JP7096557B2 - 発光ナノ粒子、それを用いた細胞の検出方法、動物の治療方法、医療装置、細胞の可視化方法、及び細胞の損傷軽減方法 - Google Patents

Description

本発明は、発光ナノ粒子に関する。特に好ましくは、バイオイメージングに用いられる発光ナノ粒子、それを用いた細胞の検出方法、動物の治療方法、医療装置、細胞の可視化方法、及び細胞の損傷軽減方法に関する。

近年、がん細胞などの腫瘍を、生体親和性の高いマーカー材料によって細胞レベルで高感度に検出する技術が求められている。

特許文献１には、バイオイメージング材料として、二光子吸収性及び蛍光性を有する色素とデンドロンとが結合した水溶性デンドリマーからなる二光子吸収材料が記載されている。

特許文献２には、量子ドットの表面が、疎水性基と極性基とを含む界面活性剤型重合開始剤により被覆されてなる水分散性量子ドットを、生体内バイオイメージング用粒子として用いることが記載されている。

特許文献３には、界面活性剤により保護されたコアまたはコア／シェル構造の疎水性無機物ナノ粒子に、炭素数８～２０個の炭化水素鎖によりチオール基と親水基とが結合された有機配位子を１～３０当量添加して界面活性剤を部分的に置換し、ナノ粒子の表面に金属チオラート（Ｍ－Ｓ）結合を形成することによって、一部分だけが親水性に表面改質され、無極性有機溶媒で個別分散性を維持する疎水性ナノ粒子を製造する段階等を含む、バイオイメージングナノ粒子の製造方法が記載されている。

特許文献４には、赤外光等のエネルギーが低い光を励起光として用い、可視光の蛍光を得る現象であるアップコンバージョン特性を有する蛍光粒子であって、蛍光粒子の材質が、Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｒ^３＋，Ｙｂ^３＋、Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｒ^３＋、ＮａＹＦ_４：Ｅｒ^３＋，Ｙｂ^３＋のうちいずれか１種、またいずれか２種以上の組み合わせである、バイオイメージングに用いられる蛍光粒子が記載されている。

特許文献５には、平均粒子径が１～２０ｎｍである半導体ナノ粒子であって、それを構成する主要成分原子と等価の価電子配置をもつ異種原子もしくは当該異種原子の原子対をドーパントとして含有し、かつ当該ドーパントが半導体ナノ粒子表面又はその近傍に分布している、分子・細胞イメージングに用いる半導体ナノ粒子が記載されている。

特許文献６には、第１の蛍光物質と、該第１の蛍光物質と識別可能な励起／発光特性を有する第２の蛍光物質とを含む蛍光物質内包ナノ粒子を含む病理診断用蛍光標識剤が記載されている。

特許文献７には、希土類蛍光錯体を含有してなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子からなる蛍光標識剤、標的分子測定用キットが記載されている。

また、非特許文献１～４にも、量子ドットや蛍光色素などをバイオイメージングに用いることが記載されている。

特開２０１０－１３３８８７号公報 特開２００９－１９０９７６号公報 特開２００９－１０７１０６号公報 特開２０１３－１４６５１号公報 国際公開第２００９／０６６５４８号 特開２０１３－５７０３７号公報 国際公開第２００５／０２３９６１号

"Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐＨ－ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅｓ " Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５， １０４ （２００９） "Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．" Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１， ２０１６ （１９９８） "Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ－Ｐａｓｓｉｖａｔｅｄ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ： Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ ｏｆ Ｆｏｒｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ． " Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４３， １７３ （２０１０） "Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ－Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｅ－Ｓｈｅｌｌ Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ．" Ｃｈｅｍ． Ｅｕｒ． Ｊ．， １５， ３５７７ （２００９）

上述のとおり、近年、がん細胞などの腫瘍を、生体親和性の高いマーカー材料によって細胞レベルで高感度に検出する技術が求められている。例えば、細胞のがん化においては、形態変化が起こる前に、分子レベルの活動変化が起こる。例えば、がん細胞は、正常細胞に比べ、ブドウ糖を多量に消費する傾向にある。同時に、細胞膜上に葉酸受容体が過剰発現するため、葉酸分子を特異的に結合・取込する傾向にある。このような細胞の分子レベル変化を、高精度に画像化することができれば、がん細胞などの超早期診断を実現することが可能となる。

しかし、画像化のためのイメージング材料として、有機分子を用いた場合、劣化・退色速度が速く、例えば、蛍光観察下における数十分間の光照射によって、発光粒子が消光するなどの問題があった。また、バイオイメージング材料として、量子ドットなどの無機材料を用いた場合には、カドミウムのような毒性の高い元素が含まれる場合があり、生体適合性などの問題があった。

本発明は、発光安定性及び耐光性を備え、生体毒性の低い、発光ナノ粒子、それを用いた細胞の検出方法、動物の治療方法、医療装置、細胞の可視化方法、及び細胞の損傷軽減方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意検討した結果、発光性の分子又はイオンを無機材料で包接した複合粒子を創製し、発光安定性及び耐光性を備え、生体毒性の低い、発光ナノ粒子、それを用いた細胞の検出方法、動物の治療方法、医療装置、細胞の可視化方法、及び細胞の損傷軽減方法を発明した。

すなわち、本発明は、以下の（１）～（２３）である。
（１）母体材料と、母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、
母体材料は、Ｔｉ、Ｓｉ、Ｃａ、Ａｌ及びＺｒからなる群から選択される少なくとも一種である陽イオン元素と、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有し、
前記発光物質の前記母体材料中の濃度は、前記発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上となる濃度である、発光ナノ粒子。
（２）母体材料は、ＴｉＯ_２、ＳｉＯ_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、Ａｌ_２Ｏ_３及びＺｒＯ_２からなる群から選択される少なくとも一種を含有する、（１）記載の発光ナノ粒子。
（３）母体材料と、前記母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、
前記母体材料は、Ｔｉ、Ｃａ、Ａｌ及びＺｒからなる群から選択される少なくとも一種である陽イオン元素と、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有する、発光ナノ粒子。
（４）母体材料は、ＴｉＯ_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、Ａｌ_２Ｏ_３及びＺｒＯ_２からなる群から選択される少なくとも一種を含有する、（３）記載の発光ナノ粒子。
（５）前記発光物質の前記母体材料中の濃度は、前記発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上となる濃度である、（３）又は（４）記載の発光ナノ粒子。
（６）発光物質は、有機発光色素及び希土類イオンからなる群から選択される少なくとも一種を含有する、（１）～（５）のいずれか記載の発光ナノ粒子。
（７）有機発光色素は、フルオレセイン系色素分子である、（６）記載の発光ナノ粒子。
（８）有機発光色素の含有濃度は、前記陽イオン元素に対して１ｍｍｏｌ％以上６ｍｏｌ％以下である、（６）又は（７）記載の発光ナノ粒子。
（９）希土類イオンは、三価のＥｕである、（６）記載の発光ナノ粒子。
（１０）希土類イオンの含有濃度は、陽イオン元素に対して１ｍｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下である、（６）又は（９）記載の発光ナノ粒子。
（１１）母体材料が界面活性剤分子を含む、（１）～（１０）のいずれか記載の発光ナノ粒子。
（１２）発光ナノ粒子の平均粒子径が１０ｎｍ～５００ｎｍである、（１）～（１１）のいずれか記載の発光ナノ粒子。
（１３）孔径が０．１～１０ｎｍの細孔を表面に備える、（１）～（１２）のいずれか記載の発光ナノ粒子。
（１４）表面に、陽イオン元素に結合した水酸基及び／又はアミノ基が形成されている、（１）～（１３）のいずれか記載の発光ナノ粒子。
（１５）表面が細胞結合分子によって修飾された、（１）～（１４）のいずれか記載の発光ナノ粒子。
（１６）励起波長及び発光波長が可視光領域に存在する、（１）～（１５）のいずれか記載の発光ナノ粒子。
（１７）バイオイメージングに用いられる、（１）～（１６）のいずれか記載の発光ナノ粒子。
（１８）表面の細孔に薬剤を担持し、治療薬として用いられる、（１）～（１７）のいずれか記載の発光ナノ粒子。
（１９）（１）～（１７）のいずれか記載の発光ナノ粒子を細胞内に投入し、発光ナノ粒子に光を照射し、細胞を観察する工程を有する、細胞の検出方法。
（２０）（１）～（１８）のいずれか一項記載の発光ナノ粒子を動物に投与し、発光ナノ粒子に光を照射し、動物を治療する工程を有する、動物の治療方法。
（２１）体内細胞の検査を行う検査部と、体内細胞の診断を行う診断部と、及び／又は体内細胞の治療を行う治療部とを備え、検査、診断、及び／又は、治療を行う際に、（１）～（１８）のいずれか記載の発光ナノ粒子を体内細胞内に投入し、発光ナノ粒子に光を照射する光照射部をさらに備える、医療装置。
（２２）母体材料と、母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、母体材料が、Ｔｉ、Ｓｉ、Ｃａ、Ａｌ及びＺｒからなる群から選択される少なくとも一種である陽イオン元素と、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有する発光ナノ粒子を、細胞内に投入し、発光ナノ粒子に光を照射し、細胞を可視化する工程を有する、細胞の可視化方法。
（２３）母体材料と、母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、母体材料が、Ｔｉ、Ｓｉ、Ｃａ、Ａｌ及びＺｒからなる群から選択される少なくとも一種である陽イオン元素と、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有する発光ナノ粒子を、細胞内に投入し、可視光領域の波長の光で発光ナノ粒子を励起させる、細胞の損傷軽減方法。

本発明によれば、発光安定性及び耐光性を備え、生体毒性の低い、発光ナノ粒子、及びそれを用いた細胞の検出方法、動物の治療方法、医療装置、細胞の可視化方法、細胞の損傷軽減方法を提供することができる。

