JP2019194158A

JP2019194158A - 複合体

Info

Publication number: JP2019194158A
Application number: JP2016168604A
Authority: JP
Inventors: 聡野原; Satoshi Nohara; 嘉雄伊藤; Yoshio Ito
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2019-11-07
Also published as: WO2018043439A1

Abstract

【課題】造影剤として実用性の高い複合体を提供する。【解決手段】複合体は、デキストラン誘導体で被覆された酸化鉄からなるナノサイズの磁性粒子と、該磁性粒子と結合されたアネキシンＶとで構成され、ＭＲＩ造影剤として用いることができる。複合体は、全体径が２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にあり、０．４７テスラにおけるＴ２緩和度と０．４７テスラにおけるＴ１緩和度との比の値が、５未満である。また、複合体は、アネキシンＶが、磁性粒子の鉄１ｍｇに対して、１ｍｇ〜５ｍｇの範囲で結合している。【選択図】図１

Description

この発明は、造影剤として用いることができる複合体に関するものである。

腫瘍に対して化学療法や放射線療法を施術した後、その治療が効果的に行われているかを判定する必要がある。一般的に、コンピュータ断層診断(ＣＴ)、核磁気共鳴法(ＭＲＩ)、超音波等の画像診断法において、単純な撮像だけでは判別しづらいケースでは画像のコントラストを増加させるような造影剤を使用することがある。しかしながら、一般に市販されている造影剤の多くは、特定の臓器や器官、病変のみに特異的に作用する性質を持っておらず、前述した目的に対して使用することはできない。従って、前記目的を達成するために、治療された腫瘍、すなわち、アポトーシスを起こした腫瘍のみに選択的に作用する新しい造影剤の開発が望まれている。その１つの方法として、アポトーシス細胞に特異的に結合する物質を造影剤に結合することにより、アポトーシス細胞に選択的に造影剤を集積させることが考えられる。

アポトーシスを起こした細胞に特異的に結合する物質としては、アネキシンＶと呼ばれるタンパク質が最も良く知られており、多くの研究例や応用例が報告されている。アネキシンＶは、哺乳類全般に存在するカルシウムおよびリン脂質に結合するタンパク質ファミリーである約２０種類存在するアネキシンのうちの一つであるため、生体に対する毒性はない。また、アネキシンＶは、分子量が約３５,０００と小さく、安定性も良いことなどから総じて利便性がよい。例えば、研究レベルにおいては、アネキシンＶを各種の蛍光色素に結合したものが既に作成され、アポトーシスを起こした細胞を検出する研究用キットとして数多く市販され、細胞生物学の実験等において広く使用されている。

一方、臨床においては、既にいくつかの画像診断法において、造影剤にアネキシンＶを結合したものが試作され、実用化に向けて研究が進められている。その中でも、放射性同位体で標識したアネキシンＶが最も良く研究されており、例えばテクネチウム９９ｍで標識したアネキシンＶは、単一光子放射断層撮影(ＳＰＥＣＴ)法においてヒトを対象とした臨床試験が行われたが、未だ実用化には至っていない(例えば、非特許文献１参照)。ＭＲＩにおいては、ＭＲＩ造影剤として一般的に使用されているガドリニウムや酸化鉄粒子にアネキシンＶを結合させたものが試作され、いくつかの研究例が報告されているが、ヒトを対象とした臨床試験には進んでいない(例えば、特許文献１および非特許文献２参照)。

特開２００９−１４９６５３号公報

Belhocine et al., Clin. Cancer Res., 8, 2766, 2002 Magn. Reson. Med., 66(4), 2011

前述したアネキシンＶと磁性粒子とを結合した複合体は、分散安定性に乏しく、沈降し易いという欠点が指摘される。また、前記複合体は、細網内皮系(肝臓、脾臓による外的異物の排除機構)からの回避や目的部位への結合能の向上などが求められており、実用化に向けて様々な課題が存在している。

すなわち本発明は、従来の技術に係る前記問題に鑑み、これらを好適に解決するべく提案されたものであって、造影剤として実用性を有する複合体を提供することを目的とする。

前記課題を克服し、所期の目的を達成するため、本願の請求項１に係る発明の複合体は、
デキストラン誘導体で被覆された酸化鉄からなるナノサイズの磁性粒子と、該磁性粒子と結合されたアネキシンＶとで構成され、
複合体全体の直径が、２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にあることを要旨とする。
請求項１に係る発明によれば、複合体の分散安定性が良好であるので、保存安定性が高く、生体に投与する造影剤として実用性を有している。また、複合体を生体に投与した際に、アポトーシス部位があった際に当該部位に集積するので、ＭＲＩ等の画像診断法で鮮明に撮像することができる。

請求項２に係る発明では、前記磁性粒子は、０．４７テスラにおけるＴ２緩和度と０．４７テスラにおけるＴ１緩和度との比の値が、５未満であることを要旨とする。
請求項２に係る発明によれば、Ｔ１効果が高まることから、Ｔ１強調撮像法での使用が可能となる。

請求項３に係る発明では、前記アネキシンＶが、前記磁性粒子の鉄１ｍｇに対して、１ｍｇ〜５ｍｇの範囲で結合していることを要旨とする。
請求項３に係る発明によれば、磁性粒子１個あたりに適切な量のアネキシンＶが結合しているので、目的部位への高集積に有利となる。

請求項４に係る発明では、前記デキストラン誘導体は、カルボキシアルキルエーテル基とアミノアルキルエーテル基とを有していることを要旨とする。
請求項４に係る発明によれば、複合体の血中滞留性(異物排除回避性)が高まり、目的部位への高集積に有利となる。

本発明に係る複合体によれば、造影剤として実用性を有している。

本発明に係る複合体を示す模式図である。本発明に係る磁性粒子を示す模式図である。試験１の結果を示すグラフ図である。試験２における複合体番号１のＴ１強調画像を示し、複合体の投与前である。試験２における複合体番号１のＴ１強調画像を示し、複合体を投与してから２４時間後である。試験２における複合体番号１のＴ１強調画像を示し、複合体を投与してから４８時間後である。試験２における複合体番号２のＴ１強調画像を示し、複合体の投与前である。試験２における複合体番号２のＴ１強調画像を示し、複合体を投与してから２４時間後である。試験２における複合体番号２のＴ１強調画像を示し、複合体を投与してから４８時間後である。試験２における複合体番号３のＴ１強調画像を示し、複合体の投与前である。試験２における複合体番号３のＴ１強調画像を示し、複合体を投与してから２４時間後である。試験２における複合体番号３のＴ１強調画像を示し、複合体を投与してから４８時間後である。試験３における複合体番号１のＴ１強調画像を示し、複合体の投与前である。試験３における複合体番号１のＴ１強調画像を示し、複合体を投与してから４時間後である。

