JP2019214609A - 改変ヌクレアーゼを用いたジストロフィン遺伝子エクソンの欠失 - Google Patents

Abstract

【課題】デュシェンヌ型筋ジストロフィーの患者を治療するための医薬の提供。【解決手段】（ｉ）筋細胞のジストロフィン遺伝子の第１エクソンの５’側上流に隣接するイントロン内にある第１認識配列を切断する第１ヌクレアーゼ又は該第１ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡ；および（ｉｉ）筋細胞のジストロフィン遺伝子の第１エクソンの３’側下流に隣接するイントロン内にある第２認識配列を切断する第２ヌクレアーゼ又は該第２ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡ；の組み合わせを含む、医薬。【選択図】なし

Description

（関連出願）
本願は、２０１４年３月１２日に出願された米国仮出願６１／９５１，６４８号の優先権の利益を主張し、参照をもってその全体を本願に組み込む。

本発明は、分子生物学および組み換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、改変ヌクレアーゼを用いてジストロフィン遺伝子から少なくとも１つのエクソンを除去することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの患者を治療する方法に関する。

デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型筋ジストロフィーは稀であり、世界中の３５００人の男児に対し約１人に影響を与えるＸ連鎖筋変性疾患である。この疾患は、最大既知遺伝子であるジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子における突然変異により引き起こされる。ＤＭＤは、Ｘ染色体の２．２Ｍｂに及び、また７９個のエクソンから誘導された１４−ｋｂ転写産物を主にコードする。骨格筋、平滑筋および心筋細胞において発現される、完全長のジストロフィンタンパク質は、３６８５個のアミノ酸であり、かつ４２７ｋＤの分子量を有する。重度のデュシェンヌ型表現型は概して、骨格筋および心筋から完全長のジストロフィンタンパク質の損失に関連し、これは筋肉の変性を衰退し、最終的には心疾患に至る。多くの異なるＤＭＤ突然変異が記載され、重症のデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは穏やかなベッカー型筋ジストロフィーをもたらすその多くが記載されている。ライデン大学医療センターは、ＤＭＤ遺伝子における変異のデータベースを管理している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｍｄ．ｎｌ）。

デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療について追求されたいくつかの治療的戦略がある。まず、「遺伝子置換」戦略は、研究の活性領域である（Ｏｓｈｉｍａ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ．Ｓｏｃ．ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：７３−８０；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１ ：２４５−２５６；Ｌａｉ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：１０３６−１０４２；Ｏｄｏｍ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１５３９−１５４５）。このアプローチは、ウイルス搬送ベクター、典型的にはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いて患者にＤＭＤ遺伝子の機能的コピーを搬送することを含む。しかしながら、ＤＭＤ遺伝子の大きなサイズは、一般的なウイルスベクターの限定された搬送能力と互換性をなくす。これは、遺伝子の反復中央部分の多くが最小限の機能性タンパク質だけを残すために除去される「マイクロジストロフィン」遺伝子の使用を必要とする。しかしながら、「マイクロジストロフィン」の発現が、臨床的利益に十分であることは明らかでない。加えて、このアプローチは、挿入変異誘発につながり得る、患者のゲノムへのランダム遺伝子の統合の可能性、および搬送ベクターに対する免疫反応への潜在性に悩まされる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィーへの第２アプローチは、患者の筋肉繊維に健康な筋肉前駆細胞の移植を含む（Ｐｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．１５：８６７−８７７；Ｓｋｕｋ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１７：３８−４６）。このアプローチは、移植された筋芽細胞の非効率な遊走および患者による免疫拒否の潜在性に悩まされる。

第３のアプローチは、ＰＴＣ１２４を用いたナンセンス突然変異の抑制を含む（Ｗｅｌｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４７：８７−９１）。しかしながら、
これは、薬剤の生涯投与を必要とし、かつ該アプローチは、十分な臨床的優位性が示されていない。

第４およびより多くの有望な、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの潜在的な治療は、「エクソンスキッピング」とよばれる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３５；Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４−１６２９；Ｙｏｋｏｔａ，ｅｔ
ａｌ．（２００７）Ａｃｔａ Ｍｙｏｌ．２６：１７９−１８４；ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１０：１５４７−１５５４；Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＦＥＢＳ Ｊ．２８０：４２６３−８０；Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｐ．１３：３３２；Ｖｅｒｈａａｒｔ ａｎｄ Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ（２０１２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２５：５８８−９６）。概して、ジストロフィン遺伝子のＮ−およびＣ−末端位は、筋肉繊維において膜を完全な状態に維持する「足場」タンパク質としての役割にとって不可欠である一方で、２４個のスペクトリン様繰り返しを含む中央「ロッドドメイン」は、少なくとも部分的には必須ではない。確かに、重症なデュシェンヌ表現型は、フレームシフトおよび／または早期の終止コドンを導入し、本質的にＣ−末端ドメインを欠くジストロフィン、タンパク質の切断型をもたらすジストロフィン遺伝子中の突然変異と典型的に関連する。全エクソンの多くの欠失を含む中央ロッドドメインの突然変異は、タンパク質のＣ−末端ドメインが完全であるようにリーディングフレームを維持する場合、より穏やかなベッカー表現型を典型的にもたらす。

デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、リーディングフレームシフトをもたらす、１以上の全エクソン（複数可）の欠失により最も頻発に引き起こされる。例えば、エクソン４５は、デュシェンヌ患者において頻繁に欠失される。エクソン４５は、３つに分割できない１７６ｂｐ長であるので、エクソンを欠失することは、エクソン４６−７９を間違ったリーディングフレームにシフトさせる。同じことが、１４８ｂｐ長のエクソン４４にも言え得る。しかしながら、エクソン４４および４５が欠失したら、欠失の全サイズは、３２４ｂｐとなり、３つに分割できる。こうして、両方のエクソンの欠失は、リーディングフレームシフトをもたらさない。これらのエクソンは、ジストロフィンタンパク質の非本質的ロッドドメインの一部をコードするので、タンパク質からそれらを欠失することは、穏やかなベッカー様表現型をもたらすことが期待される。こうして、１以上のエクソン（複数可）の欠失によるデュシェンヌ表現型を伴う患者は、リーディングフレームを回復するために１以上の隣接エクソンを欠失することにより潜在的に治療され得る。これは、改変されたオリゴヌクレオチドが、ジストロフィンプレｍＲＮＡにおけるスプライスアクセプター部位をブロックするために用いられる「エクソンスキッピング」に隠れた原理であり、その結果、１以上の特定のエクソンは、処理された転写産物を欠く。該アプローチは、ナンセンス突然変異を誘発する疾患をかくまうスキッピングエクソン２３によるｍｄｘマウスモデルにおけるジストロフィン遺伝子発現を回復するために用いられる（Ｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：４２−４７）。エクソン５１のスキッピングを誘発するオリゴヌクレオチド類似体もまた、早期ヒト臨床試験における有望性が示されている（Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＦＥＢＳＪ．２８０：４２６３−８０）。このアプローチを伴う主な制限は、（１）エクソンスキッピングプロセスが役に立たず、比較的低レベルの機能性ジストロフィン発現をもたらす、および（２）エクソンスキッピングオリゴヌクレオチドは、比較的短い半減期であり、その結果、効果が一過性であり、繰り返しかつ生涯投与を必要とする。こうして、全エクソンスキッピングアプローチは、臨床試験においていくつかの有望性を示したが、疾患進行における改善は最小限かつ可変的である。

Ｊ．ｏｆ ｔｈｅ Ａｍ．Ｓｏｃ．ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：７３−８０（２００９） Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２４５−２５６（２００５） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：１０３６−１０４２（２００６） Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１５３９−１５４５（２００８） Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：８６７−８７７（２００７） Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１７：３８−４６（２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４４７：８７−９１（２００７） ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３５（２００８） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４−１６２９（２００８） Ａｃｔａ Ｍｙｏｌ．２６：１７９−１８４（２００７） Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１０：１５４７−１５５４（２００１） ＦＥＢＳ Ｊ．２８０：４２６３−８０（２０１３） Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｐ．１３：３３２（２０１３） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２５：５８８−９６（２０１２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：４２−４７（２００１） ＦＥＢＳＪ．２８０：４２６３−８０（２０１３）