本発明の一実施形態である発光ナノ粒子の外観を示す模式図である。 本発明の一実施形態である発光ナノ粒子が、がん細胞に取り込まれるメカニズムを模式的に示した図である。 各種母体材料における発光物質の分散を示す、電子顕微鏡観察像（ＴＥＭ像）である。 各種母体材料における発光物質濃度と蛍光寿命（τ）との関係を示すグラフである。 Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子の濃度別の電子顕微鏡観察像（ＴＥＭ像）である。 母体材料がシリカの場合の、窒素吸脱着等温線と細孔径分布曲線とを示すグラフである。 フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）含有チタニア粒子の濃度別の電子顕微鏡観察像（ＦＥ－ＳＥＭ像）と、粒子径分布である。 Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子の濃度別の電子顕微鏡観察像（ＴＥＭ像）である。 粉末Ｘ線回折パターンを示すグラフであり、（ａ）Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子、（ｂ）ＦＩＴＣ含有チタニア粒子、（ｃ）Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子、である。 Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子についての界面活性剤除去前の赤外線吸収スペクトルを示すグラフである。 赤外線吸収スペクトルを示すグラフであり、（ａ）Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子、（ｂ）ＦＩＴＣ含有チタニア粒子、（ｃ）Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子、である。 励起スペクトルを示すグラフであり、（ａ）Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子、（ｂ）ＦＩＴＣ含有チタニア粒子、（ｃ）Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子、である。 発光スペクトルを示すグラフであり、（ａ）Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子、（ｂ）ＦＩＴＣ含有チタニア粒子、（ｃ）Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子、である。 入射光、散乱光、蛍光の強度スペクトルを示すグラフである。 細胞毒性定量試験の結果を示すグラフであり、（ａ）がん細胞と結合する葉酸で修飾されていない発光ナノ粒子、（ｂ）がん細胞と結合する葉酸で修飾された発光ナノ粒子、である。 細胞結合分子の修飾有無で異なるＥｕ^３＋含有シリカ粒子について、（ａ）蛍光強度と培養時間の関係を示すグラフであり、（ｂ）及び（ｃ）は粒子が取り込まれた細胞の蛍光イメージング像である。 細胞結合分子の修飾有無で異なるＦＩＴＣ含有チタニア粒子について、（ａ）蛍光強度と培養時間の関係を示すグラフであり、（ｂ）及び（ｃ）は粒子が取り込まれた細胞の蛍光イメージング像である。 細胞結合分子の修飾有無で異なるＥｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子について、（ａ）蛍光強度と培養時間の関係を示すグラフであり、（ｂ）及び（ｃ）は粒子が取り込まれた細胞の蛍光イメージング像である。

以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は当該実施形態によって限定的に解釈されるものではない。

本実施形態の第１の発光ナノ粒子は、母体材料と、母体材料内に含まれる発光物質と、を含む。母体材料は、Ｔｉ、Ｓｉ、Ｃａ、Ａｌ及びＺｒからなる群から選択される少なくとも一種である陽イオン元素と、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有する。

図１は、本実施形態の第１の発光ナノ粒子１の外観を模式的に示す模式図である。第１の発光ナノ粒子１は、母体材料２を備え、母体材料２中には発光物質３が含まれている。

第１の発光ナノ粒子１において、発光物質の母体材料中の濃度は、発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上となる濃度である。ここで、「発光物質間の平均距離」とは、発光ナノ粒子の平均粒子径、母体材料の分子量、密度、発光物質の濃度等から、下記の計算によって導かれる理論的な値をいう。よって、「発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上となる濃度」とは、式（１）～（６）を使った計算によって導かれた理論的な発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上となるときの濃度をいう。

なお、発光物質間の平均距離の算出に当たっては、発光ナノ粒子中に、発光物質が略均一に分散している状態を確認する。発光物質の分散状態の確認は、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で行うことができる。また、蛍光寿命測定法によって、発光物質濃度と蛍光寿命との関係から、発光物質が発光ナノ粒子内において略均一に分散していることを確認してもよい。発光物質の濃度が異なる複数の発光ナノ粒子において、それぞれの発光ナノ粒子中の発光物質が略均一に分散しているとき、発光物質の各濃度に対する蛍光寿命のプロットは、負の直線性の相関関係を示す。これは、発光物質の濃度増加に伴って、発光物質の寄与する占有体積が線形的に減少し、発光物質間距離が短くなり、交差緩和過程の確率が高くなるからである。発光物質が凝集しているときは、このような相関関係とはならない。
したがって、蛍光寿命測定法によって、ある発光ナノ粒子における発光物質が凝集せずに略均一に分散しているか否かを確認するためには、以下の工程を行えばよい。まず、その発光ナノ粒子の構成成分及び発光物質の濃度を分析し、その発光ナノ粒子と同じ構成成分からなり、発光物質の濃度が異なる複数のサンプルを用意する。次に、複数のサンプルの蛍光寿命を測定して、濃度と蛍光寿命の関係が直線性の相関関係となることを確認する。複数のサンプルについて、発光物質の濃度と蛍光寿命の関係が直線性の相関関係であることが確認できたのであれば、その後、分析対象の発光ナノ粒子の蛍光寿命を測定して、発光物質の濃度と蛍光寿命との関係において、サンプルと分析対象のプロットが直線性の相関関係となっているか否かを確認する。サンプルと分析対象のプロットが直線性の相関関係となっていれば、発光ナノ粒子における発光物質が略均一に分散していると確認できる。

発光ナノ粒子の平均粒子径は、顕微鏡で発光ナノ粒子を観察し、発光ナノ粒子の粒子径を｛（長径＋短径）／２｝として求め、得られた複数の粒子径を平均した値である。例えば、走査型電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）を用いて所定の領域における任意の粒子１００個以上から、平均粒子径を算出することが好ましい。

具体的には、発光物質間の平均距離は、以下の式（１）～（６）によって算出できる。

（無機分子量密度）
Ｄｅ＝Ａ・ρ_ｎ／Ｍ 式（１）
Ｄｅ ：無機分子数密度（分子数／ｎｍ^３）
Ａ ：アボガドロ数（６．０２×１０^２３）
ρ_ｎ ：ｎｍ密度（ｇ／ｎｍ^３）
Ｍ ：各分子量（シリカ（Ｓ）：７９．８６６、チタニア（Ｔ）：６０．１、水酸アパタイト（ＣＰ）：１００４．６２）

（平均１粒子体積）
Ｖ_１＝（４π／３）・（Ｒ／２）^３ 式（２）
Ｖ_１：平均１粒子体積（ｎｍ^３／１粒子）
Ｒ：平均粒子径（ｎｍ）

（含有無機分子数）
Ｘ_１＝Ｄｅ・Ｖ_１ 式（３）
Ｘ_１：発光ナノ粒子に含有される無機分子数（分子数／１粒子）

（含有発光物質数）
Ｘ_２＝Ｘ_１・Ｂ 式（４）
Ｘ_２：発光ナノ粒子に含有される発光物質数（分子数／１粒子）
Ｂ ：無機分子数に対する発光物質数（分子数／分子数）

（発光物質１分子の専有体積）
Ｖ_２＝Ｖ_１／Ｘ_２ 式（５）
Ｖ_２：発光物質１分子の専有体積（ｎｍ^３／発光物質１分子）

（発光物質間距離）
Ｄ＝｛Ｖ_２・３／（４π）｝^１／３ 式（６）
Ｄ：発光物質の中心間距離（ｎｍ）

発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上であると、発光物質３の凝集体に起因する濃度消光を防止することができ、発光安定性に優れた発光ナノ粒子となる。一方、発光物質間の平均距離が短いと、励起錯体として振る舞うため、励起した際に生じたエネルギーが移動して発光するためのエネルギーとならず、発光効率の低下などを生じさせてしまうと、本発明者らは推察している。発光物質間の平均距離は、好ましくは１．５ｎｍ以上であり、より好ましくは２ｎｍ以上である。また、発光物質間の平均距離の上限は、汎用性のある蛍光検出器の感度の観点から、好ましくは１０ｎｍ以下である。母体材料中の発光物質の濃度は、無機分子数に対する発光物質数Ｂに対応する。このため、発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上になる上記濃度は、用いる上記式（１）～（６）中の各分子量Ｍ及び平均粒子径Ｒに応じて定まるものである。

母体材料は、Ｔｉ、Ｓｉ、Ｃａ、Ａｌ及びＺｒからなる群から選択される少なくとも一種である陽イオン元素と、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有する。好適な母体材料としては、陽イオン元素であるＴｉと陰イオン元素であるＯとを含む酸化チタンや、陽イオン元素であるＳｉと陰イオン元素であるＯとを含む酸化シリコン、陽イオン元素であるＡｌと陰イオン元素であるＯとを含む酸化アルミニウム、陽イオン元素であるＺｒと陰イオン元素であるＯとを含む酸化ジルコニウムが、挙げられる。

酸化チタン及び酸化シリコンは、Ｍ（ＯＲ）_ｎの一般式で表される金属アルコキシド（ＭはＳｉ又はＴｉ、Ｒは炭素数が１～５のアルキル基）が水素結合により凝集した粒子であってもよく、又は、金属アルコキシド同士が脱水縮合し、骨格構造（－（Ｍ－Ｏ－Ｍ）_ｎ－）を形成した粒子であってもよい。

母体材料としては、陽イオン元素であるＣａと陰イオン元素であるＰ及びＯとを含むリン酸カルシウム化合物も挙げられる。

リン酸カルシウム化合物は、リン酸源（リン酸、第１リン酸ナトリウム、第２リン酸ナトリウム、第１リン酸カリウム、第２リン酸カリウム、第１リン酸アンモニウム、第２リン酸アンモニウム、などより選択される１種以上の塩）と、カルシウム源（硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、などより選択される１種以上の塩）との混合物、又は混合反応物であることが好ましい。リン酸カルシウム化合物としては、リン酸一水素カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ_４）、リン酸一水素カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）、リン酸三カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、リン酸二水素カルシウム無水和物（Ｃａ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２）、リン酸二水素カルシウム１水和物（Ｃａ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２・Ｈ_２Ｏ）、リン酸四カルシウム（Ｃａ_４Ｏ（ＰＯ_４）_２）、水酸アパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、リン酸八カルシウム（Ｃａ_８Ｈ_２（ＰＯ_４）_６・５Ｈ_２Ｏ）、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２・ｎＨ_２Ｏ）が挙げられる。

第１の発光ナノ粒子において、母体材料は、ＴｉＯ_２、ＳｉＯ_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、Ａｌ_２Ｏ_３及びＺｒＯ_２からなる群から選択される少なくとも一種を含有することが好ましい。これらの母体材料は、生体への毒性が低く、生体適合性に優れている。この中でも、ＴｉＯ_２、ＳｉＯ_２又はＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２が、第１の発光ナノ粒子の母体材料としてより好ましい。

