JP2019206481A - Collagen synthesis promoting composition and skin anti-aging agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コラーゲン合成を促進用組成物関する技術分野に属する。 The present invention belongs to the technical field related to compositions for promoting collagen synthesis.
生体組織は、細胞と細胞外マトリックスから構成されている。細胞外マトリックスは細胞の周囲に存在し、組織や器官に機械的な強さや柔軟性を与えるとともに、細胞が接着する足場となる。この細胞外マトリックスを構成する成分の代表的な分子は、コラーゲンである。コラーゲンは、体内の総タンパク量の約３０％を占める。
コラーゲンには様々なタイプが存在することが知られている。皮膚組織の真皮に存在するコラーゲンは、Ｉ型及びIII型コラーゲンが約９割を占め、残りはＶ型、VI型コラーゲンである。Ｖ型コラーゲンはマイナーコラーゲンであるが、近年の研究でコラーゲンが束になった構造の線維束形成に重要な機能を果たしていることが判明している。
A living tissue is composed of cells and an extracellular matrix. The extracellular matrix exists around the cells and provides mechanical strength and flexibility to tissues and organs, as well as a scaffold to which cells adhere. A typical molecule of the component constituting this extracellular matrix is collagen. Collagen accounts for about 30% of the total protein in the body.
It is known that there are various types of collagen. Collagen present in the dermis of the skin tissue accounts for about 90% of type I and type III collagen, and the rest are type V and type VI collagen. Although type V collagen is a minor collagen, recent studies have shown that it plays an important function in the formation of fiber bundles in which collagen is bundled.
近年の研究では、Ｖ型コラーゲンのα１鎖を欠損させたマウス（Ｃｏｌ５ａ１−／−）では全くコラーゲン線維を形成できず致死となることや、Ｃｏｌ５ａ１＋／−マウスでは大きさ・形の不揃いなコラーゲン線維が形成されることが明らかにされている（非特許文献１）。このことから、Ｖ型コラーゲンは、Ｉ型及びIII型コラーゲンを束ね、均一なコラーゲン線維形成に寄与していると考えられている（非特許文献２）。また、Ｖ型コラーゲンの遺伝子変異により発症するエーラス・ダンロス症候群（Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＥＤＳ）は、皮膚、関節、血管など全身的な結合組織が脆弱になる疾患であることも知られている（非特許文献３）。
また、加齢や光老化によりコラーゲンの線維束が細く脆くなること（非特許文献４）から、線維束形成にＶ型コラーゲンが重要な機能を果たしていることが考えられる。
そしてこれらの事実から、皮膚の弾力性や柔軟性を維持し或いは強化し、皮膚の老化を抑制するために、Ｉ型やIII型のコラーゲン産生を促進させるともに、Ｖ型コラーゲンの産生を促進させて、コラーゲン線維束を形成させることが、皮膚の健全な状態を維持するために重要であるということができる。すなわち、皮膚のＩ型コラーゲンやIII型コラーゲンとＶ型コラーゲンを共に増加させることによって、皮膚の老化防止が可能となる。
しかし従来の皮膚の老化抑制研究においては、皮膚コラーゲン線維束形成はあまり注目されていなかった。またＶ型コラーゲンについてもあまり注目されてこなかった。また、皮膚のＩ型コラーゲンやＶ型コラーゲンを共に増加させる物質については知られていない。
In recent studies, mice lacking the α1 chain of type V collagen (Col5a1-/-) are unable to form collagen fibers at all and become lethal, and Col5a1 +/- mice have irregular sizes and shapes. Is formed (Non-Patent Document 1). From this, it is considered that type V collagen bundles type I and type III collagen and contributes to uniform collagen fiber formation (Non-patent Document 2). Moreover, it is also known that Ehlers-Danlos syndrome (EDS), which develops due to a genetic mutation of type V collagen, is a disease in which systemic connective tissues such as skin, joints, and blood vessels become fragile ( Non-patent document 3).
In addition, collagen fiber bundles become thin and brittle due to aging and photoaging (Non-patent Document 4), and it is considered that V-type collagen plays an important function in fiber bundle formation.
