JP2019183047A - 蛍光ナノ粒子およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光ナノ粒子の凝集や、溶媒や表面欠陥等に起因する蛍光の発光効率の低下を抑制することができる、蛍光ナノ粒子及びその製造方法を提供する。【解決手段】希土類元素を含有する無機蛍光材料からなる単結晶のコア２と、該コア２と同じ結晶方位を有し、コア２を被覆する単結晶のシェル３と、を有する蛍光ナノ粒子１。この蛍光ナノ粒子１は、平均粒径が５ｎｍ〜６０ｎｍが好ましく、また、コア２の結晶相が立方晶であることが好ましい。【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光ナノ粒子およびその製造方法に係り、特に、所定のコア−シェル構造を有する蛍光ナノ粒子およびその製造方法に関する。

近年、生体物質や細胞に対して蛍光イメージングを用いることで医療診断等が可能となってきており、その際、生体物質や細胞の標識には標識剤として蛍光体が用いられることが多い。このような蛍光体としては、蛍光色素、蛍光タンパク質、半導体量子ドット等が挙げられ、従来、その励起光としては紫外光や可視光を用いることが多かった。

しかし、紫外光や可視光を用いて細胞塊や生体組織の蛍光イメージングを試みた場合、光散乱による光損失が大きく、生体深部まで透過できないことや生体へのダメージ（光毒性）等により、生きたままで動物の内部（薬物動態、細胞、臓器の細部など）を可視化する生体イメージングには、改良が必要である。

そこで、励起光として近赤外光を使用できる、有機蛍光色素や希土類元素を含有する無機蛍光材料の利用が検討されている。

しかしながら、有機蛍光色素は、生体透過性が良好な長波長の蛍光を発生させる材料として、測定を十分に行えるほど蛍光強度の強いものがなく実用的ではない。そして、有機材料の場合、自己吸収があったり、使用による退色性の進行があったりするため、長期に渡る蛍光イメージングや定量測定に関して、その使用には依然課題がある。また、知られている有機系色素を用いた場合、生体分子由来の自家蛍光も避けることができず、これも課題として挙げられている。

また、無機蛍光色素としては、希土類元素を含有するセラミックスナノ粒子を用いた蛍光イメージングの研究が盛んに行われるようになってきており、励起光として近赤外光を用いるものも検討されている。この場合、上記のような光散乱、光毒性、自己吸収、自家蛍光等の課題を軽減でき、また蛍光体そのものはセラミックスであるため、長時間励起しても退色することがない。これらの利点から、希土類元素を含有するセラミックスナノ粒子の生体イメージングへの応用が期待されている（例えば、特許文献１〜２、非特許文献１等参照）。

米国特許第９１８１４７７号明細書 特許第５７２１７６７号公報

Chao Zhang and Jim Young Lee, "Prevalence of Anisotropic Shell Growth in Rare Earth Core - Shell Upconversion Nanocrystals", ACS Nano, 2013, Vol.7, No.5, p4393-4402

しかしながら、特許文献１に記載の希土類元素を含有するセラミックスナノ粒子は、これを生体イメージングに適用しようとすると、その蛍光強度が思ったほど高くない。これは、粒子の表面が周囲に存在する溶媒に直接接触する影響や、表面に存在する表面欠陥等によるものと考えられる。

一方、特許文献２や非特許文献１に記載の希土類元素を含有するセラミックスナノ粒子は、セラミックスナノ粒子の表面にシェル構造を有し、溶媒等の影響による蛍光強度の低下を抑制できる。しかしながら、これらの蛍光粒子であっても、その蛍光粒子の表面に表面欠陥が存在すると、励起光のフォトンエネルギーがその欠陥に起因する準位にトラップされ、熱として放出されたり、求める波長とは異なる波長の蛍光になったりして、蛍光強度が低下するおそれがある。

また、これら特許文献及び非特許文献に記載の蛍光は、アップコンバージョンの利用を想定しており、生体イメージングに用いようとする場合には、近赤外光での励起は良好であるものの、放出される蛍光が励起光よりも短波長側となるため、生体組織により散乱してしまい、蛍光の測定を十分効率的に行えないおそれがある。

そこで、上記状況に鑑み、本発明は、蛍光ナノ粒子の、溶媒や表面欠陥等に起因する蛍光の強度低減を抑制でき、生体イメージングの蛍光標識として好適な、蛍光ナノ粒子及びその製造方法の提供を目的とする。

本発明の蛍光ナノ粒子は、希土類元素を含有する無機蛍光材料からなる単結晶のコアと、前記コアと同じ結晶方位を有し、前記コアを被覆する単結晶のシェルと、を有することを特徴とする。

本発明の蛍光ナノ粒子の製造方法は、コア原料を溶解した溶液中で、希土類元素を含有する無機蛍光材料からなる単結晶の粒子を形成するコア粒子形成工程と、シェル原料を溶解した溶液中で、前記単結晶の粒子をコア粒子とし、その表面にエピタキシャル成長により前記コア粒子と同じ結晶方位を有し、前記コア粒子を被覆するシェルを形成するシェル形成工程と、を有することを特徴とする。

本発明の蛍光ナノ粒子によれば、蛍光ナノ粒子の凝集や、溶媒や表面欠陥等に起因する蛍光の発光効率の低下を抑制でき、生体イメージングの蛍光標識として好適である。本発明の蛍光ナノ粒子の製造方法によれば、本発明の蛍光ナノ粒子を効率的に製造できる。

