JP2019144121A - Ｘ線微分干渉顕微鏡及び像形成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 Ｘ線を線源に用いて微分干渉法によるコントラスト像を得て観察対象物の高分解能観察を与えるＸ線微分干渉顕微鏡及び像形成方法の提供。【解決手段】観察対象物にＸ線を照射して得られた空間周波数分布についてＧａｂｏｒホログラムを介して複素振幅分布に変換し、フィルタリング処理してそれぞれゼロ次を含む正の空間周波数分布及び負の空間周波数分布に分離する。正の空間周波数分布のゼロ次にπ／２を付加するとともに負の空間周波数分布のゼロ次に３π／２を付加する数値処理した上で、それぞれ逆フーリエ変換して干渉させる画像処理を行ってコントラスト像を得る。【選択図】 図３

Description

本発明は、可視光に比べて波長の短いＸ線を線源に用いたＸ線顕微鏡及び像形成方法に関し、特に、微分干渉法によるコントラスト像を得て観察対象物の高分解能観察を与えるＸ線微分干渉顕微鏡及び像形成方法に関する。

光学顕微鏡において、対物レンズを通過した光を試料に入射させ、再度、該対物レンズを通過させて像を結ばせる明視野像による観察が行われる。一方、コントラストを十分に得られない試料においては、微分干渉像による観察が行われ得る。かかる微分干渉コントラスト法は、透明物体の位相の微分値の大きさを強度分布に変換してコントラストを得るものである。つまり、対物レンズの手前に光路を２つに分岐させ「横ずれ」をさせる光学素子を挿入し光源からの、試料表面の異なる観察位置、つまり、横ずれ量(シア量)だけ離れた位置での透過光を再度、該対物レンズを通過させて重ね合わせて干渉させ干渉像を得るのである。微小な凹凸や傾斜を表面に有する試料や、部分的に光の透過性の異なる透明な試料、例えば、生物試料などでは、分岐した光の間に光路差が生じ、これに対応したコントラストが得られる。

また、透明な物体の厚さのばらつきや屈折率のゆらぎによって透過光に部分的に生ずる位相差から位相コントラスト像を得る、つまり、複素振幅分布の位相の大きさを強度分布に変換して透明物体を立体感のある可視像として得る位相差顕微鏡として知られている。

例えば、特許文献１では、位相差顕微鏡の構造を開示しているが、従来の一般的な位相差顕微鏡では必須の光学部材(位相板)を用いず、画像処理により位相差画像を得る位相差顕微鏡について述べている。ここでは、光源としてパルス幅の非常に小さいフェムト秒パルスレーザを用い、光路を２つに分岐し、試料を透過した一方の光に光遅延装置で時間遅延を与えた他方の光を結合させて、イメージセンサ上で電場の時間変化を得て複素振幅分布を求め、これを画像処理することでコントラスト像を得ている。

ところで、可視光に比べて波長の短いＸ線を光源(線源)に用いたＸ線顕微鏡が提案されている。波長が短い故に空間分解能の高い画像を得られるとされている。

例えば、特許文献２や３では、線源からのＸ線を集光し細胞などの生物試料を透過させて撮像装置に結像させるＸ線顕微鏡の構造を開示している。軟Ｘ線領域、特に、炭素のＫα吸収端(４４オングストローム)と酸素のＫα吸収端(２３．７１オングストローム)の間のいわゆるＷａｔｅｒ Ｗｉｎｄｏｗ領域のＸ線波長域において、酸素、すなわち水がタンパク質などの炭素を含んだ有機物に比べて大なる透過率を有し、この水とタンパク質との間のＸ線の吸収率の違いによりコントラストを得ることができるとしている。

また、非特許文献１では、ハードＸ線領域において、入射光の振幅変化、すなわち吸収は判別できても、位相変化に関する情報は得られず、位相変化に関する情報として、ゼルニケの位相差法を用いて位相変化を強度変化に変換する位相差顕微鏡について述べている。高次回折光(散乱光)に対してゼロ次元回折光(透過光)に位相変調を与え、位相を光の強弱の位相コントラストに変換することで透明試料の可視化をしている。