And from these facts, in order to maintain or strengthen the elasticity and flexibility of the skin and suppress skin aging, it promotes the production of type I and type III collagen and promotes the production of type V collagen. Thus, it can be said that forming a collagen fiber bundle is important for maintaining a healthy state of the skin. That is, skin aging can be prevented by increasing both type I collagen and type III collagen and type V collagen in the skin.
However, skin collagen fiber bundle formation has not received much attention in conventional skin aging inhibition studies. Also, much attention has not been paid to type V collagen. Moreover, there is no known substance that increases both type I collagen and type V collagen in the skin.
一方コラーゲンを加水分解し、ジペプチドの大きさにまで分解したコラーゲンペプチドの摂取は、肌の張りやつやを回復させ、老化を抑制することが知られている。そして、ヒト線維芽細胞培養中に添加した、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｐｒｏの４配列のジペプチドを主要成分として含むコラーゲンペプチドがＩ型コラーゲンの産生を増加させることが知られている（非特許文献５）。
また、これらのジペプチドが環状構造を形成したシクロジペプチドにさまざまな生理作用が見出されている。例えば抗癌・癌予防（特許文献１）、学習意欲の改善（特許文献２）、尿酸低下作用（特許文献３、４）、糖代謝改善作用（特許文献５）、ＧＬＰ−１低下作用（特許文献６）、皮膚保湿機能改善作用（特許文献７）、カロリー低減作用（特許文献８）、ＧＬＰ−２分泌促進作用（特許文献９）、レニン−アンジオテンシン系抑制作用（特許文献１０）等がある。
On the other hand, it is known that ingestion of collagen peptides hydrolyzed to collagen to the size of dipeptides restores skin tension and gloss and suppresses aging. And, a collagen peptide containing 4 sequence dipeptides of Gly-Pro, Pro-Gly, Pro-Hyp, and Hyp-Pro added as a main component to human fibroblast culture may increase type I collagen production. It is known (Non-Patent Document 5).
In addition, various physiological actions have been found in cyclodipeptides in which these dipeptides form a cyclic structure. For example, anticancer / cancer prevention (Patent Document 1), improvement of learning motivation (Patent Document 2), uric acid lowering action (Patent Documents 3 and 4), sugar metabolism improving action (Patent Document 5), GLP-1 lowering action (Patent Document 6), skin moisturizing function improving action (Patent Document 7), calorie reducing action (Patent Document 8), GLP-2 secretion promoting action (Patent Document 9), renin-angiotensin system inhibitory action (Patent Document 10), etc. .
本発明者らは、コラーゲン由来のジペプチドの研究を行う過程で、ジペプチドであるグリシルプロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）がジケトピペラジン構造をとって環状結合したシクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）は、ジペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏを超える強いＩ型コラーゲンとＶ型コラーゲンの両方のコラーゲン産生を促進することを見出し、本発明をなしたものである。
すなわち、本発明は、シクログリシルプロリンを有効成分とするＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用の組成物の提供を課題とする。
In the process of studying collagen-derived dipeptides, the present inventors have obtained cycloglycylproline (Cyclo Gly-Pro) in which dipeptide glycylproline (Gly-Pro) has a diketopiperazine structure and is cyclically linked. The present invention has been found by promoting the production of both strong type I collagen and type V collagen exceeding dipeptide Gly-Pro.
That is, an object of the present invention is to provide a composition for promoting production of type I and type V collagen containing cycloglycylproline as an active ingredient.
（１）シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物。
（２）シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）として０．０００１〜１０質量％ を含有する（１）に記載のＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物。
（３）（１）又は（２）に記載のＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物を含む皮膚老化防止剤。
（４）皮膚外用剤である（３）に記載の皮膚老化防止剤。
（５）化粧料である（３）に記載の皮膚老化防止剤。
(1) A composition for promoting production of type I and type V collagen containing cycloglycylproline (Cyclo Gly-Pro) as an active ingredient.
(2) The composition for promoting production of type I and type V collagen according to (1), which contains 0.0001 to 10% by mass as cycloglycylproline (Cyclo Gly-Pro).
(3) A skin aging inhibitor comprising the composition for promoting production of type I and type V collagen according to (1) or (2).
(4) The skin antiaging agent according to (3), which is an external preparation for skin.
(5) The skin antiaging agent according to (3), which is a cosmetic.
