CN116083081A - 发光纳米颗粒、使用其的细胞的检测方法、动物的治疗方法、医疗装置、细胞的可视化方法、以及减轻细胞损伤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种发光纳米颗粒。该发光纳米颗粒具备发光稳定性以及耐光性，生物毒性较低。该发光纳米颗粒包括母体材料以及包含于母体材料内的发光物质，母体材料含有选自由Ti、Si、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素，发光物质在母体材料中的浓度是发光物质间的平均距离为1.2nm以上的浓度。

Description

发光纳米颗粒、使用其的细胞的检测方法、动物的治疗方法、 医疗装置、细胞的可视化方法、以及减轻细胞损伤的方法
技术领域
本发明涉及一种发光纳米颗粒。特别优选为，涉及一种用于生物成像的发光纳米颗粒、使用其的细胞的检测方法、动物的治疗方法、医疗装置、细胞的可视化方法、以及减轻细胞损伤的方法。
背景技术
近年来，需要一种将癌细胞等肿瘤，通过生物亲和性高的标记材料，在细胞层面上高灵敏度的检测出的技术。
专利文献1中，记载一种孪生光子吸收材料，其作为生物成像材料，由具有孪生光子吸收性以及荧光性的色素和树突结合的水溶性树枝状大分子构成。
专利文献2中，记载有，将量子点的表面由包含疏水基和极性基的表面活性剂聚合引发剂覆盖而成的水分散性量子点，作为生物体内生物成像用颗粒而使用。
专利文献3中记载一种生物成像纳米颗粒的制造方法，该方法包括制造通过碳原子数为 8至20个的烃链向由表面活性剂所保护的核/壳结构的疏水无机纳米颗粒中添加1至30当量的硫醇基和亲水基团结合的有机配体，并替换一部分表面活性剂，通过在纳米颗粒的表面形成金属硫醇盐(M-S)键，仅有一部分表面改性为亲水性，用非极性有机溶剂保持个体分散性的疏水性纳米颗粒的步骤等。
专利文献4中，记载一种用于生物成像的荧光颗粒，其利用将红外线等能量较低的光作为激发光，具有获得可见光的荧光的现象的上转换特性，荧光颗粒的材质为Y2O3：ER3+，Yb3+、 Y2O3：ER3+、NAYF4：ER3+，Yb3+中的任意一种，或者任意两种以上的组合。
专利文献5中，记载一种用于分子、细胞成像的半导体纳米颗粒，其为一种平均粒径为 1至20nm的半导体纳米颗粒，含有将持有构成其主要成分原子和等价的价电子配置的异原子或者将该异原子的原子对作为的掺杂剂，且该掺杂剂分布于半导体纳米颗粒表面或者其附近。
专利文献6中，记载一种包括荧光物质内囊纳米颗粒的病理诊断用荧光标识剂，该荧光物质内囊纳米颗粒包括：第1荧光物质，以及具有可以识别该第1荧光物质的激发/发光特性的第2荧光物质。
专利文献7中，记载由含有稀土类荧光复合体的有二氧化硅颗粒的稀土类荧光复合体形成的荧光标识剂、靶分子测定用试剂盒。
此外，非专利文献1至4中，也记载有，将量子点和荧光色素等用于生物成像中。
【日本专利文献1】日本专利文献特开2010-133887号公报
【日本专利文献2】日本专利文献特开2009-190976号公报
【日本专利文献3】日本专利文献特开2009-107106号公报
【日本专利文献4】日本专利文献特开2013-14651号公报
【日本专利文献5】国际专利文献特开2009/066548号
【日本专利文献6】日本专利文献特开2013-57037号公报
【日本专利文献7】国际专利文献特开2005/023961号
【非专利文献1】“Selective molecular imaging of viable cancer cells withpH-activatable fluorescence probes”nature Medicine 15，104(2009)
【非专利文献2】“Quantum Dot Bioconjugates for UltrasensitiveNonisotopic Detection.”Science 281，2016(1998)
【非专利文献3】“Nucleic Acid-Passivated Semiconductor Nanocrystals：Biomolecular Templating ofForm and Function.”Accounts ofChemicl Research，43，173(2010)
【非专利文献4】“Multimodal-Luminescence Core-Shell Nanocomposites forTargeted Imaging ofTumor Cells.”Chem.Eur.J.，15，3577(2009)
发明内容
发明所要解决的技术问题
如上所述，近年来，需要一种将癌细胞等的肿瘤，通过生物亲和性高的标记材料，在细胞层面上高灵敏度的检测出的技术。例如，在细胞的癌化中，在形态发生变化前，会出现分子层面的活性变化。例如，癌细胞与正常细胞相比，有大量消耗葡萄糖的趋势。同时，在细胞上的叶酸受体超表达，因此有将叶酸分子异常结合、吞噬的趋势。这种细胞的分子层面上的变化，如果可以高精度的成像，则可实现癌细胞等的超早期诊断。
然而，作为为了成像的成像材料，使用有机分子的情况，劣化、褪色速度快，例如，在荧光观察中数十分钟的光照下，发光颗粒会有猝灭等的问题。此外，作为生物成像材料，利用量子点等的无机材料的情况下，含有镉这种毒性高的元素的情况下，存在生物相容性等的问题。
本发明的目的在于提供一种具有发光稳定性以及耐光性、生物毒性较低的发光纳米颗粒，使用其的细胞的检测方法、动物的治疗方法、医疗装置、细胞的可视化方法、以及减轻细胞损伤的方法。
解决问题的手段
本发明的发明者为解决上述课题，认真讨论的结果是，创造性地制备了用无机材料将发光性的分子或者离子包合的复合颗粒，发明出具有发光稳定性以及耐光性、生物毒性较低的发光纳米颗粒，使用其的细胞的检测方法、动物的治疗方法、医疗装置、细胞的可视化方法、以及减轻细胞损伤的方法。
即，本发明如下面的(1)至(23)。
(1)发光纳米颗粒包括母体材料以及包含于母体材料内的发光物质；
母体材料含有选自由Ti、Si、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素；
所述发光物质在所述母体材料中的浓度是，所述发光物质间的平均距离为1.2nm以上的浓度。
(2)如(1)所述的发光纳米颗粒，母体材料，含有选自由TiO2、SiO2、Ca10(PO4)6(OH)2、Al2O3以及ZrO2构成的群中的至少一种。
(3)一种发光纳米颗粒，包括：母体材料，以及包含于所述母体材料内的发光物质；
所述母体材料，含有选自由Ti、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素。
(4)如(3)所述的发光纳米颗粒，母体材料，是含有选自由TiO2、Ca10(PO4)6(OH) 2、Al2O3以及ZrO2构成的群中的至少一种。
(5)如(3)或(4)所述的发光纳米颗粒，所述发光物质在所述母体材料中的浓度是，所述发光物质间的平均距离为1.2nm以上的浓度。
(6)如(1)至(5)的任意一项所述的发光纳米颗粒，发光物质，含有选自由有机发光色素以及稀土类离子构成的群中的至少一种。
(7)如(6)所述的发光纳米颗粒，有机发光色素是荧光素系色素分子。
(8)如(6)或(7)所述的发光纳米颗粒，有机发光色素的含有浓度是相对于所述阳离子元素在1mmol％以上6mol％以下。
(9)如(6)所述的发光纳米颗粒，稀土类离子是三价的Eu。
(10)如权利要求(6)或(9)所述的发光纳米颗粒，稀土类离子的含有浓度是相对于阳离子元素在1mmol％以上10mol％以下。
(11)如(1)至(10)的任意一项所述的发光纳米颗粒，母体材料包含表面活性剂分子。
(12)如(1)至(11)的任意一项所述的发光纳米颗粒，发光纳米颗粒的平均粒径是10nm-500nm。
(13)如权利要求(1)至(12)的任意一项所述的发光纳米颗粒，在表面具有孔径为1-10nm 的微孔。
(14)如(1)至(13)的任意一项所述的发光纳米颗粒，在表面形成有，与阳离子元素结合的羟基和/或氨基。
(15)如权利要求(1)至(14)的任意一项所述的发光纳米颗粒，表面通过细胞连接分子修饰。
(16)如(1)至(15)的任意一项所述的发光纳米颗粒，激发波长及发光波长存在于可见光区域。
(17)如(1)至(16)的任意一项所述的发光纳米颗粒，用于生物成像。
(18)如(1)至(17)的任意一项所述的发光纳米颗粒，在表面的微孔承载药剂，作为治疗剂使用。
(19)一种细胞的检测方法，具有：将(1)至(17)的任意一项所述的发光纳米颗粒投入细胞内，对发光纳米颗粒进行光照射，观察所述细胞的工序。