本発明は、プレｍＲＮＡよりもゲノムＤＮＡのレベルでの遺伝子発現を是正することにより、現在のエクソンスキッピングアプローチに基づき改善する。本発明は、１対の改変部位特定エンドヌクレアーゼを用いた、ＤＭＤコーディング配列から特定のエクソンの削除を含むデュシェンヌ型筋ジストロフィーの恒久的な治療である。エクソンと隣接するイントロン領域における部位を、そのような１対のエンドヌクレアーゼの標的とすることにより、ゲノムからエクソンを含む介在性フラグメントを恒久的に除去することを可能とする。得られた細胞、およびその子孫は、非本質的スペクトリン繰り返しドメインの一部が除かれるが、本質的Ｎ−およびＣ−末端ドメインが完全である突然変異ジストロフィンを発現するだろう。

改変部位特定エンドヌクレアーゼを製造する方法は、本分野において既知である。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ゲノムにおいて決定された部位を認識および切断するように工作され得る。ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限酵素のヌクレアーゼドメインと融合するドメインと結合するジンクフィンガーＤＮＡを含むキメラタンパク質である。ジンクフィンガードメインは、予め決められた長さ約１８個の塩基対のＤＮＡ配列と結合するタンパク質を産生するための合理的または実験的手段を介して再設計され得る。ＦｏｋＩヌクレアーゼとこの改変タンパク質ドメインとの融合により、ゲノムレベルの特異性でＤＮＡ破壊を標的とし得る。ＺＦＮは、真核生物の広い範囲における標的遺伝子追加、除去および置換を標的にするために幅広く用いられる（Ｓ．Ｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，５９７８（２００５）を参照）。同様に、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ゲノムＤＮＡにおける特定部位を切断するために産生され得る。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインと融合する改変部位特定ＤＮＡ結合ドメインを含む（Ｍａｋ，ｅｔ ａｌ．（２
０１３） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２３：９３−９を参照）。しかしながら、この場合、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬ−エフェクタードメインのタンデム配列を含み、そのそれぞれは単一ＤＮＡ塩基対を特異的に認識する。本発明の実施に対してＺＦＮおよびＴＡＬＥＮが有する制限は、それらがヘテロ二量体であるので、細胞における単一機能的ヌクレアーゼの産生が２つのタンパク質モノマーの共発現を必要とするということである。本発明は、２つのヌクレアーゼを必要とし、１つは、関連するエクソンの一方側で切断することであり、これは同じ細胞中に４つのＺＦＮまたはＴＡＬＥＮモノマーを共発現することを必要とする。従来の遺伝子搬送ベクターは搬送能力に制限があるので、これは遺伝子搬送における重大な挑戦を提供する。それはまた、モノマーがゲノムにおいて標的位置を認識しかつ切り離し得る意図しない二量体エンドヌクレアーゼ種を不適切に形成する「間違った二量体化」の可能性も導入する。これは、４つのモノマーのＦｏｌｋヌクレアーゼドメインが意図するパートナーモノマーと優先的に二量化するように差次的に工作される直交的偏性ヘテロ二量体により潜在的に最小化され得る。

コンパクトＴＡＬＥＮは、二量体化の必要性を避ける代替的エンドヌクレアーゼ構造である（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．４：１７６２）。コンパクトＴＡＬＥＮは、Ｉ−ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインと融合された改変部位特定ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。ＦｏｋＩと異なり、Ｉ−ＴｅｖＩは、二重鎖ＤＮＡ破壊を産生するために二量体化を必要としないので、コンパクトＴＡＬＥＮは、モノマーとして機能的である。こうして、本発明を実施するために同じ細胞で２つのコンパクトＴＡＬＥＮを共発現することが可能である。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に基づく改変エンドヌクレアーゼは、公知である（Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１−２３０８；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０：９５７−６３）。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、２成分（１）カスパーゼエフェクターヌクレアーゼ、典型的にはミクロバイアルＣａｓ９、および（２）ヌクレアーゼをゲノムの関連位置に向ける約２０個のヌクレオチド標的配列を含む短い「ガイドＲＮＡ」を含む。それぞれが異なる標的配列を有し、同じ細胞において複数のガイドＲＮＡを発現することにより、ゲノムにおける複数の部位において同時にＤＮＡ破壊を標的とすることが可能である。こうして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、本発明に適切である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の主な弱点は、ヒト患者を治療する系の有用性を制限する、その報告されたオフターゲットＤＮＡ破壊の高い頻度である（Ｆｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８２２−６）。

本発明の好ましい実施形態において、ＤＮＡ破壊誘発剤は、改変ホーミングエンドヌクレアーゼ（「メガヌクレアーゼ」ともよばれる）である。ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物および菌類のゲノムにおいて共通して見いだされる１５〜４０個の塩基対切断部位を認識する一群の自然発生ヌクレアーゼである。それらは、群１セルフスプライシングイントロンおよびインテインのような寄生的ＤＮＡ要素としばし関連する。それらは、細胞ＤＮＡ修復機構を募る染色体において、二重鎖破壊を産生することによりホストゲノムにおける特定の位置で相同組み換えまたは遺伝子挿入を自然と促進する（Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）， Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９−９５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは概して、４つのファミリー、ＬＡＦＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーにグループ分けされる。これらのファミリーは、触媒活動および認識配列に影響する構造的モチーフにより特徴づけられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＦファミリーのメンバーは、１または２つの保護されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのいずれかを有することにより特徴づ
けられる（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４を参照）。ＬＡＧＡＩＤＡＤＧモチーフの単一コピーを備えるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成し、一方でＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの２つのコピーを備えるメンバーはモノマーとして見いだされる。

Ｉ−ＣｒｅＩ（配列番号１）は、藻類コナミドリムシの葉緑体染色体における２２個の塩基対認識配列を認識しかつ切断するホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＧファミリーのメンバーである。遺伝子選別技術は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩ切断部位プリファレンスを修飾するために用いられる（Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１；Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８；Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０−９；Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８）。より最近では、哺乳類、イースト、植物、バクテリアおよびウイルスゲノムを含む広く分岐するＤＮＡ部位を標的とするＩ−ＣｒｅＩおよび他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計し得るモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に再設計する方法が開示された（国際公開ＷＯ２００７／０４７８５９号公報）。

国際公開ＷＯ２００９／０５９１９５号公報に最初に記載されているように、Ｉ−ＣｒｅＩおよびその改変誘導体は、通常二量体であるが、第１サブユニットのＣ−末端と第２サブユニットのＮ−末端とを結合する短いペプチドリンカーを用いて単一ペプチドに融合され得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０−６２；Ｇｒｉｚｏｔ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５−１９．）。したがって、機能性「単一鎖」メガヌクレアーゼは、単一転写から発現する。２つの異なる単鎖メガヌクレアーゼを同じ細胞にコードする遺伝子を搬送することにより、２つの異なる部位を同時に切断することが可能になる。改変メガヌクレアーゼで観察されたオフターゲット切断の極端に低い頻度と連結して、これはそれらを本発明の好ましいエンドヌクレアーゼにする。

デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための改変メガヌクレアーゼの使用は、以前国際公開ＷＯ２０１１／１４１８２０号公報（‘８２０出願）に開示されている。この出願において、著者は、異なる３つの機構を介してＤＭＤ遺伝子における欠陥を修正するために改変メガヌクレアーゼを使用することの可能性を議論している（国際公開ＷＯ２０１１／１４１８２０号公報の図１参照）。まず、著者は、ＡＡＶＳ１のような「セーフハーバー」遺伝子座へＤＭＤまたはマイクロ−ＤＭＤ遺伝子のトランスフェクトの複製を挿入するために、改変メガヌクレアーゼを使用すること意図し、それは内在性遺伝子発現に影響を与えること無く恒常的に発現する。第２に、著者は、メガヌクレアーゼがＤＭＤにおける有毒な突然変異付近の部位でゲノムを切断するようになり得およびこのＤＮＡ破壊がゲノムにおける突然変異が修正されるように、ゲノムの突然変異ＤＭＤおよびトランスにおいて提供される遺伝子の健康的な複製都の間の均質組み換えを刺激し得ることを提案する。第３に、‘８２０出願の著者は、改変メガヌクレアーゼがＤＭＤ遺伝子にイントロンに外部ＤＮＡを挿入するようになり得およびそのようなメガヌクレアーゼが疾患を引き起こす突然変異の早期イントロン上流へジストロフィンの本質的Ｃ−末端ドメインを挿入するために用いられ得ることを提案する。重要なのは、ＤＭＤ遺伝子を操作するためにメガヌクレアーゼの無数の使用を考慮することにおいて、’８２０出願の著者は、同じ細胞に同時に２つのメガヌクレアーゼの使用を意図しておらず、彼らは本発明においていずれのＤＮＡの除去も提案していない。