本発明に係る複合体は、コンピュータ断層診断(ＣＴ)、核磁気共鳴法(ＭＲＩ)、超音波等の画像診断法において、画像のコントラストを増加させる造影剤として好適に用いられるものである。図１に示すように、複合体は、デキストラン誘導体で被覆された酸化鉄からなる磁性粒子と、この磁性粒子に結合されたアネキシンＶとを含んでおり、全体の直径(以下、全体径という)がナノサイズに設定されている。本発明に係る複合体は、ナノサイズの磁性粒子とアネキシンＶとを反応させて得られ、単なる混合物ではなく、磁性粒子とアネキシンＶとの化合物である。

本発明に係る磁性粒子は、血中滞留時間が長い(代謝が緩やかである、高い血液クリアランス性)、高い保存安定性、低毒性であり、粒子表面にアネキシンＶを結合できるような官能基を有している。磁性粒子は、微粒子状の酸化鉄とデキストラン誘導体とを反応させて得られ、単なる混合物ではなく、酸化鉄とデキストラン誘導体との化合物である。例えば、本発明に係る磁性粒子は、酸化鉄微粒子とデキストラン誘導体を含む全体径および酸化鉄微粒子のみの直径の２通り観測されること、および精製工程により遊離のデキストラン誘導体を除去しても、本発明に係る磁性粒子にはデキストラン誘導体と酸化鉄が含まれることなどから判る。

前記磁性粒子を構成する酸化鉄は、毒性が低いことから本発明に係る複合体の成分として好適であり、例えば以下の式Ａのように表すことができる。
（ＦｅＯ）_ｎ・Ｆｅ₂Ｏ₃ …(式Ａ)
式Ａにおいて、ｎは０≦ｎ≦１の範囲内の実数である。
なお、前記式Ａにおいて、ｎ＝０の場合はγ−酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）であり、また、ｎ＝１の場合はマグネタイト（Ｆｅ₃Ｏ₄）である。なお、本発明における酸化鉄は、結晶水を有するものであってもよい。

前記酸化鉄は、粒径(酸化鉄の粒子の直径)が、１ｎｍ〜１０ｎｍ、好ましくは１ｎｍ〜７ｎｍ、更に好ましくは１ｎｍ〜５ｎｍの範囲にあるとよい。酸化鉄の粒径が１０ｎｍよりも大きいと得られる複合体の全体径が大きくなり、複合体の保存安定性や安全性が悪化すると共に、Ｔ２効果が強まって、Ｔ１強調撮像法での使用に不向きとなる。酸化鉄の粒径が１ｎｍよりも小さいものは、小径化の限界などにより実質的にできない。なお、磁性粒子の芯部分をなす酸化鉄の粒径は、透過型電子顕微鏡(ＴＥＭ)で測定したものである。

前記デキストラン誘導体は、中性多糖のグルコースポリマーであるデキストランにおける官能基の一部または全部を、アニオン性の官能基(以下、アニオン性基という)および／またはカチオン性の官能基(以下、カチオン性基という)で置換したものである。デキストランとしては、予め適当な還元法、例えば、ナトリウムアマルガムを用いる方法、パラジウムカーボンの存在下に水素ガスを用いる方法、水素化ホウ素ナトリウム(ＮａＢＨ₄)を用いる方法等によって還元することにより得られる還元デキストランも好適に用いることができる。

前記アニオン性基としては、カルボキシアルキルエーテル基、リン酸基、リン酸アルキルエーテル基、硫酸基および硫酸アルキルエーテル基が挙げられ、これらの中でもカルボキシルアルキルエーテル基が好ましい。なお、カルボキシアルキルエーテル基などのカルボキシ基は塩の形態であってもよい。また、前記カチオン性基としては、未置換もしくは置換アミノアルキルエーテル基、およびホスホニウム基が挙げられ、これらの中でもアミノアルキルエーテル基が好ましい。なお、アミノアルキルエーテル基などのアミノ基は塩の形態であってもよい。デキストラン誘導体は、アニオン性基とカチオン性基との両方を有しているものが望ましい。そして、デキストラン誘導体としては、カルボキシアルキルエーテル基と未置換もしくは置換アミノアルキルエーテル基の両置換基(ここで該カルボキシ基および／またはアミノ基は塩の形態であってもよい。)を有するもの(デキストランエーテル誘導体という)が特に好ましい。このように、カルボキシアルキルエーテル基とアミノアルキルエーテル基とを有しているデキストラン誘導体を用いることで、得られる複合体の血中滞留性(異物排除回避性)が高まり、目的部位への高集積に有利となる。

前記デキストランエーテル誘導体は、デキストランを既知の方法でカルボキシアルキルエーテル化、および未置換もしくは置換アミノアルキルエーテル化(以下、アミノアルキルエーテル化という)することにより製造することができる。カルボキシアルキルエーテル化およびアミノアルキルエーテル化の順序は特に制限されないが、両置換基の置換度の測定が容易であるという観点からすると、カルボキシアルキルエーテル化を先に行うことが好ましい。デキストランのカルボキシアルキルエーテル化は、それ自体既知の方法、例えば、米国特許第２，７４６，９０６号明細書、米国特許第２，８７６，１６５号明細書、工業化学会誌、６８、１５９０(１９６５年)等に記載の方法で実施可能である。例えば、デキストラン(下記の方法で予めアミノアルキルエーテル化されていてもよい)の水溶液または懸濁液にアルカリを添加した後、モノハロアルキルカルボン酸、特にモノクロロアルキルカルボン酸を加えて反応させることにより、容易にカルボキシアルキルエーテル化することができる。

前記デキストランのカルボキシアルキルエーテル化に使用し得るモノハロアルキルカルボン酸としては、特に、ハロ低級アルキルカルボン酸、例えば、モノクロロ酢酸、モノブロモ酢酸、３−クロロプロピオン酸、３−ブロモプロピオン酸、４−クロロ−ｎ−酪酸、４−ブロモ−ｎ−酪酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロ−ｎ−酪酸等が挙げられる。なお、本明細書において「低級」なる語は、この語が付された基または化合物の炭素数が６以下、好ましくは４以下であることを意味する。本発明において好適なデキストランのカルボキシアルキルエーテルには、カルボキシメチルエーテル、カルボキシエチルエーテル、カルボキシプロピルエーテル等が含まれる。デキストランカルボキシアルキルエーテルのカルボキシル基は塩の形態であってもよく、その塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アミン塩、アンモニウム塩等が挙げられ、好ましくはナトリウム塩である。