(20)一种动物的治疗方法，具有：将如(1)至(18)的任意一项所述的发光纳米颗粒给动物服用，对发光纳米颗粒进行光照射，治疗动物的工序。
(21)一种医疗装置，具有：检查部，用于进行体内细胞检查；诊断部，用于进行体内细胞诊断；和/或治疗部，用于进行体内细胞的治疗；其中，还具有光照射部，用于进行检查、诊断、和/或治疗时，将如(1)至(18)的任意一项所述的发光纳米颗粒投入体内细胞内，对发光纳米颗粒进行光照射。
(22)一种细胞的可视化方法，具有：母体材料，以及包含于母体材料内的发光物质；将母体材料中含有选自由Ti、Si、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素的发光纳米颗粒投入细胞内，对发光纳米颗粒进行光照射，使所述细胞可视化的工序。
(23)一种减轻细胞损伤的方法，具有：母体材料，以及包含于所述母体材料内的发光物质；将母体材料中含有选自由Ti、Si、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素的发光纳米颗粒投入细胞内，用可见光区域的波长的光使发光纳米颗粒激发。
发明效果
根据本发明，可以提供一种具有发光稳定性以及耐光性、生物毒性较低的发光纳米颗粒，以及使用其的细胞的检测方法、动物的治疗方法、医疗装置、细胞的可视化方法、减轻细胞损伤的方法。
附图说明
图1是本发明一实施方式的发光纳米颗粒的外观示意图。
图2是本发明一实施方式的发光纳米颗粒被癌细胞吞噬机制的示意图。
图3是表示各种母体材料中发光物质的分散，电子显微镜下的观察图(TEM图片)。
图4是表示各种母体材料中发光物质浓度与荧光寿命(τ)之间关系的图表。
图5是含有Eu3+的二氧化硅颗粒的各浓度的电子显微镜下的观察图(TEM图片)。
图6是显示母体材料为二氧化硅的情况下，氮气的吸附及解吸的等温线与微孔孔径分布曲线的图表。
图7是含有异硫氰基荧光素(FITC)的二氧化钛颗粒的各浓度的电子显微镜下的观察图 (FE-SEM图)，以及粒径分布。
图8是含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒的各浓度的电子显微镜下的观察图(TEM图片)。
图9是表示粉末X射线衍射图样的图表，(a)含有Eu3+的二氧化硅颗粒，(b)含有FITC的二氧化钛颗粒，(c)含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒。
图10是显示关于含有Eu3+的二氧化硅颗粒的除去表面活性剂前的红外线吸收谱的图表。
图11是显示红外线吸收光谱的图表，(a)含有Eu3+的二氧化硅颗粒，(b)含有FITC的二氧化钛颗粒，(c)含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒。
图12是显示激发光谱的图表，(a)含有Eu3+的二氧化硅颗粒，(b)含有FITC的二氧化钛颗粒，(c)含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒。
图13是显示发光光谱的图表，(a)含有Eu3+的二氧化硅颗粒，(b)含有FITC的二氧化钛颗粒，(c)含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒。
图14是显示入射光、散射光、荧光的强度光谱的图表。
图15是显示细胞毒性定量实验的结果的图表，(a)没有被与癌细胞结合的叶酸修饰的发光纳米颗粒，(b)用与癌细胞结合的叶酸修饰的发光纳米颗粒。
图16是关于有无细胞结合分子修饰差异的含有Eu3+的二氧化硅颗粒，(a)表示荧光强度和培养时间关系的图表，(b)以及(c)是吞噬颗粒的细胞的荧光成像图。
图17是关于有无细胞结合分子修饰差异的含有FITC的二氧化钛颗粒，(a)表示荧光强度和培养时间关系的图表，(b)以及(c)是吞噬颗粒的细胞的荧光成像图。
图18是关于有无细胞结合分子修饰差异的含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒，(a)表示荧光强度和培养时间关系的图表，(b)以及(c)是吞噬颗粒的细胞的荧光成像图。
【符号说明】
1···发光纳米颗粒
2···母体材料
3···发光物质
4···OH基或者氨基
5···肽键
6···细胞连接分子
7···细胞连接分子修饰型发光纳米颗粒
10···癌细胞
11···受体。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式进行说明。另外，本发明并非根据该实施方式进行限定的解释。
本实施方式的第1发光纳米颗粒包括：母体材料，以及包含于母体材料内的发光物质。母体材料，含有选自由Ti、Si、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素。
图1是本实施方式的第1发光纳米颗粒1的外观的示意图。第1发光纳米颗粒1具有母体材料2，母体材料2中含有发光物质3。
第1发光纳米颗粒1中，发光物质在母体材料中的浓度是发光物质间的平均距离为1.2nm 以上的浓度。其中，“发光物质间的平均距离”是根据发光纳米颗粒的平均粒径、母体材料的分子量、密度、发光物质的浓度等，通过下述计算导出的理论值。因此，“发光物质间的平均距离为1.2nm以上的浓度”是通过使用式(1)至(6)的计算导出的理论上的发光物质之间的平均距离为1.2nm以上时的浓度。
另外，当计算出发光物质之间的平均距离时，确认发光纳米颗粒中发光物质大致均匀分散的状态。确认发光物质的分散状态，例如，可以使用透射电子显微镜(TEM)进行状态的确认。此外，根据荧光寿命测定法，从发光物质浓度与荧光寿命的关系，也可以确认发光物质在发光纳米颗粒内大致均匀的分散。发光物质的浓度在不同的多个发光纳米颗粒中，每个发光纳米颗粒中的发光物质均匀地分散时，对于发光物质的各浓度的荧光寿命的样区，呈负的线性关系。这是因为伴随着发光物质浓度的增加，发光物质所占有的体积线性减少，发光物质间的距离变短，交叉弛豫过程的可能性高。发光物质凝结在一起时不会发生这种关系。
因此，根据荧光寿命测定法，为了确认某些发光纳米颗粒中发光物质是否未凝结大致均匀地分散，只需进行下面的工序。首先，分析其发光纳米颗粒的构成成分以及发光物质的浓度，准备与其发光纳米颗粒同样构成成分，发光物质浓度不同的多个样品。然后，测定多个样品的荧光寿命，确认浓度与荧光寿命关系是线性关系。关于多个样品，如可以确认发光物质浓度与荧光寿命的关系是线性关系，之后，测定分析对象的发光纳米颗粒的荧光寿命，在发光物质的浓度与荧光寿命之间的关系中，确认样品与分析对象的样区是否成为线性关系。样品与分析对象的样区成为线性关系时，可以确认发光纳米颗粒中的发光物质大致均匀地分散。
发光纳米颗粒的平均粒径是在显微镜下观察发光纳米颗粒，将发光纳米颗粒的粒度根据 {(长径+短径)/2}进行求解，对得到的多个粒度的平均值。例如，优选的，可以利用电子扫描显微镜(FE-SEM)对预定区域中任意100个以上的颗粒算出平均粒径。
具体地，发光物质间的平均距离，可以通过下面的式(1)-(6)算出。
(无机分子量密度)
DE＝A·ρn/M 式(1)
DE：无极分子数密度(分子数/nm3)
A：阿伏伽德罗数(6.02×1023)
ρn：nm密度(g/nm3)
M：各分子量(二氧化硅(S)：79.866、二氧化钛(T)：60.1、羟基磷灰石(CP)：1004.62)
(平均1个颗粒的体积)
V1＝(4π/3)·((R/2)3 式(2)
V1：平均1个颗粒的体积(nm3/1颗粒)
R：平均粒径(nm)
(含有的无机分子数)
X1＝DE·V1 式(3)
X1：发光纳米颗粒中含有的无机分子数(分子数/1颗粒)
(含有的发光物质数)
X2＝X1·B 式(4)
X2：发光纳米颗粒中含有的发光物质数(分子数/1颗粒)
B：相对于无机分子数的发光物质数(分子数/分子数)
(发光物质1个分子的专有体积)
V2＝V1/X2 式(5)
V2：发光物质1个分子的专有体积(nm3/发光物质中的1个分子)
(发光物质间距)
D＝{V2·3/((4π)}1/3 式(6)
D：发光物质的中心距(nm)
发光物质间的平均距离为1.2nm以上时，可以防止由发光物质3的凝结物引起的浓度猝灭，成为发光稳定性良好的发光纳米颗粒。发明者推测，一方面，发光物质间的平均距离短时，作为激发复合体的行动，激发时产生的能量会移动却不会成为发光的能量，使产生发光效率低下等。发光物质间的平均距离，优选的是1.5nm以上，较优选的是2nm以上。此外，发光物质间的平均距离的上限是，从有通用性的荧光检测器的灵敏度的观点来看，优选的是 10nm以上。母体材料中发光物质的浓度是，相对于无机分子数对应于发光物质数B。因此，发光物质间的平均距离为1.2nm以上的上述浓度，根据用于上述式(1)-(6)中的各分子量 M以及平均粒径R而定。