本発明により、シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物を開発した。本組成物は、皮膚外用剤として提供される。
またシクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）は皮膚老化防止剤、外用剤として効果がある。
According to the present invention, a composition for promoting production of type I and type V collagen containing cycloglycylproline (Cyclo Gly-Pro) as an active ingredient has been developed. This composition is provided as a skin external preparation.
Cycloglycylproline (Cyclo Gly-Pro) is effective as a skin antiaging agent and an external preparation.
本発明は、シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、以下「ｃＧＰ」）を有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物、皮膚老化防止剤、皮膚外用剤、化粧料である。
本発明でいう皮膚老化防止とは、老化に伴って減少する皮膚細胞のコラーゲン産生を活性化させて、皮膚の弾力性を維持するためのＩ型コラーゲン及びコラーゲン線維束の形成に重要なＶ型コラーゲンの産生を促進させてコラーゲン線維をより強固にすることをいう。
本発明の有効成分であるｃＧＰは、アミノ酸であるグリシンとプロリンがペプチド結合したジペプチドがさらにジケトピペラジン構造をとって環状結合した化合物である。
ｃＧＰは、次の一般式（１）で表すことができる。
The present invention relates to a composition for promoting production of type I and type V collagen containing cycloglycylproline (Cyclo Gly-Pro, hereinafter referred to as “cGP”) as an active ingredient, an anti-skin aging agent, an external preparation for skin, and a cosmetic. is there.
Skin aging prevention as used in the present invention refers to activation of collagen production in skin cells that decreases with aging, and type V collagen that is important for the formation of type I collagen and collagen fiber bundles to maintain skin elasticity. It means that collagen fibers are strengthened by promoting collagen production.
CGP, which is an active ingredient of the present invention, is a compound in which a dipeptide in which amino acids glycine and proline are peptide-bonded further has a diketopiperazine structure and is cyclically bonded.
cGP can be represented by the following general formula (1).
ｃＧＰは、アミド結合を介して二個のアミノ酸であるグリシンとプロリンの末端部分が結合している構造を有している。このため、分子末端部分に極性基であるカルボキシル基やアミノ基が露出している直鎖状ジペプチドと比較して脂溶性が高いという特徴を有する。そのため、特に皮膚外用剤として使用する場合には、直鎖状ジペプチドと比較してより高い皮膚透過性が期待できる。 cGP has a structure in which the terminal portions of two amino acids, glycine and proline, are bonded via an amide bond. For this reason, it has the characteristic that it is fat-soluble compared with the linear dipeptide which the carboxyl group and amino group which are polar groups are exposed to the molecule terminal part. Therefore, when used as an external preparation for skin, higher skin permeability can be expected as compared with linear dipeptides.
本発明で用いるｃＧＰは、公知の方法に従って調製することができる。例えば、化学合成方法や酵素法、微生物発酵法により製造することができる。化学合成法としては、特開２００３−２５２８９６号公報に記載の方法で、直鎖状ペプチドであるグリシルプロリンを脱水及び環化させることにより合成することができる。
或いは、コラーゲンの酵素処理や熱処理によって得られるコラーゲンペプチドを、さらに加熱処理してシクログリシルプロリンを含有する処理物を製造することができる。コラーゲン又はコラーゲンペプチドを含有する溶液を熱処理して得られる処理物とは、具体的には、例えば、コラーゲンペプチドを水に２０〜５００μｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、好ましくは８０〜１００℃の温度条件で、５分〜１２０時間、好ましくは３〜１０時間加熱して調製することができる。得られた処理物に対して、所望により、ろ過、遠心分離、濃縮、限外ろ過、凍結乾燥、粉末化等の処理を行ってもよい。
The cGP used in the present invention can be prepared according to a known method. For example, it can be produced by a chemical synthesis method, an enzymatic method, or a microbial fermentation method. As a chemical synthesis method, it can be synthesized by dehydration and cyclization of glycylproline, which is a linear peptide, by the method described in JP-A-2003-252896.
Alternatively, a collagen peptide obtained by enzymatic treatment or heat treatment of collagen can be further heat-treated to produce a treated product containing cycloglycylproline. Specifically, the processed product obtained by heat-treating a solution containing collagen or collagen peptide is, for example, a collagen peptide dissolved in water at a concentration of 20 to 500 μg / mL, preferably at a temperature of 80 to 100 ° C. Under conditions, it can be prepared by heating for 5 minutes to 120 hours, preferably 3 to 10 hours. If necessary, the obtained treated product may be subjected to treatment such as filtration, centrifugation, concentration, ultrafiltration, lyophilization, and powdering.