デキストランまたはカルボキシアルキルエーテル化されたデキストランのアミノアルキルエーテル化は、それ自体既知の方法、例えば、Chemistry and Industry，１９５９，(１１)，１４９０−１４９１、特公昭５９−３０１６１号公報等に記載の方法で実施可能である。例えば、デキストランまたはデキストランのカルボキシアルキルエーテルの水溶液あるいは懸濁液にアルカリを添加した後、未置換もしくは置換アミノアルキルハライド、当該アミノアルキルハライドに対応するエポキシド、未置換もしくは置換アンモニオアルキルハライド、当該アンモニオアルキルハライドに対応するエポキシドの何れかを加えて反応させることで、アミノアルキルエーテル化が可能である。

デキストラン(これは予めカルボキシアルキルエーテル化されていてもよい)のアミノアルキルエーテル化に使用し得る未置換もしくは置換アミノアルキルハライド、当該アミノアルキルハライドに対応するエポキシドとしては、例えば、化学式１のようなものが挙げられる。

化学式１において、Ａ_１はアルキレン基を表す。また、化学式１において、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立に水素原子または炭化水素基(例えば、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニルアルキル、アリール、アラルキル等)を表す。また、Ｒ_１およびＲ_２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって含窒素複素環(例えば、アジリジン、ピロリジン、ピロリン、ピロール、ピペリジン、モルホリン、インドール、インドリン、イソインドリン等)を形成していてもよい。化学式１において、Ｙはハロゲン原子または化学式２に示すエポキシ基を表す。

化学式１において、好ましくは、Ａ_１が低級アルキレン基を表わし、Ｒ_１およびＲ_２がそれぞれ独立に水素原子または低級アルキル基を表わすか、あるいはＲ_１とＲ_２がそれらが結合している窒素原子と一緒になって５もしくは６員の含窒素複素環(例えばピロリジン、ピロリン、ピペリジン、モルホリン等)を形成しているものが包含される。具体的には、例えば、アミノメチルクロライド、アミノメチルブロマイド、アミノエチルクロライド、アミノプロピルブロマイド、メチルアミノメチルクロライド、メチルアミノメチルブロマイド、エチルアミノエチルクロライド、エチルアミノエチルブロマイド、エチルアミノプロピルクロライド、プロピルアミノプロピルクロライド、ジメチルアミノメチルクロライド、ジメチルアミノエチルクロライド、ジエチルアミノメチルクロライド、ジエチルアミノエチルクロライド、ジエチルアミノエチルブロマイド、ジエチルアミノプロピルクロライド、ジプロピルアミノエチルブロマイド、ジプロピルアミノプロピルクロライド、１−ピロリジニルメチルクロライド、２−（１−ピロリジニル）エチルクロライド、３−（１−ピロリジニル）プロピルクロライド、１−ピペリジニルメチルクロライド、２−（１−ピペリジニル）エチルクロライド、３−（１−ピペリジニル）プロピルクロライド等並びにこれらの対応するエポキシドが挙げられる。

デキストラン(これは予めカルボキシアルキルエーテル化されていてもよい)のアミノアルキルエーテル化に使用し得る未置換もしくは置換アンモニオアルキルハライドもしくは対応するエポキシドとしては、例えば、化学式３が挙げられる。

化学式３において、Ａ_２はアルキレン基を表す。化学式３において、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５はそれぞれ独立に水素原子または炭化水素基(例えば、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニルアルキル、アリール、アラルキル等)を表す。あるいは、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５のうちの少なくとも２つが、それらが結合している窒素原子と一緒になって含窒素複素環(例えば、アジリジン、ピロリジン、ピロリン、ピロール、ピペリジン、モルホリン、ピリジン、インドール等)を形成していてもよい。Ｙは、ハロゲン原子または化学式２に示すエポキシ基を表す。また、Ｚ⁻はアニオンを表す。

化学式３において、好ましくは、Ａ_２が低級アルキレン基を表し、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５がそれぞれ独立に水素原子または低級アルキル基を表すか、あるいはＲ_３、Ｒ_４およびＲ_５のうちの少なくとも２つはそれらが結合している窒素原子と一緒になって５もしくは６員の含窒素複素環(例えば、ピロリジン、ピロリン、ピペリジン、モルホリン、ピリジン等)を形成しているものが包含される。具体的には、例えば（ただし、アニオン部分の表現は省略して記載する）、２−クロロエチルトリメチルアンモニウム、２−クロロエチルトリエチルアンモニウム、２−クロロエチルトリプロピルアンモニウム、２−クロロエチルトリｎ−ブチルアンモニウム、３−クロロプロピルトリメチルアンモニウム、３−クロロプロピルトリエチルアンモニウム、３−クロロプロピルトリプロピルアンモニウム、３−クロロプロピルトリｎ−ブチルアンモニウム、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリエチルアンモニウム、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリｎ−ブチルアンモニウム、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリｉｓｏ−ブチルアンモニウム、３−ブロモ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム、３−ブロモ−２−ヒドロキシプロピルトリエチルアンモニウム、３−ブロモ−２−ヒドロキシプロピルトリｎ−ブチルアンモニウム、３−ブロモ−２−ヒドロキシプロピルトリｉｓｏ−ブチルアンモニウム等並びにこれらの対応するエポキシドが挙げられる。

化学式１および化学式３のエーテル化剤の使用により、デキストランのヒドロキシ基が化学式４または化学式５で示されるアミノアルキルエーテル基に置換されたデキストランエーテル誘導体を得ることができる。

化学式４および化学式５において、Ａ_３およびＡ_４はそれぞれ場合によりヒドロキシ基で置換されていてもよいアルキレン基を表し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＺ⁻は、前述した定義の通りである。アミノアルキルエーテル基としては、特に、化学式６および化学式７で示されるものが好適である。

化学式６および化学式７において、Ａ_３１およびＡ_４１はそれぞれ場合によりヒドロキシ基で置換されていてもよい低級アルキレン基を表す。また、Ｒ_１１およびＲ_２１はそれぞれ独立に水素原子または低級アルキル基を表すか、あるいはＲ_１１とＲ_２１はそれらが結合している窒素原子と一緒になって５もしくは６員の含窒素複素環を形成していてもよい。Ｒ_３１、Ｒ_４１およびＲ_５１は、それぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を表すか、あるいはＲ_３１、Ｒ_４１およびＲ_５１のうちの少なくとも２つはそれらが結合している窒素原子と一緒になって５もしくは６員の含窒素複素環を形成していてもよい。Ｚ⁻はアニオンを表す。