特開２００６−２３２４７号公報 特開平６−２３０２００号公報 特開平７−２５３５００号公報

篭島靖ら、「硬Ｘ線位相差顕微鏡による植物生体試料の観察」、放射光誌、第１５巻第３号、１４６−１５２頁(２００２)

可視光を透過しない生物試料の細胞内部を高分解能観察し、又は断層撮影(トモグラフィ)するには、可視光よりも透過性に優れるＸ線を利用することが考慮される。ここで、コヒーレント(可干渉性)なＸ線を用いることで顕微鏡としての高い分解能を与え得る。非特許文献１に用いられている光学系もコヒーレントなＸ線である。しかしながら、同文献でも明らかなように、十分なエネルギーのコヒーレントなＸ線を得るには大型放射光施設などを利用しなければ難しく、一般的なＸ線顕微鏡に用いられる線源はインコヒーレント(非干渉性)なＸ線とならざるを得ない。すると、上記した特許文献２及び３のようなＸ線の吸収コントラストを可視化するＸ線顕微鏡では、Ｘ線をほとんど透過してしまう細胞などの生物試料(位相物体)に対しては、像のコントラストが不鮮明で内部構造の観察を十分に与え得ないのである。

本発明は、上記したような状況に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、Ｘ線を線源に用いて微分干渉法によるコントラスト像を得て観察対象物の高分解能観察を与えるＸ線微分干渉顕微鏡及び像形成方法の提供にある。

すなわち、本発明によるＸ線微分干渉顕微鏡は、Ｘ線を線源に用いて微分干渉法によるコントラスト像を得て観察対象物の高分解能観察を与えるＸ線微分干渉顕微鏡であって、画像処理部を含み、前記画像処理部は、前記観察対象物に前記Ｘ線を照射して得られた空間周波数分布についてＧａｂｏｒホログラムを介して複素振幅分布に変換し、フィルタリング処理してそれぞれゼロ次を含む正の空間周波数分布及び負の空間周波数分布に分離し、前記正の空間周波数分布の前記ゼロ次にπ／２を付加するとともに前記負の空間周波数分布の前記ゼロ次に３π／２を付加する数値処理した上で、それぞれ逆フーリエ変換して足し合わせる画像処理を行って前記コントラスト像を得ることを特徴とする。

また、本発明による像形成方法は、Ｘ線を線源に用いて微分干渉法によるコントラスト像を得て観察対象物の高分解能観察を与える像形成方法であって、前記観察対象物に前記Ｘ線を照射して得られた空間周波数分布についてＧａｂｏｒホログラムを介して複素振幅分布に変換し、フィルタリング処理してそれぞれゼロ次を含む正の空間周波数分布及び負の空間周波数分布に分離し、前記正の空間周波数分布の前記ゼロ次にπ／２を付加するとともに前記負の空間周波数分布の前記ゼロ次に３π／２を付加する数値処理した上で、それぞれ逆フーリエ変換して足し合わせる画像処理を行って前記コントラスト像を得ることを特徴とする。

かかる発明によれば、時間的コヒーレンスが短くても記録できるハードＸ線Ｇａｂｏｒホログラムに振動の影響を与えることなく短時間で記録させてから復号させることで、従来の微分干渉法のように「横ずらし」を利用することなく、また、作成が困難な短波長Ｘ線フィルタを用いずとも数値処理にて精度よく微分干渉法によるコントラスト像を得られて、観察対象物の高分解能観察を与え得るのである。本発明による方法は、物体の低空間周波数をカットする位相コントラスト法や、π／２のフィルタを用いて行うＺｅｒｎｉｋｅの方法などとは全く異なる原理なのである。