本実施形態の蛍光ナノ粒子の概略構成を示した断面図である。 例３の蛍光ナノ粒子のＸ線回折における回折チャートを示した図である。 例３の蛍光ナノ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による画像を示した図である。 例３の蛍光ナノ粒子の高分解能透過電子顕微鏡（ＨＲ−ＴＥＭ）による画像を示した図である。 安定性試験における保管前後の蛍光強度の測定結果を示した図である。

以下、本発明の蛍光ナノ粒子及びその製造方法について、一実施形態を参照しながら詳細に説明する。

［蛍光ナノ粒子］
本実施形態の蛍光ナノ粒子は、希土類元素を含有する無機蛍光材料からなる単結晶のコアと、そのコアと同じ結晶方位を有し、コアを被覆する単結晶のシェルと、を有し、例えば、図１に示したように、コア２とシェル３とを有する蛍光ナノ粒子１が挙げられる。

（コア）
本実施形態に用いられるコア２は、近赤外光（励起光）の照射により蛍光を発する機能を有する希土類元素を含有する無機蛍光材料から形成される。この無機蛍光材料は、蛍光中心となる希土類元素を含有しており、通常、さらに増感剤となる希土類を含有している。

上記のような蛍光を放出する材料としては、希土類元素を含有するフッ化物セラミックスが好ましい。フッ化物セラミックスとしては、公知の蛍光材料を形成する母材が挙げられ、フッ化物を母材とすることで、格子振動エネルギーを低くして、近赤外励起光の熱的緩和の発生を抑制できる。

ここでコア２を形成する材料としては、例えば、波長９５０ｎｍ〜１０５０ｎｍの近赤外光により励起され、蛍光を放出するものが好ましい。このとき、放出する蛍光は、励起光よりも短波長でも、長波長でも、いずれでもよいが、長波長を有する蛍光を放出する材料が好ましい。長波長を放出する場合、その波長としては、１５００ｎｍ以上がより好ましく、１５００ｎｍ〜１６５０ｎｍがさらに好ましい。

コア２を形成する材料としては、より具体的には、次の一般式（１）の化合物が好ましい。

Ｎａ（Ｍ１）_ａＦ_４（Ｙｂ）_ｂ（Ｅｒ）_ｃ …（１）

（式中、Ｍ１は、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ及びＬｕから選ばれる少なくとも一つの元素であり、ａは０．４≦ａ＜１、ｂは０＜ｂ≦０．５、ｃは０＜ｃ≦０．１で、ａ＋ｂ＋ｃ＝１であることが好ましい。）

上記一般式（１）において、Ｍ１は必須元素であり、ａは０．４以上が好ましく１未満が好ましい。また、Ｍ１が２元素以上の元素の場合、それら元素の含有割合が合計でａの数値を満たせばよい。例えば、Ｍ１がＭ１１とＭ１２の２元素である場合、Ｍ１１_ａ１・Ｍ１２_ａ２と表すことができ、このときａ１＋ａ２＝ａである。
Ｙｂは増感元素として必須であり、ｂは０超であり、光を吸収する観点から０．０５以上が好ましく、０．１以上がより好ましい。一方で、添加量が多いと濃度消失が起こるおそれがあり、０．５以下が好ましく、０．４以下がより好ましく、０．３５以下がさらに好ましい。
Ｅｒは発光元素として必須であり、ｃは０超であり、０．０１以上が好ましく、０．０２以上がより好ましい。一方で、添加量が多いと濃度消失が起こるおそれがあり、０．１以下が好ましく、０．０５以下がより好ましく、０．０４以下がさらに好ましい。

コア２は、上記のように希土類元素を含有する無機蛍光材料からなるため、励起光の照射により蛍光を放出することができ、その結晶構造は単結晶である。コア２を単結晶とすることで、蛍光粒子の結晶の格子が揃っており、蛍光が効率的に放出される。

コア２は上記のように単結晶からなるが、その結晶相は、特に限定されず、公知の結晶相であればよい。この結晶相としては、例えば、立方晶、六方晶等が挙げられ、なかでも、立方晶が好ましい。これは、励起光よりも長波長側の蛍光を効率的に放出することができ、生体での光散乱性を抑えられ、蛍光観察を容易にできる利点を有するためである。また、立方晶は等方的に結晶成長させて作製するため、キャッピング剤（粒子表面に配位する分子）などを用いて成長方向の制御が不要な場合が多く、合成後にキャッピング剤を除く操作が不要という利点がある。

また、コア２の形状は、粒子状であれば特に限定されず、例えば、球状、板状、薄片状、針状、星形状等が挙げられる。生体イメージングに用いる場合、生体内で流動させることが多く、その流動性が良好で、生体への刺激が抑えられている点から、角部を有さず、なだらかな表面を有する形状が好ましく、球状であることが特に好ましい。

（シェル）
本実施形態に用いられるシェル３は、コア２と同じ結晶方位を有し、コア２を被覆する単結晶からなるものである。シェル３は、コア２の表面を被覆しているため、コア２が直接外界と接触しないようになっているため、溶媒の影響による蛍光強度の低下を抑制している。

また、本実施形態において、シェル３は、コア２と同じ結晶方位を有する単結晶である。したがって、このように形成したシェル３は、コア２との界面が明確に確認されず、コア２とシェル３とが、あたかも１つの単結晶粒子となって構成される。これにより、コア２の表面に不可避的に生じてしまう表面欠陥を、シェル３が埋めることとなり、コア２の表面欠陥による蛍光強度の低下を抑制できる。

