)プロテアーゼを、第1のアレイおよび第2のアレイのうちの1つと接触させるステップであって、第1のアレイおよび第2のアレイのそれぞれが、複数の特徴を有し、第1のアレイおよび第2のアレイが同一の複数の特徴を有し、各特徴が固体支持体に結びついた少なくとも1つの配列を含み、前記少なくとも1つの配列がレポーターに結びついたプロテアーゼ基質候補を含む前記ステップ;b)検出可能な要素を第1のアレイおよび第2のアレイのそれぞれと接触させて、第1のアレイおよび第2のアレイのそれぞれの特徴において、前記検出可能な要素が前記少なくとも1つの配列内のレポーターに結合可能にするステップ;c)前記検出可能な要素が、第1のアレイのそれぞれの特徴において、前記少なくとも1つの配列内のレポーターに結合することに起因する第1のシグナル、および前記検出可能な要素が、第2のアレイのそれぞれの特徴において、前記少なくとも1つの配列内のレポーターに結合することに起因する第2のシグナルを検出するステップ;d)第1のアレイとの結合に起因する第1のシグナルと、第2のアレイとの結合に起因する第2のシグナルとを比較して、第1のシグナルと第2のシグナルとの差異を識別するステップ;ならびにe)ステップd)でプロテアーゼに対する基質として識別された特徴において、少なくとも1つのプロテアーゼ基質候補を同定するステップ。
別の態様では、レポーターは、タンパク質に対するペプチドバインダーであり、および検出可能な要素は、ペプチドバインダーが特異的に結合するタンパク質である。
また別の態様では、コア配列は、約5〜約15個のアミノ酸を有する。
別の態様では、少なくとも1つの配列は、式:
[R1]−[L1]−[Z1]−[X1]−[Z2]−[L2]
を有し、
式中、R1はレポーターペプチドであり、L1およびL2はそれぞれスペーサーであり、Z1およびZ2は、0〜約3個のアミノ酸を有するペプチド配列からそれぞれ独立に選択され、ならびにX1は、約5〜約15個のアミノ酸の定義された配列を有するペプチドである。
本開示の別の実施形態に基づけば、トロンビンプロテアーゼに対するペプチド基質は、配列番号1〜配列番号9からなる群から選択される配列を含む。
別の態様では、スペーサーは、オレイン酸を含む。
さらなる態様では、プロテアーゼ基質ペプチド候補は、5〜15個のアミノ酸を含む。
また別の態様では、レポーターペプチドとして、ストレプトアビジン結合配列が挙げられる。
[R1]−[L1]−[Z1]−[X1]−[Z2]−[L2]
を有し、
式中、R1はレポーターペプチドであり、L1およびL2はそれぞれスペーサーであり、Z1およびZ2はそれぞれ0〜約3個のアミノ酸を有するペプチド配列から独立に選択され、ならびにX1は約5〜約15個のアミノ酸の定義された配列を有するペプチドである。
本明細書で用いる場合、用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」とは、アミノ酸から構成される有機化合物を意味し、隣接した残基のカルボキシル基とアミノ基の間のペプチド結合により、共に接合したアミノ酸の直線状または環状の鎖で構成され得る。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」とは、より短いポリペプチド、すなわち、50個未満のアミノ酸残基から構成される有機化合物を意味する。
II.説明
本発明は、酵素基質モチーフを同定するために、ペプチドライブラリーをスクリーニングする方法に関する。いくつかの実施形態では、酵素はプロテアーゼであるが、一方、その他の実施形態では、酵素は、プロテインキナーゼである。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、マイクロアレイ等の固体支持体に結合している。ペプチドマイクロアレイを形成する方法は、当技術分野において公知である。ペプチドアレイを生成する特定の方法は、事前に組み立てられたペプチドをスポットするステップ、または膜上で試薬をスポットすることによるin−situ合成を含む(米国特許第6,375,903号を参照)。