JP2019188386A - 高速サンプルローディングマイクロ流体反応器およびシステム - Google Patents

Abstract

【課題】高純度のマイクロ流体反応を提供するマイクロ流体反応器を提供する。【解決手段】反応チャンバと、反応チャンバに接続された少なくとも２つの流体チャネルとを備えるマイクロ流体デバイスが開示される。少なくとも２つの流体チャネルは、反応チャンバ（１００，２００）内への流体供給／反応チャンバ（１００，２００）からの流体排出を可能にし、各流体チャネルは、入口（１０１，１０２，２０１，２０２，２０３，２０４，３０１，３０２，３０３）および出口（１１１，１１２，２１１，２１２，２１３，２１４）を含む。各流体チャネルは、流体が該流体チャネルを介して反応チャンバ内に供給された場合、反応器が充填されると、流体が少なくとも１つの他の流体チャネルの出口を介して反応チャンバを出るように構成され、これにより、少なくとも１つの他の流体チャネルからの流体が、入口に存在する場合、反応チャンバ内に拡散するのを防止する。【選択図】図３

Description

本発明は、マイクロ流体デバイスの分野に関する。より詳細には、本発明は、高純度の反応が得られるように、試薬の流入および流出の正確な制御を可能にするマイクロ流体反応器に関する。

マイクロ流体システムを使用する場合に課題の１つは、少量の流体の使用と、高純度反応を可能にするという要件とを組み合わせることである。少量の液体を使用する場合、微量の不純物の関連性はより重要である。高純度反応が必要とされる応用の例は、ＤＮＡ配列決定および、例えば、オリゴヌクレオチドなどの生体分子の合成を含むが、これに限定されない。

ＤＮＡ配列決定について本発明の１つの潜在的な応用の背景を提供するために、少し詳細に議論する。このことは、ＤＮＡ配列決定が本発明の唯一の潜在的な応用であることを意味しない。また、冗長すぎるため、ＤＮＡ配列決定の主題の包括的な評価を提供することもここでの目的ではない。手短かつ簡潔のために、本発明のあらゆる可能な使用をここで説明するわけではない。

全ゲノム配列決定において、患者のＤＮＡ中のヌクレオチドの配列を知ることが望ましい。ＤＮＡ配列の決定のために数多くの手法がある。合成によるＤＮＡ配列決定は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型(template)を取り、ヌクレオチドのアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）を反応により特定の順序で組み込んで、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を構築することによって機能する手法のあるクラスの一例である。ｓｓＤＮＡへのヌクレオチドの組み込みは、ピロリン酸（ＰＰｉ）を生成し、これは数多くの方法を用いて検出可能である。パイロシーケンシング（配列決定）は、例えば、ＰＰｉとの一連の酵素反応の際に放出される光を検出する。そのため、どのヌクレオチドがｓｓＤＮＡに組み込まれるかを決定するために、各ヌクレオチドは、典型的には、高純度レベルの反応チャンバの中に一度に１つずつ導入する必要がある。そうでなければ、組み込まれるヌクレオチドの誤った読み取りが生じ得る。

合成による全ゲノム配列決定を行うには、ＤＮＡは、典型的には数百または数千の塩基対を含む小さな断片に分割される。そして、これらの断片は多数の反応器に分散されて、配列決定のプロセスが大規模に並列処理できる。読者にスケール感覚を与えるために、ヒトゲノムには約３０億個の塩基対が存在しており、ＤＮＡが１０００個の塩基対セグメントに断片化され、各反応器が別個の異なるＤＮＡ断片を含むとすると、３００万個の反応器キャビティが名目上は必要となる。実際には、複数のＤＮＡ断片からのヌクレオチド配列の読み取りからＤＮＡを一緒につなぎ合わせる際に、良好なデータ完全性を確保するためにより多くの反応が必要となる。さらに、各反応器に、ゲノム全体の別個に異なる断片を確実に投入することは困難である。その理由は、本発明とはあまり関係していないため、これ以上議論しない。

全ゲノム配列決定のための古典的な手法は、多数の反応キャビティを含む比較的大きなフローセルを利用する。ｓｓＤＮＡ鋳型断片は、典型的には、各反応キャビティの表面に直接に共有結合されるか、または各反応キャビティに配置されたビーズに結合される。フローセルは大型であるため、フローセルをヌクレオチドで充填し、次のヌクレオチドの導入前に洗浄バッファを用いてヌクレオチドのフローセルを排出するには時間がかかる。そのため、ｓｓＤＮＡにヌクレオチドを導入して取り込むことができる速度は比較的遅い。また、この配列決定操作の際、大量の試薬が典型的に使用される。

試薬を順次導入するプロセスは、マイクロ流体チャネルを使用することによって、別個の試薬入口チャネルおよび出口チャネルを各反応チャンバに非常に近接して導入することによって高速化できる。ここで、問題は、試薬の純度を低下させ、望ましくない反応（ＤＮＡ配列決定の場合、誤ったヌクレオチドの取り込み）を引き起こすことがある、反応チャンバへの望ましくない試薬（ＤＮＡ配列決定の場合、ヌクレオチド）の拡散を防止することである。

異なる反応間で反応チャンバの洗浄を可能にする、反応チャンバから残留試薬を除去するための洗浄バッファチャネルを設けてもよいが、こうした洗浄バッファクリーニングは、試薬が反応チャンバに再び拡散することを防止しない。これを回避するために、従来は、各試薬入口チャネルにバルブが設けられ、これは、試薬が反応チャンバに入るのを可能にするために開放され、試薬が反応チャンバに入らない場合は閉止され、反応チャンバへの拡散を回避している。それでもこの解決策は、システムのサイズおよび複雑さを相当に増加させる。

さらに、バルブの存在は、バルブを開閉するための制御システムを必要とし、マイクロ流体システムの複雑さ、サイズおよびコストをも増加させる。バルブは、通常は機械部品を必要とし、これは故障する傾向があり、システムの回復力を低下させる。さらにバルブの開閉は時間がかかり、操作時間が増加させることがある。

本発明の実施形態の目的は、高純度のマイクロ流体反応を提供するためのコンパクトなマイクロ流体反応器を提供することである。

本発明の実施形態の利点は、試薬の迅速な投入および廃棄物の排出を可能にするシステムが提供されることである。本発明の実施形態の利点は、高いスループットで反応を実施できることである。