すなわち、通常、蛍光材料で形成された粒子が、被覆されておらず外界と直接接触する場合には、その周囲に存在する水や有機溶媒等の溶媒によって、蛍光粒子の表面において励起エネルギーが熱エネルギーとして奪われ、蛍光強度が低下する可能性が高い。これは、Ｏ−Ｈ、Ｃ−Ｈ伸縮運動の倍音や関連する分子の結合音が、近赤外光のフォトンエネルギーに近いため、励起されたエネルギーが周囲の溶媒に移動してしまうためと考えられている。

また、同じように、蛍光材料で形成された粒子が、被覆されておらず外界と直接接触する場合には、蛍光粒子の表面欠陥が存在すると、その表面欠陥に励起光のフォトンエネルギーがその欠陥に起因する準位にトラップされ、熱となったり、求める波長とは異なる波長の蛍光なったりして、蛍光強度が低下するおそれがある。

これに対して、本実施形態のシェル３は、蛍光粒子の表面において溶媒と直接接触させないようにし、かつ、蛍光粒子の表面欠陥を埋めることで、それらに起因する蛍光強度の低下を抑制し得るものである。

シェル３を形成する材料としては、コア２と同一の結晶方位を取り得る材料を用いる。同一の結晶方位を取り得る材料としては、コア２で用いた希土類元素を含有する無機蛍光材料に対して、その一部又は全部の希土類元素が含まれず（他の元素に置換されたりした材料も含む）、蛍光を放出しない材料等が挙げられる。このような材料としては、例えば、上記希土類元素を含有する無機蛍光材料の発光中心となる元素を除いた材料、発光中心となる元素、増感作用を有する元素、等の蛍光に関与する元素を除いた材料、等が好ましいものとして挙げられる。

シェル３を形成する材料は、蛍光に関与する希土類元素を含有しないフッ化物セラミックスが好ましい。フッ化物セラミックスとしては、コア２で説明した母材と同一のものが挙げられ、フッ化物とすることで、格子振動エネルギーを低くして、近赤外励起光の熱的緩和の発生を抑制できる。

シェル３を形成する材料としては、より具体的には、次の一般式（２）の化合物が好ましい。

Ｎａ（Ｍ２）_ｄ（Ｍ３）_ｅＦ_４ …（２）

（式中、Ｍ２は、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｈｏ、Ｔｍ、及びＬｕから選ばれる少なくとも一つの元素、Ｍ３は、Ｙｂ及びＥｒから選ばれる少なくとも１つの元素であり、ｄは０．７≦ｄ≦１．０、ｅは０≦ｅ≦０．３で、ｄ＋ｅ＝１である。）

シェル３の厚さは、上記のようにコア２から放出される蛍光強度の低減を抑制できればよく、例えば、０．１〜６ｎｍが好ましく、１〜６ｎｍがより好ましく、１〜４ｎｍがさらに好ましい。厚みが０．１ｎｍ未満であると、蛍光の強度の低減効果が十分ではなくなるおそれがあり、６ｎｍを超えると相対的にコア２の比率が小さくなり、コアの質量で揃えて比較した場合、蛍光の発生強度がそもそも低くなってしまうおそれがある。

（蛍光ナノ粒子の形状特性）
上記説明のように、コア２とシェル３とを有する蛍光ナノ粒子１は、コア２とシェル３とが同じ結晶方位であり、それぞれが単結晶からなっているため、コア−シェル構造を採りながら、粒子におけるコア２とシェル３との明りょうな界面がなく、１つの均質な結晶構造を有する粒子として認識される。

そして、上記のような構成とすることで、シェル３の説明でも記載したが、蛍光粒子の表面において溶媒と直接接触させないようにし、かつ、蛍光粒子の表面欠陥を埋めることで、それらに起因する蛍光強度の低下を抑制し得るものである。

この蛍光ナノ粒子１の粒径は、１μｍ未満のナノオーダーの粒子であり、好ましくは、その平均粒径が５〜６０ｎｍであり、より好ましくは、５〜４０ｎｍである。本明細書において「平均粒径」とは、ランダムに１０個以上の粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）や透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）の画像における粒径を測定し、その粒径の最大値と最小値の平均値［（最大値＋最小値）／２］とする。なお、粒径は、１つの粒子から測定された短径と長径とを、こちらも平均して得られる値である。

また、蛍光ナノ粒子１の形状は、コア２の表面にシェル３を被覆するため、基本的にはコア２と同等である。断面を見れば、コア２と蛍光ナノ粒子１は概ね相似形状となっている。

そして、生体イメージング用途に使用するにあたっては、その流動性や生体への刺激が抑制される等の観点から、蛍光ナノ粒子１の外表面が、鋭角な角部を有さず、なだらかであることが好ましい。ここで、外表面が、「鋭角な角部を有さず、なだらかである」とは、ＳＥＭやＴＥＭで蛍光ナノ粒子１を観察し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪにより、ランダムに選んだ１０個以上の粒子の円形度を求めたとき、９割以上の粒子が円形度が０．８５以上になることを指す。

また、蛍光ナノ粒子１は、上記のようにコア２とシェル３とで構成されるが、このコア２の体積は、蛍光ナノ粒子１の全体の体積を１００％としたとき、２５％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましく、６０％以上であることがさらに好ましい。２５％以上とすることで、測定における蛍光強度を確保できる。