より高い密度のペプチドアレイを生成するのに使用される公知のその他の方法は、フォトリソグラフィー技術と関係し、その場合、所望のバイオポリマーの合成デザインは、光等の電磁放射に曝露された際に、次の各アミノ酸に対して結合部位を放出する好適な感光性保護基(PLPG)により制御される(Fodorら、(1993年)、Nature、364巻:555〜556頁;Fodorら、(1991年)、Science、251巻:767〜773頁)。2つの異なるフォトリソグラフィー技術が、当技術分野において公知である。第1は、合成表面の特定の領域に光を誘導してPLPGの局所的な脱保護を有効にするのに使用されるフォトリソグラフィーマスクである。このような「マスク」法は、基質と嵌合し、基質とマウントの間にリアクタースペースを提供するマウント(「マスク」)を利用するポリマー合成を含む。米国特許第5,143,854号および同第5,445,934号を参照。第2のフォトリソグラフィー技術は、いわゆるマスクレスフォトリソグラフィーであり、その場合、マイクロミラーデバイス等のデジタルプロジェクション技術により、光は合成表面の特定領域に誘導されて、PLPGの局所的脱保護が有効となる(Singh−Gassonら、Nature Biotechn.、17巻(1999年)、974〜978頁)。そのような「マスクレス」アレイを合成すれば、時間および費用のかかる露光マスクの製造に対する必要性が取り除かれる。本発明の方法で利用されるペプチドマイクロアレイは、上記方法のいずれか、または2014年12月19日出願の「Systemic Discovery, Maturation and Extension Of Peptide Binders to Proteins」と題する米国特許出願番号第14/577,334号において、本発明者らによりこれまでに記載された方法を含む、当技術分野において公知の任意のその他の方法により合成され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、固体支持体上に配置されたアレイ状のペプチドの特徴を使用することを含む。アレイ上の各特徴は、定義された位置と配列を有する。さらに、各特徴は、因子、例えば所与の特徴内の開始反応部位の数、全配列に対する反応部位の変換割合(%)、および合成の忠実度等に応じて、1つまたは複数の同一の配列を含み得る。例えば、ペプチドアレイ上の仮想的な特徴は、固体支持体上の定義された座標に10μm×10μmの四角形を備え得る。特徴の例は、面積10μm2当たり推定106個の反応部位をさらに有し、これにより特徴内での最大106個の同一の配列が合成できるようになる。別の態様では、配列は、任意の数の異なる化学的構成ブロック、例えばアミノ酸(例えば、天然および非天然アミノ酸)、リンカーまたはスペーサー、蛍光物質等、およびその組合せを含み得る。
本発明の方法では、マイクロアレイ上の特徴は、レポーターペプチドとコンジュゲートした、または結びついたプロテアーゼ基質候補ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、レポーターペプチドは、検出可能な要素が特異的に結合するアミノ酸配列である。検出可能な要素−レポーター配列の対の例として、抗体−エピトープ、およびタンパク質−ペプチドバインダーの対が非限定的に挙げられる。特異的エピトープに対する抗体が、当技術分野において公知の任意の方法に基づき生成され得る。特定のペプチドに対する市販の抗体も利用可能である。したがって任意の適するエピトープ−抗体の対が、本発明の文脈において、レポーターシステムとして利用可能である。
いくつかの実施形態では、レポーターペプチドは、プロテアーゼ耐性の追加の特性を有する。いくつかの事例では、試験プロテアーゼは、レポーターペプチド配列の少なくとも一部に対して特異性を思いがけず有する可能性があり、したがって実験デザインを阻害する。そのような潜在的問題に対処するために、レポーターペプチド配列は、タンパク質分解に対して耐性を有するように設計され得る。例えば、レポーターペプチド配列は、タンパク質に通常見出されないアミノ酸(例えばD−アミノ酸等)を含み得る。その他の実施形態では、アミノ酸は、化学修飾を有する場合があり、そのような修飾アミノ酸を含有するペプチドは、タンパク質分解性の消化を排除する。一般的に、レポーターペプチド配列のタンパク質分解を防止するが、検出可能な要素による同定、または検出可能な要素により検出可能なシグナルの放出をなおも妨害しない化学修飾のいずれも、本発明の範囲内にある。この実施形態の変形形態では、レポーター配列は、ペプチド配列ではなく、レポーター配列の必要な構造的特性を有するオリゴマーまたはポリマーであり、すなわち、検出可能な要素または検出可能な要素による特異的認識を支援するが、プロテアーゼ消化に対して耐性を有する。