本発明の少なくともいくつかの実施形態の利点は、オンチップバルブを含まないマイクロ流体システムが提供されることである。本発明の実施形態の利点は、マイクロ流体反応器内で実施される反応にとって望ましくない試薬の拡散を防止するために、オンチップバルブは存在しないが、マイクロ流体反応器チャンバ内でのこうした試薬の拡散は、他の試薬または洗浄バッファ液のマイクロ流体フローを用いて制限できることである。

本発明の少なくともいくつかの実施形態の利点は、信頼性のある方法でマイクロ流体反応を可能にするマイクロ流体システムが提供されることである。

上記の目的は、本発明の実施形態に係るシステムによって得られる。

本発明は、マイクロ流体デバイスに関するものであり、少なくとも１つの流体材料の反応、例えば、反応チャンバの表面にコーティングまたは結合され、または、反応チャンバ内に配置された物体（ビーズまたは粒子を含むが、これに限定されない）にコーティングまたは結合された他の反応物との反応を可能にする反応チャンバと、反応チャンバに流体を供給したり、反応チャンバから流体を排出させるために、反応チャンバに接続された少なくとも２つの流体チャネルとを備え、各流体チャネルは、入口および出口を含み、
各流体チャネルは、流体が該流体チャネルを介して反応チャンバ内に供給される場合、反応器が充填されると、流体が少なくとも１つの他の流体チャネルの出口を介して反応チャンバを出るように構成され、これにより少なくとも１つの他の流体チャネルからの流体が、入口に存在する場合、反応チャンバ内に拡散するのを防止する。本発明の実施形態の利点は、流体チップ内に一体化されたバルブを必要とせずに、試薬の投入および取り出しが迅速に実施でき、入口ポートからキャビティへの流体の逆拡散(back diffusion)が減少しまたは回避されることである。

マイクロ流体デバイスは、反応チャンバを洗い流す(flush)ための洗浄バッファ(buffer)チャネルを備えてもよい。本発明の実施形態の利点は、キャビティおよびポートから残りの流体を除去するために、バッファが使用できることである。

各流体チャネルは、洗浄バッファが洗浄バッファチャネルを介して反応器に供給される場合、洗浄バッファは、反応器が充填されると、各流体チャネルの出口を介して反応器を出て、これにより流体が、入口に存在する場合、反応チャンバ内に拡散するのを防止する。

本発明の実施形態の利点は、出口ポートおよび入力ポートの適切な設計および配置によって、試薬の高純度を維持できることである。

少なくとも２つの流体チャネルの入口および出口は、望ましくない試薬のマイクロ反応器への拡散を制限する流体抵抗(resistance)を有してもよい。

反応チャンバによって形成されるキャビティは、コーナーフリー（コーナー無し）の形状を有してもよい。反応チャンバによって形成されるキャビティは、丸みを帯びた(rounded)形状を有してもよい。本発明の実施形態の利点は、キャビティのコーナーに残る液体の量が少なくなることである。

入口ポートの各々は、同じ形状、幾何形状及び／又は流体抵抗を有してもよく、及び／又は、出口ポートの各々は、同じ形状、幾何形状及び／又は流体抵抗を有する。

マイクロ流体デバイスは、複数の流体チャネルのうちの１つ以上の第１流体チャネルを介して、反応チャンバ内の流体の供給を制御するためのコントローラを含んでもよく、そのため１つ以上の第１流体チャネルを介して反応チャンバへの液体の供給が行われるようになり、流体は、複数の流体チャネルのうちの他の流体チャネルの出口を介して反応チャンバを出て、これにより複数の流体チャネルのうちの他の流体チャネルからの流体が反応チャンバ中に拡散するのを防止する。コントローラは、ターゲット反応の間、相互作用する必要がある試薬のフローを連続的に維持して、反応チャンバ内での連続的な体積フローおよび反応チャンバからの等しい連続的な体積フローを導入するようにプログラムしてもよい。コントローラは、１つ以上の第１流体チャネルから入口を通って入る試薬の連続的なフローを提供し、ターゲット反応に望ましくない試薬のマイクロ流体チャネルでの出口を介して反応チャンバから連続的なフローを提供するようにプログラムしてもよい。

本発明はまた、上述したような複数のマイクロ流体デバイスを備え、複数の流体反応チャンバがアレイ状に位置決めされるマイクロ流体システムに関する。本発明の実施形態の利点は、並列(parallel)反応が得られ、スループットまたは収率を増加させる。本発明の実施形態の利点は、マイクロ流体デバイスを並列に使用してマイクロ流体システムでのフローを制御するために使用できるコンポーネントが少ないことであり、こうしてシステムを簡略化し、コストを節約できる。

マイクロ流体システムは、診断システムでもよい。

マイクロ流体システムは、例えば、ＤＮＡ配列決定を実施するために、５つの試薬入口を含む少なくとも１つのマイクロ流体デバイスを備えてもよい。

本発明はまた、マイクロ流体反応チャンバ内の反応を生成する方法に関するものであり、該方法は、ターゲット反応の間に、相互作用する必要がある試薬のフローを連続的に維持することにより、反応チャンバ内での連続的な体積フローおよび反応チャンバからの等しい連続的な体積フローを導入することを含み、
反応チャンバからの連続的なフローは、ターゲット反応に望ましくない試薬のマイクロ流体チャネルの出口を介して発生し、こうしてターゲット反応に望ましくなく、かつ反応チャンバに向けて自発的に拡散する試薬が、出口を通じて反応チャンバからの連続的なフローによってこれらを出口に掃き出すことによって、反応チャンバに入るのを防止する。

方法は、診断方法でもよい。

ターゲット反応は、ＤＮＡ配列決定ステップの一部でもよい。

本開示の特定かつ好ましい態様が、添付した独立および従属の請求項に記述されている。従属請求項からの特徴は、独立請求項の特徴および他の従属請求項の特徴と適切に組み合わせてもよく、請求項に明記されたものだけに限らない。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下に記載される実施形態を参照して明らかになるであろう。