母体材料，含有选自由Ti、Si、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素。作为优选的母体材料，列举了，含有阳离子元素Ti和阴离子元素O的氧化钛，含有阳离子元素Si和阴离子元素O的氧化硅，含有阳离子元素Al和阴离子元素O的氧化铝，含有阳离子元素Zr和阴离子元素O的氧化锆。
氧化钛以及氧化硅，可以是由M((OR)n的通式表示的双金属醇盐(M是Si或者Ti，R是碳数为1-5的烷基)通过氢键凝结的颗粒，或者，也可以是双金属醇盐中相互脱水缩合，形成框架结构(-(M-O-M)n-)的颗粒。
作为母体材料，也列举了，含有阴离子元素Ca和阴离子元素P以及O的磷酸钙化合物。
磷酸钙化合物，优选的，是磷酸源(从磷酸、第1磷酸钠、第2磷酸二钠、第1磷酸钾、第2磷酸钾、第1磷酸铵、第2磷酸铵等选择的1中以上的1种以上的盐)，以及钙源(硝酸钙、碳酸钙、氯化钙、氢氧化钙、乙酸钙等选择的一种以上的盐)的混合物，或者混合反应物。作为磷酸钙化合物，列举了，磷酸氢钙非水化(CaHPO4)、磷酸氢钙二水化合物(CaHPO4· 2H2O)、磷酸三钙(Ca3(PO4)2)、磷酸二氢钙非水化合物(Ca(H2PO4)2)、磷酸二氢钙一水化合物(Ca(H2PO4)2·H2O)、磷酸四钙一水化合物(Ca4O(PO4)2)、羟基磷灰石(Ca10 (PO4)6(OH)2)、磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6·5H2O)、非晶态硫酸钙(Ca3(PO4)2·nH2O)。
第1发光纳米颗粒中，优选的，母体材料，含有选自由TiO2、SiO2、Ca10(PO4)6(OH) 2、Al2O3以及ZrO2构成的群中的至少一种。这种母体材料，对生物体的毒性较低，生物体相容性好。这其中，较优选的，TiO2、SiO2或者Ca10(PO4)6(OH)2作为第1发光纳米颗粒的母体材料。
本实施形式的第2发光纳米颗粒，包括：母体材料，以及包含于所述母体材料内的发光物质；母体材料含有选自由Ti、Si、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素的发光纳米颗粒。
第2发光纳米颗粒中，优选的，母体材料是，含有选自由TiO2、Ca10(PO4)6(OH)2、Al2O3以及ZrO2构成的群中的至少一种。这种母体材料，对生物体的毒性较低，生物体相容性好。这其中，较优选的，TiO2或者Ca10(PO4)6(OH)2作为第2发光纳米颗粒的母体材料。
优选的，第2发光纳米颗粒中，发光物质间的平均距离为1.2nm以上时，可以防止发光物质的浓度猝灭，可以成为发光稳定性良好的发光纳米颗粒。发光物质间的平均距离，优选的是1.5nm以上，较优选的是2nm以上。此外，发光物质间的平均距离的上限是，从有通用性的荧光检测器的灵敏度的观点来看，优选的是10nm以下。
第1发光纳米颗粒或者第2发光纳米颗粒(以下，无论是以第1发光纳米颗粒，还是以第2发光纳米颗粒为对象的情况中，有仅仅记载“发光纳米颗粒”的情况)中，优选为，发光物质含有选自由有机发光色素以及稀土离子构成的群中的至少一种。
有机发光色素，没有特别的限制，优选为，选自由荧光素系色素分子、罗丹明系色素分子、串联系色素分子、香豆素系色素分子、嗜曙红系色素分子、芘系色素分子以及花青素系色素分子构成的群中的至少一种。这其中，优选的是荧光素系色素分子，例如，异硫氰基荧光素(FITC)由于在可见光区域激发以及发光，在本实施方式中，优选的用作为发光物质。
稀土离子，没有特别的限制，优选为，选自由三价的Ce、四价的Ce、三价的Pr、三价的 Nd、三价的Pm、三价的Sm、二价的Eu、三价的Eu、三价的Gd、三价的Tb、三价的Dy、三价的Ho、三价的Er、三价的Tm、三价的Yb以及三价的Lu构成的群中的至少一种。这其中，优选为，三价的Eu的Eu3+，由于在可见光区域激发以及发光，在本实施方式的发光纳米颗粒中，优选的用作为发光物质。
有机发光色素中的含有浓度，优选为，相对于母体材料中的阳离子元素在1mmol％以上 6mol％以下。由于有机发光色素的含有浓度在该范围中，容易将发光物质间的平均距离维持在1.2nm以上的趋势。有机发光色素中的含有浓度，优选为，相对于阳离子元素在100mmol％以上5.5mol％以下，较优选为，在1mol％以上5mol％以下。
稀土离子的含有浓度，优选为，相对于母体材料中的阳离子元素在1mmol％以上10mol％以下。由于稀土离子的含有浓度在该范围中，容易将发光物质间的平均距离维持在1.2nm以上的趋势。稀土离子中的含有浓度，优选为，相对于阳离子元素在100mmol％以上10mol％以下，较优选为，在1mol％以上5mol％以下。
母体材料，优选为，含有表面活性剂。由于含有表面活性剂分子，可以将发光物质间的平均距离维持在适合的范围的趋势。作为表面活性剂，没有特别限制，例如，可以使用溴化十六烷基三甲铵(溴化十六烷基三甲基铵)、十六烷基三甲基氯化铵、八甲基三甲基溴化铵、十烷基三甲基溴化铵、月桂基三甲基溴化铵、溴化西基二甲基乙二胺、十六烷基胺、十二烷基硫酸钠、十六烷基胺、十八胺、辛基酚乙氧基化物、聚氧乙烯、聚气乙烯月桂醚、聚乙烯 (EO)-聚氧化亚丙基二醇(PO)共聚合体(EO20PO30)、聚氧乙烯(EO)-聚氧化亚丙基二醇(PO)-聚氧乙烯(EO)亲水亲油性三嵌段共聚物(EO5PO68EO5、EO20PO70PEO20、 EO97PO67EO97)等。另外，没有必要在适当范围内维持发光物质间的平均距离的情况下，母体材料中可以不含有表面活性剂。
母体材料中表面活性剂分子的含有量，优选为，相对于母体材料中金属元素的摩尔比为 0.01以上。由于相对于母体材料中金属元素的摩尔比为0.01以上，提高了母体材料中发光物质的分散性，可以将发光物质间的平均距离维持在适合的范围的趋势。比较优选为，摩尔比是0.05以上，更加优选为，摩尔比是0.1以上。此外，上述摩尔比的上限是，从防止仅对表面活性剂的颗粒表面或者颗粒外的液晶状态的分层的观点来看，优选为，是1.5以下，较优选为，是0.2以下。
通过缩合反应制备母体材料时，优选为，使用阳离子界面活性剂。由于使用了阳离子表面活性剂，可以通过静电的相互作用复合化，防止互相分离，形成分散性良好的状态。此外，表面活性剂，被认为是，在添加母体材料之前的溶液中先使其分散，亲水性官能团向外侧方向形成胶束，二氧化硅和二氧化钛等的非晶形的群构造和发光物质在纳米级复合化的状态下积聚而成的。据此，优选的状态是，提高了母体材料中发光物质的分散性，可以将发光物质间的平均距离维持在适合的范围的趋势。另外，例如，根据母体材料，不使用阳离子表面活性剂，而可以使用非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂。
优选为，发光纳米颗粒的平均粒径为10nm-500nm。优选为，在观察细胞的基础上，优选的趋势是，由于平均粒径在该范围内，发光纳米颗粒成为容易被吞噬的目标的细胞。一方面，优选为，如果平均粒径小，有作用于细胞的活动功能，产生毒性的问题的趋势。发光纳米颗粒的平均粒径，比较优选的是50nm-450nm，更加优选的是100nm-400nm。另外，没有将本发光纳米颗粒用于例如细胞成像的情况下，平均粒径可以大于500nm。
优选为，发光纳米颗粒，将孔径为0.1-10nm的微孔，配置于表面。发光纳米颗粒的表面通过燃烧或者溶剂萃取，在发光纳米颗粒的表面形成孔径为0.1-10nm的微孔的趋势。如果具有孔径为0.1-10nm的微孔，例如，低分子药剂固载于发光纳米颗粒成为可能，可以作为治疗剂使用。比较优选为，微孔的孔径为1nm-10nm，更加优选为，2nm-6nm。另外，发光纳米颗粒，例如，根据使用用途，可以不在表面配置孔径为0.1-10nm的微孔。
母体材料为二氧化硅时，有形成微孔的趋势。这被认为是，表面活性剂与含有发光物质的母体材料的二氧化硅之间的相互作用比较弱，通过燃烧和溶剂萃取工序脱离表面活性剂，形成微孔的原因。一方面，母体材料是二氧化钛和磷酸钙化合物等的情况下，有不容易形成微孔的趋势。这被推测为，表面活性剂与含有发光物质的母体材料的二氧化钛和磷酸钙化合物之间的相互作用比较强，不容易脱离表面活性剂的原因。