本実施形態の第２の発光ナノ粒子は、母体材料と、母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、母体材料が、Ｔｉ、Ｃａ、Ａｌ及びＺｒからなる群から選択される少なくとも一種である陽イオン元素と、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有する、発光ナノ粒子である。

第２の発光ナノ粒子において、母体材料は、ＴｉＯ_２、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、Ａｌ_２Ｏ_３及びＺｒＯ_２からなる群から選択される少なくとも一種を含有することが好ましい。これらの母体材料は、生体への毒性が低く、生体適合性に優れている。この中でも、ＴｉＯ_２又はＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２が、第２の発光ナノ粒子の母体材料としてより好ましい。

第２の発光ナノ粒子においても、発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上であると、発光物質の濃度消光を防止することができ、発光安定性に優れた発光ナノ粒子とすることができることから、好ましい。発光物質間の平均距離は、好ましくは１．５ｎｍ以上であり、より好ましくは２ｎｍ以上である。また、発光物質間の平均距離の上限は、汎用性のある蛍光検出器の感度の観点から、好ましくは１０ｎｍ以下である。

第１の発光ナノ粒子又は第２の発光ナノ粒子（以下、第１の発光ナノ粒子でも第２の発光ナノ粒子でも対象となる場合は、単に「発光ナノ粒子」と記載する場合がある）において、発光物質は、有機発光色素及び希土類イオンからなる群から選択される少なくとも一種を含有することが好ましい。

有機発光色素は、特に制限されないが、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ピレン系色素分子及びシアニン系色素分子からなる群から選択される少なくとも一種が好ましい。この中でも、フルオレセイン系色素分子が好ましく、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、可視光領域で励起及び発光することから、本実施形態における発光物質として好適に用いられる。

希土類イオンは、特に制限されないが、三価のＣｅ、四価のＣｅ、三価のＰｒ、三価のＮｄ、三価のＰｍ、三価のＳｍ、二価のＥｕ、三価のＥｕ、三価のＧｄ、三価のＴｂ、三価のＤｙ、三価のＨｏ、三価のＥｒ、三価のＴｍ、三価のＹｂ及び三価のＬｕからなる群から選択される少なくとも一種が好ましい。この中でも三価のＥｕであるＥｕ^３＋は、可視光領域で励起及び発光することから、本実施形態の発光ナノ粒子における発光物質として好適に用いられる。

有機発光色素の含有濃度は、母体材料の陽イオン元素に対して１ｍｍｏｌ％以上６ｍｏｌ％以下であることが好ましい。有機発光色素の含有濃度が当該範囲であることによって、発光物質間の平均距離を１．２ｎｍ以上に維持しやすい傾向にある。有機発光色素の含有濃度は、陽イオン元素に対し、１００ｍｍｏｌ％以上５．５ｍｏｌ％以下であることがより好ましく、１ｍｏｌ％以上５ｍｏｌ％以下であることがさらに好ましい。
希土類イオンの含有濃度は、母体材料の陽イオン元素に対して１ｍｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下であることが好ましい。希土類イオンの含有濃度が当該範囲であることによって、発光物質間の平均距離を１．２ｎｍ以上に維持しやすい傾向にある。希土類イオンの含有濃度は、陽イオン元素に対し、１００ｍｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下であることがより好ましく、１ｍｏｌ％以上５ｍｏｌ％以下であることがさらに好ましい。

母体材料は、界面活性剤分子を含むことが好ましい。界面活性剤分子を含むことによって、発光物質間の平均距離を適正な範囲に維持できる傾向にある。界面活性剤分子としては、特に限定されないが、例えば、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化オクタデシルトリメチルアンモニウム、臭化デシルトリメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルジメチルエチルアンモニウム、ヘキサデシルアミン、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（ＥＯ）－ポリオキシプロピレングリコール（ＰＯ）共重合体（ＥＯ_２０ＰＯ_３０）、ポリオキシエチレン（ＥＯ）－ポリオキシプロピレングリコール（ＰＯ）－ポリオキシエチレン（ＥＯ）両親媒性トリブロック共重合体（ＥＯ_５ＰＯ_６８ＥＯ_５、ＥＯ_２０ＰＯ_７０ＰＥＯ_２０、ＥＯ_９７ＰＯ_６７ＥＯ_９７）などを用いることができる。なお、発光物質間の平均距離を適正な範囲に維持する必要がない場合には、界面活性剤分子を母体材料に含まなくてもよい。

母体材料における界面活性剤分子の含有量は、母体材料の金属元素に対するモル比が０．０１以上であることが好ましい。母体材料の金属元素に対するモル比が０．０１以上であることによって、母体材料中の発光物質の分散性が向上し、発光物質間の平均距離を適正な範囲に維持できる傾向にある。より好ましくはモル比が０．０５以上であり、さらに好ましくはモル比が０．１以上である。また、上記モル比の上限は、界面活性剤の粒子表面又は粒子外へ液晶相のみの偏析防止の観点から、好ましくは１．５以下であり、より好ましくは０．２以下である。

母体材料を縮合反応で調製する場合には、カチオン性界面活性剤を用いることが好ましい。カチオン性界面活性剤を用いることによって、静電的相互作用で複合化し、相分離を防止し、分散性に優れた状態を形成できる。また、界面活性剤は、母体材料を添加する前の溶液に先に分散させておくと、親水性の官能基が外側に向く方向でミセルが形成され、シリカやチタニアなどのアモルファスなクラスター構造と発光物質とがナノスケールで複合化した状態で集積していくと考えられる。これにより、母体材料中の発光物質の分散性が向上し、発光物質間の平均距離を適正な範囲に維持できる傾向にあることから、好ましい態様である。なお、例えば母体材料に応じて、カチオン性界面活性剤ではなく、非イオン性界面活性剤やアニオン性界面活性剤を用いてもよい。

発光ナノ粒子の平均粒子径は、１０ｎｍ～５００ｎｍであることが好ましい。平均粒子径が当該範囲であることによって、発光ナノ粒子が標的となる細胞に取り込まれやすくなり、細胞を観察する上で好適となる傾向にある。一方、平均粒子径が小さいと、細胞の活動機能に作用して毒性の問題が生じる傾向にあるため、好ましくない。発光ナノ粒子の平均粒子径は、５０ｎｍ～４５０ｎｍがより好ましく、１００ｎｍ～４００ｎｍがさらに好ましい。なお、本発光ナノ粒子を例えば細胞イメージングに用いない場合には、平均粒子径は５００ｎｍより大きくてもよい。

発光ナノ粒子は、孔径が０．１～１０ｎｍの細孔を、表面に備えることが好ましい。発光ナノ粒子表面の焼成又は溶媒抽出により、孔径が０．１～１０ｎｍの細孔が発光ナノ粒子表面に形成される傾向にある。孔径が０．１～１０ｎｍの細孔を備えると、例えば低分子薬剤を発光ナノ粒子に担持することが可能となり、治療薬として用いることも可能となる。細孔の孔径は、１ｎｍ～１０ｎｍであることがより好ましく、２ｎｍ～６ｎｍであることがさらに好ましい。なお、発光ナノ粒子は、例えば用いられる用途に応じて、孔径が０．１～１０ｎｍの細孔を表面に備えていなくてもよい。
母体材料がシリカの時に、細孔が形成される傾向にある。これは、界面活性剤と、発光物質を含む母体材料であるシリカとの間の相互作用が比較的弱く、焼成や溶媒抽出プロセスによって界面活性剤が脱離し、細孔が形成されることによるものと考えられる。一方、母体材料がチタニアやリン酸カルシウム化合物などの場合には、細孔が形成されにくい傾向にある。これは、界面活性剤と、発光物質を含む母体材料であるチタニアやリン酸カルシウム化合物との間の相互作用が強く、界面活性剤が脱離し難いことによると推察される。

発光ナノ粒子の表面に、母体材料の陽イオン元素に結合した水酸基（ＯＨ基）が形成されていることが好ましい。また、母体材料の表面をアミノ基が修飾していることも好ましく、例えばアミノ基を含有したシランカップリング剤を用いて形成してもよい。ＯＨ基およびアミノ基は、細孔内表面に限らず、細孔外表面などの粒子表面にあればよく、細孔外表面にあることが好ましい。ＯＨ基またはアミノ基が細胞結合分子と水素結合又は縮合重合による共有結合で固定化され、発光ナノ粒子の表面が細胞結合分子に修飾されると、細胞結合分子は、がん細胞や正常細胞と特異結合することができる。細胞結合分子が細胞と特異結合すると、発光ナノ粒子が細胞内に取り込まれる。これにより、細胞内の発光ナノ粒子を発光させ、がん細胞などを検出することが可能となる。なお、発光ナノ粒子の用途によっては、表面にＯＨ基やアミノ基が形成されていなくもよい。

細胞結合分子としては、ＨＥＲ２抗体、ヒト上皮成長因子受容体に特異結合する抗体、がん特異的抗体、リン酸化タンパク抗体、葉酸、葉酸受容体βに特異結合する抗体、血管内皮細胞特異的抗体、組織特異的抗体、トランスフェリン、トランスフェリン結合型ペプチド、糖鎖と結合性を有するタンパク質などが挙げられる。この中でも、がん細胞が取り込む傾向にある葉酸を、細胞結合分子として用いることが好ましい。がん細胞は、細胞膜上に葉酸受容体が過剰発現するため、葉酸分子を特異的に結合・取込する傾向にあるからである。

また、発光ナノ粒子の表面が抗がん剤分子で修飾されてもよい。抗がん剤分子が、がん細胞と特異結合すると、発光ナノ粒子が細胞内に取り込まれる。これにより、細胞内の発光ナノ粒子を発光させ、がん細胞を検出することができ、かつ、抗がん剤分子もがん細胞に取り込まれ、抗がん剤が作用し、がん細胞の増殖を抑制することができる。なお、本実施形態の発光ナノ粒子は、がん細胞以外にも広く適用できることから、表面が抗がん剤分子で修飾されていなくてもよい。

細胞結合分子や抗がん剤分子は、発光ナノ粒子の表面に、化学結合によって修飾、固定されることが好ましい。化学結合としては、ペプチド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）、水素結合などが挙げられる。