本発明の一実施形態に係る例示的な反応チャンバの概略図を示す。 本発明の一実施形態に係る動作原理を示す。 本発明の一実施形態に係る動作原理を示す。 本発明の一実施形態に係る動作原理を示す。 本発明の一実施形態に従って、マイクロ流体反応器が合成のためにどのように利用できるかの概要を示す。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの性能特性を示す。 本発明の一実施形態に係る、２つの試薬反応器の入口における平均流体速度を示す。 本発明の一実施形態に係る、得られた時間依存濃度を示す。 本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す。 本発明の実施形態の特徴を示す、２つの反応器（図７Ａおよび図７Ｂ）の性能を比較し、予め定めた手順（図７Ｃで概説）を使用して得られた、対応する過渡的２Ｄシミュレーション（図７Ｄおよび図７Ｅ）を示す。 本発明の実施形態の特徴を示す、２つの反応器（図７Ａおよび図７Ｂ）の性能を比較し、予め定めた手順（図７Ｃで概説）を使用して得られた、対応する過渡的２Ｄシミュレーション（図７Ｄおよび図７Ｅ）を示す。 本発明の実施形態の特徴を示す、２つの反応器（図７Ａおよび図７Ｂ）の性能を比較し、予め定めた手順（図７Ｃで概説）を使用して得られた、対応する過渡的２Ｄシミュレーション（図７Ｄおよび図７Ｅ）を示す。 本発明の実施形態の特徴を示す、２つの反応器（図７Ａおよび図７Ｂ）の性能を比較し、予め定めた手順（図７Ｃで概説）を使用して得られた、対応する過渡的２Ｄシミュレーション（図７Ｄおよび図７Ｅ）を示す。 本発明の実施形態の特徴を示す、２つの反応器（図７Ａおよび図７Ｂ）の性能を比較し、予め定めた手順（図７Ｃで概説）を使用して得られた、対応する過渡的２Ｄシミュレーション（図７Ｄおよび図７Ｅ）を示す。 本発明の一実施形態に係る円形キャビティを備えた反応チャンバを示す。 本発明の一実施形態に係る反応チャンバでのフローのシミュレーションを示す。 本発明の一実施形態に係る、チャネルの階層分岐ネットワークに接続された４つの反応器を示す。 本発明の一実施形態に係るマイクロ反応器設計の一実装図を示す。 本発明の一実施形態に係るマイクロ反応器設計の一実装図を示す。 本発明の一実施形態に係るマイクロ反応器アレイの図を示す。 本発明の一実施形態に係るマイクロ反応器アレイの図を示す。 本発明に係る実施形態で使用可能なシリコンマイクロ加工を用いた構造体の構築を示す。 本発明に係る実施形態で使用可能なシリコンマイクロ加工を用いた構造体の構築を示す。 本発明に係る実施形態で使用可能なシリコンマイクロ加工を用いた構造体の構築を示す。

図面は、概略的かつ非限定的なものである。図面において、幾つかの要素のサイズは、説明目的のために誇張したり、縮尺どおり描写していないことがある。寸法および相対寸法は、本発明の実際の具体化に対応していない。特許請求の範囲でのいずれの参照符号も、範囲を限定するものとして解釈すべきではない。異なる図面において、同じ参照符号は、同じまたは類似の要素を指す。

本発明は、特定の実施形態に関して一定の図面を参照して説明するが、本発明はこれに限定されず、請求項によってのみ限定される。記載した図面は、概略的かつ非限定的なものである。図面において、幾つかの要素のサイズは、説明目的のために誇張したり、縮尺どおり描写していないことがある。寸法および相対寸法は、本発明の実際の具体化に対応していない。

さらに、説明および請求項での用語「第１」「第２」などは、類似の要素を区別するために使用しており、必ずしも時間的、空間的、ランキングまたは他の手法での順番を記述するためではない。ここで使用した用語は、適切な状況下で交換可能であり、ここで説明した本開示の実施形態は、ここで説明したり図示したものとは別の順番で動作可能であると理解すべきである。

さらに、説明および請求項での用語「上部(top)」、「下方(under)」等は、説明目的で使用しており、必ずしも相対的な位置を記述するためのものでない。こうして用いた用語は、適切な状況下で交換可能であって、ここで説明した本開示の実施形態がここで説明または図示した以外の他の向きで動作可能であると理解すべきである。

請求項で使用した用語「備える、含む(comprising)」は、それ以降に列挙された手段に限定されるものと解釈すべきでなく、他の要素またはステップを除外していないことに留意する。記述した特徴、整数、ステップまたは構成要素の存在を、参照したように特定するように解釈する必要があるが、１つ又はそれ以上の他の特徴、整数、ステップまたは構成要素、あるいはこれらのグループの存在または追加を除外していない。こうして表現「手段Ａ，Ｂを備えるデバイス」の範囲は、構成要素Ａ，Ｂのみから成るデバイスに限定すべきでない。本開示に関して、デバイスの関連した構成要素だけがＡとＢであることを意味する。

本明細書を通じて「一実施形態」または「実施形態」への参照は、実施形態との関連で記載した特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。本明細書を通じていろいろな場所での「一実施形態」または「実施形態」の語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を参照していないが、そうこともある。さらに、１つ又はそれ以上の実施形態において、本開示から当業者にとって明らかなように、特定の特徴、構造または特性は、いずれか適切な方法で組み合わせてもよい。

同様に、本開示の例示の実施形態の説明において、本開示を合理化し、１つ又はそれ以上の種々の発明態様の理解を支援する目的で、単一の実施形態、図面、または説明において、本開示のいろいろな特徴が時には一緒にグループ化していることがあると理解すべきである。しかしながら、この開示の方法は、請求項の開示が、各請求項で明示的に記載したものより多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈すべきでない。むしろ下記の請求項が反映しているように、発明の態様は、単一の前述の開示した実施形態の全ての特徴より少ない場合がある。こうして詳細な説明に追従する請求項は、この詳細な説明の中に明示的に組み込まれており、各請求項は、本開示の別々の実施形態として自立している。

さらに、ここで説明した幾つかの実施形態が、他の実施形態に含まれる幾つかの他でない特徴を含むとともに、当業者によって理解されるように、異なる実施形態の特徴の組合せが本開示の範囲内にあって、異なる実施形態を構成することを意味する。例えば、下記の請求項において、請求した実施形態の何れも、何れの組合せで使用可能である。