［蛍光ナノ粒子の製造方法］
次に、本実施形態の蛍光ナノ粒子の製造方法について説明する。

（コア粒子形成工程）
まず、希土類元素を含有する無機蛍光材料を含む数ナノ〜数十ナノオーダーのコア２となるコア粒子（蛍光粒子）を形成する。このコア粒子の形成にあたっては、公知の微粒子の製造方法を適用すればよく、ソルボサーマル法、水熱合成法、熱分解法、水熱分解法、オストワルド熟成法等が挙げられる。このとき、数ナノ〜数十ナノオーダーのコア粒子を均一、且つ簡便に形成できる点で、ソルボサーマル法、水熱合成法が好ましい。

また、コア粒子を形成するにあっては、ミクロンオーダー等の比較的大きいコア粒子を形成した後、粉砕してナノオーダーのコア粒子とすることもできる。

（シェル形成工程）
次に、得られたコア粒子をコア２とし、その表面に、コア粒子と同じ結晶方位を有し、コア粒子を被覆する単結晶のシェル３を形成する。このシェルの形成にあたっては、コア粒子上に同じ結晶方位を有し、単結晶でシェルを形成できればよく、公知のシェルの製造方法を適用できる。このような特徴的なシェルを形成するためには、コア粒子を混合溶媒中で均一に分散させた状態を維持し、且つ水酸基の様なコア粒子表面と強く相互作用する分子を結合させることなく、コア粒子を核として、エピタキシャル成長によってシェルを形成することが好ましい。

本実施形態のコア粒子及び蛍光ナノ粒子は、上記のように得られるが、得られたコア粒子及び蛍光ナノ粒子を、凝集や非特異反応を抑制し、水系溶媒中や試料液中等で安定に分散させる観点から、樹脂や低分子化合物で被覆することが好ましい。凝集を防止するには、例えば、エチレンオキサイド基（−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−（ｎは５〜１００００の整数を表す））、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ_３Ｈ）、アミド基（−ＣＯＮＨ−）、アミノ基（−ＮＨ_２）、シラノール基（−ＳｉＯＨ）、リン酸エステル基（−ＰＯ（ＯＲ）_ｎ（ＯＨ）_３−ｎ（ｎは１〜３の整数、Ｒは炭素数２以上の炭化水素含有基を表す））を有する材料やベタイン等が挙げられる。これらの材料で被覆することで、コア粒子や蛍光ナノ粒子表面に安定な水和層を形成し、凝集や非特異反応を有効に抑制できる。なお、コア粒子を被覆した場合、シェル形成にあたっては、一旦被覆層を除去する操作が必要である。

また、被覆した蛍光ナノ粒子に、さらに特異的に結合可能な特性を付与することが好ましい。このような特性としては、シェル部の表面に、物理的結合性又は化学的結合性を付与させるものであればよく、例えば、縮合反応、付加反応、置換反応等の反応性基等や、イオン乖離能、イオン配位能、金属結合能、水素結合能、特的相互作用能等の特性が挙げられる。さらに具体的には、このような特性を付与する置換基として、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基、ビニル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、エポキシ基、アセタール基、イミド基等の置換基や、ビオチン等が挙げられる。このような結合性部位を導入することで、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、タンパク質等に結合させ、標識として使用できる。

以下、コア粒子を形成する材料として、次の一般式（１）

Ｎａ（Ｍ１）_ａＦ_４（Ｙｂ）_ｂ（Ｅｒ）_ｃ …（１）

（式中、Ｍ１は、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ及びＬｕから選ばれる少なくとも一つの元素であり、ａは０．４≦ａ＜１、ｂは０＜ｂ≦０．５、ｃは０＜ｃ≦０．１で、ａ＋ｂ＋ｃ＝１である。）で表される蛍光材料を用いる場合を例に、コア粒子を形成する方法を例示する。

まず、原料として、コア粒子の原料となる、ナトリウム前駆体、フッ素前駆体、イッテルビウム前駆体、エルビウム前駆体、Ｍ１前駆体（ここで、Ｍ１、ａ〜ｃは、それぞれ上記式（１）中のＭ１、ａ〜ｃと同一である）等の希土類前駆体を所定の配合となるように溶媒中で混合して十分に溶解させる。次いで、得られた混合溶液を加熱し、これにより原料を反応させ、所望の希土類元素を含有する無機蛍光材料からなるコア粒子を形成する。

ここで、各前駆体を溶媒中に溶解する際、溶けにくい場合は加熱してもよく、加熱温度は、１０〜２００℃が好ましく、２０〜１８０℃がより好ましい。また、ナトリウム前駆体およびフッ素前駆体などを分けて混合してもよい。全てを混合した後の加熱は、これら原料の反応により蛍光材料を得るためのものであり、１２０〜３３０℃が好ましく、１５０〜２５０℃がより好ましい。

このときの原料の仕込み比や製造条件によって、得られるコア２の大きさや結晶系等が変化する。そのため、例えば、数ナノ〜数十ナノオーダーで立方晶のコア２を得るためには、ナトリウム前駆体の仕込み量を多くし、２００℃に近い温度で合成するのがよい。また、工業面を考えた際に、安全性の確保と粒子径および結晶系を均一にするために、ソルボサーマル法により、使用する有機溶媒の発火点よりも低く、最高温度の容器内の圧力が２気圧以下で製造するのが好ましい。