发光纳米颗粒的表面上，优选为，形成与母体材料的阳离子元素结合的羟基(OH基)。此外，优选为，母体材料的表面由氨基修饰，例如，可以使用含有氨基的硅烷偶联剂形成的。 OH基以及氨基，不限于微孔内表面，可以在微孔外表面等的颗粒表面，优选为，在微孔外表面。OH基或者氨基，通过细胞连接分子与氢键或者缩聚反应的共价偶联而被固定化，发光纳米颗粒的表面由细胞连接分子修饰，细胞连接分子可以与癌细胞和正常细胞特异性结合。细胞连接分子与细胞特异性结合时，发光纳米颗粒被吞噬入细胞内。据此，使细胞内的发光纳米颗粒发光，则可以检测出癌细胞等。另外，通过发光纳米颗粒的用途，可以不在表面形成 OH基和氨基。
作为细胞连接分子，列举了，与HER2抗体、与人类上皮细胞生长因子受体特异性结合的抗体、癌症特异性抗体、磷酸化蛋白质抗体、叶酸、与叶酸受体β特异性结合的抗体、血管内皮细胞特异性抗体、组织特异性抗体、转铁蛋白、转铁蛋白结合型肽类、糖链有结合型的蛋白质等。在此之中，优选为，将吞噬癌细胞趋势的叶酸作为细胞连接分子使用。癌细胞，在细胞膜上的叶酸受体超表达，因此有将叶酸分子异常结合、吞噬的趋势。
此外，发光纳米颗粒的表面也可以通过抗癌剂分子修饰。抗癌剂分子，与癌细胞特异性结合时，发光纳米颗粒被吞噬入细胞内。据此，使细胞内的发光纳米颗粒发光，则可以检测出癌细胞，且，抗癌剂分子也吞噬癌细胞，抗癌剂起作用，可以抑制癌细胞的增殖。另外，本实施方式的发光纳米颗粒，除了癌细胞以外也能广泛应用，所以表面也可以不被抗癌剂分子修饰。
细胞连接分子和抗癌剂分子，优选为，在发光纳米颗粒的表面，通过化学结合修饰、固定。作为化学结合，列举了，多肽结合(-CO-NH-)、氢键等。
图2是本发明一实施方式的发光纳米颗粒，被癌细胞吞噬机制的模式示意图。如图2所示，具有含有发光物质3的母体材料2的发光纳米颗粒1，在母体材料2的表面具有OH基或者氨基的原子键4，与细胞连接分子6通过多肽结合5结合，可以形成细胞连接分子修饰型发光纳米颗粒7。细胞连接分子修饰型发光纳米颗粒7，可以与癌细胞10的受体11结合，吞噬入癌细胞10内。
本实施方式的发光纳米颗粒，优选为，激发波长及发光波长存在于可见光区域。激发波长以及发光波长在可见光波长以上时，可以减轻由于光照射产生的生物体组织以及表示材料的劣化。此外，可以减轻样本表面的散射光，提高观察灵敏度。另外，在使用发光纳米颗粒的用途中，没有必要考虑对生物体组织和标识材料损伤的情况下，激发波长以及发光波长可以不在可见光区域存在。
本实施方式的发光纳米颗粒，优选的使用生物成像。使用作为母体材料的有机分子的情况，劣化、褪色速度快，通过紫外线激发，存在损伤正常生物体组织的问题。此外，使用量子点等的无机材料的情况下，存在含有毒性高的元素等的生物体相容性的问题，由于激发光的波长含有紫外线区域，也有可能给生物体组织造成伤害。对此，本实施方式的发光纳米颗粒，具有发光稳定性以及耐光性，可以减轻对生物体组织的损伤，由于生物体毒性也较低，可以很好地使用生物成像。另外，本实施方式的发光纳米颗粒，优选的方式为，也可以用于生物成像以外的用途。
本实施方式的细胞的检测方法，具有：将发光纳米颗粒注射进细胞内，对发光纳米颗粒进行光照射，观察细胞的工序。根据本检测方法，本实施方式的发光纳米颗粒是高灵敏度，因此可以更容易进行细胞的观察。
本实施方式的动物的治疗方法，具有：将发光纳米颗粒给动物服用，对发光纳米颗粒进行光照射，治疗动物的工序。根据本治疗方法，本实施方式的发光纳米颗粒是高灵敏度的，且，由于生物体亲和性高，可以灵敏度高且安全地检测动物体内疾患的状况，也可以正确治疗动物的疾患。
本实施方式的医疗装置，具有：检查部，用于进行体内细胞的检查；诊断部，用于进行体内细胞的诊断；和/或治疗部，用于进行体内细胞的治疗；还具有光照射部，用于进行检查、诊断、和/或治疗时，将如(1)-(18)的任意一项所述的发光纳米颗粒注射进体内细胞内，对发光纳米颗粒进行光照射。其中，作为检查体内细胞的检查部，例如，列举了进行精密图像诊断的荧光内视镜。此外，作为进行体内细胞诊断的诊断部，例如，列举了进行组织活体检查的装置。还有，作为进行体内细胞治疗的治疗部，列举了通过内窥镜摘出肿瘤部的装置。此外，以体内细胞作为例子，可以示例关于口腔癌，咽喉癌、食道癌、大肠癌、小肠癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌的癌细胞。根据本医疗装置，本实施方式的发光纳米颗粒是高灵敏度，且，由于生物体亲和性高，可以灵敏度高且安全地检查、诊断、治疗体内细胞。
本实施方式的细胞可视化方法，该方法具有：母体材料，以及包含于母体材料内的发光物质；将母体材料中含有选自由Ti、Si、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素的发光纳米颗粒注射进细胞内，对发光纳米颗粒进行光照射，使细胞可视化的工序。根据本可视化方法，本实施方式的发光纳米颗粒是高灵敏度的，因此可以更容易进行细胞的可视化。
本实施方式的减轻细胞损伤的方法，该方法具有：母体材料，以及包含于母体材料内的发光物质；将母体材料中含有选自由Ti、Si、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素的发光纳米颗粒注射进细胞内，用可见光区域的波长的光使发光纳米颗粒激发的工序。根据本方法，本实施方式的发光纳米颗粒是高灵敏度的，使发光纳米颗粒激发的光的波长由于在可见光区域，与现有的细胞成像方法相比，可以减轻细胞的损伤。
实施例
下面关于本发明的具体实施方式进行说明。另外，本发明并非根据该实施方式进行限定的解释。
＜实施例1、2、比较例1＞
(含有Eu3+的二氧化硅颗粒的合成)
向225mL的去离子水中添加1.0g的溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)，再添加3.5mL的2.0M-NaOH，在353K下搅拌30分钟。向搅拌后的溶液中加入5.515mL四乙氧基硅烷(TEOS)、15mL的含有EuCl3的去离子水(EuCl3为0g时，Eu合成开始时的加入量是0摩尔％，表示为“Eu0mol％-S”(比较例1)。EuCl3是0.452g时，Eu合成开始时的加入量是5摩尔％，表示为“Eu5mol％-S”(实施例1)。EuCl3是0.904g时，Eu合成开始时的加入量是10摩尔％，表示为“Eu10mol％-S”(实施例2)，在353K下搅拌2小时，过滤。过滤物用20mL的去离子水清洗4次、用10mL的乙醇清洗1次。然后，在室温下干燥1日，在550℃下燃烧6小时。
构成实施例1、2、比较例1的颗粒的元素的浓度等，如表1。
【表1】
Figure BDA0003884576380000131
Figure BDA0003884576380000141
＜实施例3、比较例2、3＞
(含有异硫氰基荧光素(FITC)的二氧化钛颗粒的合成)
混合0.011mL(4.63×10-5mol)的3-氨基丙基三乙氧硅烷(APTES：C9H23NO3Si)、0mg(0mol、比较例2)、或者、91.1mg＝(实施例3)、或者、182mg(4.68×10-4mol、比较例3) 的异硫氰基荧光素(FITC：C21H11NO5S)、36.1mL(0.471mol)的2-丙烷(IPA)，在室温下用电磁搅拌器搅拌24小时。在该溶液中，混合加入1.37mL(4.68×10﹣3mol)的四丙醇(TTIP： C12H28O4Ti)，使Ti/APTES摩尔比＝100，制备溶液A。比较例2的FITC的合成开始时的加入量是0摩尔％，表示为“FITC0mol％-T”，实施例3的FITC的合成开始时的加入量是5摩尔％，表示为“FITC5mol％-T”，比较例3的FITC的合成开始时的加入量是10摩尔％，表示为“FITC10mol％-T”。
混合37.3mL(0.487mol)的IPA和0.231mL(1.28×10-2mol)的离子交换水，制备溶液B。混合205mg(7.61×10﹣4mol)的十八胺(ODA：C18H39N)、189mL(2.47mol)的IPA、以及0.900mL(4.99×10﹣2mol)的离子交换水，聚丙烯制的容器中制备溶液C。其中，APTES期待伴随着ODA和FITC的氢键等形成的相互作用的发现。IPA作为TTIP、APTES、FITC以及ODA的良溶剂使用，离子交换水，作为TTIP以及APTES加水分解的反应物质使用，ODA是为了控制生成物的形状、尺寸以及纳米结构而使用。
溶液A和B，分别以流速30mL*min-1输送液体，混合。将其反应液以向溶液C的容器以流速60mL*min-1排出，直至排出完毕用电磁搅拌器搅拌后，在室温下静置24小时，得到颗粒分散液。通过离心分离(9000rpm、10min)进行固液分离，除去上澄清液后，将沉淀物在60℃干燥一晚，得到样本粉末。