最後に、Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．は、ＤＮＡ破壊がＴＡＬＥＮを用いてＤＭ
Ｄコード配列に標的とされ得、破壊が変異原性非均質末端結合経路を介して頻繁に修復され、遺伝子のリーディングフレームを変化し得る小さな挿入および／または欠失（「インデル」）の導入をもたらす（Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２１：１７１８−２６）ことを実証した。彼らは、ＤＮＡ破壊をエクソンに次に即座に突然変異体に搬送しおよび細胞のいくつかの割合におけるリーディングフレームを回復するために変異原性ＤＮＡ修復に頼ることにより突然変異細胞の一部においてＤＭＤ遺伝子発現を回復することの可能性を実証した。本発明とは異なり、このアプローチは、単一ヌクレアーゼを含みおよび遺伝子のコード配列に標的とされる。

本発明は、一対の改変ヌクレアーゼ、または遺伝子エンコード改変ヌクレアーゼを、通常のリーディングフレームを回復するために２つのヌクレアーゼがＤＭＤ遺伝子の１以上のエクソンを切断するように患者の筋細胞に搬送することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療する方法である。そのように治療される細胞は、中央スペクトリン繰り返しドメインの一部がＮ−およびＣ−末端ドメインが完全であることを除き不在であるジストロフィンタンパク質の縮められた形態を発現するだろう。多くの場合、これは、疾患の重症度を穏やかなベッカー発現型に低減するだろう。

したがって、１つの実施形態において、本発明は、一対のヌクレアーゼを用いてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療する一般的な方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、本方法を実施するのに適した改変メガヌクレアーゼを提供する。第３実施形態において、本発明は、本方法を実施するのに適した改変コンパクトＴＡＬＥＮを提供する。第４実施形態において、本発明は、本方法を実施するためのＣＲＩＳＰＲを提供する。第５実施形態において、本方法は、患者の細胞に改変ヌクレアーゼを搬送するベクターおよび技術を提供する。

ＤＭＤ遺伝子の構造。リーディングフレームを示すために、７９エクソンが描かれる。それぞれ約エクソン２−８および６２−７０スパンの本質的アクチン結合およびジストログリカン結合ドメインが示される。 ヌクレアーゼの異なる種類を用いたＤＭＤ遺伝子からエクソンを欠失するための戦略。２Ａ）一対のＣＲＩＳＰＲを用いたエクソン欠失の戦略。関連するエクソンを並べる一対の認識部位を補足する一対の「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」）が用いられる。この図に描かれているように、ｇＲＮＡは、保護された「ＧＧ」モチーフおよびＣａｓ９ＤＮＡ開裂の部位に遠位である認識配列を補足し得る。この配向において、ＣＲＩＳＰＲ認識配列は、ＤＮＡ開裂、ゲノムＤＮＡ介入フラグメントの切断、および染色体末端の再結合の後で大半保存される。２Ｂ）ｇＲＮＡがエクソンに近位である認識配列を補填する一対のＣＲＩＳＰＲを用いてエクソンを欠失するための代替スキーム。この配向において、ＣＲＩＳＰＲ認識配列は、ＤＮＡ開裂、ゲノムＤＮＡの介入フラグメントの削除、および染色体末端の再結合の後で大半保存される。本発明はまた２Ａおよび２Ｂに示されるスキームのハイブリッドを含み得ることが考慮される。２Ｃ）一対のコンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を用いたエクソン欠失のための戦略。関連するエクソンを剥離する一対の認識部位と結合する一対のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン（「ＴＡＬＥ」）が用いられる。この図に示されているように、ＴＡＬＥは、認識され、かつＩ−ＴｅｖＩ開裂ドメイン（「ＴｅｖＩ−ＣＤ」）により切断される「ＣＮＮＮＧ」モチーフに遠位である認識配列と結合し得る。この配向において、ｃＴＡＬＥＮ認識配列は、ＤＮＡ開裂、ゲノムＤＮＡの介入フラグメントの削除、および染色体末端の再結合後に大半保存される。さらに、この図におけるｃＴＡＬＥＮは、Ｎ−からＣ−配向におけるＴＡＬＥおよびＴｅｖＩ−ＣＤドメインとともに示される。Ｃ−からＮ−配向におけるこれら２つのドメインとともにｃＴＡＬＥＮを生成することも可能である。２Ｄ）ＴＡＬＥドメインがエクソンに近位の認識配列と結合する一対のｃＴＡＬＥＮを用いてエクソンを欠失する代替スキーム。この配向において、ｃＴＡＬＥＮ認識配列は、ＤＮＡ開裂、ゲノムＤＮＡの介入フラグメントの削除、および染色体末端の再結合の後で大半保存される。また、この図のｃＴＡＬＥＮは、Ｃ−からＮ−配向におけるＴＡＬＥおよびＴｒｅｖＩ−ＣＤドメインとともに描かれる。本発明はまた、２Ｃおよび２Ｄに示されるスキームのハイブリッドを含み得ることが考慮される。２Ｅ）一対の単一鎖メガヌクレアーゼを用いたＤＭＤ遺伝子からエクソンを欠失する戦略。リンカーにより結合される２つのドメインタンパク質（ＭＧＮ−Ｎ：Ｎ−末端ドメインおよびＭＧＮ−Ｃ：Ｃ−末端ドメイン）としてメガヌクレアーゼが示される。図において、Ｃ−末端ドメインは、エクソンに最も近い認識配列の半分との結合として描かれている。しかしながら、いくつかの実施形態において、Ｎ−末端ドメインは、認識配列のこの半分と結合し得る。認識配列の中央の４つの塩基対は、「ＮＮＮＮ」として示される。これら４つの塩基対は、メガヌクレアーゼによる開裂後に単一鎖３’「オーバーハング」になる。配列のこの領域を含む好ましい４つの塩基対のサブセットは、ＷＯ／２０１０／００９１４７に確認される。一対のメガヌクレアーゼによるＤＮＡ開裂は、染色体末端で一対の４つの塩基対３’オーバーハングを生じる。これらのオーバーハングが相補的ならば、それらは互いにアニールし得および直接再結合され得、エクソン開裂後に染色体に保持されたままの４つの塩基対配列をもたらす。メガヌクレアーゼは、認識配列の中央付近で開裂するので、各認識配列の半分は、エクソンの開裂後に染色体において頻繁に保持され得る。各認識配列の他の半分は、エクソンと共にゲノムから除かれ得る。 ＤＹＳ−１／２およびＤＹＳ−３／４メガヌクレアーゼを用いたＤＭＤエクソン４４の削除。３Ａ）ＤＭＤエクソン４４および配列領域の配列。エクソン配列には、下線が引かれている。ＤＹＳ−１／２およびＤＹＳ−３／４メガヌクレアーゼの認識部位は、太字の中央４つの塩基対（メガヌクレアーゼによる開裂後の３’オーバーハングとなる）とともにグレイで陰影されている。分析に用いるための一対のＰＣＲプライマーのアニール部位は、イタリック体である。３Ｂ）ＤＹＳ−１／２およびＤＹＳ−３／４を共発現するＨＥＫ−２９３細胞のアガロースゲル電気泳動分析。ゲノムＤＮＡは、細胞から単離され、（３Ａ）に示されるプライマーを用いてＰＣＲにより評価される。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲルで溶解され、２つのメガヌクレアーゼを共発現するＨＥＫ−２９３細胞が一対のＰＣＲバンドを生じるのに対し、野生型ＨＥＫ−２９３細胞はより大きなバンドのみを生じるということがわかった。３Ｃ）（３Ｂ）からより小さいＰＣＲ生成物をかくまう３つのプラスミドからの配列。３つの配列は、野生型ヒト配列に配向して示される。ＤＹＳ−１／２およびＤＹＳ−３／４認識配列の位置は、太字の中央４つの塩基対とともにグレイに陰影されている。 ＤＹＳ−５／６およびＤＹＳ−７／８メガヌクレアーゼを用いたＤＭＤエクソン４５の削除。４Ａ）ＤＭＤエクソン４５および配列領域の配列。エクソン配列には、下線が引かれている。ＤＹＳ−５／６およびＤＹＳ−７／８メガヌクレアーゼについての認識部位は、太字の中央４つの塩基対（メガヌクレアーゼによる開裂後の３’オーバーハングとなる）とともにグレイで陰影されている。分析に用いるための一対のＰＣＲプライマーのアニール部位は、イタリック体である。４Ｂ）ＤＹＳ−５／６およびＤＹＳ−７／８を共発現するＨＥＫ−２９３細胞のアガロースゲル電気泳動分析。ゲノムＤＮＡは、細胞から単離され、（４Ａ）に示されるプライマーを用いてＰＣＲにより評価される。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲルで溶解され、２つのメガヌクレアーゼを共発現するＨＥＫ−２９３細胞が一対のＰＣＲバンドを生じるのに対し、野生型ＨＥＫ−２９３細胞はより大きなバンドのみを生じるということがわかった。４Ｃ）（４Ｂ）からより小さいＰＣＲ生成物をかくまう１６個のプラスミドからの配列。配列は、野生型ヒト配列に配向して示される。ＤＹＳ−５／６およびＤＹＳ−７／８認識配列の位置は、太字の中央４つの塩基対とともにグレイに陰影されている。 ＣＨＯ細胞の受容体アッセイにおけるＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４メガヌクレアーゼの評価。Ａ）アッセイの図。２つのメガヌクレアーゼのそれぞれに対し、我々は、受容体カセットが細胞のゲノムに安定して統合されるＣＨＯ細胞株を生成した。受容体カセットは、５’から３’の順で、ＳＶ４０早期プロモーター、ＧＦＰ遺伝子の５’２／３、ＭＤＸ−１／２（配列番号１４９）の認識部位またはＭＤＸ−１３／１４（配列番号１５０）の認識部位の一方、ＣＨＯ−２３／２４メガヌクレアーゼ（ＷＯ／２０１２／１６７１９２）の認識部位、およびＧＦＰ遺伝子の３’２／３を含んだ。このカセットでトランスフェクトされる細胞は、ＤＮＡ破壊誘発剤の不存在下でＧＦＰを発現しなかった。しかしながら、ＤＮＡ破壊が、メガヌクレアーゼ認識部位のいずれかで誘発される場合、ＧＦＰ遺伝子の複製領域は、互いに組み替えられて機能的ＧＦＰ遺伝子を産生する。次いで、ＧＦＰ発現遺伝子細胞の割合は、メガヌクレアーゼによるゲノム開裂の頻度の間接的測定としてフローサイトメトリにより決定され得る。Ｂ、Ｃ）２つのＣＨＯ受容体株は、ＭＤＸ−１／２（Ａ）、ＭＤＸ−１３／１４（Ｂ）、またはＣＨＯ−２３／３４（ＡおよびＢ）メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた。１．５ｅ６ＣＨＯ細胞は、製造者の指示によるロンザヌクレオフェクター２およびプログラムＵ−０２４を用いて細胞当たり１ｅ６のｍＲＮＡの複製でトランスフェクトされた。４８時間のトランスフェクト後、細胞は、トランスフェクトされなかった（空）負対照と比較してＧＦＰ−陽性細胞の割合を決定するためにフローサイトメトリにより評価された。アッセイは、３回行われおよび標準偏差が示される。ＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４メガヌクレアーゼは、ヌクレアーゼが細胞の意図する標的配列を効率的に認識および切断できることを示しながら、負（空）対照およびＣＨＯ−２３／２４正対照の両方を非常に超える頻度でそれらの各細胞株においてＧＦＰ＋細胞を産生することが見出された。 ＤＭＤ遺伝子の一部が、ＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４メガヌクレアーゼでの同時トランスフェクトにより欠失される２０Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞クローンからの配列の配置。ＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４標的部位の位置および配列として、ＤＭＤエクソン２３の位置が示される。２０個の配列（配列番号１５３−１７２）のそれぞれは、参照野生型ＤＭＤ配列に対して配列し、参照に対する削除は中空バーとして示される。 ｐＡＡＶ−ＭＤＸプラスミドのベクターマップ。この「パッケージング」プラスミドは、Ａｄヘルパープラスミドと共に用いられて、ＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４メガヌクレアーゼをコードする遺伝子を同時に搬送し得るＡＡＶウイルスを産生する。