なお、シェルを形成するための合成の際に、上記した粒子を安定して分散させるための樹脂や低分子化合物を分散剤として含有させてもよいが、特に、立方晶とする場合には等方的に結晶を成長させる必要があるため、分散剤の様な被覆剤をできる限り使用せずに、成長させることが好ましい。このように、分散剤で被覆せずに、合成溶媒中で安定に分散しているコア粒子は、続くシェル形成工程や、任意の分散剤の被覆工程において、表面を覆っている不必要な分散剤を洗浄除去する必要がなく、工程が簡便となる。
なお、本明細書において「分散剤」とは、プロトンが脱離あるいは、付加することで、電荷を持ち、ナノ粒子と強く相互作用する有機系の分子のことをいう。

このとき使用される原料としては、以下の化合物が挙げられる。
イッテルビウム前駆体としては、イッテルビウムの硝酸塩、硫酸塩、塩化物及び酢酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物を含むものが例示できる。
エルビウム前駆体としては、エルビウムの硝酸塩、硫酸塩、塩化物及び酢酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物を含むものが例示できる。
Ｍ１前駆体としては、Ｍ１の硝酸塩、硫酸塩、塩化物及び酢酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物を含むものが例示できる。

ナトリウム前駆体としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等が例示できる。
フッ素前駆体としては、フッ化アンモニウム、トリフルオロ酢酸、フッ化ナトリウム等が例示できる。

また、ここで用いる蛍光成分含有溶液の溶媒としては、水、有機溶剤等が挙げられ、水、エチレングリコールが好ましい。この溶媒としては、用いる蛍光元素を含む化合物が可溶性であるものを用いる。

得られた蛍光粒子は、この蛍光粒子を含有する混合溶液を濾過や遠心分離等により、蛍光粒子と液体成分とを分離して、次のシェル形成工程に使用すればよい。

この分離操作では、蛍光粒子と液体成分とを分離できればよく、通常公知の濾過操作や遠心分離操作を行えばよい。例えば、コア粒子を、その表面に捕捉できるフィルターを備えたろ過装置を用いて、公知の方法により濾過して達成できる。この濾過により、フィルター上にはコア粒子が捕捉されて残り、液体成分はフィルターを通過し、固形成分であるコア粒子と液体成分とを簡便な操作で、確実に分離できる。また、遠心分離の場合には、公知の遠心分離器により、例えば、５，０００〜３００，０００ｇ、５〜６０分間遠心分離して、コア粒子と液体成分とを分離できる。

以下、シェルを形成する材料として、次の一般式（２）

Ｎａ（Ｍ２）_ｄ（Ｍ３）_ｅＦ_４ …（２）

（式中、Ｍ２は、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｈｏ、Ｔｍ、及びＬｕから選ばれる少なくとも一つの元素、Ｍ３は、Ｙｂ及びＥｒから選ばれる少なくとも１つの元素であり、ｃは０．７≦ｃ≦１．０、ｄは０≦ｄ≦０．３で、ｄ＋ｅ＝１である。）で表される化合物を用いる場合を例に、シェルを形成する方法を例示する。

まず、原料として、シェルの原料となる、ナトリウム前駆体、フッ素前駆体、イットリウム前駆体、Ｍ２前駆体、Ｍ３前駆体（ここで、Ｍ２、Ｍ３は、それぞれ上記式（２）中のＭ２、Ｍ３と同一の元素である）等の前駆体を所定の配合となるように溶媒中で混合して混合溶液とし、十分に溶解させる。その後、この混合溶液に、上記のコア形成工程で得られたコア粒子を混合し、十分に溶解させる。次いで、得られた混合溶液を加熱し、これにより原料を反応させ、コア粒子表面に、所望の結晶系であるシェルを形成する。

ここで、各前駆体を溶媒中に溶解する際、溶けにくい場合は加熱してもよく、加熱温度は、１０〜２００℃が好ましく、２０〜１８０℃がより好ましい。また、ナトリウム前駆体およびフッ素前駆体などを分けて混合してもよいし、コア反応溶液に直接全ての前駆体を入れて溶かしてもよい。全てを混合した後の加熱は、これら原料の反応により蛍光材料を得るためのものであり、１２０〜３３０℃が好ましく、１５０〜２５０℃がより好ましい。

ここで、シェルをコア粒子の表面からエピタキシャル成長させて形成することで、コア粒子と同じ結晶方位を有するシェルが得られる。エピタキシャル成長は、核となるコア粒子の結晶の表面に結晶成長させてシェルを形成するため、その結晶面がコア粒子とシェルとでそろえて配列できる。

なお、公知のコア−シェル構造を有する粒子において、シェルの形成にあたって分散剤を含有させることが一般的であるが、本実施形態においては、分散剤を含有させずにシェルを形成するのが好ましい。分散剤を用いないことで、粒子形状が球状に近くなりやすく、また、コア粒子製造後に、分散剤の除去等の操作が必要なく、そのままシェル形成に使用できる。

このとき使用される原料としては、以下の化合物が挙げられる。
Ｍ２前駆体としては、Ｍ２の硝酸塩、硫酸塩、塩化物及び酢酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を含むものが例示できる。
Ｍ３前駆体としては、Ｍ３の硝酸塩、硫酸塩、塩化物及び酢酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物を含むものが例示できる。