図1Bに示す通り、各ペプチドの特徴150は、プロテアーゼ基質候補ペプチドを含む。該特徴内のプロテアーゼ基質候補ペプチドは、長さ5個のアミノ酸であっても、またはそれより長くてもよい。いくつかの実施形態では、アレイ合成期間中に、ペプチドは、N末端、C末端、または両方の端部において、1つまたは複数のアミノ酸により延長され得る。そのような延長は、2またはそれ超のアミノ酸の混合物が、組み込みに用いられる「ウォブル合成」であり得る。いくつかの実施形態では、「ウォブル混合物」は、グリシン(G)およびセリン(S)を3:1の比で含有する。その他の例では、ウォブル混合物は、等しい濃度(例えば、等しい比)のG、S、アデニン(A)、バリン(V)、アスパラギン酸(D)、プロリン(P)、グルタミン酸(E)、ロイシン(L)、トレオニン(T)、および/または等しい濃度(例えば、等しい比)のアミノ酸L、A、D、リジン(K)、T、グルタミン(Q)、P、F、V、チロシン(Y)を含有する。本実施形態では、得られたプロテアーゼ基質候補ペプチドは、ランダムおよび指向性合成アミノ酸の組合せを有する。例えば、図1に示す通り、アレイ上の候補ペプチドは、フォーマット:ZZZZZ−5mer−ZZZZZを有する15−merであり得、式中Zは、特定のウォブル混合物に由来するアミノ酸である。
本発明は、固体支持体(例えば、マイクロアレイ)上に存在するプロテアーゼ基質候補ペプチドの集団の中からプロテアーゼ基質ペプチドを切断するステップを含む方法である。本方法は、プロテアーゼ基質候補ペプチドを有する固体支持体を、試験プロテアーゼが酵素的に活性な条件の下で、試験プロテアーゼに曝露するステップを含む。そのような条件の下で、候補中の基質ペプチドは切断を受ける一方、非基質ペプチドは、固体支持体上にそのまま留まる。当業者は、同一のプロテアーゼであっても、各基質について異なる活性、すなわち、異なる動力学的特性(KD)を有し得ると認識する。同様に、同一のプロテアーゼであっても、プロテアーゼが最大活性を発揮するような好ましい反応条件を有する可能性がある。条件は、反応バッファーの温度、pH、および組成により特徴付けられる。したがって、本発明の範囲には、プロテアーゼ基質候補ペプチドを有する固体支持体を、切断とプロテアーゼに対して好ましい基質とあまり好ましくない基質の識別とを可能にする様々な反応条件の下で試験プロテアーゼに曝露するステップが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドマイクロアレイを使用してプロテアーゼ基質を同定する方法である。方法は、試験プロテアーゼを、アドレス可能な特徴を有する第1の固体支持体(例えばマイクロアレイ等)と接触させるステップを含み、各特徴はプロテアーゼ基質候補ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、各特徴は、候補ペプチド配列とコンジュゲートした、または結びついたレポーターペプチド配列をさらに含む。さらなる実施形態では、各特徴は、検出可能な要素が結合可能なレポーターペプチド配列の代わりに検出可能な要素を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、プロテアーゼに対する基質を同定するためのマイクロアレイである。マイクロアレイは、アドレス可能な特徴を含み、各特徴は、固体支持体と結びつき、レポーターペプチド配列とさらに結びついた固有のプロテアーゼ基質候補ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、プロテアーゼに対する基質を同定するシステムである。該システムは、少なくとも2つのマイクロアレイを含み、各マイクロアレイは、アドレス可能な特徴を含み、各特徴は、固体支持体と結びつき、レポーターペプチド配列とさらに結びついた、または検出可能な要素に直接結びついた固有のプロテアーゼ基質候補ペプチドを含有する。