构成实施例3、比较例2、3的元素的浓度等，如表2。
【表2】
Figure BDA0003884576380000142
Figure BDA0003884576380000151
＜实施例4、5、比较例4＞
(含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒的合成)
由100mL的H2O(80℃)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB、CTAB、分子量364.45)8.75g(0.024mol)形成的溶液中，添加2.09g(0.012mol)的K2HPO4、1N-NAOH，PH13的溶液冷却至40℃以下。
然后，60mL的H2O、CaCl2·2H2O为2.87g(0.0195mol)、EuCl3·6H2O为0g(0mmol)、0.357g(0.9mmol)或者0.714g(1.9mmol)。比较例4的Eu的合成开始时的加入量是0摩尔％，表示为“Eu0mol％-CP”，实施例4的Eu的合成开始时的加入量是5摩尔％，表示为“Eu5mol％-CP”，比较例5的Eu的合成开始时的加入量是10摩尔％，表示为“Eu10mol％-CP”。将这些含有Eu的溶液，以6mL/分的滴下速度，冷却至40℃以下的溶液滴下。滴下后，边搅拌，在40℃加热回流24小时。得到的白色沉淀物用纯水洗净2回，用酒精洗净2回。洗净后，进行离心分离(10000G、15分、4℃)，在100℃干燥24小时。
构成实施例4、5、比较例4的颗粒的元素的浓度等，如表3。
【表3】
Figure BDA0003884576380000152
(通过TEM观察发光物质的分散)
关于实施例2、5、比较例3的发光纳米颗粒，通过透射电子显微镜(TEM)进行发光物质分散的观察。
具体的，将各种颗粒粉末以0.1wt％的浓度分散于酒精中，进行超声波处理15分钟，将颗粒分散液向玻璃衬底以0.01mL/cm2的浓度铸型。实施1日的真空干燥，在衬底表面实施碳蒸发(膜厚：10nm)，由聚焦离子束，切断离子膜的截面(面积：8μm×6μm)，承载于碳微型智能电网。然后，通过透射电子显微镜(TEM)(日立高新技术公司制、HT7700)、以及附属EDS(散能X射线分光计)，评价、解析颗粒膜的中心部。
观察结果如图3所示。图3中，发光物质，确认为，作为白色的近似圆形的单一分子、颗粒存在，在发光纳米颗粒中分散存在。
(发光物质间的平均距离的测定方法)
在母体材料中发光物质的分散可以通过TEM确认，因此可以从发光纳米颗粒的平均粒径、发光物质的浓度，算出发光物质间的平均距离。
具体的，通过荧光X射线(XRF)的分析与电子扫描显微镜(FE-SEM)的观察，通过对于母体材料的无机相的金属元素的发光物质的浓度计算，算出发光物质间的距离。
(1)无机相的无机分子数密度的计算
下面，如表4，通过无机相的密度(已知值)，算出无机相的分子数的密度。
【表4】
Figure BDA0003884576380000161
(注1)硅化相的密度，用多孔氧化硅的密度1.50(参考文献：岩元和敬、妹尾学、“通过溶胶凝胶法的无机、有机复合材料的功能化”生产研究，42(8)，1990.等)。
(注2)钛化相的密度，比起XRD模式而是非晶相(如果不是非晶，含有各种发光物质是困难的)。在此之中，使用非晶相的二氧化钛的密度3.0g/cm3(参考文献：M.Laube,F.Rauch,C. Ottermann,O.Anderson and K.Bange,Nucl.Instrum.Methods Phys.Res.,Sect.B,1996,113,288-292；C.R. Ottermann andK.Bange,Thin SolidFilms,1996,286,32-34；D.Mergel,D.Buschendorf,S.Eggert,R.Grammes and B.Samset,Thin SolidFilms,2000,371,218-224；D.Mergel,Thin Solid Films,2001,397,216-222；V.V. Hoang,H.Zung andN.H.B.Trong,Eur.Phys.J.D,2007,44,515-524.等)。
(注3)羟基磷灰石(CP)的密度，由于确认了比起XRD模式而是羟基磷灰石单相的结晶相，使用羟基磷灰石单相的结晶相的密度(3.2g/cm3)。
(2)平均粒径、每个颗粒的无机分子数的计算
关于实施例1-5、比较例3的发光纳米颗粒，利用FE-SEM对发光纳米颗粒100个以上进行计量，算出平均粒径。此外，算出每个颗粒中含有的无机相的无机分子数(参照表5)。
【表5】
Figure BDA0003884576380000171
(注4)各颗粒由于是各向异性形状，上述平均粒径R以{(长径+短径)/2}计算。
(注5)发光物质体积视为点(零)来计算。利用，硅化相的情况，无机二氧化硅分子单元中的1个对应Si是1个，钛化相的情况，无机二氧化钛分子单元中的1个对应Ti是1个，羟基磷灰石相的情况，无机羟基磷灰石分子单元中的1个对应Ca是6个的对应关系。
(3)发光物质间距的计算
从对通过XRF得到的无机金属元素的发光物质的浓度，算出发光物质间距。如表6，通过实施例1-5、比较例3制备的发光纳米颗粒，母体材料中含有的发光物质间的平均距离是除比较例3中FITC10mol％-T以外，在1.2nm以上。
【表6】
Figure BDA0003884576380000172
Figure BDA0003884576380000181
(注6)假设发光物质通过表面活性剂大致平均地单分散。
(B)荧光寿命的验证
通过荧光寿命的测定，验证发光物质的分散性。发光物质的样本，准备了下面的实施例制作的合成时的加入量是5mol％，加入10mol％的发光物质，2.5mol％的样本。关于发光物质 Eu，使用日本分光株式会社制、荧光分光光度计FP-8500。关于发光物质FITC，使用株式会社堀场制作所制、荧光寿命光度计DeltaPro进行。光源使用氙闪光管，激发波长使用与荧光光谱波长相同的，检测波长使用荧光光谱的最大波长。激发侧与受光侧的分离带宽是2nm。灯管点灯之后，关于发光物质Eu测量50ms间的荧光强度的变化，关于发光物质FITC测量200nS 间的荧光强度变化，其荧光强度的衰减曲线重复10次进行测定。该10次的衰减曲线与下述式(7)拟合，算出荧光寿命τ。
I(t)＝I(O)EXP(-t/τ) 式(7)
其中，I(t)是时间t中的荧光强度，I(O)是灯管点灯之后的荧光强度。其结果，荧光寿命τ为下述表7。而且，制作横轴是发光物质浓度，纵轴为荧光寿命τ的样区。其结果如图4所示。
【表7】
样本名 发光物质含有浓度(mol％) 荧光寿命
Eu2.5mol％-S 2.78 1.2
Eu5mol％-S 4.65 1.1
Eu10mol％-S 9.78 0.8
FITC2.5mol％-T 2.00 6.4×106
FITC5mol％-T 4.00 5.6×106
FITC10mol％-T 9.00 4.0×106
Eu2.5mol％-CP 2.32 1.2
Eu5mol％-CP 3.73 1.1
Eu10mol％-CP 8.34 0.9
图4中的(a)是硅化相(S)，图4中的(b)是钛化相(T)，图4中(c)是羟基磷灰石 (CP)的发光物质浓度与荧光寿命关系的示意图，如图4中的(a)-(c)，对各浓度荧光寿命的样区呈负的线性关系。此关系是单调下降的，因此推测是对发光物质等价的母体环境。即，伴随着发光物质浓度的增加，发光物质所占有的体积线性减少，发光物质间的距离变短，交叉弛豫过程的可能性高(表现为激发能部分向接近离子移动，结果产生的2个低激发状态的离子向衬底状态快速弛豫的现象)。被认为是，发光物质浓度与荧光寿命的关系系数是0.95 以上时表现为高相关，发光物质之间不凝结，作为单一分子、离子大致平均分散的存在，且，发光物质间距变小。根据以上，确认为，用于实施例的发光纳米颗粒中，发光物质大致平均分散存在。
图5是含有Eu3+的二氧化硅颗粒的各浓度的电子显微镜下的观察图(TEM图片)。图5中的(a)是比较例1(Eu0mol％-S)，图5中的(b)是实施例1(Eu5mol％-S)、图5中的(c) 是实施例2(Eu10mol％-S)。如图5中的(a)～(c)，表示为，Eu的浓度越高，含有Eu3+的二氧化硅颗粒的平均粒径(D)越小的趋势。此外，相对标准差的变动系数(CV)是15-20％。