上記した発明において、前記Ｇａｂｏｒホログラムに平面波又は球面波を照射したときの再生像の振幅分布をフーリエ変換しゼロ次をカットして共役像を得て、前記共役像を参照光として前記再生像の前記複素振幅分布を得ることを特徴としてもよい。また、前記平面波又は球面波の曲率を変えることで、前記再生像及び前記共役像の再生位置を変化させることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、凸及び凹の再生光の曲率を可変とした平面波又は球面波を用いることで再生像及び共役像の再生位置を制御し、ゼロ次カットによる不要な波面間の干渉を除去できて、結果として、高分解能観察を与え得るのである。

上記した発明において、略点状の前記線源から拡がる曲面波として前記Ｘ線を前記観察対象物に照射し透過線をＣＣＤに導いて前記Ｇａｂｏｒホログラムを得ることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、観察対象物へのＸ線の照射により得られる散乱Ｘ線を含む透過Ｘ線からＣＣＤにてＧａｂｏｒホログラムに形成させて、高速に数値処理できるようにできて、結果として、高分解能観察を与え得るのである。

本発明による像形成方法の手順を示すフロー図である。 本発明によるＸ線微分干渉顕微鏡の要部を示す図である。 本発明による像形成方法の手順を示すブロック図である。 ナイフエッジフィルタにおける選択を示す写真である。ここで、(ａ)はゼロ次と正の周波数、(ｂ)はゼロ次と負の周波数を選択したところを示す。 再生像面における再生像の波面を示すグラフである。 微分干渉コントラスト像の強度分布を示すグラフである。 本発明による像形成方法により得られたコントラスト像の写真である。(ａ)はポリスチレンビーズ球、(ｂ)はＨｅＬａ細胞の像である。

本発明によるＸ線微分干渉顕微鏡及び像形成方法の１つの実施例について、工程を示すフロー図である図１に沿って、適宜、図２乃至７を用いてその詳細を説明する。

図１に示すように、像形成方法は、シアリング干渉法を用いずに透明物体を観測できる微分干渉コントラスト法であって、Ｘ線の照射により得られる散乱Ｘ線を含む透過Ｘ線で観察対象物からの像情報を得るＸ線照射工程と、この像情報から画像処理を行ってコントラスト像を得る画像処理工程と、を含む。

図２に示すように、略点状のＸ線の線源１０から拡がる曲面波としてＸ線ビームＭを観察対象物１２に照射する(図１、Ｓ１)。点光源とみなせる線源１０から拡がる曲面波の中に位相物体である観察対象物１２を配置し、所定距離だけ離れた位置に記録媒体１４を配置し、透過線で記録媒体１４の位置にホログラムを形成させ、これを記録する(図１、Ｓ２)。

線源１０としては、観察対象物１２の内部構造を観察するためには、エネルギーが高く、透過性の高いハードＸ線を用いることが好ましい。しかしながら、後述するように、本発明はＸ線の波長域のみならず、線種の異なる可視光であっても原理上、有効である。

ここで、記録媒体１４としては、各種媒体を考慮できるが、好適には、ＣＣＤが用いられ、透過Ｘ線が導かれる。線源１０としてハードＸ線を用いる場合にあっては、その可干渉距離が短いためＬｅｉｔｈタイプのホログラムを作成できない。一方、時間的コヒーレンスが短くても記録できるＧａｂｏｒタイプのホログラム２１(図３参照)を用いることができて、更に、記録媒体１４としてＣＣＤを用いることで、強度分布を短時間で記録できて、振動の影響を除去できるとともに、後述するような、作成困難な短波長Ｘ線フィルタを用いない数値処理で高速に処理できて好ましい。

図３に示すように、ホログラム２１を画像処理部としてのコンピュータに取り込むが、このコンピュータ内で、ホログラム２１に平面波又は球面波を照射して再生したときの複素振幅分布４１を算出し(図１、Ｓ３)、微分干渉像６１を生成させる(図１、Ｓ４)。