ナトリウム前駆体としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等が例示できる。
フッ素前駆体としては、フッ化アンモニウム、トリフルオロ酢酸、フッ化ナトリウム等が例示できる。

また、ここで用いる溶媒としては、上記したコア粒子を形成する際に用いる溶媒と同じものが挙げられる。

このようにして蛍光ナノ粒子が得られるが、さらに、蛍光ナノ粒子に対して、上記のように凝集の防止のため、樹脂や低分子有機化合物等により被覆することが好ましい。この被覆は、シェル形成工程後に行ってもよいし、シェル形成時の混合溶液に混ぜて、シェル形成反応と同時に被覆してもよい。さらに、生体分子との特異的な相互作用や、細胞への取り込まれの機能の付与等を行う場合には、被覆した蛍光ナノ粒子に対して、特性基や特異結合部位を付与する操作を公知の方法により行えばよい。

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定して解釈されるものではない。なお、例２〜６、８〜９、１１が実施例、例１、７、１０、１２〜１６が比較例である。

（例１）
塩化イットリウム・六水和物（２．４ｍｍｏｌ）、塩化イッテルビウム・六水和物（０．５４ｍｍｏｌ）、塩化エルビウム・六水和物（０．０６ｍｍｏｌ）、塩化ナトリウム（６．０ｍｍｏｌ）を、４５ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ａを調整し、これとは別に、フッ化アンモニウム（１２ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ｂを調整した。溶液Ａと溶液Ｂを混合して、１０分間撹拌して均一濃度の混合溶液とし、希土類元素を含有する蛍光材料を含むコア粒子形成用の混合溶液１を調製した。

得られた混合溶液を、１００ｍＬオートクレーブに入れ、熱風循環式オーブンにて２００℃で２時間反応させ、合成液１を１００ｍＬ得た。得られた合成液１を２５０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製の Ａｖａｎｔｉ ＪＸＮ−３０, ローターＪＡ−３０．５０Ｔｉ）で２０分間遠心分離を行い、上澄み液を捨てた後、水を１００ｍＬ加えて超音波発生装置（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ ＵＳ−５０、株式会社日本精機製作所製）にて超音波分散を２分間行い分散させた。続いて、この操作を二回繰り返し、表１に記載の組成を有するコア粒子１の水分散液を得た。

（例２）
例１と同じ操作を行い合成液１を得た後、２５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、上澄み液を捨てた。ここにエチレングリコールを１００ｍＬ加え、超音波分散を行い、コア粒子１を含むエチレングリコール液を得た。この得られた液に、塩化イットリウム・六水和物（３．０ｍｍｏｌ）、塩化ナトリウム（６．０ｍｍｏｌ）、フッ化アンモニウム（１２ｍｍｏｌ）をそれぞれ所定の濃度となるようによく溶解して、シェル形成用の混合溶液２を調製した。

このシェル形成用の混合溶液２を上述の超音波発生装置を用いて分散させた後、オートクレーブ内に入れ、熱風循環式オーブンにて２００℃で２時間反応させて、コア粒子１の表面にシェルを形成し、得られた反応液を例１と同じ操作により遠心分離及び分散処理し、蛍光ナノ粒子２の水分散液を得た。

（例３〜６）
シェル形成の操作を繰り返し行い、シェルの厚さを表１に示したものとした以外は、例２と同様の操作により、蛍光ナノ粒子３〜６を得た。

（例７）
塩化イットリウム・六水和物（２．４ｍｍｏｌ）、塩化イッテルビウム・六水和物（０．５４ｍｍｏｌ）、塩化エルビウム・六水和物（０．０６ｍｍｏｌ）、塩化ナトリウム（６．０ｍｍｏｌ）を４５ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ａを調整し、これとは別に、フッ化アンモニウム（２４ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ｃを調整した。溶液Ａと溶液Ｃを混合した。以降は例１と同一の操作により、平均粒径が５０ｎｍのコア粒子７の水分散液を得た。

（例８）
コア粒子１の代わりに例７で得たコア粒子７を用い、シェル厚みが６．５ｎｍとなるように、塩化イットリウム・六水和物（３．０ｍｍｏｌ）、塩化ナトリウム（６．０ｍｍｏｌ）、フッ化アンモニウム（２４ｍｍｏｌ）と調合した以外は、例２と同様の操作により蛍光ナノ粒子８の水分散液を得た。

（例９）
例２と同じく、コア粒子１を用い、シェル形成用の混合溶液として塩化イットリウム・六水和物（２．４ｍｍｏｌ）、塩化イッテルビウム・六水和物（０．６ｍｍｏｌ）、塩化ナトリウム（６．０ｍｍｏｌ）、フッ化アンモニウム（１２ｍｍｏｌ）と調合した以外は、例２と同様の操作により蛍光ナノ粒子９の水分散液を得た。

（例１０）
塩化イットリウム・六水和物（１．５ｍｍｏｌ）、塩化イッテルビウム・六水和物（０．５４ｍｍｏｌ）、塩化エルビウム・六水和物（０．０６ｍｍｏｌ）、塩化ガドリ二ウム・六水和物（０．９ｍｍｏｌ）、塩化ナトリウム（６．０ｍｍｏｌ）を、４５ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ｄを調整し、これとは別に、フッ化アンモニウム（１２ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ｅを調整した。溶液Ｄと溶液Ｅを混合して、１０分間撹拌して均一濃度の混合溶液とし、希土類元素を含有する蛍光材料を含むコア粒子形成用の混合溶液を調製した。以降は例１と同一の操作により、表１に記載の組成を有するコア粒子１０の水分散液を得た。