ここで提供した説明では、多数の具体的な詳細を説明している。しかしながら、本開示の実施形態は、これらの具体的な詳細なしで実施してもよいことは理解されよう。別の例では、本説明の理解を曖昧にしないために、周知の方法、構造、および技法は詳細には示していない。

第１態様において、本発明は、反応チャンバと、反応チャンバに複数の流体を導入し、反応チャンバから複数の流体を除去するためのチャネルの配列とを備えたマイクロ流体デバイスに関するものであり、交差汚染を低減または回避する。マイクロ流体デバイスは、複数の試薬を反応チャンバ内に連続的に導入する必要があり、ターゲット反応に使用されない試薬の汚染を避ける必要がある用途において好都合に使用できる。少なくとも２つの流体チャネルが、流体を内部に導入するために反応チャンバに接続される。流体チャネルの各々は、入口および出口を含む。

本発明の実施形態によれば、各流体チャネルは、流体が該流体チャネルを介して反応チャンバ内に供給された場合、反応器が充填されると、流体が少なくとも１つの他の流体チャネルの出口を介して反応チャンバを出るように構成され、これにより、少なくとも１つの他の流体チャネルからの流体が、入口に存在する場合、反応チャンバ内に拡散するのを防止する。動作の際、システムは、ターゲット反応に必要とされる試薬の連続的なフローの下で動作する。この連続的なフローは、ターゲット反応に関与しないが、マイクロ流体チャネルに存在する試薬が反応チャンバ中に拡散することを回避する。

幾つかのターゲット反応では、２つの異なる試薬を反応チャンバに導入してもよく、２つの異なる試薬の連続的な供給、および連続的な供給が反応チャンバから除去されることに起因して、ターゲット反応に使用されない試薬のマイクロ流体チャネルでの出口を用いて、更なる試薬が反応チャンバの中に拡散するのが防止される。このことは、逆拡散を低減し、チャンバ内の流体の純度を増加させ、反応の質を増加させる。この実装例は、個々の入口及び／又は出口ポートにポンプまたはバルブを必要とせずに、高いレベルの純度を得て、これは複数のマイクロ反応器を実装する場合に特に有利である。前回の試薬の除去は、簡単なシステムで迅速に実施することができ、サンプル投入および廃棄物除去の全体速度を増加させる。

出口を介して、流体は、マイクロ流体デバイスの外部において、例えば、処理のためのコレクタに向けて、マイクロ流体デバイスの異なる部分などに送出できる。入口は、試薬チャネルまたは貯蔵器から反応器キャビティに試薬または流体を提供することを可能にする。

本発明の実施形態において、入口および出口は、マイクロ反応器への望ましくない試薬の拡散を制限する流体抵抗を備えるように構成される。入口および出口の抵抗の範囲は、１０^１６〜１０^２２Ｐａ・ｓ／ｍ^３の範囲内でもよい。ポートの流体抵抗は、例えば、ポートマイクロチャネルの適切な長さ、適切な幅または直径、またはこれらの組合せなど、適切な寸法を選択することによって構成できる。しかしながら、本発明はマイクロチャネルに限定されず、他の流体連通手段が使用できる。例えば、シンク(sink)が、各入口ポートマイクロチャネルに含まれてもよく、シンクは、予め定めた流体抵抗を生じるような形状およびサイズを有する。

一例として、本発明の実施形態は、これに限定されないが、例示的なマイクロ流体デバイスを参照して、いくつかの標準的な特徴および任意的な特徴について議論する。図１は、反応チャンバ１００と、２つのマイクロ流体入口チャネル１０１，１０２と、２つのマイクロ流体出口チャネル１１１，１１２とを含む例示的なマイクロ流体デバイスを示す。反応チャンバ１００は、任意の適切な形状、例えば、正方形、円形、楕円形などを有してもよい。好都合な実施形態では、反応チャンバのコーナーは、反応チャンバの洗浄を容易にするために回避される。反応チャンバは、反応を検出または監視するための１つのセンサまたは複数のセンサを含んでもよい。代替として、センサは、例えば、光検出を用いて、反応器の外部でもよい。例えば、洗浄バッファを導入及び／又は除去するために、任意の洗浄ポート１０３が含まれる。マイクロ流体入口チャネル１０１，１０２および出口チャネル１１１，１１２は、マイクロ流体チャネル１２１，１２２に接続される。そしてマイクロ流体チャネル１２１，１２２は、反応チャンバ１００に接続される。入口チャネルは、反応チャンバ１００から予め定めた距離１０４に予め定めた角度で位置決めしてもよく、角度は、例えば、９０°の角度を形成するが、他の角度も可能である。入口チャネルと反応チャンバとの間のこの予め定めた距離１０４は、出口／入口チャネルと反応チャンバとの間に決定された流れ(flow)抵抗を直列に提供する（流れ抵抗は、チャネルのサイズおよび断面によっても決定される）。例えば、キャビティと出口との間の距離１０４は、マイクロ流体チャネル１２１の流れ抵抗が、入口チャネル１０１または出口チャネル１１１の抵抗の約１００％未満になるようにしてもよい。チャネル１２１の抵抗を最大化することは、入口チャネル１０１を通って反応チャンバ１００に導入できる試薬の純度を改善する。しかしながら、この抵抗を最小化することにより、出口チャネル１１１を通って入口チャネル１０１に導入される試薬の廃棄が少なくなり、これにより反応チャンバ１００をバイパスする。従って、距離１０４は、設計の仕様（反応器容積、フレーレートなど）に応じて最適な距離で、これらの２つの競合する利益をパランスさせるように選択する必要がある。

本発明の実施形態において、入口ポートの各々は、同じ形状、幾何学的形状および流体抵抗を有し、出口ポートも同じ形状、幾何学的形状および流体抵抗を有する。代替の実施形態において、入口ポートおよび出口ポートの各々は、特定の流体および試薬が前記ポートと共に使用されるように調整される。