これには、空間周波数分布３１をフーリエ変換して得られる複素振幅分布４１にナイフエッジフィルタ１６を用いて、ゼロ次を含みこれから正の周波数側を選択し(図３の１６ａ、及び、図４(ａ)参照)、ゼロ次にｅｘｐ(ｊπ／２)を付加して強度分布５１ａを算出する。一方、ゼロ次を含みこれから負の周波数側を選択し(図３の１６ｂ、及び、図４(ｂ)参照)、ゼロ次にｅｘｐ(ｊ３π／２)を付加して強度分布５１ｂを算出する。これらの一旦分離した２つの強度分布を逆フーリエ変換し足し合わせて、微分干渉像６１を求めるのである。

このようにして、可視光における微分干渉顕微鏡での「シア(横ずらし)」を行うことなく、画像処理にて微分干渉コントラストを得ることで、シア量による分解能の低下を防ぐことができる。また、像情報としてのホログラム２１を一旦、記録媒体１４にＧａｂｏｒホログラムとして記録し、その後、画像処理することでＸ線照射工程を画像処理工程から切り離すことが出来て、且つ、記録媒体１４にＣＣＤを用いて強度分布を短時間で記録及び読み出しできるので、Ｘ線照射時の外部振動の影響を減じ、高分解能観察を与え得るのである。

なお、上記した再生像の振幅分布をフーリエ変換しゼロ次をカットして共役像を得て、共役像を参照光として再生像の複素振幅分布４１を得ることで、ゼロ次カットによる不要な波面間の干渉を除去できてより高い分解能を与える。このとき、上記した平面波又は球面波において、凸及び凹の曲率を可変とすることで、再生像及び共役像の再生位置を変化させるよう制御することが好ましい。

更に、図３に沿って、ホログラム２１を介して微分干渉像６１を得る方法について詳述する。

まず、ホログラム２１の強度分布は、

で表される。また、参照光及び物体光の複素振幅分布は、それぞれ、

で与えられる。

上記した式(１)によって与えられるホログラム２１をＸ線再生系の軸に平行な平面波で再生する。このとき、再生像面における複素振幅分布４１について、ゼロ次及び共役像の複素振幅分布を求める。

式(１)をフレネル変換する。つまり、Ｆ^-1［］はフレネル変換を表すものとすると、

で表される。

再生像面における再生像の複素振幅分布４１は、

によって求められる。つまり、

となる。

ここで、式(５)において、再生像の得られる位置Ｚ_iは、

の条件を満足する位置に生じ、

によって与えられる。したがって、

が得られる。

ここで、Ｍは倍率であり、Ｚ_iはホログラムから再生像面までの距離、Ｚは物体面とホログラム面の間の距離、

である。

再生像面における照明光の複素振幅分布は、式(４)より、

によって与えられる。ここで、

である。

さらに、共役像の複素振幅分布は、

によって与えられる。特に、

によって表される場合には、式(９)は、

となる。ここで、

である。

図５に再生像面における再生像の波面、つまり、再生像面に生ずる複素振幅分布４１を示した。これら再生像面に生じた複素振幅分布４１から微分干渉像６１を求める。

空間周波数分布にナイフエッジフィルタ１６を用いてフィルタリング処理して、ゼロ次の空間周波数と正の空間周波数の複素振幅分布を取り出す(図３の１６ａ参照)。そして、このゼロ次の空間周波数の複素振幅分布にｅｘｐ(ｊπ／２)を掛けて、つまり、π／２を用いてcosineの部分を−sineに変換する。このようにしてcosineを微分し、正の空間周波数の大きさが微分値の大きさに比例するので、位相分布の大きさに比例して、Ф(ｘ_i／Ｍ，ｙ_i／Ｍ)＝０の時の値(Ｃ₀ ²＋Ｃ_i ²)よりも暗くなる。すなわち、Ф(ｘ_i／Ｍ，ｙ_i／Ｍ)の値が十分小さいならば、その時の干渉縞の強度分布は、