該システムは、分離した検出可能な要素も含み得る。いくつかの実施形態では、検出可能な要素は直接検出可能であり、またその他の実施形態では、検出可能な要素は、間接的に検出可能、例えば、検出可能な基質にコンジュゲートした二次抗体を用いて検出可能である。いくつかの実施形態では、システムは、マイクロアレイ上の特定のアドレス可能な特徴の存在を検出するための検出手段をさらに含み得る。例えば、検出可能な要素が、蛍光基または蛍光標識を含む、またはそれにコンジュゲートしている場合、該標識は、蛍光スキャナーにより検出可能である。その他の標識および対応する検出方法として、化学発光、比色定量、またはオートラジオグラフィーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載する新規の方法により同定されるプロテアーゼに対するペプチド基質である。本方法は、1)プロテアーゼを、アドレス可能な特徴を有する第1の固体支持体(例えばマイクロアレイ等)と接触させるステップであって、前記固体支持体上に位置している各特徴は、プロテアーゼ基質候補ペプチドおよび候補ペプチド配列とコンジュゲートした、または結びついたレポーターペプチド配列を含む前記ステップ;2)第1の固体支持体を、検出可能な要素と接触させて、検出可能なシグナルを生成させるステップ;および3)第1の固体支持体上のレポーター配列の存在を検出するステップ;4)プロテアーゼと接触しなかった固体支持体を用いてステップ2)および3)を繰り返すステップ;5)第1ではなく第2の固体支持体上に存在する特徴を同定し、その特徴内のペプチドをプロテアーゼに対する基質として同定するステップを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、試験プロテアーゼに対する基質として同定された候補の確認をさらに含む。該確認は、試験プロテアーゼ、および追加の配列を備える、または備えない候補ペプチドを含めて実施される、ならびに溶液中で、または固体支持体上で実施される、競合的または非競合的なタンパク質分解アッセイを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドマイクロアレイを使用してトロンビンに対する基質を同定する方法である。いくつかの天然および合成トロンビン基質が記載されている。GallwitzM.ら、(2012年)、The Extended Cleavage Specificity of Human Thrombin.PLoS ONE、7巻(2):e31756.doi:10.1371/journal.pone.0031756。本発明の文脈において、該方法は、トロンビンをアドレス可能な特徴を有する第1の固体マイクロアレイと接触させるステップであって、各特徴が、トロンビン基質候補ペプチドを含む前記ステップを含む。いくつかの実施形態では、各特徴は、候補ペプチド配列とコンジュゲートした、または結びついたレポーターペプチド配列をさらに含む。方法は、第1のマイクロアレイ上のレポーター配列の存在を検出することにより、候補ペプチド配列の存在を検出するステップをさらに含む。該ステップは、第1のマイクロアレイを、それがレポーター配列に結合するのを可能にする条件下で検出可能な要素と接触させるステップを含む。未結合の検出可能な要素を任意選択的に除去した後、結合した検出可能な要素の存在が検出され、これによりトロンビンで処理した後に固体支持体上に残った各プロテアーゼ基質候補ペプチドの存在を検出する。いくつかの実施形態では、結合した検出可能な要素は、直接検出可能である。その他の実施形態では、検出可能な要素が、検出可能なシグナルを発する能力を有する別の分子と接触する。該方法は、検出可能な要素と接触させ、およびそれを検出する前にトロンビンに曝露されないことを除き、第1のマイクロアレイと同一であり、同一方式で処理される第2のマイクロアレイをさらに含む。第1のアレイではなく第2のアレイ上に存在するものとして検出された特徴内の候補ペプチド配列が、トロンビンプロテアーゼに対する基質として同定される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドマイクロアレイを使用してプロテアーゼ基質を同定する方法である。