（例１１）
コア粒子１の代わりに、例１０で得られたコア粒子１０を用いた以外は、例２と同一の操作により、蛍光ナノ粒子１１の水分散液を得た。

（例１２）
塩化イットリウム・六水和物（１．５ｍｍｏｌ）、塩化イッテルビウム・六水和物（０．５４ｍｍｏｌ）、塩化エルビウム・六水和物（０．０６ｍｍｏｌ）、塩化セリウム・七水和物（０．９ｍｍｏｌ）、塩化ナトリウム（６．０ｍｍｏｌ）を４５ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ｆを調整し、これとは別に、フッ化アンモニウム（１２ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ｇを調整した。溶液Ｆと溶液Ｇを混合して、１０分間撹拌して均一濃度の混合溶液とし、希土類元素を含有する蛍光材料を含むコア粒子形成用の混合溶液を調製した。以降は例１と同一の操作により、表１に記載の組成を有するコア粒子１２の水分散液を得た。

（例１３）
塩化イットリウム・六水和物（２．９４ｍｍｏｌ）、塩化エルビウム・六水和物（０．０６ｍｍｏｌ）、塩化ナトリウム（６．０ｍｍｏｌ）を、４５ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ｈを調整し、これとは別に、フッ化アンモニウム（１２ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのエチレングリコールに溶解して溶液Ｉを調整した。溶液Ｈと溶液Ｉを混合して、１０分間撹拌して均一濃度の混合溶液とし、希土類元素を含有する蛍光材料を含むコア粒子形成用の混合溶液を調製した。以降は例１と同一の操作により、表１に記載の組成を有するコア粒子１３の水分散液を得た。

（例１４）
コア粒子が表１の組成となるように、塩化イットリウム・六水和物（２．７ｍｍｏｌ）、塩化エルビウム・六水和物（０．３ｍｍｏｌ）とした以外は、例１３と同様の操作によりコア粒子１４の水分散液を得た。

（例１５〜１６）
コア粒子が表１の組成となるように、例１５では塩化イットリウム・六水和物（１．８ｍｍｏｌ）、塩化イッテルビウム・六水和物（１．１４ｍｍｏｌ）と、例１６では塩化イットリウム・六水和物（２．３１ｍｍｏｌ）、塩化エルビウム・六水和物（０．１５ｍｍｏｌ）とした以外は、例１と同様の操作によりコア粒子１５〜１６の水分散液を得た。

なお、上記例１〜１６において、コア組成は、各元素の仕込み組成（モル比）から算出した値を示している。また、例１，３，４，１０，１２においては、この仕込み組成からの計算値とＩＣＰ発光分析による元素分析値とがモル比で０．００１未満の精度で同等の値となることを確認した。ＩＣＰによる元素分析は、水洗浄により未反応物を取り除き得られたコア粒子または蛍光ナノ粒子を塩酸で加熱溶解処理し、定容した後、ＩＣＰ発光分析法により各成分の含有量を測定し、各元素の割合を算出して行った。

また、各例で得られたコア粒子又は蛍光ナノ粒子の平均粒径、シェル厚み、コアの体積割合、１１１シェラー径、蛍光強度を表１に併せて示した。

［平均粒径］
平均粒径は、ランダムに１０個以上のコア粒子又は蛍光ナノ粒子のＳＥＭ又はＴＥＭの画像における粒径を測定し、その粒径の最大値と最小値の平均値［（最大値＋最小値）／２］とした。なお、粒径は、１つの粒子から測定された短径と長径とを、こちらも平均して得られる値である。

［シェル厚み、コアの体積割合］
シェル厚みは、コア粒子に対するシェルの仕込み量から算出した値である。なお、例８において、この算出値とＳＴＥＭ−ＥＤＸ（Thermo Fisher scientific社製 Talos透過型電子顕微鏡）を用いて測定されたシェル厚みとが同等であることを確認した。

また、コアの体積割合は、上記平均粒径とシェル厚みとから、粒子形状が真球と仮定して算出したものである。

［１１１シェラー径］
表１における「１１１シェラー径」は、コア粒子又は蛍光ナノ粒子のＸ線回折パターンにおいて、空間群Ｆ（０）の結晶構造モデルでの（１１１）面のシェラー径を示す。Ｘ線回折測定は、Ｘ線回折装置（リガク社製、装置名：ＳｍａｒｔＬａｂ）を用いて行った。得られたＸ線回折パターンから、Ｘ線解析ソフトウェア（リガク社製、統合粉末Ｘ線解析ソフトウェアＰＤＸＬ２）を用いてシェラー径を算出した。１１１シェラー径が、平均粒径と同等であり、シェルを形成することにより、そのシェラー径が大きくなることが確認できる。

なお、例１〜１６のコア粒子及び蛍光ナノ粒子について、Ｘ線回折により、単一の結晶種から構成されることを確認し、かつ、立方晶であることを確認した。図２には、代表的に、例３の蛍光ナノ粒子３のデータを示した。

さらに、図３には、例３の蛍光ナノ粒子３の高分解能透過電子顕微鏡（ＨＲ−ＴＥＭ、日本電子製 JEM-2010F）の画像を示した。この画像からも、内部のコアと外部のシェルにおいて確認される縞模様が同一方向かつ同一間隔で、コアとシェルでは結晶方位が同じであることが確認できた。