となる。

同様に、ナイフエッジフィルタ１６を用いて、ゼロ次の空間周波数と負の空間周波数の複素振幅分布を取り出す(図３の１６ｂ参照)。そして、このゼロ次の空間周波数の複素振幅分布にｅｘｐ(ｊ３π／２)を掛けて、つまり、π／２を用いてcosineの部分をsineに変換する。このようにしてcosineの部分を微分し、位相分布の大きさに比例するため、(Ｃ₀ ²＋Ｃ_i ²)よりも明るくなる。すなわち、その時の干渉縞の強度分布は、

となる。

式(１１)と式(１２)を足し合わせれば、微分干渉法によって得られる像の強度分布は、

となる。

図６に微分干渉コントラスト像の強度分布のグラフを示した。微分干渉によって得られた強度分布において、式(１３)からも明らかなように、波面の勾配の正の部分は暗く、逆に、負の部分は明るくなる。また、ゼロの部分は中間の明るさになることがわかる。このようにして、微分干渉像６１が得られるのである。

次に、再生像面に生ずる複素振幅分布の他の干渉縞についても述べる。

再生像ｕ_i(ｘ_i，ｙ_i)とその共役像ｕ_c(ｘ_i，ｙ_i)との間の干渉によって生ずる縞の強度分布は、

となる。

同様に共役像ｕ_c(ｘ_i，ｙ_i)とｕ₀(ｘ_i，ｙ_i)との干渉によって生ずる縞の強度分布は、

となる。

再生像面には、再生像の複素振幅分布ｕ_i(ｘ_i，ｙ_i)、再生の照明ビームの複素振幅分布ｕ₀(ｘ_i，ｙ_i)、共役像の複素振幅分布ｕ_c(ｘ_i，ｙ_i)が存在する。それらの複素振幅分布が互いに干渉し合い、干渉によって生ずる縞の強度分布をそれぞれ(１３)式、(１４)式及び(１５)式に示した。なお、微分干渉像を求めるには、(１３)式となる。

ここで、(１４)式、(１５)式が(１３)式に与える影響について述べる。複素振幅分布の振幅Ｃ₀、Ｃ_i及びＣ_icの大きさを再生像面において比較すると、Ｃ₀は再生の照明ビームであり、Ｃ₀の一部がホログラムの再生像に寄与している。但し、再生像面全体に広がる。Ｃ_iはホログラムから再生像面の一部に位置する像に集まり像を形成する。Ｃ_icは再生像面からホログラムと再生像面の間距離の２倍離れた位置に結像し、デフォーカスされた像となる。これらを考慮すると、Ｃ₀，Ｃ_i＞＞Ｃ_icとなると考えられ、Ｃ₀Ｃ_i＞＞Ｃ_icＣ_i，Ｃ₀Ｃ_icとなり、ほぼ無視できる。

さらに、通常の物体の場合、デフォーカスによって物体の形状を維持できず、再生像面上に広がった弱いボケた像となり、照明ビームＣ_oに隠されてしまう。但し、球状の物体の場合はデフォーカスされた像は球状に拡がるため、式(１３)の外側に式(１５)に示される弱い微分干渉像が現れる。

図７には、上記の処理を経て得られた微分干渉コントラスト像を示した、図７(ａ)は直径８μｍのポリスチレンビーズ球、図７(ｂ)は乾燥後のＨｅＬａ細胞の微分干渉コントラスト像である。外形やその内部の構造のコントラスト像を得られていることがわかる。

以上述べてきた実施例において、ハードＸ線を用いることで人間や生物の細胞内部の観察、つまり、人間の目では不透明でもその内部の状況を観察でき得るのである。すなわち、細胞内部のＣＴ画像や、欠陥検査などを与え得る。また、原子や分子レベルの観測に用いられる顕微鏡への応用もでき、原子・分子レベルでの干渉計測を与え得る。