図２Ａ〜図２Ｃは、本発明の実施形態の動作原理を示す。実際には、入口チャネル１０１，１０２，１０３は、個々の入口ポート１３１，１３２，１３３を介して供給チャネルを分離するようにそれぞれ接続される。各供給チャネルは、それぞれ別個の流体を収容する個々の貯蔵器に接続される。供給チャネルは、入口チャネル１０１，１０２，１０３に比べて比較的低い抵抗を有する。チャネル１０１，１０２，１０３の目的は、供給チャネルから反応チャンバの中への拡散を制限することである。入口チャネル１０１，１０２，１０３にとって、拡散を制限するために小さな断面寸法および比較的長い長さを有することが好都合である。しかしながら、こうしたチャネルは、大きな圧力降下をもたらすため、許容可能な圧力降下を維持することと質量拡散レートを制限することとの間でバランスをとる必要がある。各流体が反応チャンバ１００に導入される時期を制御するために、供給チャネルと貯蔵器との間にバルブを配置できる。出口チャネル１１１，１１２は、出口ポート１４１，１４２を介して共通の出口供給チャネルに接続できる。出口供給チャネルは、更なる処理及び／又は分析または廃棄に通ずる。

図２Ａは、入口ポート１３１を通って入口チャネル１０１への試薬流体Ａの導入を示す。バルブは、試薬流体Ｂを停止し、洗浄バッファは、入口ポート１３２，１３３をそれぞれ通って入口チャネル１０２，１０３にそれぞれ入る。しかしながら、質量拡散によって、試薬Ｂはまだ入口チャネル１０２に入る。本発明の利点は、反応チャンバ１００への試薬Ｂの質量拡散が、チャネル１２２を通じた試薬流体Ａの流れを使用する試薬Ｂの移流(advection)によって緩和されることであり、これにより拡散する試薬Ｂを出口チャネル１１２に掃き出すことである。本発明の利点は、試薬流体Ａの高い純度が反応チャンバ１００内で維持されることである。

図２Ｂは、反応チャンバ１００への洗浄バッファの流れを示す。洗浄バッファの目的は、次の試薬流体の導入前に、先に導入された試薬流体を反応チャンバ１００から除去することである。洗浄バッファは、入口ポート１３３を介して入口チャネル１０３に導入される。バルブは、入口流体チャネル１０１，１０２への試薬流体Ａ、Ｂの流れをそれぞれ防止する。しかしながら、前述したように、質量拡散は、試薬Ａ，Ｂがそれぞれ入口チャネル１０１，１０２を通って輸送されることを導く。洗浄バッファは、チャネル１２１，１２２を通って流れ、試薬Ａ，Ｂを出口チャネル１１１，１２１にそれぞれ流入させる。本発明の利点は、両方の試薬流体Ａ，Ｂが、洗浄バッファを流すことによって、反応チャンバ１００から効果的に除去されることである。

図２Ｃは、試薬流体Ｂの導入を示す。先の議論と同様なプロセスにおいて、入口チャネル１０１を通って拡散する試薬Ａは、チャネル１２１から出口チャネル１１１への試薬流体Ｂのフローによって運ばれ、反応チャンバ１００での流体Ｂの高い純度を維持する。

反応チャンバへの試薬流体Ｂの導入後、試薬流体Ｂは、図２Ｂに示すように他の洗浄ステップを導入することによって、反応チャンバから除去できる。周期的な反応が望ましい場合、試薬流体Ａは、図２Ａに示すように再び導入可能であり、このプロセスは繰り返し可能である。本発明の利点は、各ステップの際に、所望の試薬の高い純度が反応チャンバ内で維持されることである。従って、所望の試薬と、反応チャンバの表面または反応チャンバ内に配置されたビーズ／粒子のいずれかに結合した分子との間で反応が起こる場合、どの試薬が反応したかが高い確率で既知となる。

図３は、マイクロ流体反応器がどのように合成（例えば、ＤＮＡなどの有機分子の）のために利用できるかの概要を示す。最初に、合成のための鋳型（配列決定用途の場合には一本鎖ＤＮＡ）は、マイクロ反応器内の官能基またはマイクロ反応器内のビーズに結合される。そして余分な鋳型を洗浄バッファを用いて反応器から洗浄する。第１試薬Ａは、マイクロ反応器を通して洗い流される。ＤＮＡ配列決定では、試薬Ａは、ヌクレオチドの１つを含んでもよく、これは、もし試薬Ａ中のヌクレオチドが、一本鎖ＤＮＡ分子の第１開環部位で正しい塩基対を形成する場合にのみ、ポリメラーゼと称される酵素の支援により一本鎖ＤＮＡに組み込まれる。ヌクレオチドの組み込みは、ピロリン酸の形成をもたらし、これは、例えば、ルシフェラーゼなどの酵素を用いて光学的に検出できる。もし試薬Ａが正しいヌクレオチドを含まない場合、組み込みは起こらず、ピロリン酸は生成されない。そして試薬Ａは、洗浄バッファを用いて反応器から除去できる。

反応器中の試薬Ａの濃度が適切に低くなった後、次の試薬Ｂが導入できる。本発明の利点は、マイクロ流体バルブを使用せずに、マイクロ反応器への導入時に高い純度の試薬Ｂが得られることである。追加の試薬（多くの試薬ラインがマイクロ反応器に接続される）は、洗浄ステップを進めることによって、高純度で反応器に導入できる。すべての試薬の導入後、このプロセスは周期的な方法で繰り返すことができる。合成によるＤＮＡ配列決定の用途では、このことは、反応器中へヌクレオチドの各々を１つずつ導入することを可能にする。光信号の検出は、一本鎖ＤＮＡ断片へのヌクレオチドの一つの組み込みを示す。ヌクレオチドは高純度で反応器に導入されるため、どのヌクレオチドが組み込まれたかをある程度の信頼で決定できる。