１．１ 参照および定義
本明細書で参照される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を構築する。本明細書で引用される、ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む、発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、および参照文献は、それぞれが明示的かつ個別に参照をもって引用されることを示された場合、同範囲まで参照を持って本明細書に引用される。

本明細書で使用されているように、用語「メガヌクレアーゼ」は、Ｉ−ＣｒｅＩから誘導されたエンドヌクレアーゼを指す。用語メガヌクレアーゼは、本明細書で使用されているように、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ開裂活性、ＤＮＡ結合親和性、または二量体化特性に関して天然Ｉ−ＣｒｅＩに対して修飾されたＩ−ＣｒｅＩの改変バリアントを指す。そのようなＩ−ＣｒｅＩの修飾されたバリアントを産生する方法は本分野で知られている（例えば、国際公開ＷＯ２００７／０４７８５９号公報）。メガヌクレアーゼは、野生型Ｉ−ＣｒｅＩの場合のように、ホモ二量体として二重鎖ＤＮＡと結合し得、またはヘテロ二量体としてＤＮＡに結合し得る。メガヌクレアーゼは、一対のＩ−ＣｒｅＩから誘導されたＤＮＡ結合ドメインが、ペプチドリンカーを用いて単一ポリペプチドに結合される「単鎖メガヌクレアーゼ」となり得る。

本明細書で使用されているように、用語「単鎖メガヌクレアーゼ」は、リンカーにより結合した一対のメガヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドである。単鎖メガヌクレアーゼは、構成：Ｎ−末端サブユニット−リンカー−Ｃ−末端サブユニットを有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、それぞれＩ−ＣｒｅＩから誘導され、アミノ酸配列において概して非同一性であり得、非同一性ＤＮＡ配列を認識し得る。こうして、単鎖メガヌクレアーゼは典型的に、擬似回帰性または非回帰性認識配列を開裂する。単鎖メガヌクレアーゼは、「単鎖ヘテロ二量体」または「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」として示され得るが、実際は二量体ではない。明確さのために、明示されてなければ、用語「メガヌクレアーゼ」は、二量体または単鎖メガヌクレアーゼを指し得る。

本明細書で使用されているように、用語「コンパクトＴＡＬＥＮ」は、任意の配向においてＩ−ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼのいずれの部分と融合された１６−２２ＴＡＬドメイン繰り返しを備えるＤＮＡ−結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。

本明細書で使用されているように、用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、Ｃａｓ９のようなカスパーゼ、およびハイブタライズによりカスパーゼのＤＮＡ開裂をゲノムＤＮＡにおける認識部位に向けるガイドＲＮＡを含むカスパーゼ系エンドヌクレアーゼを指す。

本明細書で使用されているように、タンパク質に関して、用語「組み換え」は、ゲノム改変技術をタンパク質をコードする核酸、およびタンパク質を発現する細胞または器官に適用した結果としての改変アミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、用語「組み換え」は、ゲノム改変技術の適用の結果としての改変核酸配列を有することを意味する。遺伝子上の改変技術は、限定されないが、ＰＣＲおよびＤＮＡクローン技術、トランスフェクション、トランスフォーメーション、および他のトランスファー技術、同相組み換え、部位特異的突然変異誘発、ならびに遺伝子融合を含む。この定義によると、自然発生タンパク質と同一であるが、異種宿主におけるクローニングおよび発現により産生されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、考慮された組み換えではない。

本明細書で使用されているように、用語「野生型」は、メガヌクレアーゼのいずれかの自然発生形態を指す。用語「野生型」は、自然における酵素の最も一般的な対立遺伝子バリアントを意味することを意図しておらず、むしろ自然で見出されるいずれの対立遺伝子バリアントを意味する。天然型ホーミングエンドヌクレアーゼは、組み換えまたは非自然発生メガヌクレアーゼと区別される。

本明細書で使用されているように、用語「認識配列」は、エンドヌクレアーゼにより結合および開裂されたＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４つの塩基対により分離される一対の転化された９個の塩基対「半分部位」を含む。単鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ−末端ドメインは、第１半分部位と接触し、タンパク質のＣ−末端ドメインは第２半分部位と接触する。メガヌクレアーゼによる開裂は、塩基対３’「オーバーハング」を産生する。「オーバーハング」または「スティッキィエンド」は、二重鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ開裂により産生され得る短い単鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ−ＣｒｅＩから誘導されるメガヌクレアーゼおよび単鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２個の塩基対認識配列の塩基１０−１３を含む。コンパクトＴＡＬＥＮの場合、認識配列は、Ｉ−ＴｅｖＩドメイン、次いで非特異的スペーサー長さ４−１６塩基対、次いでＴＡＬ−エフェクタードメイン（この配列は５’Ｔ塩基を典型的に含む）により認識される第２配列長さ１６−２２ｂｐにより認識される第１ＣＮＮＮＧＮ配列を含む。コンパクトＴＡＬＥＮによる開裂は、２つの３’オーバーハングを産生する。ＣＲＩＳＰＲの場合、認識配列は、ガイドＲＮＡがＣａｓ９開裂を配列に向けさせるために結合する配列であり、典型的には１６−２４個の塩基対である。ＣＲＩＳＰＲ
による開裂は、ブラントエンドを産生する。