本発明において特に好適なデキストランのアミノアルキルエーテルとしては、ジメチルアミノメチルエーテル、ジエチルアミノエチルエーテル、ジプロピルアミノプロピルエーテル、ジエチルアミノプロピルエーテル、２−（１−ピロリジニル）エチルエーテル、トリメチルアンモニオエチルエーテル、トリエチルアンモニオエチルエーテル、トリプロピルアンモニオエチルエーテル、トリメチルアンモニオプロピルエーテル、トリエチルアンモニオプロピルエーテル、トリメチルアンモニオ−２−ハイドロキシプロピルエーテル、トリエチルアンモニオ−２−ハイドロキシプロピルエーテル等が挙げられる。デキストランアミノアルキルエーテルの未置換もしくは置換アミノ基は塩の形で存在することができ、その塩の中には、酸付加塩のみならず、前記化学式５または化学式７で示されるようなアンモニウム塩をも包含される。酸付加塩としては、無機酸塩として、例えば、塩酸塩、フッ化水素酸塩、臭化水素酸塩および硝酸塩等、有機酸塩として、例えば、ギ酸塩および酢酸塩等が挙げられる。なお、前記化学式５または化学式７で示されるようなアンモニウム塩の形態のアミノアルキルエーテル基を含むデキストランエーテル誘導体は、エーテル化剤として化学式３の化合物を用いて製造することができ、あるいは化学式１の化合物でエーテル化した後、そのアミノアルキルエーテル基のアミノ基を、例えば、未置換もしくは置換アルキルハライドと反応させることによりアンモニウム塩の形に変えることによって製造することもできる。更に、カルボキシアルキルエーテル基とアミノアルキルエーテル基の両置換基を有するデキストランエーテル誘導体は、カルボキシル基とアミノ基とが分子内で塩を形成していてもよい。

本発明に用いるデキストラン誘導体は、水溶性であることが望ましく、その極限粘度［η］(lntrinsic viscosity)は一般に０．０２〜０．５ｄｌ／ｇ、好ましくは０．０４〜０．２ｄｌ／ｇ、更に好ましくは０．０６〜０．１ｄｌ／ｇの範囲にあるとよい。本明細書において、デキストランエーテル誘導体の極限粘度は、次のように測定したときの値である。日本薬局方(第１７改正、２０１６年）、一般試験法、第２．５３項粘度測定法に記載されている方法に従って、２５℃において測定する。その際に用いる溶媒は、塩の形態のデキストランエーテル誘導体の両置換基の対イオンと同じイオンからなる１Ｍ塩水溶液、通常は１Ｍ食塩水溶液である。所望の極限粘度をもつデキストランエーテル誘導体は、対応する極限粘度を持つデキストランを出発原料に用いるか、あるいは高粘度のデキストランエーテル誘導体を予め調製した後に低粘度化することにより得ることができる。

前記デキストラン誘導体は、アニオン性基およびカチオン性基の置換度(Degree of Substitution：DS)が、単糖あたり０．１〜０．５の範囲にあることが好ましく、当該範囲にあることで、両置換基に由来する好適な血中クリアランス性が得られる。デキストラン誘導体における両置換基の置換度が０．１より小さいと、両置換基による血液クリアランス性の向上効果が小さくなる。これに対して、デキストラン誘導体における両置換基の置換度が０．５より大きいと、疎水性の効果が高まり、水中での分散安定性が悪化するおそれがある。また、デキストラン誘導体の両置換基の置換度は、ほぼ同じ程度であることが好ましく、具体的には置換度の差、すなわち、(アミノアルキルエーテル基の置換度−カルボキシアルキルエーテル基の置換度)は、通常０．１未満、好ましくは０．０７未満、更に好ましくは０．０５未満であるのがよい。なお、本明細書において、置換度(DS)は単糖あたりの置換基の数を意味する。

本発明に係るデキストラン誘導体における両置換基の置換度は、例えば前記デキストランエーテル誘導体の場合、次のように測定することができる。デキストランエーテル誘導体のカルボキシアルキルエーテル基の置換度は、中間体であるアミノアルキルエーテル化する前のデキストランカルボキシアルキルエーテルを用いて測定することができる。すなわち、デキストランカルボキシアルキルエーテルの塩を水に溶解し、これを適当に希釈して測定試料液とする。試料液のカルボキシル基の対イオンである金属イオンの標準試料(濃度既知)について、日本薬局方(第１７改正、２０１６年)、一般試験法、第２．２３項原子吸光光度法に記載される方法により金属含量を測定し、デキストランカルボキシアルキルエーテルの置換度を計算する。デキストランエーテル誘導体のカルボキシアルキルエーテル基の置換度は、赤外線吸収法でも測定することができる。すなわち、カルボキシアルキルエーテル基の置換度を種々変えて作成したデキストランカルボキシアルキルエーテル試料について上記の原子吸光光度法で置換度を測定すると同時に、上記試料の赤外吸収スペクトルの１６００ｃｍ^-1付近のピークの吸光度を測定し、原子吸光光度法による置換度と赤外吸収スペクトルの１６００ｃｍ^-1付近のピークの吸光度との関係をプロットした標準曲線を作成しておき、置換度が未知のデキストランエーテル誘導体の赤外スペクトルの１６００ｃｍ^-1付近のピークの吸光度を読み取り、前記標準曲線に当てはめることにより、該未知試料の置換度を決定することができる。

アミノアルキルエーテル基の置換度の測定は、デキストランエーテル誘導体について、日本薬局方(第１７改正、２０１６年)、一般試験法、第１．０８項、窒素定量法に記載の方法に従って、その窒素含量を測定し、アミノアルキルエーテル基の置換度を計算する。

本発明に係る磁性粒子は、その粒子径がナノサイズにある。磁性粒子の粒子径は、１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲、好ましくは１０ｎｍ〜３０ｎｍの範囲にあるのが望ましく、この範囲にあることで、複合粒子を後述する全体径の範囲に収め易くなる。また、磁性粒子の粒子径が前記範囲にあることで、後述するＴ１緩和度およびＴ２緩和度を適切な範囲に調節することができると共に、生体に投与した際の安全性および代謝性や、複合体自体の物理的安定性を得ることができる。なお、磁性粒子の粒子径は、平均粒子径であり、動的光散乱法に従いレーザー光散乱測定装置によって測定した時の値である。

Ｔ１緩和度およびＴ２緩和度は、ＭＲＩに供した際の信号強度に関係することから特に重要な要素である。一般的に、酸化鉄粒子は、Ｔ１緩和度よりもＴ２緩和度が数倍〜１０倍ほど高いことから、Ｒ２／Ｒ１の値は５〜１０の範囲にあり、Ｔ２強調撮像法にて使用されている。本発明に係る磁性粒子は、Ｔ１緩和度(Ｒ１)が高く設定され、ＭＲＩにおけるＴ１強調撮像法において効果を発揮するようになっている。具体的には、磁性粒子は、Ｔ２緩和度(Ｒ２)／Ｔ１緩和度(Ｒ１)が５未満であり、より好ましくは３未満であることがよい。そして、Ｔ１緩和度およびＴ２緩和度が前記範囲にある磁性粒子を用いることで、当該磁性粒子から得られる複合体についても、Ｒ２／Ｒ１の値が前記範囲になる。このように、本発明に係る磁性粒子は、Ｒ２／Ｒ１の値が５未満であることで、得られる複合体について画像コントラストがより明瞭なＴ１強調撮像法に使用できる。なお、本明細書において、Ｔ１緩和度およびＴ２緩和度は全て０．４７テスラにおける値である。