図２は、本発明の一実施形態である発光ナノ粒子が、がん細胞に取り込まれるメカニズムを模式的に示した図である。図２に示すように、発光物質３を含有する母体材料２を備える発光ナノ粒子１は、母体材料２の表面にＯＨ基又はアミノ基の結合手４を有し、細胞結合分子６とペプチド結合５で結合し、細胞結合分子修飾型発光ナノ粒子７を形成してもよい。細胞結合分子修飾型発光ナノ粒子７は、がん細胞１０の受容体１１に結合し、がん細胞１０内に取り込まれてもよい。

本実施形態の発光ナノ粒子は、励起波長及び発光波長が可視光領域に存在することが好ましい。励起波長及び発光波長が可視光波長以上であると、光照射による生体組織及び標識材料の劣化を軽減できる。また、試料表面の光散乱を軽減し、観察感度を向上させることもできる。なお、発光ナノ粒子を用いる用途において、生体組織や標識材料へのダメージを考慮する必要がない場合には、励起波長及び発光波長が可視光領域に存在しなくてもよい。

本実施形態の発光ナノ粒子は、バイオイメージングに用いられることが好ましい。母体材料として有機分子を用いた場合、劣化・退色速度が速く、紫外線で励起することによって、正常な生体組織が損傷するという問題があった。また、量子ドットなどの無機材料を用いた場合には、毒性の高い元素が含まれるなど生体適合性の問題があり、励起光の波長が紫外線領域を含むため、生体組織にダメージを与えてしまう恐れもあった。これに対し、本実施形態の発光ナノ粒子は、発光安定性及び耐光性を備え、生体組織へのダメージを軽減でき、生体毒性も低いことから、バイオイメージングに好適に用いることができる。なお、本実施形態の発光ナノ粒子は、バイオイメージング以外の用途に用いられることも好ましい態様である。

本実施形態の細胞の検出方法は、発光ナノ粒子を細胞内に投入し、発光ナノ粒子に光を照射し、細胞を観察する工程を有する。本検出方法によれば、本実施形態の発光ナノ粒子が高感度であるため、細胞の観察をより容易に行うことが可能となる。

本実施形態の動物の治療方法は、発光ナノ粒子を動物に投与し、発光ナノ粒子に光を照射し、動物を治療する工程を有する。本治療方法によれば、本実施形態の発光ナノ粒子が高感度であり、かつ、生体親和性が高いため、動物の体内疾患の状況を感度よく、かつ安全に検知することができ、動物の疾患を適切に治療することが可能となる。

本実施形態の医療装置は、体内細胞の検査を行う検査部と、体内細胞の診断を行う診断部と、及び／又は体内細胞の治療を行う治療部とを備え、検査、診断、及び／又は、治療を行う際に、（１）～（１８）のいずれか記載の発光ナノ粒子を体内細胞内に投入し、発光ナノ粒子に光を照射する光照射部をさらに備える、医療装置である。ここで、体内細胞の検査を行う検査部としては、例えば精密画像診断を行う蛍光内視鏡が挙げられる。また、体内細胞の診断を行う診断部としては、例えば組織生検を行う装置が挙げられる。さらに、体内細胞の治療を行う治療部としては、内視鏡による腫瘍部摘出装置が挙げられる。また、体内細胞の例としては、口腔癌、咽頭癌、食道癌、大腸癌、小腸癌、肺癌、乳癌、膀胱癌に係るがん細胞を例示することができる。本医療装置によれば、本実施形態の発光ナノ粒子が高感度であり、かつ、生体親和性が高いため、体内細胞の検査、診断、治療を感度よく、かつ安全に行うことが可能となる。

本実施形態の細胞の可視化方法は、母体材料と、母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、母体材料が、Ｔｉ、Ｓｉ、Ｃａ、Ａｌ及びＺｒからなる群から選択される少なくとも一種である陽イオン元素と、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有する発光ナノ粒子を、細胞内に投入し、発光ナノ粒子に光を照射し、細胞を可視化する工程を有する方法である。本可視化方法によれば、本実施形態の発光ナノ粒子が高感度であるため、細胞の可視化をより容易に行うことが可能となる。

本実施形態の細胞の損傷軽減方法は、母体材料と、母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、母体材料が、Ｔｉ、Ｓｉ、Ｃａ、Ａｌ及びＺｒからなる群から選択される少なくとも一種である陽イオン元素と、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有する発光ナノ粒子を、細胞内に投入し、可視光領域の波長の光で発光ナノ粒子を励起させる工程を有する方法である。本方法によれば、本実施形態の発光ナノ粒子が高感度であり、発光ナノ粒子を励起させる光の波長が可視光領域であるため、従来の細胞イメージング方法に比べ、細胞の損傷を軽減することが可能となる。

以下、本発明の具体的な実施例について説明する。なお、本発明は当該実施例によって限定的に解釈されるものではない。

＜実施例１、２、比較例１＞
（Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子の合成）
脱イオン水２２５ｍＬに、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）１．０ｇを添加し、さらに２．０Ｍ－ＮａＯＨ３．５ｍＬを添加し、３５３Ｋで３０分間攪拌した。攪拌した溶液に、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）５．５１５ｍＬ、ＥｕＣｌ_３が含まれる脱イオン水１５ｍＬを加え（ＥｕＣｌ_３が０ｇのとき、Ｅｕの合成開始時の仕込み量は０モル％であり、「Ｅｕ０ｍｏｌ％－Ｓ」と示した（比較例１）。ＥｕＣｌ_３が０．４５２ｇのとき、Ｅｕの合成開始時の仕込み量は５モル％であり、「Ｅｕ５ｍｏｌ％－Ｓ」と示した（実施例１）。ＥｕＣｌ_３が０．９０４ｇのとき、Ｅｕの合成開始時の仕込み量は１０モル％であり、「Ｅｕ１０ｍｏｌ％－Ｓ」と示した（実施例２））、３５３Ｋで２時間攪拌し、濾過した。濾過物を脱イオン水２０ｍＬで４回、エタノール１０ｍＬで１回洗浄した。その後、室温で１日乾燥させ、５５０℃で６時間焼成した。
実施例１、２、比較例１の粒子を構成する元素の濃度等は、表１のとおりである。

＜実施例３、比較例２、３＞
（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）含有チタニア粒子の合成）
０．０１１ｍＬ（４．６３×１０^－５ｍｏｌ）の３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ：Ｃ_９Ｈ_２３ＮＯ_３Ｓｉ）、０ｍｇ（０ｍｏｌ、比較例２）、又は、９１．１ｍｇ（実施例３）、又は、１８２ｍｇ（４．６８×１０^－４ｍｏｌ、比較例３）のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：Ｃ_２１Ｈ_１１ＮＯ_５Ｓ）、３６．１ｍＬ（０．４７１ｍｏｌ）の２－プロパノール（ＩＰＡ）を混合し、室温でマグネチックスターラーを用いて２４時間撹拌した。この溶液へ、Ｔｉ／ＡＰＴＥＳモル比＝１００となるように１．３７ｍＬ（４．６８×１０^－３ｍｏｌ）のチタニウムテトライソプロポキシド（ＴＴＩＰ：Ｃ_１２Ｈ_２８Ｏ_４Ｔｉ）を加えて混合し、溶液Ａを調製した。比較例２のＦＩＴＣの合成開始時の仕込み量は０モル％であり、「ＦＩＴＣ０ｍｏｌ％－Ｔ」、実施例３のＦＩＴＣの合成開始時の仕込み量は５モル％であり、「ＦＩＴＣ５ｍｏｌ％－Ｔ」、比較例３のＦＩＴＣの合成開始時の仕込み量は１０モル％であり、「ＦＩＴＣ１０ｍｏｌ％－Ｔ」と示した。
３７．３ｍＬ（０．４８７ｍｏｌ）のＩＰＡと０．２３１ｍＬ（１．２８×１０^－２ｍｏｌ）のイオン交換水を混合し、溶液Ｂを調製した。２０５ｍｇ（７．６１×１０^－４ｍｏｌ）のオクタデシルアミン（ＯＤＡ：Ｃ_１８Ｈ_３９Ｎ）、１８９ｍＬ（２．４７ｍｏｌ）のＩＰＡ、及び０．９００ｍＬ（４．９９×１０^－２ｍｏｌ）のイオン交換水を混合し、溶液Ｃをポリプロピレン製の容器へ調製した。ここで、ＡＰＴＥＳはＯＤＡおよびＦＩＴＣとの水素結合等の形成に伴う相互作用発現を期待した。ＩＰＡはＴＴＩＰ、ＡＰＴＥＳ、ＦＩＴＣおよびＯＤＡの良溶媒として用い、イオン交換水はＴＴＩＰおよびＡＰＴＥＳ加水分解するための反応物質として用い、ＯＤＡは生成物の形状、サイズ及びナノ構造の制御のために使用した。
溶液ＡとＢは、それぞれ流速３０ｍＬ・ｍｉｎ^－１で送液し、混合した。その反応液を溶液Ｃの容器へ流速６０ｍＬ・ｍｉｎ^－１で吐出し、吐出終了までマグネチックスターラーを用いて撹拌した後、室温で２４時間静置し、粒子分散液を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）によって固液分離し、上澄み液を除去した後に沈殿物を６０℃で一晩乾燥し、試料粉末を得た。
実施例３、比較例２、３の粒子を構成する元素の濃度等は、表２のとおりである。

＜実施例４、５、比較例４＞
（Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子の合成）
１００ｍＬのＨ_２Ｏ（８０℃）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、分子量３６４．４５）８．７５ｇ（０．０２４ｍｏｌ）からなる溶液に、Ｋ_２ＨＰＯ_４を２．０９ｇ（０．０１２ｍｏｌ）、１Ｎ－ＮａＯＨを添加し、ｐＨ１３となった溶液を４０℃以下まで冷ました。
次に、６０ｍＬのＨ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏが２．８７ｇ（０．０１９５ｍｏｌ）、ＥｕＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏが０ｇ（０ｍｍｏｌ）、０．３５７ｇ（０．９ｍｍｏｌ）、又は０．７１４ｇ（１．９ｍｍｏｌ）であった。比較例４のＥｕの合成開始時の仕込み量は０モル％であり、「Ｅｕ０ｍｏｌ％－ＣＰ」、実施例４のＥｕの合成開始時の仕込み量は５モル％であり、「Ｅｕ５ｍｏｌ％－ＣＰ」、実施例５のＥｕの合成開始時の仕込み量は１０モル％であり、「Ｅｕ１０ｍｏｌ％－ＣＰ」と示した。これらのＥｕ含有溶液を６ｍＬ／分の滴下速度で、４０℃以下まで冷ました溶液に滴下した。滴下後、攪拌しながら、４０℃で２４時間加熱還流した。得られた白色の沈殿物を純水で２回洗浄し、エタノールで２回洗浄した。洗浄後、遠心分離し（１００００Ｇ、１５分、４℃）、１００℃で２４時間乾燥した。
実施例４、５、比較例４の粒子を構成する元素の濃度等は、表３のとおりである。