図４Ａ〜図４Ｂは、図１の実施形態の一例を示し、こうした例の性能特性を示す。例示の反応器の寸法は図４Ａで与えられ、すべての寸法はマイクロメートル単位であり、反応器の深さおよび接続チャネルは０．５μｍで一定である。寸法は、１つの特定な例を示し、実施形態はこれに限定されないことに留意されたい。１次元の定常状態移流拡散問題は、例示の反応器の近似的な性能特性を生じさせるように解かれる。このモデルは、試薬Ａが反応チャンバ内にのみ拡散しながら、試薬Ｂが反応器に（Ｖ_Ｂ＝５，１０、または２０ｍｍ／ｓで）ポンプ送給されるシナリオをシミュレーションしている。チャネル１２１，１２２の長さは、Ｌ＝０．１μｍから１０μｍまで変化する。流体は、１ｍＰａ・ｓの粘度を有すると仮定し、両方の試薬種(species)の拡散係数は１０^−９ｍ^２／ｓと仮定している。モデリング結果（図４Ｂ参照）は、定常状態条件下で、百万分率（ｐｐｍ）のオーダまたはそれ以上の純度が容易に達成可能であることを示す。入口速度Ｖ_Ｂが高いほど、長さＬが長いほど、反応器内の純度が高くなる。

図５は、別個の洗浄入口を備えた２つの試薬反応器の入口における平均流体速度、および反応器に導入される２つの化学種の生じた時間依存濃度を示す。サイクル１の際、試薬Ａが導入され、続いて洗浄サイクルが行われ、続いて試薬Ｂが導入され、続いて洗浄サイクルが行われる（図５Ａ参照）。シーケンスは、サイクル２および３について繰り返される。種Ａおよび種Ｂ、試薬Ａ，Ｂ中の対象化学物質、の正規化濃度を図５Ｂに示す。サイクル１において、種Ａの正規化濃度は、試薬Ａの導入の際に１に迅速に近づく。洗浄ステップの際、Ａの濃度は、非常に低い値まで徐々に低下する。種Ｂの導入の際、Ａの濃度は、反応器内で約４×１０^−４の値まで増加し、これはマイクロ反応器中の種Ｂの濃度より１０００倍以上低い。

図６は、本発明の他の実施形態を示す。チャネル２２１は、入口／出口チャネル２０１，２１１と反応チャンバ２００との間の直列流れ抵抗を減少させるために、寸法２０５によって示されるような拡大した断面を有する。図３のチャネル２２１は、一定の幅で描かれているが、これはテーパー形状、丸みを帯びた形状、または他の適切な形状の使用を排除していない。チャネル２２１の減少した抵抗は、入口チャネル２０１を通じて導入され、出口チャネル２１１から流出する試薬の廃棄を低減する。換言すると、チャネル２２１の減少した抵抗は、入口チャネル２０１に導入され、反応チャンバ２００へ流入する試薬流体のより大きな割合を可能にする。出口チャネル２１１は、寸法２０７だけオフセットしてもよく、これにより試薬の増加する廃棄を犠牲にして、反応チャンバへの望ましくない質量拡散をさらに減少させる。

図７Ａ〜図７Ｅは、実施形態１００の反応器（図７Ａ参照）と、実施形態２００の反応器（図７Ｂ参照）の性能を比較する。図７Ａおよび図７Ｂに示す寸法は、全てマイクロメートル単位である。図示した寸法は例であり、実施形態はそれに限定されないことに留意されたい。過渡的な２次元シミュレーション（無限の深度を仮定する）を実施して性能を評価し、これは種の濃度について正確な結果を合理的に提供する必要がある。シミュレーション手順は図７Ｃに概説している。最初に、数値ドメインは、洗浄入口における平均速度がＶ_ｗａｓｈ＝１０ｍｍ／ｓであり、他の入口が０に設定された定常状態問題を解くことによって初期化される。これは、長い洗浄ステップ後に反応器内でのフローおよび種の濃度の代表的なものである。マイクロ反応器への種Ｂの導入を表すステップをシミュレーションするために、種の濃度が更新されない間にＶ_Ｂ＝１０ｍｍ／ｓの入口速度について流体フロー（圧力および速度）が最初に解かれる。これは、液体フロー変数がマイクロ秒の時間スケールで定常状態条件に達するとともに、種の濃度については、関心のある時間スケールがミリ秒単位であるために行うことができる。最後に、過渡的な種の濃度は、各数値の場合について解かれる。

分析の結果を図７Ｄおよび図７Ｅに示す。種Ｂの正規化濃度は、実施形態１００，２００の両方について、数ミリ秒（図７Ｄ参照）内でほぼ１(unity)に達するが、種Ａの正規化濃度は、反応器への種Ｂの導入の間は低いままである。濃度比Ｃ_Ａ／Ｃ_Ｂは、実施形態１００（図７Ｅ参照）について１０ｍｓで約１０^−５に達する。実施形態２００では、濃度比は、１０ｍｓでより低い大きさであり、かなり改善されている。

ＤＮＡ配列決定の用途では、合計５つの試薬入口（洗浄バッファ用に１つ、各ヌクレオチド：グアニン、チミン、アデニン、シトシン用に４つ）が最も興味深いであろう。

図８は、円形キャビティ３００と、４つの入口ポート３０２，３０３，３０４，３０５の一部と、各入口ポートから分岐する４つの出口ポート３１２，３１３，３１４，３１５を備えた洗浄バッファ用の別個の入口３０１とを備える反応チャンバを示す。最小数のバルブ（図８に示す構成では合計５つ、洗浄用に１つ、試薬用に４つ）の使用により高度の純度が得られ、これらはマイクロ流体システムの外部にあってもよい。例えば、拡大した断面３２２，３２３，３２４，３２５を備えたチャネルなど、先の実施形態で論じた設計特徴も存在してもよい。

図９は、本発明の実施形態に係る反応チャンバ内のフローのシミュレーションの一例を示す。反応器は、４つの入口ポート３０２，３０３，３０４，３０５と、洗浄バッファ入口３０１と、キャビティの予め定めた距離に（あるいはこの場合、キャビティに含まれるノズル３２５）ある、分岐した出口ポート３１１，３１２とを備えた円形キャビティ３００を含む。

例えば、試薬及び／又はバッファは、出口ポートを介して除去してもよい。図９は、入口３０２を介して導入される化学物質の種の濃度を示しており、正規化スケール３４０に従ってパターン化したゾーンによって表される。出口ポートのより高い流れ抵抗に起因して、流体の大部分はキャビティに入り、ごく少ない量の流体が充填中に出口ポートに通過する。入口ポートチャネル３０４内に残留する試薬３０７の量は減少する。理由は、その大部分が、充填（例えば、他の試薬によるキャビティの充填）中、または、各入口ポート３０４に接続された出口ポート３１４を通じた洗浄（例えば、洗浄ポート３０１からのバッファでキャビティを充填）中に除去されるためである。入口ポートからの流体の逆拡散を防止するために、ポートにはバルブまたはポンプは必要ではなく、これらは包含された出口によって十分に清掃されるためである。