前記Ｔ１緩和度およびＴ２緩和度は、次のように求められる。ある濃度に希釈した磁性粒子について、ＮＭＲにてＴ１緩和時間およびＴ２緩和時間を測定する。得られたＴ１緩和時間およびＴ２緩和時間と濃度を以下の式１にあてはめた際に、定数となるＲ１のことをＴ１緩和度と呼び、Ｒ２のことをＴ２緩和度と呼ぶ。一般的に磁性の強いものほどＴ２緩和時間が短くなることから、Ｔ２緩和度が高い値となる。
１／Ｔｘ−１／Ｔｘｃ＝Ｒｘ×Ｃ … 式１
Ｔｘ：磁性粒子のＴ１緩和時間またはＴ２緩和時間(秒)
Ｔｘｃ：磁性粒子が分散している溶媒のＴ１緩和時間またはＴ２緩和時間（秒）
Ｃ：磁性粒子の濃度（mmol/L）
Ｒｘ：Ｔ１緩和度（mM^-1・s^-1）またはＴ２緩和度
式１においてｘは、Ｔ１緩和の場合「１」であり、Ｔ２緩和の場合「２」である。なお、測定するＮＭＲ機器の磁場強度によってＴ１緩和度およびＴ２緩和度の値が異なるので、本発明でのＴ１緩和度およびＴ２緩和度の値は全て０．４７テスラで測定した場合の値である。

本発明に係る磁性粒子において、デキストラン誘導体と酸化鉄との比率は、酸化鉄粒子の粒径およびデキストラン誘導体の分子量に依存し、広い範囲内で変えることができる。本発明に係る磁性粒子は、デキストラン誘導体を酸化鉄中の金属１重量部当たり０．２〜１０重量部、好ましくは０．５〜５重量部、更に好ましくは１〜３重量部含有させるのがよい。なお、磁性粒子中の金属含量(当該金属は磁性粒子に含まれる酸化鉄に由来する)は、原子吸光光度法で測定したときの値である。磁性粒子に少量の水の存在下に塩酸を添加し、含まれる金属を完全に塩化物まで分解した後、適当に希釈し、各金属の基準液と比較して金属含量を決定している。また、磁性粒子中のデキストラン誘導体の含量は、Analytical Chem．，２５，１６５６(１９５３)に準拠し、硫酸−アントロン法で測定したときの値である。すなわち、磁性粒子のゾルを適当に希釈した液に硫酸−アントロン試液を加えて発色させ、吸光度を測定する。同時に磁性粒子体の製造に用いたデキストラン誘導体を基準物質として、同様に発色させ、吸光度を測定し、両者の吸光度の比率から磁性粒子中のデキストラン誘導体の含量を求めている。

本発明に係る磁性粒子は、例えば次の２つの方法により製造することができる。第１の製造方法は、あらかじめ磁性粒子の芯部分になる酸化鉄を含む水性ゾルを調製し、デキストラン誘導体と反応させる方法である。第２の製造方法は、水系でデキストラン誘導体の存在下に２価の金属塩と３価の金属塩と塩基を撹拌下に混合及び反応させる方法である。

第１の製造方法においては、まず、酸化鉄を含む水性ゾル(以下、原料ゾルという)を調製し、これをデキストラン誘導体と反応させて磁性粒子を生成する。原料ゾル中の酸化鉄の粒径および磁性は得られる磁性粒子に含まれる酸化鉄とほとんど同じである。従って、目的に応じた物性を有する酸化鉄を含む原料ゾルをあらかじめ調製することが望ましい。酸化鉄を含む原料ゾルの調製は、例えば、アルカリ共沈法により行うことができる。具体的には、例えば、第１鉄鉱酸塩と第２鉄鉱酸塩をモル比で１：３〜２：１で含む水溶液とＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ₄ＯＨ等の塩基とをｐＨ７〜１２になるように混合する。混合物を、必要なら加熱熟成し、次いで生成する酸化鉄の粒子を分離、水洗する。その後に、水に再分散し、塩酸等の鉱酸を液のｐＨが１〜３となるまで加えることにより、酸化鉄を含む水性ゾルを得ることができる。この水性ゾルは必要に応じて、透析、限外濾過、遠心分離等により精製および／または濃縮してもよい。前記原料ゾルは、特公昭４２−２４６６３号公報に開示されている方法によっても調製することができる。例えば、強塩基性イオン交換樹脂スラリーに撹拌下に、第１鉄塩と第２鉄塩を１：２のモル比で含む水溶液を、液のｐＨを８〜９に保ちながら添加する。その後に、塩酸等の鉱酸をｐＨ１〜３になるまで加え、次いで樹脂を濾別し、必要により透析、限外濾過等により精製および／または濃縮すれば、磁性酸化鉄の水性ゾルが得られる。

原料ゾルとデキストラン誘導体の水溶液とを混合反応させることにより磁性粒子を生成することができる。具体的には、例えば、原料ゾルに含まれる酸化鉄１重量部(金属換算で)に対し、デキストラン誘導体を、１〜１０重量部、好ましくは３〜５重量部の割合で反応させる。反応液中の酸化鉄の濃度は、特に制限されるものではないが、通常、金属換算で０．１〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは１〜５ｗ／ｖ％の範囲内とするのがよい。反応は一般に室温〜１２０℃の範囲内において１０分〜１０時間行うことができるが、便宜的には１時間程度還流加熱すれば十分である。冷却後、必要に応じて精製および／または濃度調整を行ってもよい。例えば、得られる反応液にメタノール、エタノール、アセトン、エチルエーテル等の磁性粒子に対する貧溶媒を添加し、該磁性粒子を優先的に沈澱析出させ、析出物を分離し、次いで析出物を水に再溶解し、流水透析し、必要に応じて減圧濃縮し、所望の純度及び濃度を有する磁性粒子の水性ゾルを得ることができ、また、限外濾過により生成する磁性粒子から未反応デキストラン誘導体および低分子化合物を分離する操作を繰り返し、所望の純度及び濃度を有する磁性粒子の水性ゾルを得ることができる。この際、所望により、前記工程の途中および／または最後に、ｐＨ調整、遠心分離および／または濾過の工程を入れることもできる。こうして得られる磁性粒子の水性ゾルを既知の方法で乾燥し、好ましくは凍結乾燥することにより、磁性粒子を粉末として取得することもできる。