（ＴＥＭによる発光物質分散の観察）
実施例２、５、比較例３の発光ナノ粒子について、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による発光物質分散の観察を行った。
具体的には、各種粒子粉末を０．１ｗｔ％の濃度でエタノールへ分散させ、超音波処理を１５分間施し、粒子分散液をガラス基板上へ０．０１ｍＬ／ｃｍ^２の濃度でキャストした。１日間真空乾燥を施し、基板表面へカーボン蒸着（膜厚：１０ｎｍ）を施し、集束イオンビームにより、粒子膜の断面（面積：８μｍ×６μｍ）を切り出し、カーボンマイクログリッドへ載せた。次いで、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）（日立ハイテクノロジーズ株式会社製、ＨＴ７７００）、及び付属ＥＤＳ（エネルギー分散型Ｘ線分光法）により、粒子膜の中心部を評価・解析した。
観察結果を図３に示す。図３において、発光物質は白色の略円形状の単一な分子・イオンとして存在し、発光ナノ粒子内にて分散して存在していることを確認した。

（発光物質間の平均距離の測定方法）
母体材料中に発光物質が分散していることをＴＥＭで確認できたので、発光ナノ粒子の平均粒子径、発光物質の濃度から、発光物質間の平均距離を算出した。
具体的には、蛍光Ｘ線（ＸＲＦ）分析と走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）観察とにより、母体材料である無機相の金属元素に対する発光物質の濃度計算より、発光物質間距離を算出した。
（１）無機相の無機分子数密度の算出
以下の表４のように、無機相の密度（既知値）より、無機相の分子数密度を算出した。

（注１）シリカ相の密度は、多孔質シリカの密度１．５０を用いた（参考文献：岩元和敬、妹尾学、「ゾルゲル法による無機・有機複合材料の機能化」生産研究，４２（８），１９９０．等）。
（注２）チタニア相の密度は、ＸＲＤパターンよりアモルファス相であることがわかる（アモルファスでないと種々の発光物質の含有が困難である）。そこで、アモルファス相のチタニアの密度３．０ｇ／ｃｍ^３を用いた（参考文献：Ｍ． Ｌａｕｂｅ， Ｆ． Ｒａｕｃｈ， Ｃ． Ｏｔｔｅｒｍａｎｎ， Ｏ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｋ． Ｂａｎｇｅ， Ｎｕｃｌ． Ｉｎｓｔｒｕｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．， Ｓｅｃｔ． Ｂ， １９９６， １１３， ２８８－２９２； Ｃ． Ｒ． Ｏｔｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｋ． Ｂａｎｇｅ， Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍｓ， １９９６， ２８６， ３２－３４； Ｄ． Ｍｅｒｇｅｌ， Ｄ． Ｂｕｓｃｈｅｎｄｏｒｆ， Ｓ． Ｅｇｇｅｒｔ， Ｒ． Ｇｒａｍｍｅｓ ａｎｄ Ｂ． Ｓａｍｓｅｔ， Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍｓ， ２０００， ３７１， ２１８－２２４； Ｄ． Ｍｅｒｇｅｌ， Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍｓ， ２００１， ３９７， ２１６－２２２； Ｖ． Ｖ． Ｈｏａｎｇ， Ｈ． Ｚｕｎｇ ａｎｄ Ｎ． Ｈ． Ｂ． Ｔｒｏｎｇ， Ｅｕｒ． Ｐｈｙｓ． Ｊ． Ｄ， ２００７， ４４， ５１５－５２４． 等）。
（注３）水酸アパタイト（ＣＰ）の密度は、ＸＲＤパターンより水酸アパタイト単相の結晶相を確認したため、水酸アパタイト単相の結晶相の密度（３．２ｇ／ｃｍ^３）を用いた。

（２）平均粒子径、１粒子当たりの無機分子数の算出
実施例１～５、比較例３の発光ナノ粒子について、ＦＥ－ＳＥＭを用いて発光ナノ粒子の粒径を１００個以上計測し、平均粒子径を算出した。また、１粒子当たりに含まれる無機相の無機分子数を算出した（表５参照）。

（注４）各粒子は異方性形状なため、上記平均粒子径Ｒは｛（長径＋短径）／２｝として計算した。
（注５）発光物質の体積は点（ゼロ）とみなして計算した。シリカ相の場合は無機シリカ分子ユニット１個に対してＳｉが１個、チタニア相の場合は無機チタニア分子ユニット１個に対してＴｉが１個、水酸アパタイト相の場合は無機水酸アパタイト分子ユニット１個に対してＣａが６個の対応関係を利用した。

（３）発光物質間距離の算出
ＸＲＦにより得た無機金属元素に対する発光物質の濃度から、発光物質間距離を算出した。表６のとおり、実施例１～５及び比較例３で作製された発光ナノ粒子は、母体材料に含まれる発光物質間の平均距離は、比較例３であるＦＩＴＣ１０ｍｏｌ％－Ｔ以外は１．２ｎｍ以上であった。

（注６）発光物質が界面活性剤により略均一に単分散していると仮定した。

（Ｂ）蛍光寿命による検証
蛍光寿命測定により、発光物質の分散性を検証した。発光物質の試料は、以下の実施例で作製した合成時の仕込み量が５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％の発光物質に加え、２．５ｍｏｌ％の試料も準備した。発光物質Ｅｕについては、日本分光株式会社製・蛍光分光光度計ＦＰ－８５００を用いた。発光物質ＦＩＴＣについては株式会社堀場製作所製・蛍光寿命光度計ＤｅｌｔａＰｒｏを用いて行った。光源はキセノンフラッシュランプを用い、励起波長は蛍光スペクトルと同波長を用い、検出波長は蛍光スペクトルの極大波長を用いた。励起側と受光側のスリットバンド幅は２ｎｍとした。フラッシュランプ点灯直後から、発光物質Ｅｕについては５０ｍｓの間の蛍光強度変化を計測し、発光物質ＦＩＴＣについては２００ｎｓの間の蛍光強度変化を計測し、その蛍光強度の減衰曲線を１０回繰り返し測定した。その１０回分の減衰曲線を下記式（７）へフィッティングし、蛍光寿命τを算出した。
Ｉ（ｔ）＝Ｉ（０）ｅｘｐ（－ｔ／τ） 式（７）
ここで、Ｉ（ｔ）は時間ｔにおける蛍光強度であり、Ｉ（０）はフラッシュランプ点灯直後の蛍光強度である。その結果、蛍光寿命τは下記の表７となった。そして、横軸を発光物質濃度、縦軸を蛍光寿命τとしたプロットを作成した。その結果を図４に示す。

図４（ａ）はシリカ相（Ｓ）、図４（ｂ）はチタニア相（Ｔ）、図４（ｃ）は水酸アパタイト（ＣＰ）の発光物質濃度と蛍光寿命との関係を示すグラフであり、図４（ａ）～（Ｃ）のように、各濃度に対する蛍光寿命のプロットは、負の直線性の相関関係を示した。この相関関係が単調減少であるため、発光物質に対して等価な母体環境であることが推察された。つまり、発光物質の濃度増加に伴って、発光物質の寄与する占有体積が線形的に減少し、発光物質間距離が短くなり、交差緩和過程の確率が高くなった（励起エネルギーが部分的に近接イオンに移動し、結果的に生じる２個の低い励起状態のイオンは基底状態へと急速に緩和する現象を示している）。発光物質濃度と蛍光寿命との相関係数が０．９５以上と高い相関を示しており、発光物質同士が凝集せず単一な分子・イオンとして略均一に分散して存在しており、且つ、発光物質間距離が小さくなっていると考えられる。以上により、実施例で用いた発光ナノ粒子において、発光物質が略均一に分散して存在していることを確認した。

図５は、Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子の濃度別の電子顕微鏡観察像（ＴＥＭ像）である。図５（ａ）は比較例１（Ｅｕ０ｍｏｌ％－Ｓ）であり、図５（ｂ）は実施例１（Ｅｕ５ｍｏｌ％－Ｓ）であり、図５（ｃ）は実施例２（Ｅｕ１０ｍｏｌ％－Ｓ）である。図５（ａ）～（ｃ）のとおり、Ｅｕの濃度が高くなるほど、Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子の平均粒子径（Ｄ）が小さくなる傾向を示した。また、相対標準偏差である変動係数（ＣＶ）は１５～２０％であった。

実施例１、２、比較例１の粒子のアスペクト比は、以下の表８のとおりとなった。アスペクト比は、粒子の長軸サイズを短軸サイズで除すことによって求めた。Ｅｕの濃度が高くなるほどアスペクト比が減少し、粒子が針状から球状の形態へ変化したことを示した。

実施例１、２のＥｕ^３＋含有シリカ粒子における発光物質間の平均距離は、それぞれ１．５ｎｍと１．２ｎｍであった（上記表６参照）。
また、実施例１、２のＥｕ^３＋含有シリカ粒子について、界面活性剤の溶媒抽出または焼成（酸化分解）により、径が１～１０ｎｍの範囲の細孔が観測された。下記表９へ比表面積と細孔径の解析結果を示した。また、図６として、窒素吸脱着等温線及び細孔径分布を示した。図６（ａ）及び（ｄ）はＥｕ０ｍｏｌ％－Ｓ、図６（ｂ）及び（ｅ）はＥｕ５ｍｏｌ％－Ｓ、図６（ｃ）及び（ｆ）はＥｕ１０ｍｏｌ％－Ｓに関する。測定法は、窒素吸脱着等温線測定（マイクロトラック・ベル(株)製ＢＥＬＳＯＲＰ－ｍｉｎｉ）により、（ＢＥＴ法より求める）ＢＥＴ比表面積と（ＢＪＨ法より求める）ＢＪＨ細孔径分布を測定した。試料を室温で一昼夜脱気し、１００℃で１２時間乾燥させて、吸着温度－１９６℃、最大平衡圧力７６０Ｔｏｒｒにて測定した。その結果、表９に示すように、Ｅｕのドープ量の増加に伴ってメソ細孔の拡張が確認された。含有メソ細孔径の分布中心は、約２～６ｎｍであった。