また、従来の「横ずらし」を行うことなく微分干渉コントラスト像を得ることができ、観察対象物の高分解能観察を可能とする。なお、以上述べてきた方法は波動減少一般の応用であり、線源として、Ｘ線だけでなく、可視光、電子線や超音波など波動として取り扱えるものを同様に用い得る。そして、その用途としては、顕微鏡だけでなく、波動現象による分野で広く利用することが可能である。

以上、本発明による実施例及びこれに基づく変形例を説明したが、本発明は必ずしもこれに限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の主旨又は添付した特許請求の範囲を逸脱することなく、様々な代替実施例及び改変例を見出すことができるであろう。

１０ 線源
１２ 観察対象物
１４ 記録媒体
１６ ナイフエッジフィルタ
２１ ホログラム
３１ 空間周波数分布
４１ 複素振幅分布
５１ａ、５１ｂ 強度分布
６１ 微分干渉像

Claims (8)

1. Ｘ線を線源に用いて微分干渉法によるコントラスト像を得て観察対象物の高分解能観察を与えるＸ線微分干渉顕微鏡であって、
   画像処理部を含み、
   前記画像処理部は、前記観察対象物に前記Ｘ線を照射して得られた空間周波数分布についてＧａｂｏｒホログラムを介して複素振幅分布に変換し、フィルタリング処理してそれぞれゼロ次を含む正の空間周波数分布及び負の空間周波数分布に分離し、前記正の空間周波数分布の前記ゼロ次にπ／２を付加するとともに前記負の空間周波数分布の前記ゼロ次に３π／２を付加する数値処理した上で、それぞれ逆フーリエ変換して足し合わせる画像処理を行って前記コントラスト像を得ることを特徴とするＸ線微分干渉顕微鏡。
2. 前記Ｇａｂｏｒホログラムに平面波又は球面波を照射したときの再生像の振幅分布をフーリエ変換しゼロ次をカットして共役像を得て、前記共役像を参照光として前記再生像の前記複素振幅分布を得ることを特徴とする請求項１記載のＸ線微分干渉顕微鏡。
3. 前記平面波又は球面波の曲率を変えることで、前記再生像及び前記共役像の再生位置を変化させることを特徴とする請求項２記載のＸ線微分干渉顕微鏡。
4. 略点状の前記線源から拡がる曲面波として前記Ｘ線を前記観察対象物に照射し透過線をＣＣＤに導いて前記Ｇａｂｏｒホログラムを得ることを特徴とする請求項１乃至３のうちの１つに記載のＸ線微分干渉顕微鏡。
5. Ｘ線を線源に用いて微分干渉法によるコントラスト像を得て観察対象物の高分解能観察を与える像形成方法であって、
   前記観察対象物に前記Ｘ線を照射して得られた空間周波数分布についてＧａｂｏｒホログラムを介して複素振幅分布に変換し、フィルタリング処理してそれぞれゼロ次を含む正の空間周波数分布及び負の空間周波数分布に分離し、前記正の空間周波数分布の前記ゼロ次にπ／２を付加するとともに前記負の空間周波数分布の前記ゼロ次に３π／２を付加する数値処理した上で、それぞれ逆フーリエ変換して足し合わせる画像処理を行って前記コントラスト像を得ることを特徴とする像形成方法。
6. 前記Ｇａｂｏｒホログラムに平面波又は球面波を照射したときの再生像の振幅分布をフーリエ変換しゼロ次をカットして共役像を得て、前記共役像を参照光として前記再生像の前記複素振幅分布を得ることを特徴とする請求項５記載の像形成方法。
7. 前記平面波又は球面波の曲率を変えることで、前記再生像及び前記共役像の再生位置を変化させることを特徴とする請求項６記載の像形成方法。
8. 略点状の前記線源から拡がる曲面波として前記Ｘ線を前記観察対象物に照射し透過線をＣＣＤに導いて前記Ｇａｂｏｒホログラムを得ることを特徴とする請求項５乃至７のうちの１つに記載の像形成方法。

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