［蛍光強度］
測定に用いた水分散ナノ粒子はコア部の質量パーセントを約１.０質量％になるように調製した。モジュール型近赤外高速蛍光分光光度計ＮａｎｏＬｏｇ（堀場製作所製）を用い測定を行った。励起光として波長９８０ｎｍの光を照射し、放出される波長１５７０ｎｍの蛍光値を［濃度（質量％）×コアの体積割合］で除して得られる値を、コア粒子又は蛍光ナノ粒子の蛍光強度とした。

［粒子形状］
また、得られたコア粒子及び蛍光ナノ粒子について、ＳＥＭ画像を取得し、粒子形状を確認した。いずれの粒子も鋭角な角部がなく、その表面はなだらかなものであった。一例として、例３のＳＥＭ画像を図４に示した。

（安定性試験）
例１で得られたコア粒子１と例３で得られた蛍光ナノ粒子３について、２５℃の水中で３か月間保管した。この保管前後の各粒子について、上記と同様に蛍光強度を測定し、その結果を図５に示した。
図５から、例３の蛍光ナノ粒子３では、保管前後において蛍光強度の変動はほぼ見られなかったのに対し、例１のコア粒子１では、保管後の蛍光強度が低下することが確認でき、シェル被覆された蛍光ナノ粒子は、安定性に優れていることが確認できた。なお、この蛍光強度の低下は、コア粒子に対して水分子に起因する表面コロージョンにより輝度が低下したものと考えられ、シェルの有無が大きく影響していると推定される。

以上より、本実施形態の蛍光体粒子及びその製造方法によれば、小粒子径で高輝度なナノ粒子が得られ、深部まで蛍光法により生体イメージングが可能となる。これは、必要に応じてナノ粒子の表面を樹脂や生体分子で修飾することで、より高度なイメージングが可能となる。

本実施形態の蛍光ナノ粒子及びその製造方法は、溶媒や表面欠陥等に起因する蛍光の強度低減を抑制することができ、生体イメージングの蛍光標識として好適である。

また、本実施形態の蛍光ナノ粒子は、生体イメージングに限定されず、蛍光物質を標識剤とする蛍光イメージング全般に使用でき、さらに、化粧品の顔料や樹脂組成物の充填材、例えば、偽造防止塗料やバーコード用塗料など、可視域に吸収を持たず、且つ、可視域以外で励起発光する特徴を利用したステルス塗料、として蛍光物質を含有させる製品にも応用でき、蛍光材料として幅広く使用できる。

１…蛍光ナノ粒子、２…コア、３…シェル

Claims (11)

1. 希土類元素を含有する無機蛍光材料からなる単結晶のコアと、
   前記コアと同じ結晶方位を有し、前記コアを被覆する単結晶のシェルと、
   を有することを特徴とする蛍光ナノ粒子。
2. 平均粒径が５ｎｍ〜６０ｎｍである請求項１に記載の蛍光ナノ粒子。
3. 前記コアの結晶相が立方晶である請求項１又は２に記載の蛍光ナノ粒子。
4. 外表面が、鋭角な角部を有さず、なだらかである請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子。
5. 前記コアの体積割合が、前記蛍光ナノ粒子の全体体積の２５％以上であり、かつ、前記シェルの厚みが６ｎｍ以下である請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子。
6. 前記無機蛍光材料が、波長９５０〜１０５０ｎｍの近赤外光で励起可能で、波長１５００ｎｍ以上の蛍光を発する、ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子。
7. 前記コアおよび前記シェルが、フッ化物セラミックスからなることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子。
8. 前記コアの形成材料が、次の一般式（１）
   
   Ｎａ（Ｍ１）_ａＦ_４（Ｙｂ）_ｂ（Ｅｒ）_ｃ …（１）
   
   （式中、Ｍ１は、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ及びＬｕから選ばれる少なくとも一つの元素であり、ａは０．４≦ａ＜１、ｂは０＜ｂ≦０．５、ｃは０＜ｃ≦０．１で、ａ＋ｂ＋ｃ＝１である。）の化合物を有する請求項７に記載の蛍光ナノ粒子。
9. 前記シェルの形成材料が、次の一般式（２）
   
   Ｎａ（Ｍ２）_ｄ（Ｍ３）_ｅＦ_４ …（２）
   
   （式中、Ｍ２は、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｈｏ、Ｔｍ、及びＬｕから選ばれる少なくとも一つの元素、Ｍ３は、Ｙｂ及びＥｒから選ばれる少なくとも１つの元素であり、ｄは０．７≦ｄ≦１．０、ｅは０≦ｅ≦０．３で、ｄ＋ｅ＝１である。）の化合物を有する請求項７又は８に記載の蛍光ナノ粒子。
10. コア原料を溶解した溶液中で、希土類元素を含有する無機蛍光材料からなる単結晶の粒子を形成するコア粒子形成工程と、
    シェル原料を溶解した溶液中で、前記単結晶の粒子をコア粒子とし、その表面にエピタキシャル成長により前記コア粒子と同じ結晶方位を有し、前記コア粒子を被覆するシェルを形成するシェル形成工程と、
    を有することを特徴とする蛍光ナノ粒子の製造方法。
11. 前記シェル形成工程において、前記シェル原料を溶解した溶液中に、分散剤を含有させない請求項１０に記載の蛍光ナノ粒子の製造方法。

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