第２の製造方法は、水系でデキストラン誘導体の存在下に、２価の金属鉱酸塩及び３価の金属鉱酸塩の混合金属塩溶液と塩基溶液とを混合反応させ、１工程で磁性粒子を得る方法である。第２の製造方法は更に添加順序により、(Ａ)デキストラン誘導体の水溶液に混合金属塩水溶液を添加し、次いで塩基水溶液を添加して反応させる方法、(Ｂ)デキストラン誘導体の水溶液に塩基水溶液を添加し、次いで混合金属塩水溶液を添加して反応させる方法、(Ｃ)塩基水溶液にデキストラン誘導体の水溶液と混合金属塩水溶液を添加して反応させる方法、(Ｄ)混合金属塩水溶液に塩基水溶液とデキストラン誘導体の水溶液の混液を添加して反応させる方法などに分類される。(Ａ)〜(Ｄ)は、添加順序が相違するのみで、他の条件は本質的には変わらないが、少なくとも得られる磁性粒子の物性を幅広く変えられる点で(Ａ)が好ましい。

前記混合金属塩水溶液の調製には、例えば、２価の金属塩が第１鉄でありかつ３価の金属塩が第２鉄の場合には、第１鉄塩と第２鉄塩とのモル比を１：４〜３：１、好ましくは１：３〜１：１の割合で水性媒体中に溶解する。混合金属塩水溶液の濃度は特に制限されないが、通常、０．１〜３Ｍ、好ましくは０．５〜２Ｍの範囲が適当である。金属塩としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸等の鉱酸から選ばれる１種、通常塩酸との塩を挙げることができる。また、塩基としては、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等のアルカリ金属水酸化物や、アンモニアや、トリメチルアミン、トリエチルアミン等のアミン類等から選ばれる少なくとも１種、通常、ＮａＯＨを使用することができる。塩基水溶液の濃度も広範囲にわたり変えることができるが、通常、０．１〜１０Ｎ、好ましくは１〜５Ｎの範囲内が適当である。使用する塩基の量は添加終了後の反応液のｐＨがほぼ中性ないしｐＨ１２になる量、すなわち金属塩と塩基との比が１：１〜１：１．４（規定比）となるような量である。

デキストラン誘導体の量は、用いる金属塩中の金属の重量を基準にして１〜１５倍、好ましくは３〜１０倍とすることができる。また、デキストラン誘導体水溶液の濃度も厳密に制限されるものではないが、通常、１〜３０ｗ／ｖ％、好ましくは５〜２０ｗ／ｖ％の範囲内が好適である。各水溶液の添加及び混合は、撹拌下に０〜１００℃、好ましくは２０〜８０℃の非加熱又は加熱下に行うことができる。そして、必要ならば、塩基または酸を添加してｐＨを調整した後、５０〜１２０℃の温度で１０分〜５時間、通常１〜２時間加熱還流することにより反応させることができる。前述した混合および反応は、空気雰囲気下で行うことができるが、所望によりＮ₂およびＡｒガス等の不活性ガス、Ｈ₂ガス等の還元性ガス、またはＯ₂ガス等の酸化性ガスのもとで行ってもよい。こうして得られる反応液は前記第１の製造方法におけると同様に精製し、所望ならば、ｐＨ調整、濃縮、濾過、更には乾燥することができる。

前記第１の製造方法と第２の製造方法を比較すると、少なくとも工程の長さ及び多様な物性を有する磁性粒子を製造できる点で第２の製造方法が好ましい。また、第１の製造方法と第２の製造方法とを組み合わせてもよい。すなわち、予め調製された既知のデキストランもしくはデキストラン誘導体と酸化鉄とのゾルまたはデキストランで被覆した酸化鉄のゾルにデキストラン誘導体を添加し、所望により第１の製造方法におけると同様に加熱反応、精製、ｐＨ調整、濃縮、濾過、更には乾燥して、磁性粒子を製造することができる。この場合、デキストランで被覆した酸化鉄のゾルを既知の精製方法、例えば貧溶媒による再沈殿、ゲル濾過及び限外濾過等により、不純物、遊離のデキストランもしくはデキストラン誘導体を減らしたものを用いることができ、かつそれが好ましい。

本発明に係る複合体の成分であるアネキシンＶは、哺乳類全般に存在するカルシウムおよびリン脂質に結合するタンパク質であって、アポトーシスを起こした細胞に特異的に結合する。アネキシンＶとしては、比較的簡便かつ大量に調製できるため広く行われている遺伝子組換えにより発現させる方法により得られたものを用いることができ、その他の調整法によって得られるものも用いることができる。また、アネキシンＶは、一般にタンパク質調製の際には精製を行い易くする目的から、タンパク質末端にHis-Tag等のラベル化を行うことがあるが、アネキシンＶの末端にそのようなラベルがあっても構わない。

本発明に係る複合体は、磁性粒子上に存在するカルボキシル基とアネキシンＶ中に存在するアミノ基によるアミド結合によって、磁性粒子とアネキシンＶとを結合させることで得るのが、最も単純である。磁性粒子とアネキシンＶとの結合は、前記アミド結合に限らず、リンカー等を介して間接的に結合させてもよい。具体的には、磁性粒子上に存在するカルボキシル基を各種の縮合剤とＮ-ヒドロキシコハク酸イミドなどを反応させて活性エステル化した後にアネキシンＶを加えることで、比較的温和な条件下でアミド結合を形成させることができる。また、リンカーを使用する場合は、例えば両端にアミノ基を有する二官能性リンカー等を用いることで、上記と同様なアミド結合反応により、第一に磁性粒子とリンカーを結合、第二にリンカーとアネキシンＶを結合するといった、２段階的な結合を行うこともできる。

本発明に係る複合体において、アネキシンＶの結合量は、磁性粒子の鉄１ｍｇ当たり、１ｍｇ〜５ｍｇの範囲が好ましく、１ｍｇ〜３ｍｇの範囲であることがより好ましい。磁性粒子の好適な粒子サイズが前述した範囲にあることから、磁性粒子と結合できるアネキシンＶの量には限度があり、また、目的部位との相互作用の観点から前述した結合量に調節することが望ましい。複合体は、磁性粒子１個あたりに適切な量のアネキシンＶが結合しているので、アポトーシスを起こした細胞など、目的部位への高集積に有利となる。なお、アネキシンＶの結合量は全ての磁性粒子に対して均一とは限らず、あくまで平均量を意味する。また、複合体におけるアネキシンＶの重量は、一般的なタンパク質定量法、例えばＢＣＡ法等で測定することができる。

本発明に係る複合体の全体径は、磁性粒子の粒子径(直径)とアネキシンＶのサイズ(５ｎｍ)との和となるので、具体的には磁性粒子の平均粒子径プラス１０ｎｍ程度の大きさとなる。そして、複合体は、その全体径が、２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲、より好ましくは２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲にあることがよく、当該範囲にあることで、後述するＴ１緩和度およびＴ２緩和度を適切な範囲に調節することができると共に、生体に投与した際の安全性および代謝性や、複合体自体の物理的安定性を得ることができる。複合体の全体径を２０ｎｍより小さくすることは、磁性粒子の小径化の限界などにより実質的にできない。なお、複合体の全体径は、平均粒子径であり、動的光散乱法に従いレーザー光散乱測定装置によって測定した時の値である。