本発明の実施形態に係る反応器は、２つ以上の流体を混合するのに適したマイクロ流体システムにおいて使用でき、各流体（例えば、試薬）は別個のチャネルによって供給される。各チャネルは、流体を反応器にポンプ送給でき、そのために統合され、または好ましくは外部のバルブが使用できる。本発明の実施形態は、流体システムの任意のチャネルに接続することができるため、高い設計柔軟性を可能にする。反応器はチップに含まれてもよく、拡散を制限するという課題は、オンチップバルブを使用することなく解決される。バルブは、好都合には反応器の外部にすることができる。

本発明の更なる態様において、複数のマイクロ流体デバイスを備えた流体システムが得られる。この態様は、例えば、マイクロ流体システムに適用できる。少なくとも２つの流体チャネルが、本発明の第１態様の複数の反応器の少なくとも２つの入口ポートの各々に接続できる。本発明の第２態様の実施形態は、好都合に並列に使用できる複数の反応器を提供し、収率を増加させ、時間を節約する。Ｎ個の試薬チャネルによって供給される所定Ｎ個の試薬を提供するのに適した本発明の実施形態において、本発明の第１態様のいくつかの反応器、例えば、Ｍ個の反応器（１００）を、適切なチャネルのネットワークによって並列に使用することが可能である。反応器の各々は、Ｎ個の入口ポート（１０２，１０３）を備える。本発明のいくつかの有利な実施形態は、Ｎ×Ｍ個のバルブ（入口ポート当たり１つのバルブ）の代わりに、Ｎ個のバルブ（４０８−試薬チャネル当たり１つのバルブ）を使用してもよい。各反応器に洗浄ポート（１０１）を含む実施形態においても、Ｎ＋１個のバルブだけが必要であり、Ｎ個は試薬チャネル用であり、１個は洗浄チャネル用である。

この例示の図１０は、外部バルブ（４０８）に接続されたチャネルの階層分岐ネットワーク（４０１，４０２，４０３）に接続された４つの反応器（４０４，４０５，４０６，４０７）を示す。各反応器入口は、反応器中に拡散する望ましくない試薬を掃き出すために、出口チャネル（１１２，１１３）に接続される。出口は、チャネルの階層分岐ネットワーク４１１に接続される。実際には、比較的少ない数の外部バルブを使用するだけで、反応器の数を数百万に拡大することができる。

さらに、バッファなどの洗浄液でキャビティを洗い流すために、洗浄ポートが各キャビティに追加可能であり、これにより必要に応じてさらに純度を向上させることができる。

図１１Ａと図１１Ｂは、マイクロ反応器設計の実装の２つの図を示す。マイクロ反応器５００は、４つの試薬入口５０２，５０３，５０４，５０５および任意の洗浄入口５０１に接続される。入口チャネル５０２，５０３，５０４，５０５および出口チャネル５１２，５１３，５１４，５１５は、基板上の実装面積を節約するために蛇行してもよい。入口および出口チャネルは、それぞれ入口ポート５３１および出口ポート５４２を介して、試薬用の供給チャネルおよび廃棄用のドレインチャネルにそれぞれ接続できる。

図１２Ａと図１２Ｂは、洗浄バッファ用の供給チャネル５５１、試薬５５２，５５３，５５４，５５５用の供給チャネル、および廃棄出口用のドレインチャネル５６１接続されたマイクロ反応器のアレイの異なる図を示す。上部反応器の上に配置された供給およびドレインチャネルが示され、そのため単一の供給／ドレインチャネルが複数のマイクロ反応器への流体アクセスを有する。さらに、供給およびドレインチャネルの他の層（図１２Ａおよび図１２Ｂには不図示）が、ポート５７１，５７２，５７３，５７４，５７５，５８１を介して下位の流体ネットワークに流体接続された供給チャネル５５１，５５２，５５３，５５４，５５５およびドレインチャネル５６１の上部に配置できる。この階層は、最小数の供給およびドレインチャネルを備えた多数の反応器にアクセスするために繰り返すことが可能である。いくつかの用途では、１試薬あたり１つの供給チャネルのみを有することが好ましい場合がある。この配置は、１試薬あたり１つのバルブしか必要とせず、これはマイクロ流体システムの外部にあってもよい。本発明の利点は、複数のマイクロ反応器が供給およびドレインチャネルに接続でき、最小数の外部バルブを介して制御できることである。

いくつかの製造方法を使用して、ここで説明したマイクロ反応器、接続チャネル、および供給およびドレインチャネルを製造できる。特に、入口および出口チャネルのサイズが幅および深さで数百ナノメートルである場合、シリコンおよび二酸化シリコンのマイクロ加工が最も受け入れられる可能性がある。図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃは、シリコンマイクロ加工を用いた構造体の構築を示す。酸化物層７０２が、シリコンウエハ上に熱的に成長または堆積される。マイクロ反応器キャビティ６００は、等方性または異方性のエッチングを用いて酸化物層内にエッチング形成される。他の酸化物層７０３が層７０２上に堆積してエッチングでき、チャネル６０２を接続する入口６０２および出口６１４を形成できる。ビアポート６３２，６４４が他の酸化物層７０４の上に形成でき、供給チャネル６５２およびドレインチャネル６６４が酸化物層７０５の上に形成でき、供給ポート６７２およびドレインポート６８４が、同様の手法を用いて酸化物層７０６内に形成できる。より大きな供給チャネル８０２およびドレインチャネル８１４については、深い反応性イオンエッチングが他のシリコン基板９０１において使用できる（図１３Ｂ参照）。これらの供給およびドレインチャネルは、ポート８２２，８３４を介して入口および出口接続部に接続できる。酸化物層９０２が、シリコン基板９０１の上に熱的に成長または堆積でき、図１３Ａに示す基板との酸化物−酸化物結合を可能にする。