例えば、特許第５４５６８７６号公報に記載の方法に従って、コラーゲン分解物である直鎖トリペプチドを２５％以上含有する粉末を水に溶解し、これを９５℃で１８時間インキュベートしてコラーゲントリペプチドを環状化・脱離反応によってｃＧＰを生成させて、本発明に使用可能なシクログリシルプロリンを含む処理物を得ることができる。かくして得られる処理物を本発明の有効成分を含む組成物として用いることができる。 For example, according to the method described in Japanese Patent No. 545676, a powder containing 25% or more of a linear tripeptide which is a collagen degradation product is dissolved in water, and this is incubated at 95 ° C. for 18 hours to circulate the collagen tripeptide. A treated product containing cycloglycylproline that can be used in the present invention can be obtained by generating cGP by the conversion / elimination reaction. The treated product thus obtained can be used as a composition containing the active ingredient of the present invention.
以上のようにして得られたｃＧＰは、Ｉ型及びＶ型コラーゲンの産生促進作用を有し、さらに皮膚の老化を防止する。 The cGP obtained as described above has an action of promoting production of type I and type V collagen and further prevents skin aging.
また本発明において使用するｃＧＰは、化学的に合成された化合物であっても使用可能である。また市販されているシクログリシルプロリンを一定量以上含有する組成物を購入して使用することもできる。本発明において使用可能な市販されているｃＧＰとしては、ｃＧＰを１０質量％以上含有するｃＧＰ１０（ゼライス株式会社）を例示することができる。
なおｃＧＰの含有量の分析は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行うことができる。
ＨＰＬＣの分析条件の一例を以下に示す。
The cGP used in the present invention can be a chemically synthesized compound. A commercially available composition containing a certain amount or more of cycloglycylproline can also be purchased and used. Examples of the commercially available cGP that can be used in the present invention include cGP10 (Zerais Co., Ltd.) containing 10% by mass or more of cGP.
The analysis of the cGP content can be performed using high performance liquid chromatography (HPLC).
An example of HPLC analysis conditions is shown below.
逆相クロマトグラフィーの分析条件
Ｃｏｌｕｍ：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
Ｅｌｕｅｎｔ：Ａ）Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ（１００／０．１）、Ｂ）Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ（５０／５０／０．１）
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：４０℃
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：０−１５ｍｉｎｓ ０％ Ｂ、１５ ｔｏ ３０ ｍｉｎｓ ９０％ Ｂ、３０ ｔｏ ３３ ｍｉｎｓ １００％ Ｂ、３３ ｔｏ ３５ ｍｉｎｓ ０％ Ｂ、３５ ｔｏ ５０ ｍｉｎｓ ０％ Ｂ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ ａｔ ２１４ｎｍ
Analytical conditions for reverse phase chromatography Column: TSKgel ODS-80Ts (4.6 mm × 150 mm)
Eluent: A) H2O / TFA (100 / 0.1), B) Acetonitrile / H2O / TFA (50/50 / 0.1)
Temperature: 40 ° C
Flow rate: 1 mL / min
Gradient Conditions: 0-15mins 0% B, 15 to 30 mins 90% B, 30 to 33 mins 100% B, 33 to 35 mins 0% B, 35 to 50 mins 0% B
Detection: UV at 214nm
サイズ排除クロマトグラフィーの分析条件
Ｃｏｌｕｍ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ（１０ｍｍ×３００ｍｍ）
Ｅｌｕｅｎｔ：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：３０℃
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ ａｔ ２１４ｎｍ
シクログリシルプロリンの含有量は、クロマトグラムの全面積あたりの面積比から算出できる。
Analysis conditions for size exclusion chromatography Column: Superdex peptide (10 mm x 300 mm)
Eluent: 100 mM Tris / HCl (pH 7.4)
Temperature: 30 ° C
Flow rate: 1 mL / min
Detection: UV at 214nm
The content of cycloglycylproline can be calculated from the area ratio per total area of the chromatogram.