本明細書に記載されているように、用語「標的部位」または「標的配列」は、メガヌクレアーゼのための認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。

本明細書に記載されているように、用語「相同組み換え」または「ＨＲ」は、二重鎖ＤＮＡ破壊が修復鋳型として相同ＤＮＡ配列を用いて修復される自然細胞プロセスを指す（Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６を参照）。相同ＤＮＡ配列は、細胞へ搬送される内因性染色体配列または外因性核酸であり得る。

本明細書に記載されているように、用語「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、二重鎖ＤＮＡ破壊が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接結合により修復される自然細胞プロセスを指す（Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復は、誤りがちでしばしば修復部位でＤＮＡ配列の意図しない転化または欠失をもたらす。

本明細書に記載されているように、用語「再連結」は、一対の二重鎖ＤＮＡ破壊により産生した２つのＤＮＡ末端が、介在ＤＮＡ配列の損失を伴い互いに共有結合しているが、いずれの更なるＤＮＡ配列を得ても失ってもいないプロセスを指す。単鎖オーバーハングで産生される一対のＤＮＡ破壊の場合、再連結は、相補的オーバーハングのアニーリングを介し、次いでＤＮＡリガーゼによる５’および３’末端共有結合により促進され得る。再連結は、修復の部位からＤＮＡの意図しない添加または削除をもたらさないＮＨＥＪとは異なる。

本明細書に記載されているように、特に明示していない限り、単語「または」は、「および／または」の包括的意味として試用され、「一方／または」の排他的意味ではない。

２．１ エクソン欠失の原理
本発明は、部分的に、デュシェンヌ表現型を引き起こすＤＭＤ遺伝子における特定の欠失が、更なるエクソン（単複可）を突然変異の上流または下流で即座に欠失することにより補足され得るという仮説に基づく。ＤＭＤ−ライデンデータベースは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こす突然変異のほとんどが、リーディングフレームにおけるシフトを引き起こす１以上の全エクソンの欠失であることを示す。多くの場合、リーディングフレームは、突然変異前後に即座にエクソンを排除することにより回復され得る。表１に示すように、約６５％の患者を表す、２９個の異なるデュシェンヌ誘導突然変異体は、突然変異体に隣接する単一エクソンを欠失することにより補足され得る。例えば、患者の約７％に生じるＤＭＤエクソン４５の欠失による疾患を伴う患者は、エクソン４６を欠失する治療法で治療され得る。注目すべきことに、エクソン５１またはエクソン４５を欠失し得る治療法は、１５％および１３％の患者をそれぞれ治療するために使用され得る。

２．２ エクソン欠失のためのヌクレアーゼ
生きている細胞のゲノムにおけるＤＮＡ破壊をするために部位特異性ヌクレアーゼを使用することが可能なことおよびそのようなＤＮＡ破壊が、突然変異誘発性ＮＨＥＪ修復またはトランスフェクトＤＮＡ配列でＨＲを介したゲノムの恒久的改変をもたらし得ることは本分野で知られている。しかしながら、本発明は、同細胞内における一対のヌクレアーゼの共発現を含む。驚くべきことに、我々は、互いに近位のＤＮＡ部位（１０，０００塩基対未満離れている）を標的とされた一対のヌクレアーゼが、ゲノムからの介在ＤＮＡフラグメントを切除し得ることを発見した。また驚くべきことに、我々は、一対のヌクレアーゼを用いたＤＮＡ削除が、ヌクレアーゼにより生じた単鎖ＤＮＡオーバーハングを含む機構を介して頻繁に進行することを発見した。相補的（つまり、同一的）ＤＮＡオーバーハングを生じる一対のメガヌクレアーゼを含む実験において、オーバーハング配列が、フラグメント切除および得られた染色体末端の後に頻繁に保存されることが発見された（実施例１および２を参照）。この場合において、ＤＮＡ修復の機構は、哺乳類の細胞では観察されない破壊末端の再連結を指示するように思われる。そのような正確な欠失および再連結は、非同一的オーバーハングを生じる一対のメガヌクレアーゼを用いた場合では観察されなかった（実施例３を参照）。したがって、好ましい実施形態において、ＤＭＤエクソン切除のために使用される一対のヌクレアーゼは、補足的オーバーハングを生じるために選択される。

エクソンを効率的に切除するために、一対のヌクレアーゼ切除部位は、比較的互いに近いことが必要とされる。概して、２つの部位が互いにより近いほど、プロセスがより効率的になろう。したがって、本発明の好ましい実施形態は、１０，０００、より好ましくは５，０００、さらに好ましくは２，５００、最も好ましくは１，５００未満の塩基対離れた配列を切除する一対のヌクレアーゼを使用する。

図２に示すように、異なる種類の多様なヌクレアーゼは、本発明の実施に有用である。図２Ａおよび２Ｂは、どのようにして本発明が一対のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いて実施され得るかの実施例を示す。この場合、本発明は、３つの遺伝子を細胞に搬送するこ
とにより実施され得る：Ｃａｓ９タンパク質をコードする１つの遺伝子および２つのガイドＲＮＡのそれぞれをコードする１つの遺伝子。最終生成物が概して配列においてさらなる挿入および／または欠失（「インデル」）突然変異体を有するように、ＣＲＩＳＰＲは、正確に概して再連結しないブラントエンドを残すためにＤＮＡを切除する。代替的実施形態において、Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ．１５４：１３８０−９に報告されるように「ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ」が用いられ得る。この実施形態を実施するために、細胞における４つのガイドＲＮＡを発現することが必要であり、その２つはエクソンの配列上流に対して補足的であり、その２つはエクソンの配列下流に補足的である。この実施形態において、２対のガイドＲＮＡは、標的領域における補足的鎖とハイブタライズし、一対の各メンバーは、鎖の１つで単鎖ＤＮＡ刻み目を生じる。結果は、本発明を実施するために有利な単鎖オーバーハングを生じるために互いからオフセットされ得る一対の刻み目（二重鎖破壊と等しい）である。予め決められたＤＮＡ部位を認識するＣＲＩＳＰＲおよびＣＲＩＳＰＲニッカーゼを産生する方法は、例えば、Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１−３０８のように本分野で知られている。

代替的実施形態において、図２Ｃおよび図２Ｄに図示するように、ヌクレアーゼ対は、コンパクトＴＡＬＥＮであり得る。コンパクトＴＡＬＥＮは、Ｎ−またはＣ−末端で、少なくとも１−９６残基を含む、好ましくはＩ−ＴｅｖＩの１−１８２残基を含む、Ｉ−ＴｅｖＩからの開裂ドメインと融合するＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ）を有する。Ｉ−ＴｅｖＩ開裂ドメインは、５’−ＣＮｂＮＮｔＧ−３’形態のＤＮＡ配列を認識し切除し、ここで、「ｂ」は、下鎖の開裂部位を表し、「ｔ」は、上鎖の開裂部位を表し、「Ｎ」は、４つの塩基のいずれかである。したがって、コンパクトＴＡＬＥＮは、２つの塩基対３’オーバーハングを産生するために開裂する。好ましい実施形態において、エクソン切除のために使用されるコンパクトＴＡＬＥＮ対は、直接再連結し得る補足的オーバーハングを有するように選択される。予め決められたＤＮＡ部位に結合するＴＡＬＥドメインを産生する方法は、例えば、Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：４６０−５のように本分野で知られている。

好ましい実施形態において、図２Ｅに示すように、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは、一対の単鎖メガヌクレアーゼである。単鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドにより結合されたＮ−末端およびＣ−末端を有する。２つのドメインのそれぞれは、認識配列の半分を認識しおよびＤＮＡ開裂の部位は２つのサブユニットの界面付近の認識配列の中央である。ＤＮＡ鎖破壊は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ開裂が一対の４つの塩基対、３’単鎖オーバーハングを産生するように一対の４つの塩基対によりオフセットされる。好ましい実施形態において、実施例１および２のように、補足的オーバーハングで認識配列をカットする単鎖メガヌクレアーゼが選択される。ＤＭＤエクソン４４、４５および５１個の典型的認識配列が表２〜７に挙げられる。例えばエクソン４４を削除するために、認識配列をカットする第１メガヌクレアーゼは、エクソン４４の認識配列上流を挙げている表２から選択され得る。認識配列をカットする第２メガヌクレアーゼは、エクソン４４の認識配列下流を挙げている表３から選択され得る。したがって、小さい細胞の２つのメガヌクレアーゼの共発現は、エクソン４４を削除する。好ましくは、補足的単鎖オーバーハングを残すためにＤＮＡをカットするメガヌクレアーゼが選択される。例えば、配列番号１９がメガヌクレアーゼによりカットされる場合、オーバーハング配列５’−ＧＴＡＣ−３’を残す。同様に、配列番号４２がメガヌクレアーゼによりカットされる場合、オーバーハング配列５’−ＧＴＡＣ−３’を残す。こうして、配列番号４２を開裂する第２メガヌクレアーゼと配列番号１９を開裂する第１メガヌクレアーゼを共発現することは、ヒト細胞のゲノムからＤＭＤエクソン４４を削除し得、その結果、直接的な再連結を介して修復され得る補足的オーバーハングが産生される。