实施例1、2、比较例1的颗粒的长径比，如表8所示。长径比是由颗粒的长轴尺寸除以短轴尺寸求得的。Eu的浓度越高，长径比就减少，表现为颗粒由针状向球状的形态的变化。
【表8】
样品名 颗粒的长径比
实施例1(Eu5mol％-S) 1.17±0.11
实施例2(Eu10mol％-S) 1.07±0.11
比较例1(Eu0mol％-S) 1.23±0.18
实施例1、2的含有Eu3+含的二氧化硅颗粒中，发光物质间的平均距离分别是1.5nm和 1.2nm(参照上述表6)。
此外，关于实施例1、2中含有Eu3+的二氧化硅颗粒，通过表面活性剂的溶剂萃取或者燃烧(氧化降解)，观测到直径为1-10nm范围的微孔。下述表9，表示了比面积和微孔孔径的解析结果。此外，作为图6表示为，氮的吸附及解吸等等温线以及微孔孔径的分布。关于图6 中的(a)以及(d)是Eu0mol％-S，图6中的(b)以及(e)是Eu5mol％-S，图6中的(c) 以及(f)关于Eu10mol％-S。测定法是通过氮的吸附及解吸等等温线的测定(麦奇克·贝尔 (株)制BELSORP-mini)，测定(通过BET法求得)BET比表面和(由BJH法求得)BJH微孔孔径的分布。将样本在室温下脱气一日，在100℃干燥12小时，测定的吸附温度是-196℃，最大平衡压力是760Torr。该结果，如表9所示，被认为是，伴随着Eu的掺杂量的增加，间隙孔扩张。含有间隙孔的分布中心约为2-6nm。
【表9】
Figure BDA0003884576380000191
Figure BDA0003884576380000201
图7是含有FITC的二氧化钛颗粒的各浓度的电子显微镜下的观察图(FE-SEM图)，以及粒度分布。图7中的(a)是比较例2(FITC0mol％-T)，图7中的(b)是实施例3(FITC0mol％-T)、图7中的(c)是实施例3(FITC0mol％-T)。如图7中的(a)-(c)，表示为，FITC的浓度越高，含有FITC的二氧化钛颗粒的平均粒径(D)越大的趋势。此外，变动系数(CV)是8.1-10.4％。
实施例3、比较例2、3颗粒的长径比，如表10所示。长径比是由颗粒的长轴尺寸除以短轴尺寸求得的。
【表10】
样品名 颗粒的长径比
实施例3(FITC5mol％-T) 1.01±0.01
比较例3(FITC10mol％-T) 1.00±0.01
比较例2(FITC0mol％-T) 1.01±0.01
实施例3、比较例3的含有FITC的二氧化钛颗粒中，发光物质间的平均距离分别是1.2nm 和0.9nm(参照上述表6)，显示出伴随着发光物质的增加而减少的趋势。
此外，关于实施例3的含有FITC的二氧化钛颗粒，通过表面活性剂的溶剂萃取或者燃烧 (氧化降解)，没有观测到微孔。此为表面活性剂与实施例3的含有FITC的二氧化钛颗粒的相互作用，其强于表面活性剂和实施例1、2的含有Eu3+的二氧化硅颗粒的相互作用，因此推测是不容易脱离表面活性剂的。
图8是含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒的各浓度的电子显微镜下的观察图(TEM图片)。图 8中的(a)是比较例4(Eu0mol％-CP)，图8中的(b)是实施例4(Eu5mol％-CP)、图8中的(c)是实施例5(Eu10mol％-CP)。如图8中的(a)～(c)，表示为，Eu的浓度越高，含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒的平均粒径(D)越小的趋势。此外，变动系数(CV)是23-30％。
实施例4、5、比较例4的颗粒的长径比，如表11所示，Eu的浓度越高，长径比就减少，表现为颗粒由针状向球状的形态的变化。
【表11】
样品名 颗粒的长径比
实施例4(Eu5mol％-CP) 1.89±0.13
实施例5(Eu10mol％-CP) 1.53±0.18
比较例4(Eu0mol％-S) 2.43±0.12
图9是表示粉末X线衍射图样的图表，其中(a)含有Eu3+的二氧化硅颗粒，(b)含有FITC 的二氧化钛颗粒，(c)含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒。图9中的(a)中，未见来自于Eu的析出物或二氧化硅结晶的峰值，是非晶结构，显示出Eu含量越高，峰值强度越低的趋势。图9中的(b)中，显示出FITC含量越高，表左端的峰值强度越高的趋势。图9中的(c)中，可以看到，从面指数的归属判断的晶体结构是羟基磷灰石单相，Eu的含有量越多，峰值的半频带宽度有部分变低。
图10是显示除去关于含有Eu3+的二氧化硅颗粒的表面活性剂前的红外线吸收谱的图表。观测到，3640cm﹣1的氢键类型的Si-OH伸缩振动，2925cm﹣1的C-H伸缩振动(-CH3)，2855Cm-1的C-H伸缩振动(-CH2-)，1480cm﹣1的C-H变角振動(-CH2-)，1225cm-1的Si-O-Si非对称伸缩振动((Si-O-Si)n由来)，1070cm﹣1的Si-O-Si对称伸缩振动((Si-O-Si)n由来)，965cm﹣1的Si-OH伸缩振动，795cm﹣1的Si-OH伸缩振动等的特性吸收带。根据2925cm﹣1的C-H伸缩振动(-CH3)，2855cm﹣1的C-H伸缩振动(-CH2-)，1480cm﹣1的C-H变角振動(-CH2-)中吸收带的存在，确认了表面活性剂的存在。
图11是显示红外线吸收光谱的图表，其中(a)含有Eu3+的二氧化硅颗粒，(b)含有FITC 的二氧化钛颗粒，(c)含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒。观测到，3640cm﹣1的氢键类型的Si-OH 伸缩振动，1225cm﹣1的Si-O-Si非对称伸缩振动((Si-O-Si)n由来)，1070cm﹣1的Si-O-Si对称伸缩振动((Si-O-Si)n由来)，965cm﹣1的Si-OH伸缩振动，795cm﹣1的Si-OH伸缩振动等的特性吸收带。通过燃烧或者溶剂萃取工序，由于没有了2925cm﹣1的C-H伸缩振动(-CH3)，2855cm ﹣1的C-H伸缩振动(-CH2-)，1480cm﹣1的C-H变角振動(-CH2-)的吸收带，则判断表面活性剂被去除了。
图11中的(b)中，观测到，存在于3640cm﹣1的二氧化钛结构内的-OH基的伸缩振动，3720～3000cm﹣1的颗粒被表面的H2O以及Ti-OH的OH基的伸缩振动，2920cm﹣1以及2850cm﹣1的表面活性剂ODA(十八胺)以及发光物质FITC引起的-CH3和-CH2-的伸缩振动，1460cm﹣1的-CH2-的变角振动，1590cm﹣1的C＝O伸缩振动等的特性吸收带。即使通过最终的IPA洗净工序，表面活性剂还是残留了。由此，推测出，通过二氧化钛/FITC和表面活性剂的相互作用，残存了表面活性剂。
图11中的(c)中，观测到，存在于3550cm﹣1的羟基磷灰石的晶体结构内的-OH基的伸缩振动，1100cm﹣1，1000cm﹣1，960cm﹣1的磷酸基的P-O伸缩振动，3800～3000cm﹣1以及1650cm﹣1的颗粒表面的H2O的OH基的伸缩振动等的特性吸收带。作为磷酸钙化合物(特别是羟基磷灰石)的特征峰值的P-O以及-OH的伸缩振动。最终，没有观测到表面活性剂。这是因为，通过洗净，表面活性剂已被完全除去。对比XRF结果，通过最终的洗净工序，确认可以除去表面活性剂，但没有在CP形成微孔。
实施例4、5中含有Eu3+含的磷酸钙化合物颗粒中，发光物质间的平均距离分别是1.6nm 和1.3nm(参照上述表6)。
关于实施例4、5中含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒，通过表面活性剂的溶剂萃取或者燃烧 (氧化降解)，没有观测到微孔。这是因为，表面活性剂与含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒的相互作用，其强于表面活性剂和实施例1、2中的含有Eu3+的二氧化硅颗粒的相互作用，因此推测含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒中的表面活性剂是不容易脱离的。
＜实施例6-8＞
(对于发光物质5mol％中含有的颗粒，进行癌细胞连接分子(叶酸衍生物FA-NHS)的修饰)