図７は、ＦＩＴＣ含有チタニア粒子の濃度別の電子顕微鏡観察像（ＦＥ－ＳＥＭ像）と、粒子径分布である。図７（ａ）は比較例２（ＦＩＴＣ０ｍｏｌ％－Ｔ）であり、図７（ｂ）は実施例３（ＦＩＴＣ５ｍｏｌ％－Ｔ）であり、図７（ｃ）は比較例３（ＦＩＴＣ１０ｍｏｌ％－Ｔ）である。図７（ａ）～（ｃ）のとおり、ＦＩＴＣの濃度が高くなるほど、ＦＩＴＣ含有チタニア粒子の平均粒子径（Ｄ）はわずかに大きくなる傾向を示した。また、変動係数（ＣＶ）は８．１～１０．４％であった。

実施例３、比較例２、３の粒子のアスペクト比は、以下の表１０のとおりとなった。アスペクト比は、粒子の長軸サイズを短軸サイズで除すことによって求めた。

実施例３、比較例３のＦＩＴＣ含有チタニア粒子における発光物質間の平均距離は、それぞれ１．２ｎｍと０．９ｎｍであり（表６参照）、発光物質の濃度増加に伴い減少する傾向を示した。
また、実施例３のＦＩＴＣ含有チタニア粒子について、界面活性剤の溶媒抽出または焼成（酸化分解）により、細孔は観測されなかった。これは界面活性剤と実施例３のＦＩＴＣ含有チタニア粒子との相互作用が、界面活性剤と実施例１、２のＥｕ^３＋含有シリカ粒子との相互作用よりも強いことにより、界面活性剤が脱離し難かったことによるもの、と推察された。

図８は、Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子の濃度別の電子顕微鏡観察像（ＴＥＭ像）である。図８（ａ）は比較例４（Ｅｕ０ｍｏｌ％－ＣＰ）であり、図８（ｂ）は実施例４（Ｅｕ５ｍｏｌ％－ＣＰ）であり、図８（ｃ）は実施例５（Ｅｕ１０ｍｏｌ％－ＣＰ）である。図８（ａ）～（ｃ）のとおり、Ｅｕの濃度が高くなるほど、Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子の平均粒子径（Ｄ）が小さくなる傾向を示した。また、変動係数（ＣＶ）は２３～３０％であった。

実施例４、５、比較例４の粒子のアスペクト比は、以下の表１１のとおりであり、Ｅｕの濃度が高くなるほどアスペクト比が減少し、粒子が針状から球状の形態へ変化したことを示した。

図９は、粉末Ｘ線回折パターンを示すグラフであり、（ａ）Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子、（ｂ）ＦＩＴＣ含有チタニア粒子、（ｃ）Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子、である。図９（ａ）では、Ｅｕの析出物やシリカの結晶に由来するピークはみられず、アモルファス構造であり、Ｅｕ含有量が多くなるほど、ピーク強度が低くなる傾向を示した。図９（ｂ）では、ＦＩＴＣ含有量が多くなるほど、グラフの左端側のピーク強度が高くなる傾向を示した。図９（ｃ）では、面指数の帰属から結晶構造が水酸アパタイト単相であり、Ｅｕ含有量が多くなるほど、ピークの半値幅が低くなる部分も見られた。

図１０は、Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子についての界面活性剤除去前の赤外線吸収スペクトルを示すグラフである。３６４０ｃｍ^－１の水素結合タイプのＳｉ－ＯＨ伸縮振動、２９２５ｃｍ^－１のＣ－Ｈ伸縮振動（―ＣＨ_３）、２８５５ｃｍ^－１のＣ－Ｈ伸縮振動（―ＣＨ_２―）、１４８０ｃｍ^－１のＣ－Ｈ変角振動（―ＣＨ_２―）、１２２５ｃｍ^－１のＳｉ－Ｏ－Ｓｉ非対称伸縮振動（（Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ）ｎ由来）、１０７０ｃｍ^－１のＳｉ－Ｏ－Ｓｉ対称伸縮振動（（Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ）ｎ由来）、９６５ｃｍ^－１のＳｉ－ＯＨ伸縮振動、７９５ｃｍ^－１のＳｉ－ＯＨ伸縮振動等の特性吸収帯を観測した。２９２５ｃｍ^－１のＣ－Ｈ伸縮振動（―ＣＨ_３）、２８５５ｃｍ^－１のＣ－Ｈ伸縮振動（―ＣＨ_２―）、１４８０ｃｍ^－１のＣ－Ｈ変角振動（―ＣＨ_２―）における吸収帯の存在により、界面活性剤の存在を確認した。

図１１は、赤外線吸収スペクトルを示すグラフであり、（ａ）Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子、（ｂ）ＦＩＴＣ含有チタニア粒子、（ｃ）Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子、である。図１１（ａ）では、３６４０ｃｍ^－１の水素結合タイプのＳｉ－ＯＨ伸縮振動、１２２５ｃｍ^－１のＳｉ－Ｏ－Ｓｉ非対称伸縮振動（（Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ）ｎ由来）、１０７０ｃｍ^－１のＳｉ－Ｏ－Ｓｉ対称伸縮振動（（Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ）ｎ由来）、９６５ｃｍ^－１のＳｉ－ＯＨ伸縮振動、７９５ｃｍ^－１のＳｉ－ＯＨ伸縮振動、等の特性吸収帯を観測した。焼成又は溶媒抽出プロセスによって、２９２５ｃｍ^－１のＣ－Ｈ伸縮振動（―ＣＨ_３）、２８５５ｃｍ^－１のＣ－Ｈ伸縮振動（―ＣＨ_２―）、１４８０ｃｍ^－１のＣ－Ｈ変角振動（―ＣＨ_２―）の吸収帯がなくなるため、界面活性剤が除去されたと判断した。
図１１（ｂ）では、３６４０ｃｍ^－１のチタニア構造内に存在する－ＯＨ基の伸縮振動、３７２０～３０００ｃｍ^－１の粒子表面のＨ_２Ｏ及びＴｉ－ＯＨのＯＨ基の伸縮振動、２９２０ｃｍ^－１及び２８５０ｃｍ^－１の界面活性剤ＯＤＡ（オクタデシルアミン）及び発光物質ＦＩＴＣに起因する－ＣＨ_３と－ＣＨ_２－の伸縮振動、１４６０ｃｍ^－１の－ＣＨ_２－の変角振動、１５９０ｃｍ^－１のＣ＝Ｏ伸縮振動、等の特性吸収帯を観測した。最終的なＩＰＡによる洗浄プロセスによっても界面活性剤が残存していた。このことから、チタニア／ＦＩＴＣと界面活性剤の相互作用により界面活性剤が残存したと推察した。
図１１（ｃ）では、３５５０ｃｍ^－１の水酸アパタイトの結晶構造内に存在する－ＯＨ基の伸縮振動、１１００ｃｍ^－１、１０００ｃｍ^－１、９６０ｃｍ^－１のリン酸基のＰ－Ｏ伸縮振動、３８００～３０００ｃｍ^－１及び１６５０ｃｍ^－１の粒子表面のＨ_２ＯのＯＨ基の伸縮振動、等の特性吸収帯を観測した。リン酸カルシウム化合物（特に、水酸アパタイト）の特徴的なピークであるＰ－Ｏ及び－ＯＨの伸縮振動を観測した。最終的に、界面活性剤は観測されなかった。これは、洗浄により、界面活性剤が十分除去されたためである。ＸＲＦ結果より、最終的な洗浄プロセスによって界面活性剤を除去できることが確認されるが、ＣＰでは細孔が形成されなかった。

実施例４、５のＥｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子における発光物質間の平均距離は、それぞれ１．６ｎｍと１．３ｎｍであった（表６参照）。
実施例４、５のＥｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子について、界面活性剤の溶媒抽出または焼成（酸化分解）により、細孔が観測されなかった。これは界面活性剤とＥｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子との相互作用が、界面活性剤と実施例１、２のＥｕ^３＋含有シリカ粒子との相互作用よりも強いことにより、Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子において界面活性剤が脱離し難かったことによるもの、と推察された。

＜実施例６～８＞
（発光物質５ｍｏｌ％含有粒子への、がん細胞結合分子（葉酸誘導体ＦＡ－ＮＨＳ）の修飾）
実施例１、３、４の各発光物質５モル％含有粒子２５０ｍｇに、ＨＣｌ水溶液（ｐＨ＝２）１２ｍＬを添加し、超音波処理を行った。次に、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）０．７８ｍＬ（３．３ｍｍｏｌ）を５ｍＬのエタノールに含有させた溶液を調製し、超音波処理した溶液に加え、混合溶液を得た。当該混合溶液を４０℃で２０時間攪拌した（ｐＨ＜６．５）。攪拌終了後、当該混合溶液を遠心分離し、エタノールで洗浄した。洗浄後、減圧乾燥し、ＡＰＴＥＳが表面に修飾した発光物質５ｍｏｌ％含有粒子１５０ｍｇを得た。このＡＰＴＥＳ／発光物質５モル％含有粒子１５０ｍｇに、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）２５ｍＬを添加し、超音波処理を行った。次に、ＦＡ－ＮＨＳ（葉酸誘導体）４３０ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１２ｍＬに含有させた溶液を調製し、超音波処理した溶液に加え、混合溶液を得た。当該混合溶液を室温で３時間攪拌した。攪拌終了後、当該混合溶液を遠心分離し、水で洗浄した。洗浄後、減圧乾燥し、実施例６～８のＦＡ（葉酸）／発光物質５ｍｏｌ％含有粒子を得た。

図１２は、励起スペクトルを示すグラフであり、（ａ）Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子、（ｂ）ＦＩＴＣ含有チタニア粒子、（ｃ）Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子である。図１２（ａ）では、４６５ｎｍのｆ－ｆ遷移に起因するピークを観測した。図１２（ｂ）では、４６８、４８３、４９３ｎｍにおいて、マイナスにイオン化した単分子の発光物質ＦＩＴＣに起因するピーク（カチオン性剤ＯＤＡ（オクタデシルアミン）と相互作用してＦＩＴＣが単分散に粒子内へ導入された）を観測した。図１２（ｃ）では、４６５ｎｍのｆ－ｆ遷移に起因するピークを観測した。