２．３ ヌクレアーゼの搬送および発現方法
本発明を用いたデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療は、一対のヌクレアーゼが筋細胞で発現されることを必要とする。ヌクレアーゼは、精製されたタンパク質またはヌクレアーゼをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡとして搬送され得る。１つの実施形態において、ヌクレアーゼタンパク質またはｍＲＮＡまたはヌクレアーゼをコードするベクターは、筋肉内注射（Ｍａｌｔｚａｈｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０９：２０６１４−９）またはハイドロダイナミック注射（Ｔａｎｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１２：１６３０−７；Ｈｅｇｇｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１ ：８２９−４２）を介して筋細胞に供給される。細胞内への取り込みを容易にするために、タンパク質または核酸（複数可）は、筋細胞による取り込みを容易にするために、細胞貫通ペプチドと連結し得る。本分野で知られている細胞貫通ペプチドの例は、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ．１６：１６２４−９）、ＨＩＶウイルスからのＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚ
ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９−７３６）、ＭＰＧ（（Ｓｉｍｅｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４）、Ｐｅｐ−１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：７６９８−７７０６）およびＨＳＶ−１ ＶＰ−２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９−４９）を含む。代わりに、細胞貫通は、リポソームカプセル化により容易になし得る（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡを参照）。リポソーム製剤は、標的細胞との脂質二層融合を容易にするために用いられ得、それによりその表面に関連するリポソームまたはタンパク質の内容物を細胞に運ぶことを可能にする。

いくつかの実施形態において、一対のヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ウイルスベクターを用いて搬送される。このようなベクターは、本分野で知られ、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を含む（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１３ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１−２２）にレビューされている）。いくつかの実施形態において、ウイルスは直接筋組織に注入される。代わりの実施形態において、ウイルスベクターは、全身に搬送される。実施例３は、筋肉に一対の単鎖メガヌクレアーゼをコードする組み換えＡＡＶウイルスが注射される好ましい実施形態を示す。異なるＡＡＶベクターが異なる組織に局所的に制限する傾向があることは本分野で知られている。筋肉向性ＡＡＶセロタイプは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２．５（Ｂｏｗｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０：４４３−５５）を含む。したがって、これらのセロタイプは、筋組織へのヌクレアーゼの搬送にとって好ましい。

ＤＮＡ形態（例えば、プラスミド）および／またはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を介してヌクレアーゼ遺伝子を搬送するる場合、それらはプロモーターと操作可能に結合されなければならない。いくつかの実施形態において、これは、ウイルスベクターからの内因性プロモーター（例えば、レンチウイルスベクター）またはよく知られたサイトメガロウイルス若しくはＳＶ４０ウイルス早期プロモーター等のウイルスプロモーターであり得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ遺伝子は、筋細胞の遺伝子発現を優先的に誘導するプロモーターと操作可能に連結される。筋特定プロモーターの例は、Ｃ５−１２（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３−９２）、筋特定クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（Ｙｕａｓａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１５７６−８８）、または潤滑筋肉２２（ＳＭ２２）プロモーター（Ｈａａｓｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９−５４）を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ遺伝子は、２つの分離したプロモーターの制御下にある。代わりの実施形態において、遺伝子は、単鎖プロモーターの制御下にあり、内部リポソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）または２Ａペプチド配列（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ａｎｄ Ｖｉｇｎａｌｉ（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．５：６２７−３８）により分離される。

単一治療により、患者細胞の割合からエクソンを恒久的に欠失することが想像される。好ましい実施形態において、これらの細胞は、機能的（または半機能的）ジストロフィンを発現する全筋線維を複製しおよび全筋線維の元となり得る筋芽細胞または他の筋前駆細胞であり得る。しかしながら、エクソン欠失の頻度が低い場合、各患者で複数回の筋肉内注射のような複数の治療を行うことが必要であり得る。

本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、限定として解釈するべきではない
。当業者は、わずかな定例の実験を用いて、本明細書に記載の特定物質および手順との多くの同等物を認識しまたは確認することができよう。このような同等物は、以下の実施例を支持する請求項の範囲に包含されることを意図する。

実施例１；一対の改変単鎖メガヌクレアーゼを用いたＤＭＤエクソン４４の欠失
１．配列番号１９および配列番号４２を認識するメガヌクレアーゼ
配列番号１９を認識し開裂する改変メガヌクレアーゼ（配列番号１３５）を調製した。このメガヌクレアーゼは、「ＤＹＳ−１／２」とよばれる。配列番号４２を認識し開裂する第２改変メガヌクレアーゼ（配列番号１３６）を調製した。このメガヌクレアーゼは、「ＤＹＳ−３／４」（図３Ａ）とよばれる。各メガヌクレアーゼは、ＳＶ４０から誘導されるＮ−末端ヌクレアーゼ局所化シグナル、第１メガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、および第２メガヌクレアーゼサブユニットを含む。

２．ＨＥＫ−２９３細胞のＤＭＤエクソン４４の欠失
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞は、ＤＹＳ−１／２およびＤＹＳ−３／４をコードするｍＲＮＡで共トランスフェクトされた。ｍＲＮＡは、インビトロ転写反応（配列番号１３９および配列番号１４０）用のＰＣＲ鋳型を最初に産生することにより調製した。各ＰＣＲ産物は、Ｔ７プロモーターおよびメガヌクレアーゼ遺伝子のベクター配列下流の６０９ｂｐを含んだ。単一鋳型を確保するために、ＰＣＲ産物をゲル精製した。キャップ（ｍ７Ｇ）ＲＮＡは、製造者の指示によりＲｉｂｏＭＡＸＴ７キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて調製した。Ｒｉｂｏｍ７Ｇキャップ類似体（ｐｒｍｅｇａ）が反応中に含まれ、０．５μｇの精製されたメガヌクレアーゼＰＣＲ産物がＤＮＡ鋳型として働いた。キャップＲＮＡは、製造者の指示によりＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製された。

１．５×１０^６ＨＥＫ−２９３細胞が、製造者の指示によりＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ装置（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ＤＹＳ−１／２ｍＲＮＡの１．５×１０^１２コピーおよびＤＹＳ−３／４ｍＲＮＡの１．５×１０^１２コピー（２×１０^６コピー／細胞）でヌクレオフェクトされた。４８時間後のトランスフェクションで、製造者の指示によりＦｌｅｘｉＧｅｎｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡが細胞から単離された。次いで、ゲノムＤＮＡは、ＤＹＳ−１／２およびＤＹＳ−３／４切断部位（配列番号１４１および配列番号１４２）を並べるプライマーを用いてＰＣＲを受けさせた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離したところ、ＤＹＳ−１／２およびＤＹＳ−３／４を共発現する細胞が１０７９塩基対および２３３塩基対の明白な長さを備える２つのＰＣＲ産物を産出したのに対し、トランスフェクトされていないＨＥＫ−２９３細胞からのゲノムＤＮＡは、より大きな生成物だけ産出したことは明らかである（図３Ｂ）。より大きな生成物は、完全なＤＭＤエクソン４４を備える細胞からのＰＣＲフラグメントの予測された大きさと一致する。より小さな生成物は、エクソン４４がＤＭＤ遺伝子から削除された細胞からのＰＣＲフラグメントの予測された大きさと一致する。

より小さなＰＣＲ産物をゲルから単離し、配列分析用のバクテリアプラスミド（ｐＵＣ−１９）にクローンした。３つのプラスミドクローンがシーケンスされ、その全てがエクソン４４を欠失していることが見出された（図３Ｃ）。驚くべきことに、３つのプラスミドのうちの２つは、欠失が正確に、予期されたＤＹＳ−１／２およびＤＹＳ−３／４誘発ＤＮＡ破壊を介入する領域からなる細胞からＰＣＲ産物を運んだ。２つのメガヌクレアーゼが、それらの意図する認識部位を開裂し、互換性ある５’−ＧＴＡＣ−３’オーバーハングを残し、エクソン４４を含む介在フラグメントが失われ、次いで２つの染色体末端が再連結されたようである。第３のプラスミドクローンは、２つの開裂部位に介在する領域が１０つの更なる塩基に沿って削除される細胞からＰＣＲ産物を運んだ。