該方法は、試験プロテアーゼを、アドレス可能な特徴を有する単一の固体支持体(例えばマイクロアレイ等)と接触させるステップであって、前記固体支持体に位置する各特徴が、プロテアーゼにより切断された際に検出可能なシグナルを発する能力を有する検出可能な要素に直接コンジュゲートしたプロテアーゼ基質候補ペプチドを含む前記ステップを含む。検出可能な要素は、例えば、タンパク質分解性の消化の前に蛍光消光物質と対をなす蛍光レポーター色素であり得る。ペプチドが試験プロテアーゼによりタンパク質分解性の消化を受けた後に、消光分子がレポーター蛍光物質から分離し、蛍光が生ずるのを可能にする。切断が生じ、蛍光シグナルが検出される場合、そのような特徴内のプロテアーゼ基質候補がプロテアーゼ基質ペプチドとして同定される。
下記の実施例は、説明的であるように意図されており、またいかなる場合においても制限するようには意図されない。
本開示に基づくマスクレスアレイ合成を使用してペプチドマイクロアレイを合成した。各マイクロアレイは、N末端からC末端の順番で、下記の構造を有する特徴を備えた:
WTHPQFEQK−[6−ヘキサン酸]−[3Z]−[5−merコア配列]−[3Z]−[6−ヘキサン酸]−[固体支持体](図1を参照)
3Zは、一連の3個の「Z」アミノ酸を表し、Zは、5−merコア配列に対して溶解性および可撓性を付与する目的を有する1つまたは複数のアミノ酸の混合物を表す。一態様では、5−merコア配列に隣接するZアミノ酸の数は、0〜3個のアミノ酸またはそれ超のアミノ酸まで変化し得る。本実施例では、Zは、Gly:Serが3:1の混合物であった。ただし、その他の実施例では、Zは、単にグリシンのみである(実施例2を参照)。別の態様では、各5−mer候補ペプチドの特徴を、事前に定義されたアミノ酸配列を用いて合成したが、固有のペプチドの特徴それぞれが有する定義されたアミノ酸配列は異なった。したがって、マイクロアレイ上の各場所にある5−mer候補のアミノ酸配列は既知であった。
プロテアーゼであるマトリプターゼ(EC3.4.21.109)に対する基質を同定することを目的として、実施例1と同様にペプチドマイクロアレイを合成した。1つの重要な相違点として、Zは、グリシンのみの解決法(glycine only solution)であったことが挙げられる(すなわち、3Z=GGG)。
切断の検出では、マイクロアレイスライドを、ストレプトアビジン−Cy5バッファー:640μlの1Mトリス−Cl,pH7.4、6.4mlの5%アルカリ可溶性カゼイン、16μlのTween20、25.28のH2O、150μlのストレプトアビジン−Cy5(1μg/μl)と結合させた。マイクロアレイスライドを、Cy5標識ストレプトアビジンの存在下で1時間インキュベートし、次に1×TBS中で30秒間洗浄し、水で15秒間洗浄し、最終的にスピン乾燥した。
プローブを繰り返し行い、その平均値および標準誤差(SE)を両方のアレイについて計算した。処理有りの相対蛍光ユニット(RFU)に対する処理無しRFUの比を計算し、SEカットオフを、0.20に設定した。
Claims (15)
- プロテアーゼに対する基質を同定する方法であって、
a.プロテアーゼを、第1のアレイおよび第2のアレイのうちの1つと接触させるステップであって、第1のアレイおよび第2のアレイのそれぞれが、複数の特徴を有し、第1のアレイおよび第2のアレイが同一の複数の特徴を有し、各特徴が固体支持体と結びついた少なくとも1つの配列を含み、前記少なくとも1つの配列がレポーターと結びついたプロテアーゼ基質候補を含む、前記ステップ、
b.検出可能な要素を第1のアレイおよび第2のアレイのそれぞれと接触させて、第1のアレイおよび第2のアレイのそれぞれの特徴において、前記検出可能な要素が前記少なくとも1つの配列内のレポーターに結合可能にするステップ、
c.前記検出可能な要素が、第1のアレイのそれぞれの特徴において、前記少なくとも1つの配列内のレポーターに結合することに起因する第1のシグナル、および前記検出可能な要素が、第2のアレイのそれぞれの特徴において、前記少なくとも1つの配列内のレポーターに結合することに起因する第2のシグナルを検出するステップ、