本発明に係る複合体において、該複合体自体が有する磁気的性質は磁性粒子に起因するものであり、アネキシンＶが結合することにより磁性粒子が元々有している磁気的性質が特に影響を受けることはない。複合体は、４℃で調節された暗所で保存した場合、少なくとも５ヶ月間はアネキシンＶの活性は損なわれず、また、複合体の分散安定性も保持される。複合体には、更に分散安定性を向上させるために分散安定化剤やタンパク質安定化剤等を添加してもよい。本発明に係る複合体を生体に静脈投与すると、徐々に肝臓等で代謝されて行くものの、少なくとも数時間の間はその半量以上が血管内を循環する。この血管内循環の間にアポトーシス細胞への集積が起こり、集積した部分をＭＲＩで描出することができる。また、本発明に係る複合体を５００μmol-Fe/kgのような高用量で生体に投与した場合であっても、生体にとって毒性は認められない。

特許文献１に示すような１００ｎｍを超える大きな直径の造影剤は、分散安定性が著しく低下するので沈降してしまい、生体内に投与する薬剤として用いることができない。これに対して、本発明に係る複合体は、全体径が適切な範囲に調整されているので、複合体の分散安定性が良好であり、保存安定性が高い。また、複合体は、全体径の調整により、従来の造影剤と比べて、細網内皮系(肝臓、脾臓による外的異物の排除機構)に取り込まれない回避性や、目的部位への結合能が向上しており、複合体を生体に投与した際に、目的部位に高集積するので、ＭＲＩ等の画像診断法で鮮明に撮像することができる。このように、複合体は、生体に投与する造影剤として実用性を有している。

ＭＲＩを撮像する際の撮像方法(Ｔ１もしくはＴ２)は、腫瘍(濃灰-黒色に写る)を対象に撮像することから、造影剤の集積部位が白くなるＴ１強調撮像を用いると判別がし易い。しかしながら、従来提案されている磁性粒子系のＭＲＩ造影剤は、Ｔ２効果が非常に高く、Ｔ１強調撮像には不向きという欠点がある。本発明に係る複合体は、Ｔ２緩和度(Ｒ２)／Ｔ１緩和度(Ｒ１)が５未満であり、Ｔ１効果を高めてあることから、ＭＲＩ等の画像診断において画像コントラストがより明瞭なＴ１強調撮像法での使用が可能となる。このように、本発明に係る複合体は、Ｔ１強調撮像法において用いることができる実用性を有している。

(カルボキシメチル／ジエチルアミノエチル化デキストラン(ＣＭＥＡＤ)の調製)
平均分子量約１万の還元型デキストラン５００ｇを水１Ｌに溶解し、これに水酸化ナトリウム９５ｇ及びモノクロロ酢酸１１５ｇを約３０℃以下で加えた後、６０℃で２時間攪拌する。冷却後、水を加え２Ｌに調整した後、メタノール４Ｌを攪拌下に添加し、目的物を析出させる。析出させた目的物を水０．７５Ｌに再溶解し、メタノール３Ｌを加えて目的物を得る操作を３回行い、得られた目的物を水１Ｌに溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８に調整する。減圧濃縮し、凍結乾燥してデキストランのカルボキシメチルエーテル・ナトリウム塩(以下、ＣＭＤという)を得る。

１００ｇのＣＭＤを水３００ｍＬに溶解し、これに水酸化ナトリウム２３ｇ及びジエチルアミノエチル塩酸塩３５ｇを約３０℃以下で加えた後、約６５℃で１．５時間攪拌する。冷却後、塩酸を用いてｐＨを７に調整した後、水を加えて５００ｍＬに調整する。これにメタノール１．１Ｌを攪拌下に添加し、目的物を析出させる。析出させた目的物に水を加えて４００ｍＬとし、メタノール３７０ｍＬを加えて目的物を得る操作を２回行い、得られた目的物に水を加えて３００ｍＬとする。これを１．２Ｌのメタノールに攪拌しながら添加し、細かい目的物とさせた後、ガラスフィルターで濾過回収し、減圧乾燥してデキストランのカルボキシメチルエーテル／ジエチルアミノエチル化物(以下、ＣＭＥＡＤという)を得る。

(磁性粒子の合成)
前述のように得られたＣＭＥＡＤ３．８ｇを水に溶解し、ここに予め調製した塩化鉄(II／塩化鉄(III)＝１：２の１Ｍ水溶液１４ｍＬを８０℃、窒素雰囲気下で撹拌混合する。その後、８０℃で撹拌を維持しながら、３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５．６ｍＬを混合する。混合終了後、塩酸で中和し、続いて還流を１．５時間実施する。冷却後、溶液を遠心処理(１８８０Ｇ、６０分)し、上清を回収する。上清を限外ろ過(分画分子量５０,０００Ｄａ)で精製し、目的の磁性粒子水溶液(以下、ＣＭＥＡＤＭという)９５ｍＬを得た。なお、実施例の磁性粒子は、鉄濃度が１４．２ｍｇ／ｍＬ、０．４７テスラにおけるＲ１が３２mM^-1・s^-1、Ｒ２が６１mM^-1・s^-1、Ｒ２／Ｒ１が１．９である。なお、反応条件を適宜調節することで、平均粒子径の異なるＣＭＥＡＤＭを得ることができる。

(未修飾デキストランで被覆された磁性粒子の合成)
平均分子量１万のデキストラン１４．２ｇを水に溶解し、ここに予め調製した塩化鉄(II／塩化鉄(III)＝１：２の１Ｍ水溶液２２ｍＬを８０℃、窒素雰囲気下で撹拌混合する。その後、８０℃で撹拌を維持しながら、３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３５ｍＬを混合する。混合終了後、塩酸で中和し、続いて還流を１．５時間実施する。冷却後、溶液を遠心処理(１８８０Ｇ、６０分)し、上清を回収する。上清を限外ろ過(分画分子量５０,０００Ｄａ)で精製し、再度遠心処理することで、参考例に係る未修飾デキストランで被覆された磁性粒子水溶液８０ｍＬを得た。なお、参考例の磁性粒子は、鉄濃度が１４．２ｍｇ／ｍＬ、平均粒子径が６４ｎｍ、０．４７テスラにおけるＲ１が１３mM^-1・s^-1、Ｒ２が７２mM^-1・s^-1、Ｒ２／Ｒ１が５．５である。