３．結論
我々は、培養した細胞株のヒトゲノムからフラグメントを削除するために一対の改変単鎖メガヌクレアーゼを用いることが可能であることを実証した。ＤＮＡ除去および修復プロセスは、オーバーハングが互いに補足的かつアニール可能である場合、ヌクレアーゼにより形成される３’オーバーハングを含む機構を介して促進されるようであり、プロセスがより効果的であることを示唆する。

実施例２；一対の改変単鎖メガヌクレアーゼを用いたＤＭＤエクソン４５の欠失
１．配列番号６２および配列番号７４を認識するメガヌクレアーゼ
配列番号６２を認識し開裂する改変メガヌクレアーゼ（配列番号１３７）を調製した。このメガヌクレアーゼは、「ＤＹＳ−５／６」と呼ばれる。配列番号７４を認識し開裂する第２改変メガヌクレアーゼ（配列番号１３８）を調製した。このメガヌクレアーゼは、「ＤＹＳ−７／８」と呼ばれる（図４Ａ）。各メガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来のＮ−末端ヌクレアーゼ局所化シグナル、第１メガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列および第２メガヌクレアーゼサブユニットを含む。

２．ＨＥＫ−２９３細胞におけるＤＭＤエクソン４５の欠失
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞を、ＤＹＳ−５／６およびＤＹＳ−７／８をコードするｍＲＮＡで同時トランスフェクトした。ｍＲＮＡは、インビトロ転写反応（配列番号１４３（２０）および配列番号１４４（２１））のためのＰＣＲ鋳型を最初に産生することにより調製した。各ＰＣＲ産物は、メガヌクレアーゼ遺伝子のベクター配列下流の６０９ｂｐおよびＴ７プロモーターを含有した。単一鋳型を保証するために、ＰＣＲ産物をゲル精製した。キャップ（ｍ７Ｇ）ＲＮＡは、製造者の指示によりＲｉｂｏＭＡＸＴ７キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて産生された。Ｒｉｂｏｍ７Ｇキャップ類似体（ｐｒｍｅｇａ）が反応中に含まれ、０．５μｇの精製されたメガヌクレアーゼＰＣＲ産物がＤＮＡ鋳型として働いた。キャップＲＮＡは、製造者の指示によりＳＶトータルＲＮＡアイソレーションシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製された。

製造者の指示によりＡｍｅｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ装置（Ｌｏｎｚａ）を用いて、１．５×１０^６ＨＥＫ−２９３細胞をＤＹＳ−５／６ｍＲＮＡの１．５×１０^１２コピーおよびＤＹＳ−７／８ｍＲＮＡの１．５×１０^１２コピー（２×１０^６コピー／細胞）でヌクレオフェクトした。４８時間後のトランスフェクションで、製造者の指示によりＦｌｅｘｉＧｅｎｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡを細胞から単離した。次いでゲノムＤＮＡは、ＤＹＳ−５／６およびＤＹＳ−７／８切断部位（配列番号１４５および配列番号１４６）を並べるプライマーを用いてＰＣＲを受けさせた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離したところ、ＤＹＳ−５／６およびＤＹＳ−７／８を共発現する細胞は、１３８４塩基対および１６１塩基対の明白な長さを備える２つのＰＣＲ産物を産出したのに対し、トラスフェクトされていないＨＥＫ−２９３細胞からのゲノムＤＮＡは、より大きな生成物だけ産出したことは明らかであった（図４Ｂ）。より大きな生成物は、完全なＤＭＤエクソン４５を備える細胞からのＰＣＲフラグメントの予期されたサイズと一致する。より小さな生成物は、エクソン４５がＤＭＤ遺伝子から削除された細胞からのＰＣＲフラグメントの予期された大きさと一致する。

より小さなＰＣＲ産物をゲルから単離し、配列分析用のバクテリアプラスミド（ｐＵＣ−１９）にクローンした。１６個のプラスミドクローンがシークエンスされ、その全てが、エクソン４５を欠失していることがわかった（図４Ｃ）。驚くべきことに、１６個のプラスミドのうち１４個が、欠失が正確に、予期されたＤＹＳ−５／６およびＤＹＳ−７／８誘発ＤＮＡ破壊を介入する領域からなる細胞からＰＣＲ産物を運んだ。２つのメガヌクレアーゼが、それらの意図する認識部位を開裂し、互換性ある５’−ＧＴＡＣ−３’オーバーハングを残し、エクソン４５を含む介在フラグメントが失われ、次いで２つの染色体
末端が再連結されたようである。２つの残ったプラスミドクローンは、２つの開裂部位に介在する領域が３６個の更なる塩基に沿って削除される細胞からのＰＣＲ産物を運んだ。

３．結論
我々は、培養した細胞株のヒトゲノムからのフラグメントを削除するために、一対の改変単鎖メガヌクレアーゼを使用することができることを実証した。ＤＮＡ削除および修復プロセスは、ヌクレアーゼにより産生された３’オーバーハングを含む機構を介して促進されるようであり、オーバーハングが互いに相補的かつアニールできる場合、プロセスがより効率的になることを示唆する。

実施例３；ＡＡＶ搬送メガヌクレアーゼを用いたマウスにおけるＤＭＤエクソン２３の欠失
１．マウスＤＭＤエクソン２３を欠失するヌクレアーゼの開発
ＤＭＤの標準マウスモデルはｍｄｘマウスであり、該マウスは、未成熟終止コドンを導入するエクソン２３におけるポイント突然変異を有する（Ｓｉｃｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４４：１５７８−８０）。マウスにおいて、ＤＭＤエクソン２３は、２１３個の塩基対であり、７１個のアミノ酸と等価である。こうして、我々は、エクソン２３全体を欠失し、それによりＤＭＤ遺伝子のリーディングフレームを維持しつつ停止コドンを削除することは可能であると推論した。最後に、我々は、「ＭＤＸ−１／２」（配列番号１４７）および「ＭＤＸ−１３／１４」（配列番号１４８）とよばれる一対の単鎖メガヌクレアーゼを開発した。前者は、マウスＤＭＤエクソン２３（配列番号１４９）のＤＮＡ配列上流を認識するが、後者はマウスＤＭＤエクソン２３（配列番号１５０）のＤＮＡ配列下流を認識する。まず、図５に示すように、ＣＨＯ細胞において「ｉＧＦＦＰ」と呼ばれる受容体アッセイを用いてヌクレアーゼを試験した。このアッセイを用いて、両方のヌクレアーゼは、それらの意図するＤＮＡ部位を効率的にカットすることが見出された。

２．マウス筋芽細胞におけるマウスＤＭＤエクソン２３の欠失
マウス発芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を、ＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４ヌクレアーゼをコードするインビトロ転写ｍＲＮＡで同時トランスフェクトした。ｍＲＮＡは、ＰｒｏｍｅｇａからのＲｉｂｏＭＡＸＴ７キットを用いて調製した。１ｅ６Ｃ２Ｃ１２細胞を、Ａｍａｘａ２ｂ装置およびＢ−０３２プログラムを用いて各ＭＤＸ酵素対（各ｍＲＮＡの１ｅ６コピー）をコードするｍＲＮＡの全２ｅ６コピー／細胞でヌクレオフェクトした。９６時間後、細胞は９６個のウェルプレートにおいて希釈を制限してクローンされた。およそ２週間の成長後、細胞を回収し、ＱｉａｇｅｎからのＦｌｅｘｉＧｅｎｅキットを用いてゲノムＤＮＡを単離した。次いで、ＰＣＲ産物は、ＤＭＤイントロン２２（配列番号１５１）における前プライマーおよびイントロン２３（配列番号１５２）における逆プライマーを用いて各クローンについて産生された。次いで、６０個のＰＣＲ産物をクローンして配列決定した。２０個の配列は、ＤＭＤ遺伝子のメガヌクレアーゼ開裂その後の突然変異ＤＮＡ修復と一致する欠失である（図６、配列番号１５３−１７２）。１１個の配列は、エクソン２３（配列番号１５３−１６３）と同様にＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４認識部位の少なくとも一部を失っていた。これらの配列は、両方のヌクレアーゼがそれらの意図する部位をカットしかつ介入配列が欠失される細胞から誘導されそうであった。４個の配列は、エクソン２３を失っていたが、完全なＭＤＸ−１／２認識配列（配列番号１６４−１６７）を有した。これらは、ＭＤＸ−１３／１４単独によるＤＮＡ開裂その後の多くの配列の欠失に起因するようである。５個の配列は、完全なＭＤＸ−１／２認識部位およびエクソン２３の全てまたは一部を有するが、ＭＤＸ−１３／１４認識部位（配列番号１６８−１７２）の全てまたは一部を失っていた。これらの配列は、ＭＤＸ−１３／１４単独によるＤＮＡ開裂その後のエクソン２３のすべてを除去するのに不十分なより小さな量の配列の欠失によるようである。実施例１および２における実験とは
全く対照的に、我々は、マウス細胞におけるＤＭＤエクソン２３の欠失後の一貫したＤＮＡ配列を得られなかった。これは、２つのＭＤＸメガヌクレアーゼが、互換性ある３’オーバーハングでのＤＮＡ破壊を生じないからのようである。ＭＤＸ−１／２は、配列５’−ＧＴＧＡ−３’を備えるオーバーハングを産生し、ＭＤＸ−１３／１４は、配列５’−ＡＣＡＣ−３’を備えるオーバーハングを産生する。こうして、我々は、実施例１および２において得られた一貫した配列結果が、一対のメガヌクレアーゼにより産生された３’オーバーハングの互換性によると結論を下す。