向250mg的含有实施例1、3、4的各个发光物质5mol％的颗粒中，加入12mL的HCl水溶液(pH＝2)，并进行超声波处理。然后，使3-氨丙基(APTES)0.78mL(3.3mmol)加入含有5mL酒精的溶液进行调制，加入超声波处理过的溶液，得到混合溶液。将该混合溶液在40℃搅拌20小时(PH＜6.5)。搅拌完毕后，离心分离该混合溶液，用酒精洗净。洗净后，减压干燥，得到150mg用APTES在表面修饰的含有发光物质5mol％的颗粒。此APTES/150mg含有发光物质5摩尔％的颗粒中，添加50mM的磷酸缓冲液(PH＝7.0)25mL，进行超声波处理。然后，使FA-NHS(叶酸衍生物)430mg(0.8mmol)加入含有二甲亚砜(DMSO)的12mL的溶液进行调制，加入超声波处理过的溶液，得到混合溶液。该混合溶液在室温下搅拌3小时。搅拌完毕后，离心分离该混合溶液，用水洗净。洗净后，减压干燥，得到实施例6-8的FA(叶酸)/含有发光物质5mol％的颗粒。
图12是显示激发光谱的图表，其中(a)含有Eu3+的二氧化硅颗粒，(b)含有FITC的二氧化钛颗粒，(c)含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒。图12中的(a)中，观测到，465nm的f-f 过渡引起的峰值。图12中的(b)中，观测到，在468、483、493nm中，负离子化单分子发光物质FITC引起的峰值(与阳离子剂ODA(十八胺)相互作用，FITC单分散性导入到颗粒内)。图12中的(c)中，观测到，465nm的f-f过渡引起的峰值。
图13是显示发光光谱的图表，其中(a)含有Eu3+的二氧化硅颗粒，(b)含有FITC的二氧化钛颗粒，(c)含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒。图13中的(a)中，观测到，从577nm的5D0到7F0的过度，从585nm、590nm、595nm的5D0到7F1的过度，从611nm的D0到7F2へ的过度，从646nm的5D0到7F3へ的过度，从700nm的5D0到7F4へ的过度引起的峰值。通过最终燃烧或者溶剂萃取工序(表面活性剂的除去工序)，发光光谱的形状和强度没有变化。从此结果来看，颗粒被核生成的晶体生长过程时的发光物质的大致平均分散化、固定化中，表面活性剂被认为起到重要的作用。
图13中的(b)中，观测到，540nm附近的发光物质FITC的单分散分子或者2分子聚集状态引起的峰值。凝结体引起的峰值没有被观测到，所以被认为是与表面活性剂分子相互作用大致平均分散的存在。
图13中的(c)中，观测到，根据发光物质Eu(III)离子的4f-4f过度的荧光峰值；590nm 的5D0→7F1，616nm的5D0→7F2、，652nm的5D0→7F3，700nm的5D0→7F4过度引起的峰值。通过最终洗净工序(表面活性剂的除去工序)，发光光谱的形状和强度没有变化。也根据此结果，颗粒被核生成的晶体生长过程时的发光物质的大致平均分散化、固定化中，表面活性剂被认为起到重要的作用。
关于各发光物质的合成完成时的5mol％样本和10mol％的样本，使用表面活性剂的颗粒合成，发光物质在颗粒内大致均匀分散的情况下，不使用一切表面活性剂通过与本实施例相同的实验方法进行颗粒合成，发光物质在颗粒内凝结的情况下测定量子产率。通过荧光光谱测定装置，求得量子产率。利用φ60mm的积分球ISF-834进行测定，激发散射光的测定中，在积分球的反射位置上贴上石英窗板的状态下，设置标准白板进行测定。测定入射光、散射光、以及荧光的强度光谱，算出其积分峰值的强度，分别缩写为I0、I1以及I2，将量子产率(内部量子产率)Φint通过式(8)算出。另外，激发/荧光光谱，利用各样本的激发/荧光光谱图中所看到的极大波长。
Φint＝I2/(I0-I1)×100 式(8)
图14是显示入射光、散射光、荧光的强度光谱的图表。此外，测定的量子产率的结果如下。使用表面活性剂合成的情况，比不使用的情况量子产率高，发光物质的大致平均的分散化(高效率发光)中显示了表面活性剂的重要性。
Eu5mol％-S-使用表面活性剂合成：11.5％
Eu10mol％-S-使用表面活性剂合成：8.3％
Eu5mol％-S-使用表面活性剂合成：2.5％
Eu10mol％-S-使用表面活性剂合成：1.3％
FITC5mol％-T-使用表面活性剂合成：19.4％
FITC5mol％-T-使用表面活性剂合成：13.1％
Eu5mol％-CP-使用表面活性剂合成：7.1％
Eu10mol％-CP-使用表面活性剂合成：4.8％
Eu5mol％-CP-使用表面活性剂合成：3.6％
Eu10mol％-CP-使用表面活性剂合成：1.9％
(正常细胞(成纤维细胞)的活细胞率实验)
将正常细胞(NIH3T3细胞)在PS烧瓶培养(接种浓度：100×104Cells/37cm2)。此后，进行解冻以及接种7日，剥离、分离细胞。NIH3T3细胞的浓度是，(1.97±0.15)×105Cells/mL。
进行细胞的浓度调整，在DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基)培养10vol％的FBS(胎牛血清)。每1mL是，7.5×104cells/mL。
对12well的皿(培养面积：3.8cm2/well)以0.9mL/well的量接种。接种浓度是，1.8×104cells/cm2。
然后，进行培养(温度：37℃、CO2浓度：5％、湿度100％)。
12小时后，FA-Eu：将NPS添加到10vol％的DMEM，使分散，浓度调整为100mg/mL。
细胞增殖实验，通过MTT分析法实施。MTT分析法，吞噬入细胞内的MTT[3-(4， 5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]，将通过细胞内的线粒体的脱氢酶还原产生的甲月替染料，由有机溶剂萃取，测定570nm的吸光度，从而测量活细胞率的方法。
接种后24小时后、48小时后、72小时后，添加100μL的MTT reagent(Cat.No.10009591)，培养3小时(温度：37℃，CO2浓度：5％，湿度：100％)。然后，除去培养基，添加1mL的 (Crystal Dissolving Solution)(Cat.No.10009593)、震动(可变模式、1分钟)。570nm中测定吸光度。
活细胞率(％)由以下式算出。
活细胞率(％)＝(评估对象细胞的吸光度-空白的吸光度)/(颗粒非添加细胞的吸光度- 空白的吸光度)×100
图15是显示细胞毒性定量实验的结果的图表，其中(a)没有被与癌细胞结合的叶酸修饰的发光纳米颗粒，(b)用与癌细胞结合的叶酸修饰的发光纳米颗粒。如图15中的(a)所示，叶酸非修饰(叶酸修饰前)的全颗粒中，没有添加颗粒的样本，即，可视为仅与诱发正常的细胞增殖特性的组织培养聚苯乙烯同样的正常增殖特性。如图15中的(b)所示，叶酸修饰后的全颗粒中，可视为与没有对细胞增殖特性造成危害的叶酸分子(FA)相同的正常增殖特性。以上，本实施形式的颗粒，表示为没有给予细胞毒性的正常增殖特性。
(癌细胞成像和荧光强度测定)
Hela癌细胞在PS烧瓶培养(接种浓度：100×104cells/37cm2)。进行解冻以及接种7日。
剥离、分离细胞。Hela的浓度是，99±0.07)×105cells/mL。
进行细胞的浓度调整，在DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基)培养10vol％的FBS(胎牛血清)。每1mL是，7.5×104cells/mL。
对PS培养皿(培养面积：9.6cm2)以2.25mL/PS的量接种，接种浓度为1.8×104Cells/cm2。
(显微镜观察)
然后，进行培养(温度：37℃、CO2浓度：5％、湿度100％)。
12小时后，FA-Eu：将NPS添加到10vol％的DMEM，使分散，浓度调整为100mg/mL。
活细胞成像，将颗粒对细胞表面喷雾3小时后，24小时后、48小时后、72小时后中，除去培养基。然后、添加1mL的PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)，进行除去(1次)。此外，添加1mL的蒸馏水，进行除去(1次)。
进行荧光强度的测定。
含有Eu3+：Ex过滤器：485nm±40nm
Em过滤器：590nm±35nm
含有Eu3+：Ex过滤器：485nm±40nm
Em过滤器：540nm±35nm
仅24小时后进行荧光显微镜观察。
另外，荧光强度(PL)，培养后，除去培养基，用PBS和蒸馏水，除去了“没有与细胞结合的颗粒”，或者“没有吞噬入细胞的颗粒”，由特定的激发波长和检测波长测量。因此，得到的荧光强度，仅是“与细胞结合的颗粒”，或者“吞噬入细胞的颗粒”引起的发光。