本発明のＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物又は皮膚老化防止剤におけるｃＧＰの含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、決定されるが、特に限定されるものではないが、Ｉ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物として好ましくは０．０００１〜１０質量％、特に好ましくは０．００１〜１質量％である。 The content of cGP in the composition for promoting production of type I and type V collagen or the anti-skin aging agent of the present invention is determined in consideration of its administration form, administration method, etc., but is not particularly limited. However, the composition for promoting production of type I and type V collagen is preferably 0.0001 to 10% by mass, particularly preferably 0.001 to 1% by mass.
ｃＧＰを有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物は、医薬品・医薬部外品、化粧料として使用可能である。
なお製剤化に当たっては、賦形剤やその他の有効成分を本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グアーガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシルメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸などの脂溶性又は水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、賦形剤、保存料・酸化防止剤、風味調整剤や香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウムなどの呈味料、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、アスパルテームなどの低カロリー甘味料、着色剤などである。
Compositions for promoting production of type I and type V collagen containing cGP as an active ingredient can be used as pharmaceuticals, quasi drugs, and cosmetics.
In the preparation, excipients and other active ingredients can be used as long as the purpose of the composition of the present invention is not impaired. Specifically, cyclodextrin, hemicellulose, lignin, guar gum, konjac mannan, isagor, alginic acid, agar, carrageenan, chitin, carboxymethylcellulose, polydextrose and other dietary fibers and thickeners, edible oil, calcium, iron, Minerals such as sodium, zinc, copper, potassium, phosphorus, magnesium, iodine, manganese, selenium; fat-soluble or water-soluble such as vitamin A, vitamin C, vitamin D, vitamin E, vitamin K, niacin, folic acid, pantothenic acid Emulsifiers and dispersants such as vitamins, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, phospholipid, gum arabic, xanthan gum, tragacanth gum, locust bean gum, Quantities, excipients, preservatives / antioxidants, flavor modifiers and flavors, flavoring agents such as sodium chloride, sodium glutamate, glycine, succinic acid, sodium lactate, citric acid, sodium citrate, acetic acid, adipic acid Acidulants such as fumaric acid and malic acid, low calorie sweeteners such as maltitol and aspartame, and coloring agents.
本発明の組成物は、試験例に示すとおり、線維芽細胞に直接作用して、線維芽細胞においてＩ型及びＶ型コラーゲン産生促進作用を発揮する。したがって化粧品のような、外用剤として使用することが作用機構上好ましい。
化粧料は、上記のとおりＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進作用を発揮できる組成であれば、配合成分には特に大きな制限はない。また形態も、液状、クリーム状、ゲル状など様々な形態であっても問題はない。また水中油型或いは油中水型のいずれの乳化組成物であっても良い。
As shown in the test examples, the composition of the present invention acts directly on fibroblasts and exhibits type I and type V collagen production promoting effects in fibroblasts. Therefore, it is preferable in terms of action mechanism to be used as an external preparation such as cosmetics.
As long as the cosmetic is a composition capable of exhibiting the action of promoting production of type I and type V collagen as described above, there are no particular limitations on the ingredients. Moreover, there is no problem even if the form is various forms such as liquid, cream or gel. Moreover, any emulsified composition of an oil-in-water type or a water-in-oil type may be sufficient.
ｃＧＰを有効成分として含有する皮膚老化防止剤は、医薬品・医薬部外品、化粧料として使用可能である。
なお製剤化に当たっては、Ｉ型及びＶ型コラーゲン産生促進用の組成物と同様に、賦形剤やその他の有効成分を本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グアーガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシルメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸などの脂溶性又は水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、賦形剤、保存料・酸化防止剤、香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、着色剤などである。
Skin anti-aging agents containing cGP as an active ingredient can be used as pharmaceuticals, quasi drugs, and cosmetics.
In the preparation, excipients and other active ingredients can be used as long as they do not impair the purpose of the composition of the present invention, like the compositions for promoting production of type I and type V collagen. Specifically, cyclodextrin, hemicellulose, lignin, guar gum, konjac mannan, isagor, alginic acid, agar, carrageenan, chitin, carboxymethylcellulose, polydextrose and other dietary fibers and thickeners, edible oil, calcium, iron, Minerals such as sodium, zinc, copper, potassium, phosphorus, magnesium, iodine, manganese, selenium; fat-soluble or water-soluble such as vitamin A, vitamin C, vitamin D, vitamin E, vitamin K, niacin, folic acid, pantothenic acid Emulsifiers and dispersants such as vitamins, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, phospholipid, gum arabic, xanthan gum, tragacanth gum, locust bean gum, Quantities, excipients, preservatives / antioxidants, flavorings, sodium chloride, sodium glutamate, glycine, succinic acid, sodium lactate, citric acid, sodium citrate, acetic acid, adipic acid, fumaric acid, malic acid, etc. Materials, maltitol, colorants and the like.