３．一対の改変ヌクレアーゼの搬送のための組み換えＡＡＶベクターの産生
ＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４遺伝子を同時搬送するためのＡＡＶベクターを調製するために、我々は最初に、それぞれＣＭＶ早期プロモーターの制御下にある、ＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ１３／１４メガヌクレアーゼのための配列をコードする遺伝子と同様に、ＡＡＶ２からの一対の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む「ｐＡＡＶ−ＭＤＸ」（図７、配列番号１７３）とよばれる「パッケージング」プラスミドを調製した。このベクターは、Ｘｉａｏらの方法によるＡｄヘルパープラスミドでのＨＥＫ−２９３細胞の同時トランスフェクションにより組み換えＡＡＶ２ウイルスを産生するために用いられた（Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４−２２３２）。次いで、ウイルスは、ＧｒｉｅｇｅｒおよびＳａｍｕｌｓｋｉ（Ｇｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ５０７：２２９−２５４）によって説明されたように、塩化セシウム勾配遠心によって単離された。得られたウイルス粒子が伝染性でかつ両方の改変メガヌクレアーゼを発現し得ることを確認するために、それらをＭＤＸ−１／２またはＭＤＸ−１３／１４の一方のための受容体カセットを運ぶ培養されたｉＧＦＦＰ ＣＨＯに加えた（図５Ａ参照）。ＭＤＸ−１／２のための受容体を運ぶＣＨＯ株へのウイルスへの添加は、１０．２％の細胞においてＧＦＰ遺伝子発現をもたらした。こうして、我々は、ウイルスがＣＨＯ細胞を変換し得、変換された細胞が両方のヌクレアーゼを発現したという結論を下す。

４．一対のメガヌクレアーゼ遺伝子のＡＡＶ搬送後のマウス筋肉におけるＤＭＤエクソン２３の欠失
ＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４遺伝子を運ぶ組み換えＡＡＶ１ウイルス粒子を、上記のように調製した。Ｘｉａｏらに記載されているように、一対のｍｄｘマウスの３つの後脚ＴＡ筋肉にウイルスを注入した（Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４−２２３２）。１つのマウスからの１つの筋肉は、陰性対照として注入しなかった。２つのマウスからの筋肉が、注入後４日または７日目で回収され、ゲノムＤＮＡを筋組織から単離した。ＤＭＤエクソン２３を囲むゲノム領域は、第１プライマー対（配列番号１５１および配列番号１５２）を用いて、ＰＣＲにより増幅された。次いで、この反応は、非特定ＰＣＲ産物を除去するために、「入れ子状態の」（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー対（配列番号１７４および配列番号１７５）を用いて第２ＰＣＲ反応を鋳型にするために用いられた。次いで、ＰＣＲ産物は、アガロースゲルで視覚化され、未注入対照筋肉ではない３つのＡＡＶ１注入された筋肉からのゲノムＤＮＡが、ＭＤＸ−１２およびＭＤＸ−１３／１４メガヌクレアーゼによるＤＭＤエクソン２３の欠失後の予測された生成物の大きさと一致するより小さなＰＣＲ生成物を産出した。次いで、より小さなＰＣＲ生成物をクローンし、配列決定した。３つの特異な配列が得られ、それぞれがイントロン２２およびイントロン２３の一部を含むがエクソン２３を欠くマウスＤＭＤ遺伝子の一部およびＭＤＸ−１／２およびＭＤＸ−１３／１４メガヌクレアーゼ（配列番号１７６−１７８）のためのカット部位に介在配列すべてから構成される。こうして、我々は、ＡＡＶにより搬送された一対のメガヌクレアーゼが、マウス筋肉からのインビボＤＭＤ遺伝子の一部を欠失するために使用され得るという結論を下した。

５．結論
我々は、組み換えＡＡＶベクターを用いて、一対の改変単鎖メガヌクレアーゼをコードする遺伝子を細胞および器官に搬送することができ、そのように搬送されたメガヌクレアーゼは、細胞におけるゲノムＤＮＡを開裂し、且つゲノムからＤＮＡのフラグメントを欠失させることができるという結論を下した。我々は更に、互換性を有するオーバーハングを産生しない一対のメガヌクレアーゼ誘発性ＤＮＡ破壊が、介入する配列の除去後に規定された配列成果を生じるために再連結しないであろうという結論を下した。したがって、規定された配列成果の望ましい治療的適用のために、同一のオーバーハングを形成する一対のヌクレアーゼを用いることが好ましい。

Claims (19)

1. 第１認識配列を切断する第１ヌクレアーゼおよび第２認識配列を切断する第２ヌクレアーゼを対象の筋細胞のＤＮＡと接触させることを含み、
   前記第１認識配列は、ジストロフィン遺伝子の第１エクソンの上流であり、
   前記第２認識配列は、ジストロフィン遺伝子の前記第１エクソンの下流であり、且つ、
   少なくとも１つの第２エクソンは、前記細胞のジストロフィン遺伝子から除去される、必要とする対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療する方法。
2. 前記第１および第２ヌクレアーゼのそれぞれは、メガヌクレアーゼである、請求項１記載の方法。
3. 前記第１および第２ヌクレアーゼのそれぞれは、ＣＲＩＳＰＲである、請求項１記載の方法。
4. 前記第１および第２ヌクレアーゼのそれぞれは、コンパクトＴＡＬＥＮである、請求項１記載の方法。
5. 前記第１エクソンは、エクソン４４である、請求項１記載の方法。
6. 前記第１エクソンは、エクソン４５である、請求項１記載の方法。
7. 前記第１エクソンは、エクソン５１である、請求項１記載の方法。
8. 前記第１認識配列は、配列番号２〜２８から選択され、前記第２認識配列は、配列番号２９〜４４から選択される、請求項５記載の方法。
9. 前記第１認識配列は、配列番号４５〜６３から選択され、前記第２認識配列は、配列番号６４〜７４から選択される、請求項６記載の方法。
10. 前記第１認識配列は、配列番号７５〜１０５から選択され、前記第２認識配列は、配列番号１０６〜１３４から選択される、請求項７記載の方法。
11. 前記第１ヌクレアーゼは、配列番号１３５であり、前記第２ヌクレアーゼは、配列番号１３６である、請求項８記載の方法。
12. 前記第１ヌクレアーゼは配列番号１３７であり、前記第２ヌクレアーゼは、配列番号１３８である、請求項９記載の方法。
13. 前記第１および第２ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、組み換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を用いて前記細胞に搬送される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記第１および第２認識部位は、前記第１および第２ヌクレアーゼにより切断される場合、同一のオーバーハングを有するように選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 第１認識部位を切断する第１ヌクレアーゼおよび第２認識部位を切断する第２ヌクレアーゼとＤＮＡを接触させることを含み、前記第１および第２認識部位は、前記第１および第２ヌクレアーゼにより切断される場合、同一のオーバーハングを有するように選択され
    る、細胞のゲノムからＤＮＡ配列を除去する方法。
16. 前記第１および第２ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、組み換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を用いて前記細胞に搬送される、請求項１５記載の方法。
17. 前記第１および第２ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである、請求項１５または１６記載の方法。
18. 前記第１および第２ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲである、請求項１５または１６記載の方法。
19. 前記第１および第２ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮである、請求項１５または１６記載の方法。

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