(複合体番号１)
平均粒子径１９ｎｍの実施例に係るＣＭＥＡＤＭ(鉄濃度１．０ｍｇ／ｍＬ)６．０ｍＬにＮ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)、水溶性カルボジイミド(ＷＳＣ)を加え、４０℃で３０分間反応する。ここにアネキシンＶ２３．６ｍｇを加え、４０℃で５時間反応する。その後、０．０１Ｍホウ酸バッファー(ｐＨ８．０)を加え、限外濾過(ザルトリウスVIVASPIN20 分画分子量１００ｋＤａ)で精製し、最終的に６．０ｍＬに調整して複合体番号１に係る複合体を得た。得られた複合体番号１の複合体について、ＢＣＡタンパク定量法(Pierce BCA Protein Assay kit)によりアネキシンＶ含量を測定した。また、動的光散乱法(マルバーン、ゼータサイザーナノＺＳ)により全体径を測定した。複合体番号１の複合体は、鉄濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ、全体径が３１ｎｍ、アネキシンＶの結合量が２．７ｍｇ／ｍｇ−Ｆｅである。

(複合体番号２)
平均粒子径３５ｎｍの実施例に係るＣＭＥＡＤＭを用い、アネキシンＶの添加量を１４．３ｍｇとする以外は複合体番号１と同様の操作を行うことにより、複合体番号２の複合体を得た。複合体番号２の複合体は、鉄濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ、全体径が４７ｎｍ、アネキシンＶの結合量が１．９ｍｇ／ｍｇ−Ｆｅである。

(複合体番号３)
平均粒子径６６ｎｍの実施例に係るＣＭＥＡＤＭを用い、アネキシンＶの添加量を１３．２ｍｇとする以外は複合体番号１と同様の操作を行うことにより、複合体番号３の複合体を得た。複合体番号３の複合体は、鉄濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ、全体径が７６ｎｍ、アネキシンＶの結合量が１．７ｍｇ／ｍｇ−Ｆｅである。

(複合体番号４)
前述した参考例の磁性粒子(鉄濃度１．０ｍｇ／ｍＬ)５．０ｍＬに、過ヨウ素酸ナトリウム０．３ｍｇ添加し、２５℃で１時間反応する。その後、アネキシンＶ８．２ｍｇを添加し３時間反応した後、水素化ホウ素ナトリウムを添加し反応を終了する。０．０１Ｍホウ酸バッファー(ｐＨ９．２)を加え、限外濾過(ザルトリウスVIVASPIN20 分画分子量１００ｋＤａ)で精製し、最終的に５．０ｍＬに調整して、複合体番号４の複合体を得た。複合体番号４の複合体は、鉄濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ、全体径が６７ｎｍ、アネキシンＶの結合量が１．７ｍｇ／ｍｇ−Ｆｅである。

複合体番号１〜４は、全体径、Ｒ２／Ｒ１の値およびアネキシンＶの結合量が、表１の通りである。

(試験１：in vitro試験)
Jurkat細胞(理研バイオリソースセンター、RBRC-RCB3052)を培養し、５×１０７個/ｍLの濃度まで増殖した。ここにカンプトテシンが１５μＭとなるように添加して６時間インキュベートし、アポトーシスを誘導した。細胞を冷たいリン酸緩衝生理食塩水(冷ＰＢＳ(−))で２回洗浄した後、複合体番号１〜４およびコントロール(磁性粒子)をいずれも濃度を１００μg-Fe/mLに希釈して５０μＬ添加し、２６℃で１時間インキュベートした。遠心分離にて未結合の複合体を上清に分離し、さらに洗浄操作を２回繰り返し、細胞のみを回収した。回収した細胞をＴＤ−ＮＭＲ(ブルカー製、０．４７Ｔ−ミニスペックｍｑ２０)に供し、Ｔ２緩和時間を測定し、得られたＴ２緩和時間から細胞に結合した複合体の鉄濃度を計算した。その結果を図３に示す。図３に示すように、平均粒子径(全体径)が小さい複合体ほど多くの量が細胞に結合することが明らかである。

(試験２：マウス／ＭＲＩ撮像試験)
複合体番号１〜３の複合体を、アポトーシス誘導腫瘍マウスに静脈内投与した後、２４時間、４８時間経過時点でＴ１強調のＭＲＩ撮像(測定機器：ＤＳファーマバイオメディカル製、1.5T-MR VivoL VA)を行った。なお、複合体の投与量は、何れも５００μmol-Fe/kgである。表２に投与前／後での腫瘍部分の信号強度比を示す、図４〜図１２にＴ１強調画像を示す。

表２および図４〜図１２に示すように、複合体番号１および２の比較的全体径が小さいものは、腫瘍部分の信号上昇が確認できたが、複合体番号３のように比較的全体径が大きいものは、腫瘍部分の信号上昇は確認できなかった。

(試験３：マウス／ＭＲＩ撮像試験(投与量減))
複合体番号１を、アポトーシス誘導腫瘍マウスに静脈内投与した後、２、４、６、２４時間経過時点でＴ１強調のＭＲＩ撮像(測定機器：ＤＳファーマバイオメディカル製、1.5T-MR VivoL VA)を行った。なお、複合体の投与量は、１００μmol-Fe/kgである。表３に投与前／後での腫瘍部分の信号強度比を示す、図１３および図１４にＴ１強調画像を示す。

表３および図１３および図１４に示すように、複合体の投与量を少なくしても腫瘍部分の信号上昇を確認できる。

(試験４：保存安定性試験(複合体の分散安定性))
前記複合体番号１〜４の合成方法に従い、複合体番号５〜８を合成した上で、それら複合体を温度４０℃、湿度７５％の環境で保存し、分散安定性を比較した。試験４の結果を表４に示す。なお、合成法は、複合体番号５が複合体番号１に対応し、複合体番号６が複合体番号２に対応し、複合体番号７が複合体番号３に対応し、複合体番号８が複合体番号４に対応している。

表４に示すように、ＣＭＥＡＤＭを原料とした複合体番号５〜７は、未修飾デキストランで被覆された磁性粒子を原料とした複合体番号８と比べて、分散安定性が高いことが示された。また、複合体の全体径が小さいものほど分散安定性が高い傾向にある。

Claims

デキストラン誘導体で被覆された酸化鉄からなるナノサイズの磁性粒子と、該磁性粒子と結合されたアネキシンＶとで構成され、
複合体全体の直径が、２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にある
ことを特徴とする複合体。
前記磁性粒子は、０．４７テスラにおけるＴ２緩和度と０．４７テスラにおけるＴ１緩和度との比の値が、５未満である請求項１記載の複合体。
前記アネキシンＶが、前記磁性粒子の鉄１ｍｇに対して、１ｍｇ〜５ｍｇの範囲で結合している請求項１または２記載の複合体。
前記デキストラン誘導体は、カルボキシアルキルエーテル基とアミノアルキルエーテル基とを有している請求項１〜３の何れか一項に記載の複合体。