本発明の皮膚老化防止剤は、Ｉ型及びＶ型コラーゲン産生促進作用によってコラーゲン線維束を形成させ、加齢や光老化によって低下した皮膚の柔軟性を回復させ、或いは加齢や光による皮膚老化の進行を防止する。したがって化粧品のような、外用剤として使用することが作用機構上好ましい。 The skin aging inhibitor of the present invention forms collagen fiber bundles by promoting the production of type I and type V collagen, restores the flexibility of the skin that has been lowered by aging and photoaging, or skin aging by aging and light. Prevent progress. Therefore, it is preferable in terms of action mechanism to be used as an external preparation such as cosmetics.
以下に試験例を示し、本発明をさらに説明する。
＜試験例１：Ｉ型、Ｖ型コラーゲン産生促進試験＞
１．試験用細胞の播種と試験用サンプルの添加
正常ヒト線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＮＨＤＦ）をＤ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養し、１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように播種した。
細胞がコンフルエントになったことを確認し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、ＦＢＳ ｆｒｅｅ Ｄ−ＭＥＭに試験サンプルとして、比較対照のジペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ：ＧＰ（富士フイルム和光純薬株式会社））、及びｃＧＰ（ＢＡＣＨＥＭ）を、それぞれ１ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、これを１ｍＬ添加した。
Test examples are shown below to further explain the present invention.
<Test Example 1: Type I and V type collagen production promotion test>
1. Seeding of test cells and addition of test sample Normal human fibroblasts (NHDF) were cultured in D-MEM medium at 37 ° C., 5% CO 2 , and 12 well plate. Was seeded at 2 × 10 5 cells / mL / well.
After confirming that the cells were confluent, the cells were washed with PBS (−), and FBS free D-MEM was used as a test sample as a comparative dipeptide (Gly-Pro: GP (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), And cGP (BACHEM) were each dissolved at a concentration of 1 mg / mL, and 1 mL thereof was added.
２．ＲＮＡの回収
試験用サンプル添加後３時間、又は６時間後に細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社）を５００μＬ／ｗｅｌｌ添加し溶解後、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。
2. Recovery of RNA 3 hours or 6 hours after addition of the test sample, the cells were washed with PBS (−), and RNAiso Plus (Takara Bio Inc.) was added at 500 μL / well for dissolution, and then total RNA was recovered.
３．Ｉ型及びＶ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量の測定
全ＲＮＡを回収後、「５ｘ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘＰｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ」（タカラバイオ株式会社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡ量５００ｎｇを逆転写反応させた後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを含んだＰＣＲ酵素「ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑII」（タカラバイオ株式会社）、Ｃｏｌ１ａ１・Ｃｏｌ５ａ１プライマー、Ｅａｓｙ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ（タカラバイオ株式会社）を用いて１０倍希釈したｃＤＮＡ、滅菌精製水を混合しｔｏｔａｌ ２０μＬに調整し、ＰＣＲ反応液を作成した。
作成したＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応装置Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈに入れ常法に従ってＰＣＲ増幅反応を行った。
3. Measurement of mRNA expression level of type I and type V collagens After collecting total RNA, a total RNA amount of 500 ng was reverse-transcribed using “5 × PrimeScript RT Master MixPerfect Real Time” (Takara Bio Inc.), and then SYBR Green PCR enzyme “SYBR Premix Ex TaqII” (Takara Bio Inc.), Col1a1 / Col5a1 primer, Easy Dilution (Takara Bio Inc.) diluted 10-fold with cDNA and sterilized purified water were mixed to prepare a total of 20 μL. A PCR reaction solution was prepared.
The prepared PCR reaction solution was placed in a PCR reactor Light Cycler 480 (Roch), and a PCR amplification reaction was performed according to a conventional method.