図１３は、発光スペクトルを示すグラフであり、（ａ）Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子、（ｂ）ＦＩＴＣ含有チタニア粒子、（ｃ）Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子、である。図１３（ａ）では、５７７ｎｍの^５Ｄ_０から^７Ｆ_０への遷移、５８５ｎｍ・５９０ｎｍ・５９５ｎｍの^５Ｄ_０から^７Ｆ_１への遷移、６１１ｎｍのＤ_０から^７Ｆ_２への遷移、６４６ｎｍの^５Ｄ_０から^７Ｆ_３への遷移、７００ｎｍの^５Ｄ_０から^７Ｆ_４への遷移に起因するピークを観測した。最終的な焼成又は溶媒抽出プロセス（界面活性剤の除去プロセス）によっては、発光スペクトル形状と強度において変化がなかった。この結果から、粒子が核形成されて結晶成長する過程時の発光物質の略均一分散化・固定化において、界面活性剤は重要な役割を担っていると考えられた。
図１３（ｂ）では、５４０ｎｍ付近の発光物質ＦＩＴＣの単分散分子又は２分子会合状態に起因するピークを観測した。凝集体に起因するピークは観測されなかったため、界面活性剤分子と相互作用して略均一分散して存在したと考えられた。
図１３（ｃ）では、発光物質Ｅｕ（ＩＩＩ）イオンの４ｆ－４ｆ遷移による蛍光ピーク；５９０ｎｍの^５Ｄ_０→^７Ｆ_１、６１６ｎｍの^５Ｄ_０→^７Ｆ_２、６５２ｎｍの^５Ｄ_０→^７Ｆ_３、７００ｎｍの^５Ｄ_０→^７Ｆ_４遷移に起因するピークを観測した。最終的な洗浄プロセス（界面活性剤除去プロセス）によっては、発光スペクトル形状と強度において変化がなかった。この結果からも、粒子が核形成されて結晶成長する過程時の発光物質の略均一分散化・固定化において、界面活性剤は重要な役割を担っていると考えられた。

各発光物質の合成仕込時の５ｍｏｌ％試料と１０ｍｏｌ％試料について、界面活性剤を使用して粒子合成し、発光物質が粒子内で略均一に分散している場合と、界面活性剤を一切使用せず本実施例と同実験方法で粒子合成し、発光物質が粒子内で凝集している場合の量子収率を測定した。蛍光スペクトル測定装置によって、量子収率を求めた。φ６０ｍｍの積分球ＩＳＦ－８３４を用いて測定を行った、励起散乱光の測定には、積分球の反射位置に石英窓板を張り付けた状態で標準白板をセットし測定した。入射光、散乱光、および蛍光の強度スペクトルを測定し、それらの積分ピーク強度を算出し、それぞれ、Ｉ_０、Ｉ_１及びＩ_２と略記し、量子収率（内部量子効率）Φ_ｉｎｔを式（８）より算出した。なお、励起／蛍光スペクトルは、各試料の励起／蛍光スペクトル図中にみられる極大波長を用いた
Φ_ｉｎｔ＝Ｉ_２／（Ｉ_０－Ｉ_１）×１００ 式（８）

図１４は、入射光、散乱光、蛍光の強度スペクトルを示すグラフである。また、測定した量子収率の結果は以下のとおりである。界面活性剤を使用して合成した場合の方が、不使用の場合よりも量子収率が高く、発光物質の略均一分散化（高効率発光）において界面活性剤が重要であることを示した。
Ｅｕ５ｍｏｌ％－Ｓ－界面活性剤使用合成：１１．５％
Ｅｕ１０ｍｏｌ％－Ｓ－界面活性剤使用合成：８．３％
Ｅｕ５ｍｏｌ％－Ｓ－界面活性剤不使用合成：２．５％
Ｅｕ１０ｍｏｌ％－Ｓ－界面活性剤不使用合成：１．３％
ＦＩＴＣ５ｍｏｌ％－Ｔ－界面活性剤使用合成：１９．４％
ＦＩＴＣ５ｍｏｌ％－Ｔ－界面活性剤不使用合成：１３．１％
Ｅｕ５ｍｏｌ％－ＣＰ－界面活性剤使用合成：７．１％
Ｅｕ１０ｍｏｌ％－ＣＰ－界面活性剤使用合成：４．８％
Ｅｕ５ｍｏｌ％－ＣＰ－界面活性剤不使用合成：３．６％
Ｅｕ１０ｍｏｌ％－ＣＰ－界面活性剤不使用合成：１．９％

（正常細胞（線維芽細胞）の生細胞率試験）
正常細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）をＰＳフラスコで培養した（播種濃度：１００×１０^４ｃｅｌｌｓ／３７ｃｍ^２）。その後、解凍及び播種を７日間行い、細胞を剥離・分離した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の濃度は、（１．９７±０．１５）×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
細胞の濃度調整を行い、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変培地）に１０ｖｏｌ％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を培養した。１ｍＬあたり、７．５×１０^４ｃｅｌｌｓであった。
１２ｗｅｌｌプレート（培養面積：３．８ｃｍ^２／ｗｅｌｌ）へ０．９ｍＬ／ｗｅｌｌの量で播種した。播種濃度は、１．８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であった。
その後、培養した（温度：３７℃、ＣＯ_２濃度：５％、湿度１００％）。
１２時間後、ＦＡ－Ｅｕ：ＮＰＳ粒子を１０ｖｏｌ％ＤＭＥＭへ添加し、分散させ、濃度１００ｍｇ／ｍＬに調整した。

細胞増殖試験をＭＴＴアッセイにより実施した。ＭＴＴアッセイは、細胞内に取り込まれたＭＴＴ［３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ］が、細胞内にあるミトコンドリアの脱水素酵素によって還元されて生じるフォルマザン色素を、有機溶媒により抽出し、５７０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞率を計測する方法である。
播種後２４時間後、４８時間後、７２時間後において、ＭＴＴ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０００９５９１）を１００μＬ添加し、３時間培養した（温度：３７℃、ＣＯ_２濃度：５％、湿度：１００％）。その後、培地を除去し、結晶溶解溶液（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０００９５９３）を１ｍＬ添加し、振った（可変モード、１分間）。５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
生細胞率（％）は、以下の式で算出した。
生細胞率（％）＝（評価対象細胞の吸光度－ブランクの吸光度）／（粒子非添加細胞の吸光度－ブランクの吸光度）×１００

図１５は、細胞毒性定量試験の結果を示すグラフであり、（ａ）がん細胞と結合する葉酸で修飾されていない発光ナノ粒子、（ｂ）がん細胞と結合する葉酸で修飾された発光ナノ粒子、である。図１５（ａ）に示すとおり、葉酸非修飾（葉酸修飾前）の全粒子において、粒子無添加試料、すなわち、正常な細胞増殖特性が誘起される組織培養ポリスチレンのみと同様に正常な増殖特性がみられた。図１５（ｂ）に示すとおり、葉酸修飾後の全粒子において、細胞増殖特性へ害を加えないとされる葉酸分子（ＦＡ）のみと同様に正常な増殖特性がみられた。以上より、本実施形態の粒子は、細胞へ毒性を与えず正常な増殖特性を示した。

（がん細胞イメージングと蛍光強度測定）
Ｈｅｌａがん細胞をＰＳフラスコで培養した（播種濃度：１００×１０^４ｃｅｌｌｓ／３７ｃｍ^２）。解凍及び播種を７日間行った。
細胞を剥離、分離した。Ｈｅｌａの濃度は、（０．９９±０．０７）×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
細胞の濃度調整を行い、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変培地）に１０ｖｏｌ％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を培養した。１ｍＬあたり、７．５×１０^４ｃｅｌｌｓであった。
ＰＳシャーレ（培養面積：９．６ｃｍ^２）へ２．２５ｍＬ／ＰＳの量で播種し、播種濃度は１．８×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であった。（顕微鏡観察）
その後、培養した（温度：３７℃、ＣＯ_２濃度：５％、湿度１００％）。
１２時間後、ＦＡ－Ｅｕ：ＮＰＳ粒子を１０ｖｏｌ％ＤＭＥＭへ添加し、分散させ、濃度１００ｍｇ／ｍＬに調整した。

生細胞イメージングは、粒子を細胞表面へ噴霧した３時間後から、２４時間後、４８時間後、７２時間後において、培地除去した。その後、１ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を添加し、除去した（１回）。また、１ｍＬの蒸留水を添加し、除去した（１回）。
蛍光強度測定を行った。
Ｅｕ^３＋含有：Ｅｘフィルター：４８５ｎｍ±４０ｎｍ
Ｅｍフィルター：５９０ｎｍ±３５ｎｍ
ＦＩＴＣ含有：Ｅｘフィルター：４８５ｎｍ±４０ｎｍ
Ｅｍフィルター：５４０ｎｍ±３５ｎｍ
２４時間後のみ蛍光顕微鏡観察を行った。
なお、蛍光強度（ＰＬ）は、培養後、培地を除去し、ＰＢＳと蒸留水で、「細胞と結合していない粒子」、又は「細胞へ取込まれていない粒子」を取り除いてから、特定の励起波長と検出波長にて計測した。このため、得られた蛍光強度は、「細胞と結合している粒子」、又は「細胞へ取り込まれている粒子」のみに起因した発光である。

図１６は、細胞結合分子の修飾有無で異なるＥｕ^３＋含有シリカ粒子について、（ａ）蛍光強度と培養時間の関係を示すグラフであり、（ｂ）及び（ｃ）は粒子が取り込まれた細胞の蛍光イメージング像である。図１６（ａ）に示すとおり、細胞結合分子の修飾を有するＥｕ^３＋含有シリカ粒子の方が、細胞結合分子の修飾を有さないＥｕ^３＋含有シリカ粒子よりも、培養時間に対する蛍光強度の上昇が大きく、７２時間後では約５倍の蛍光強度を示した。図１６（ｂ）に示すとおり、細胞結合分子の修飾を有さないＥｕ^３＋含有シリカ粒子の場合は生細胞イメージングができなかったが、細胞結合分子の修飾を有するＥｕ^３＋含有シリカ粒子では、生細胞イメージングが可能となった（図１６（ｃ））。また、これらの結果は、Ｅｕ^３＋含有シリカ粒子が優れた発光安定性及び耐光性を備えていることを示した。