d.第1のアレイとの結合に起因する第1のシグナルと、第2のアレイとの結合に起因する第2のシグナルとを比較して、第1のシグナルと第2のシグナルとの差異を識別するステップ、および、
e.ステップd)でプロテアーゼに対する基質として識別された特徴において、少なくとも1つのプロテアーゼ基質候補を同定するステップ、
を含む、前記方法。 - 前記レポーターが、ペプチドエピトープであり、前記検出可能な要素が、前記ペプチドエピトープに対して特異的な抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記レポーターが、タンパク質に対するペプチドバインダーであり、前記検出可能な要素が、前記ペプチドバインダーが特異的に結合するタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ基質候補が、天然および非天然アミノ酸から選択されるコア配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能な要素が、ストレプトアビジンであり、前記ペプチドバインダーが、WTHPQFE、DYLAEYHGG、YERPGWKLS、PAPAWAHGG、NSFDEWLQK、WTHPQFEQK、ADYLAEYHGG、YERPGWKLGT、DPAPAWAHGG、およびNSFDDWLAKGGからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記検出可能な要素が、蛍光基を含有する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの配列が、式:
[R1]−[L1]−[Z1]−[X1]−[Z2]−[L2]
を有し、
式中、R1はレポーターであり、L1およびL2はそれぞれスペーサーであり、Z1およびZ2は、0から約3個のアミノ酸を有するペプチド配列からそれぞれ独立に選択され、X1は、約5から約15個のアミノ酸の定義された配列を有するペプチドである、
請求項1に記載の方法。 - 配列番号1から配列番号9からなる群から選択される配列を含む、トロンビンプロテアーゼに対するペプチド基質。
- 配列番号10から配列番号28からなる群から選択される配列を含む、マトリプターゼプロテアーゼに対するペプチド基質。
- 複数の特徴を含むプロテアーゼに対する基質を同定するためのペプチドマイクロアレイであって、各特徴が、固体支持体と結びついた少なくとも1つの配列を有し、前記配列が、プロテアーゼ基質候補ペプチドおよびレポーターペプチドを含むペプチドマイクロアレイ。
- 前記プロテアーゼ基質候補ペプチドおよび前記レポーターペプチドが、スペーサーを介して連結する、請求項10に記載のマイクロアレイ。
- 前記プロテアーゼ基質候補ペプチドが、5から15個のアミノ酸を含む、請求項10に記載のマイクロアレイ。
- 前記レポーターペプチドが、ストレプトアビジン結合配列である、請求項10に記載のマイクロアレイ。
- 少なくとも1つの配列が、式:
[R1]−[L1]−[Z1]−[X1]−[Z2]−[L2]
を有し、
式中、R1はレポーターペプチドであり、L1およびL2はそれぞれスペーサーであり、Z1およびZ2は、0から約3個のアミノ酸を有するペプチド配列からそれぞれ独立に選択され、X1は約または正確に5個から約または正確に15個のアミノ酸の定義された配列を有するペプチドである、
請求項10に記載のマイクロアレイ。 - プロテアーゼに対する基質を同定する方法であって、
a.プロテアーゼを、複数の特徴を有する第1のアレイと接触させるステップであって、各特徴が固体支持体に結びついた少なくとも1つの配列を含み、前記少なくとも1つの配列が、プロテアーゼ基質候補がタンパク質分解性の消化を受けた際に検出可能なシグナルを生成する能力を有する検出可能な要素に結びついた前記プロテアーゼ基質候補を含むステップと
b.1つまたは複数の特徴において、前記プロテアーゼ基質候補のタンパク質分解性の消化に起因するシグナルを検出するステップと、
c.シグナルが、前記プロテアーゼに対する基質としてステップb)において検出されている特徴において、前記プロテアーゼ基質候補を同定するステップと、
を含む方法。
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