測定に用いたプライマー配列は次のとおりである。
col1a1 PCR Forward Primer:
GCTTGGTCCACTTGCTTGAAGA（配列番号１）
col1a1 PCR Reverse Primer:
GAGCATTGCCTTTGATTGCTG（配列番号２）
col5a1 PCR Forward Primer:
TCCCTGACAAGAAGTCCGAAGG（配列番号３）
col5a1 PCR Reverse Primer:
CGTCCACATAGGAGAGCAGTTTC（配列番号４）
The primer sequences used for the measurement are as follows.
col1a1 PCR Forward Primer:
GCTTGGTCCACTTGCTTGAAGA (SEQ ID NO: 1)
col1a1 PCR Reverse Primer:
GAGCATTGCCTTTGATTGCTG (SEQ ID NO: 2)
col5a1 PCR Forward Primer:
TCCCTGACAAGAAGTCCGAAGG (SEQ ID NO: 3)
col5a1 PCR Reverse Primer:
CGTCCACATAGGAGAGCAGTTTC (SEQ ID NO: 4)
４．結果
測定結果を図１及び図２に示す。
なお測定結果は、試験試料無添加（ｃｏｎｔｒｏｌ）ウエルの測定結果を１とした相対値で示した。Ｉ型コラーゲン（ｃｏｌ１ａ１）の発現量は、試験試料添加６時間後の結果を示した。また、Ｖ型コラーゲン（ｃｏｌ５ａ１）の発現量は、試験試料添加３時間後の結果を示した。
4). Results The measurement results are shown in FIGS.
In addition, the measurement result was shown by the relative value which set the measurement result of the test sample non-addition (control) well to 1. The expression level of type I collagen (col1a1) showed the result 6 hours after the addition of the test sample. The expression level of type V collagen (col5a1) showed the result 3 hours after addition of the test sample.
線維芽細胞にＧＰ（０．１％）、ｃＧＰ（０．１％）を添加したところＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）発現量は、コントロールに比べｃＧＰ（０．１％）添加によって約１．４倍増加した。またＶ型コラーゲン（Ｃｏｌ５ａ１）発現量もコントロールに比べ約１．４倍産生促進されていた。これらの結果から、ｃＧＰが強いＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進作用を有することが確認された。 When GP (0.1%) and cGP (0.1%) were added to fibroblasts, the expression level of type I collagen (Col1a1) was about 1.4 times higher when cGP (0.1%) was added than in the control. Increased. The expression level of type V collagen (Col5a1) was also promoted by about 1.4 times that of the control. From these results, it was confirmed that cGP has a strong type I and type V collagen production promoting action.
＜試験例２：若齢者及び高齢者の細胞におけるＶ型コラーゲン産生能測定＞
年代別（若齢：１０代と高齢：８０代）の線維芽細胞を用いてＶ型コラーゲンの発現量をリアルタイムＰＣＲにて確認した。
高齢では若齢よりＶ型コラーゲンの発現量が低い傾向であることがわかった（図３参照）。
このことから、老化に伴いＶ型コラーゲンが減少する為、Ｖ型コラーゲンの発現を高めることは皮膚老化防止に繋がると考えられる。
<Test Example 2: Measurement of V-type collagen production ability in young and elderly cells>
The expression level of type V collagen was confirmed by real-time PCR using fibroblasts classified by age (young: teens and old: 80s).
It was found that the expression level of type V collagen tends to be lower in younger age than in younger age (see FIG. 3).
From this, since V-type collagen decreases with aging, it is considered that increasing the expression of V-type collagen leads to prevention of skin aging.
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|---|---|---|---|---|
| WO2021156181A1 (en) * | 2020-02-03 | 2021-08-12 | Société des Produits Nestlé S.A. | Compositions and methods for the improvement and maintenance of glucose metabolism in childhood and adolescence |
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| KR100635618B1 (en) * | 2001-10-05 | 2006-10-17 | 주식회사 한진피앤씨 | Color individual packing sheet for disposable sanitary napkin |
| WO2016063901A1 (en) * | 2014-10-22 | 2016-04-28 | サントリーホールディングス株式会社 | Skin moisture-retention improving agent with cyclic dipeptide as active ingredient |
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2018
- 2018-05-28 JP JP2018101847A patent/JP2019206481A/en active Pending
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