図１７は、細胞結合分子の修飾有無で異なるＦＩＴＣ含有チタニア粒子について、（ａ）蛍光強度と培養時間の関係を示すグラフであり、（ｂ）及び（ｃ）は粒子が取り込まれた細胞の蛍光イメージング像である。図１７（ａ）に示すとおり、細胞結合分子の修飾を有するＦＩＴＣ含有チタニア粒子の方が、細胞結合分子の修飾を有さないＦＩＴＣ含有チタニア粒子よりも、培養時間に対する蛍光強度の上昇が大きく、７２時間後では約５倍の蛍光強度を示した。図１７（ｂ）に示すとおり、細胞結合分子の修飾を有さないＦＩＴＣ含有チタニア粒子の場合は生細胞イメージングができなかったが、細胞結合分子の修飾を有するＦＩＴＣ含有チタニア粒子では、生細胞イメージングが可能となった（図１７（ｃ））。また、これらの結果は、ＦＩＴＣ含有チタニア粒子が優れた発光安定性及び耐光性を備えていることを示した。

図１８は、細胞結合分子の修飾有無で異なるＥｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子について、（ａ）蛍光強度と培養時間の関係を示すグラフであり、（ｂ）及び（ｃ）は粒子が取り込まれた細胞の蛍光イメージング像である。図１８（ａ）に示すとおり、細胞結合分子の修飾を有するＥｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子の方が、細胞結合分子の修飾を有さないＥｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子よりも、培養時間に対する蛍光強度の上昇が大きく、７２時間後では約４倍の蛍光強度を示した。図１８（ｂ）に示すとおり、細胞結合分子の修飾を有さないＥｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子の場合は生細胞イメージングができなかったが、細胞結合分子の修飾を有するＥｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子では、生細胞イメージングが可能となった（図１８（ｃ））。また、これらの結果は、Ｅｕ^３＋含有リン酸カルシウム化合物粒子が優れた発光安定性及び耐光性を備えていることを示した。

（測定装置）
本実施例で用いた主な測定装置は、以下のとおりである。
・蛍光分光光度計（日本分光株式会社製、装置名：ＦＰ－８５００）：
励起側バンド幅：１０ｎｍ、蛍光側バンド幅：１０ｎｍ、走査速度：２００ｎｍ／分、データ取り込み間隔：０．１ｎｍ、レスポンス：１秒、ＰＭＴ電圧：３５０Ｖにて行った。測定は、２０ｍｇの試料を直径１６ｍｍの円形状石英窓を介して行った。
・赤外分光光度計（ＪＡＳＣＯ株式会社製、装置名：ＦＴ／ＩＲ－４１００）：
ＫＢｒ粉末法により行った。目的試料の粉末をＫＢｒ粉末により１０倍に希釈して透過率（％）を測定した。バックグラウンドはＫＢｒ粉末とし、積算回数は１００回、分解能２．０ｃｍ^－１とした。
・走査型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジーズ株式会社製、装置名：ＳＵ８０００）［チタニア粒子系（Ｔ）で使用］：
ＦＥ電圧５ｋＶ、電流１０μＡの条件で観察した。０．０１ｗｔ％に調製したナノ粒子のエタノール懸濁液をシリコン基板上へ滴下・乾燥し観察した。
・透過型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジーズ株式会社製、装置名：ＨＴ７７００）［シリカ粒子系（Ｓ）とリン酸カルシウム化合物粒子系（ＣＰ）で使用］：
０．０１ｗｔ％に調製したナノ粒子のエタノール懸濁液を、カーボンがコーティングされた銅グリッド（（株）Ｏｋｅｎｓｈｏｊｉ社製、商品名：カーボン／ホルムバールフィルム）上へ滴下した。滴下したグリッドは、窒素雰囲気下で２４時間デシケーター中にて乾燥させ、加速電圧１２０ｋＶで観察した。
・蛍光顕微鏡 （ＯＬＹＭＰＵＳ（株）製、装置名：ＣＫＸ４１）：
露出時間１００ｍ秒、感度ＩＳＯ４００とした。また、光源はＯＬＹＭＰＵＳ（株）製の装置名：Ｕ－ＲＦＬＴ５０を用いた。励起フィルターにより特定波長領域（特許説明資料ＰＤＦファイル２１枚目）についてダイロックミラーを介して試料へ照射し、発光をダイロックミラーおよび吸収フィルターを介して検出した。
・粉末Ｘ線回折（（株）リガク製、装置名：Ｓｍａｒｔ Ｌａｂ）：
Ｘ線源：ＣｕＫα線源（λ：１．５４１８Å）、出力：４０ｋＶ／３０ｍＡ、スキャンスピード：５．０°／ｍｉｎ、サンプリング幅：０．０１°、測定モード：連続、の条件で測定した。回折線位置、回折角、及び、半値幅は、装置付属のソフトウェア（（株）リガク製、ソフト名：ＰＤＸＬ）により得た。
・蛍光Ｘ線分析（（株）リガク製、装置名：ＺＳＸ ＰｒｉｍｕｓＩＩ）：
試料粉末の直径１０ｍｍのペレットを、油圧ハンドプレスを用いて、作製した。測定は装置付属のソフトウェア（（株）リガク製、ソフト名：ＥＺ ｓｃａｎ ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて解析した。

１・・・発光ナノ粒子、２・・・母体材料、３・・・発光物質、４・・・ＯＨ基又はアミノ基、５・・・ペプチド結合、６・・・細胞結合分子、７・・・細胞結合分子修飾型発光ナノ粒子、１０・・・がん細胞、１１・・・受容体。

Claims (21)

1. 母体材料と、前記母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、
   前記母体材料は、陽イオン元素であるＳｉと、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有し、
   前記発光物質として、希土類イオンと、前記陽イオン元素に対して１ｍｏｌ％以上５ｍｏｌ％以下の有機発光色素と、のうち少なくともいずれかを含有し、
   前記発光物質の前記母体材料中の濃度は、前記発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上となる濃度である、発光ナノ粒子。
2. 前記母体材料は、ＳｉＯ _２ を含有する、請求項１記載の発光ナノ粒子。
3. 前記発光物質は、有機発光色素及び希土類イオンからなる群から選択される少なくとも一種を含有する、請求項１又は２記載の発光ナノ粒子。
4. 前記有機発光色素は、フルオレセイン系色素分子である、請求項３の発光ナノ粒子。
5. 前記希土類イオンは、三価のＥｕである、請求項４記載の発光ナノ粒子。
6. 前記希土類イオンの含有濃度は、前記陽イオン元素に対して１ｍｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下である、請求項４又は５記載の発光ナノ粒子。
7. 前記母体材料は、界面活性剤分子をさらに含有する、請求項１～６のいずれか一項記載の発光ナノ粒子。
8. 前記母体材料における、前記界面活性剤分子の、前記陽イオン元素に対するモル比は、０．０１以上である、請求項７記載の発光ナノ粒子。
9. 前記母体材料における、前記界面活性剤分子の、前記陽イオン元素に対するモル比は、１．５以下である、請求項７又は８記載の発光ナノ粒子。
10. 前記発光ナノ粒子の平均粒子径が１０ｎｍ～５００ｎｍである、請求項１～９のいずれか一項記載の発光ナノ粒子。
11. 孔径が０．１～１０ｎｍの細孔を表面に備える、請求項１～１０のいずれか一項記載の発光ナノ粒子。
12. 表面に、前記陽イオン元素に結合した水酸基及び／又はアミノ基が形成されている、請求項１～１１のいずれか一項記載の発光ナノ粒子。
13. 表面が細胞結合分子によって修飾された、請求項１～１２のいずれか一項記載の発光ナノ粒子。
14. 励起波長及び発光波長が可視光領域に存在する、請求項１～１３のいずれか一項記載の発光ナノ粒子。
15. バイオイメージングに用いられる、請求項１～１４のいずれか一項記載の発光ナノ粒子。
16. 表面の細孔に薬剤を担持し、治療薬として用いられる、請求項１～１５のいずれか一項記載の発光ナノ粒子。
17. 請求項１～１６のいずれか一項記載の発光ナノ粒子を細胞内に投入し、前記発光ナノ粒子に光を照射し、前記細胞を観察する工程を有する、細胞の検出方法。
18. ヒトを除く動物の治療方法であって、
    請求項１～１６のいずれか一項記載の発光ナノ粒子を前記動物に投与し、前記発光ナノ粒子に光を照射し、前記動物を治療する工程を有する、治療方法。
19. 体内細胞の検査を行う検査部と、前記体内細胞の診断を行う診断部と、及び／又は前記体内細胞の治療を行う治療部とを備え、
    前記検査、前記診断、及び／又は前記治療を行う際に、請求項１～１６のいずれか一項記載の発光ナノ粒子を体内細胞内に投入し、前記発光ナノ粒子に光を照射する光照射部をさらに備える、医療装置。
20. 母体材料と、前記母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、前記母体材料が、陽イオン元素であるＳｉと、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有し、前記発光物質として、希土類イオンと、前記陽イオン元素に対して１ｍｏｌ％以上５ｍｏｌ％以下の有機発光色素と、のうち少なくともいずれかを含有し、前記発光物質の前記母体材料中の濃度は、前記発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上となる濃度である発光ナノ粒子を、細胞内に投入し、前記発光ナノ粒子に光を照射し、前記細胞を可視化する工程を有する、細胞の可視化方法。
21. 母体材料と、前記母体材料内に含まれる発光物質と、を含み、前記母体材料が、陽イオン元素であるＳｉと、Ｏ及びＰからなる群から選択される少なくとも一種である陰イオン元素と、を含有し、前記発光物質として、希土類イオンと、前記陽イオン元素に対して１ｍｏｌ％以上５ｍｏｌ％以下の有機発光色素と、のうち少なくともいずれかを含有し、前記発光物質の前記母体材料中の濃度は、前記発光物質間の平均距離が１．２ｎｍ以上となる濃度である発光ナノ粒子を、細胞内に投入し、可視光領域の波長の光で前記発光ナノ粒子を励起させる、細胞の損傷軽減方法。

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