酸化物層７０６，９０２を介して酸化物−酸化物結合した後の組み立てたマイクロ流体デバイスの断面を図１３Ｃに示す。ゲノム配列決定の用途では、基板材料７０１または９０１の一方が光学的に透明であることが好都合であり、そのためヌクレオチドの組み込みの際の酵素反応によってマイクロ反応器６００で生成された光が、外部イメージセンサによって観察できる。代替として、基板７０１は、マイクロ反応器６００の下方にある複数画素を備えたシリコン内イメージセンサでもよく、マイクロ反応器６００内で生成された光を捕捉することができる。

本発明は、例えば、ＤＮＡ配列決定のために使用できる。他の用途は、オリゴヌクレオチドの生成または等温ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でもよい。

本発明は、マイクロ流体に関して開示しているが、用途をその構成要素の特定の大きさに限定することを意図しておらず、例えば、ナノ流体システムに適用してもよい。

さらに別の態様では、本発明は、マイクロ流体反応チャンバ内で反応を生成する方法に関する。この方法は、ターゲット反応の間に、相互作用する必要がある試薬フローを連続的に維持することを含む。このことは、反応チャンバ内に連続的な体積フローを導入し、反応チャンバから等しい連続的な体積フローを除去することを意味する。この方法によれば、反応チャンバからの連続的なフローは、ターゲット反応に望ましくない試薬のマイクロ流体チャネル内の出口を通じて発生し、こうしてターゲット反応に望ましくなく、かつ反応チャンバに向けて自発的に拡散する試薬が、出口を通じて反応チャンバから連続的なフローによってこれらを出口に掃き出すことによって、反応チャンバに入ることを防止する。他の方法ステップは、第１態様で説明したように、デバイスの特定のコンポーネントの機能を表現してもよい。

Claims (15)

1. ・少なくとも１つの流体材料の反応を可能にする反応チャンバ（１００，２００）と、
   ・反応チャンバ（１００，２００）からそれぞれ流体を供給および排出するために、反応チャンバに接続された少なくとも２つの流体チャネルであって、各流体チャネルは、入口（１０１，１０２，２０１，２０２，２０３，２０４，３０１，３０２，３０３）および出口（１１１，１１２，２１１，２１２，２１３，２１４）を含む、少なくとも２つの流体チャネルとを備え、
   各流体チャネルは、流体が該流体チャネルを介して反応チャンバ内に供給された場合、反応器が充填されると、流体が少なくとも１つの他の流体チャネルの出口を介して反応チャンバを出るように構成され、これにより、少なくとも１つの他の流体チャネルからの流体が、入口に存在する場合、反応チャンバ内に拡散するのを防止する、マイクロ流体デバイス。
2. 反応チャンバ（１００，２００）を洗い流すための洗浄バッファチャネル（３０５）をさらに備える、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
3. 各流体チャネルは、洗浄バッファが洗浄バッファチャネル（３０５）を介して反応器に供給される場合、洗浄バッファは、反応器が充満したときに各流体チャネルの出口を介して反応器を出て、これにより流体が、入口に存在する場合、反応チャンバ内に拡散するのを防止する、請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
4. 少なくとも２つの流体チャネルの入口（１０１，１０２，２０１，２０２，２０３，２０４，３０１，３０２，３０３）および出口（１１１，１１２，２１１，２１２，２１３，２１４）は、望ましくない試薬のマイクロ反応器への拡散を制限する流体抵抗を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
5. 反応チャンバによって形成されるキャビティ（２００）は、コーナー無し形状を有する、請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
6. 入口ポートの各々は、同じ形状、幾何形状及び／又は流体抵抗を有し、及び／又は、出口ポートの各々は、同じ形状、幾何形状及び／又は流体抵抗を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
7. 反応チャンバおよびマイクロ流体チャネルの少なくとも一部は、チップ上に実装され、
   マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チャネル内の試薬のフローを制御するためのバルブをさらに備え、該バルブは、チップ外に位置決めされる、請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
8. マイクロ流体デバイスは、複数の流体チャネルのうちの１つ以上の第１流体チャネルを介して、反応チャンバ内の流体の供給を制御するためのコントローラを含み、そのため１つ以上の第１流体チャネルを介して反応チャンバへの液体の供給が行われるようになり、流体は、複数の流体チャネルのうちの他の流体チャネルの出口を介して反応チャンバを出て、これにより複数の流体チャネルのうちの他の流体チャネルからの流体が反応チャンバ中に拡散するのを防止する、請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
9. コントローラは、ターゲット反応の間、相互作用する必要がある試薬のフローを連続的に維持して、反応チャンバ内での連続的な体積フローおよび反応チャンバからの等しい連続的な体積フローを導入するようにプログラムされ、
   コントローラは、１つ以上の第１流体チャネルから入口を通って入る試薬の連続的なフローを提供し、ターゲット反応に望ましくない試薬のマイクロ流体チャネルでの出口を介して反応チャンバから連続的なフローを提供するようにプログラムされる、請求項８に記載のマイクロ流体デバイス。
10. 請求項１〜９のいずれかに記載の複数のマイクロ流体デバイスを備え、
    複数の流体反応チャンバがアレイ状に位置決めされる、マイクロ流体システム（４００）。
11. マイクロ流体システムは、診断システムである、請求項１０に記載のマイクロ流体システム。
12. マイクロ流体システムは、ＤＮＡ配列決定を実施するために、５つの試薬入口を含む少なくとも１つのマイクロ流体デバイスを備える、請求項１１に記載のマイクロ流体システム。
13. マイクロ流体反応チャンバ内の反応を生成する方法であって、
    ・ターゲット反応の間に、相互作用する必要がある試薬のフローを連続的に維持して、反応チャンバ内での連続的な体積フローおよび反応チャンバからの等しい連続的な体積フローを導入することを含み、
    反応チャンバからの連続的なフローは、ターゲット反応に望ましくない試薬のマイクロ流体チャネルでの出口を介して発生し、こうしてターゲット反応に望ましくなく、かつ反応チャンバに向けて自発的に拡散する試薬が、出口を通じて反応チャンバからの連続的なフローによってこれらを出口に掃き出すことによって、反応チャンバに入るのを防止する、方法。
14. 方法は、診断方法である、請求項１３に記載の方法。
15. ターゲット反応は、ＤＮＡ配列決定ステップの一部である、請求項１３または１４に記載の方法。

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