图16是关于有无细胞结合分子修饰差异的含有Eu3+的二氧化硅颗粒，其中(a)表示荧光强度和培养时间关系的图表，(b)以及(c)是吞噬颗粒的细胞的荧光成像图。如图16中的(a)所示，有细胞连接分子修饰的含有Eu3+的二氧化硅颗粒，比没有细胞连接分子修饰的含有Eu3+的二氧化硅颗粒，对于培养时间的荧光强度的上升大，72小时后，显示为约5倍的荧光强度。如图16中的(b)所示，没有细胞连接分子修饰的含有Eu3+的二氧化硅颗粒的情况下，不能进行活细胞成像，有细胞连接分子修饰的含有Eu3+的二氧化硅颗粒的情况下，能进行活细胞成像。此外，该结果，显示为含有Eu3+的二氧化硅颗粒具有优良的发光稳定性以及耐光性。
图17是关于有无细胞结合分子修饰差异的含有FITC的二氧化钛颗粒，其中(a)表示荧光强度和培养时间关系的图表，(b)以及(c)是吞噬颗粒的细胞的荧光成像图。如图17中的(a)所示，有细胞连接分子修饰的含有FITC的二氧化钛颗粒，比没有细胞连接分子修饰的含有FITC的二氧化钛颗粒，对培养时间的荧光强度的上升大，72小时后，显示为约5倍的荧光强度。如图17中的(b)所示，没有细胞连接分子修饰的含有FITC的二氧化钛颗粒的情况下，不能进行活细胞成像，有细胞连接分子修饰的含有FITC的二氧化钛颗粒的情况下，能进行活细胞成像(图17中的(c))。此外，该结果，显示为含有FITC的二氧化钛颗粒具有优良的发光稳定性以及耐光性。
图18是关于有无细胞结合分子修饰差异的含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒，其中(a)表示荧光强度和培养时间关系的图表，(b)以及(c)是吞噬颗粒的细胞的荧光成像图。如图18中的(a)所示，有细胞连接分子修饰的含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒，比没有细胞连接分子修饰的含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒，对培养时间的荧光强度的上升大，72小时后，显示为约4倍的荧光强度。如图18中的(b)所示，没有细胞连接分子修饰的含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒的情况下，不能进行活细胞成像，有细胞连接分子修饰的含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒的情况下，能进行活细胞成像(图18中的(c))。此外，该结果，显示为含有Eu3+的磷酸钙化合物颗粒具有优良的发光稳定性以及耐光性。
(测定装置)
本实施例中使用的主要测定装置，如下。
·荧光分光光度计(日本分光株式会社制、装置名：FP-8500)：
在激发侧带宽度：10nm，荧光侧带宽度：10nm，扫描速度：200nm/分，数据提取间隔：0.1nm，反应：1秒，PMT电压：350V进行。测定，20mg的样品，通过直径为16mm的圆形石英窗进行。
·红外线分光光度计(JASCO株式会社制，装置名：FT/IR-4100)：
通过KBr粉末法进行。目标样本的粉末由KBr粉末稀释10倍，测定透过率(％)。背景作为KBr粉末，累计次数100回，分辨率是2.0cm﹣1。
·电子扫描显微镜(日立高新技术株式会社制，装置名：SU8000)[作为二氧化钛颗粒系(T)使用]
在FE电压为5kV、电流为10μA的条件下进行观察。将0.01wt％下调制的纳米颗粒的酒精悬浊液在硅衬底上滴下、干燥进行观察。
·电子透射显微镜(日立高新技术株式会社制，装置名：HT7700)[作为二氧化硅颗粒系(S)和磷酸钙化合物颗粒系(CP)使用]：
将0.01wt％下调制的纳米颗粒的酒精悬浊液，碳覆盖的铜网格((株式会社)Okenshoji 公司制，商品名：碳/弗姆瓦膜)从上面滴下。滴下的网格，氮气氛下24小时在干燥剂下干燥，在加速电压120kV下观察。
·荧光显微镜(OLYMPUS(株式会社)制，装置名：CKX41)：
暴露100m秒，灵敏度是ISO400。此外，光源是OLYMPUS(株式会社)制的装置名：使用U-RFLT50。关于根据激发过滤器的特定波长区域(专利说明资料PDF文件21页)，通过分色镜对样本进行照射，发光通过分色镜以及吸收过滤器检测。
·粉末X射线衍射((株式会社)日本理学株式会社制，装置名：Smart Lab)：
X射线源：在CuKα线源(λ：
Figure BDA0003884576380000271
)，输出：40kV/30mA，扫描速度：5.0°/min，样品宽度：0.01°，测定模式：连续，的条件下测定。折射线位置、折射角、以及半频带宽度，通过装置附属的软件((株式会社)日本理学株式会社制，软件名：PDXL)获得。
·荧光X射线分析((株式会社)日本理学株式会社制，装置名：ZSX PrimusⅠⅠ)：
样本粉末的直径10mm的小球，使用液压冲床制作的。测定，使用装置附属的软件((株式会社)日本理学株式会社制，软件名：EZ scanprogram)进行解析。

Claims (19)

1.一种发光纳米颗粒，其特征在于，包括母体材料以及包含于所述母体材料内的发光物质；
所述母体材料，含有选自由Ti、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素；
所述发光物质在所述母体材料中的浓度是所述发光物质间的平均距离为1.2nm以上的浓度。
2.如权利要求1所述的发光纳米颗粒，其特征在于，所述母体材料含有选自由TiO2、Ca10(PO4)6(OH)2、Al2O3以及ZrO2构成的群中选择的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的发光纳米颗粒，其特征在于，所述发光物质含有选自由有机发光色素以及稀土类离子构成的群中的至少一种。
4.如权利要求3所述的发光纳米颗粒，其特征在于，所述有机发光色素是荧光素系色素分子。
5.如权利要求3或4所述的发光纳米颗粒，其特征在于，所述有机发光色素的含有浓度相对于所述阳离子元素在1mmol％以上6mol％以下。
6.如权利要求3所述的发光纳米颗粒，其特征在于，所述稀土类离子是三价的Eu。
7.如权利要求3或6所述的发光纳米颗粒，其特征在于，所述稀土类离子的含有浓度相对于所述阳离子元素在1mmol％以上10mol％以下。
8.如权利要求1至7的任意一项所述的发光纳米颗粒，其特征在于，所述母体材料包含表面活性剂分子。
9.如权利要求1至8的任意一项所述的发光纳米颗粒，其特征在于，所述发光纳米颗粒的平均粒径是10nm-500nm。
10.如权利要求1至9的任意一项所述的发光纳米颗粒，其特征在于，在表面具有孔径为0.1-10nm的微孔。
11.如权利要求1至10的任意一项所述的发光纳米颗粒，其特征在于，在表面形成有与所述阳离子元素结合的羟基和/或氨基。
12.如权利要求1至11的任意一项所述的发光纳米颗粒，其特征在于，表面通过细胞连接分子修饰。
13.如权利要求1至12的任意一项所述的发光纳米颗粒，其特征在于，激发波长及发光波长存在于可见光区域。
14.如权利要求1至13的任意一项所述的发光纳米颗粒，其特征在于，用于生物成像。
15.如权利要求1至14的任意一项所述的发光纳米颗粒，其特征在于，表面的微孔承载药剂，作为治疗剂使用。
16.一种细胞的检测方法，其特征在于，具有将如权利要求1至15的任意一项所述的发光纳米颗粒投入细胞内，对所述发光纳米颗粒进行光照射，观察所述细胞的工序。
17.一种医疗装置，其特征在于，具有：检查部，其用于进行体内细胞检查；诊断部，其用于进行所述体内细胞诊断；和/或治疗部，其用于进行所述体内细胞的治疗；
其中，还具有光照射部，其在进行所述检查、所述诊断、和/或所述治疗时，将如权利要求1至15的任意一项所述的发光纳米颗粒投入体内细胞内，对所述发光纳米颗粒进行光照射。
18.一种细胞的可视化方法，其特征在于，包括：
将发光纳米颗粒投入细胞内，对所述发光纳米颗粒进行光照射，使所述细胞可视化的工序；
该发光纳米颗粒包括母体材料以及包含于所述母体材料内的发光物质；
所述母体材料中含有选自由Ti、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素。
19.一种减轻细胞损伤的方法，其特征在于，将发光纳米颗粒投入细胞内，用可见光区域的波长的光使所述发光纳米颗粒激发；
该发光纳米颗粒包括母体材料以及包含于所述母体材料内的发光物质；
所述母体材料中含有选自由Ti、Ca、Al以及Zr构成的群中的至少一种阳离子元素，以及选自由O和P构成的群中的至少一种阴离子元素。
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