JP2019135939A - Cell count method, cell count device and cell culture method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は細胞カウント方法および細胞カウント装置ならびに細胞培養方法に関し、詳しくは撮影した細胞から上記細胞の数をカウントする細胞カウント方法および細胞カウント装置ならびに上記細胞カウント方法を用いた細胞培養方法に関する。 The present invention relates to a cell counting method, a cell counting device, and a cell culture method, and more particularly to a cell counting method and a cell counting device for counting the number of cells from photographed cells, and a cell culture method using the cell counting method.
今日、細胞を培養してこれを治療等に用いることが行われており、このため細胞を効率的に培養するための様々な細胞培養方法が提案されている。このような細胞培養方法では、培養操作の途中に容器に収容された細胞の数をカウントして、培養が順調に進行しているか確認する場合がある。
そして上記細胞の数をカウントする方法としては、細胞を収容した容器にトリパンブルー等の試薬を投入して細胞の細胞核を染色し、染色した細胞を撮影するとともに画像処理により染色された細胞核を認識し、当該細胞核の数をカウントするものが知られている（特許文献１）。
Today, cells are cultured and used for treatment and the like. For this reason, various cell culture methods for efficiently culturing cells have been proposed. In such a cell culture method, the number of cells accommodated in the container during the culture operation may be counted to confirm whether the culture is proceeding smoothly.
As a method of counting the number of cells, a reagent such as trypan blue is put into a container containing cells to stain the cell nucleus, photograph the stained cell, and recognize the stained cell nucleus by image processing. And what counts the number of the said cell nucleus is known (patent document 1).
しかしながら、上記特許文献１に記載された細胞カウント方法の場合、細胞を試薬によって染色してしまうため、当該染色された細胞をその後の培養に使用することができない。
そのため、細胞の数をカウントする度に染色した細胞を廃棄しなければならず、また染色作業が伴うことからカウント作業が煩雑であるという問題もあった。
このような問題に鑑み、本発明は細胞の染色をせずに細胞の数をカウントとすることが可能な細胞カウント方法および細胞カウント装置を提供するとともに、上記細胞カウント方法を利用した細胞培養方法を提供するものである。
However, in the case of the cell counting method described in Patent Document 1, since the cells are stained with a reagent, the stained cells cannot be used for subsequent culture.
Therefore, the stained cells must be discarded every time the number of cells is counted, and there is also a problem that the counting operation is complicated because the staining operation is involved.
In view of such problems, the present invention provides a cell counting method and a cell counting apparatus capable of counting the number of cells without staining the cells, and a cell culture method using the cell counting method Is to provide.
すなわち請求項１の発明にかかる細胞カウント方法は、 細胞を収容した容器を撮影し、撮影された画像から上記細胞の数をカウントする細胞カウント方法において、
同じ容器の同じ箇所について撮影された、容器に試薬を投入していない基画像と、当該容器に試薬を投入して上記細胞の細胞核を染色した染色画像とを予め複数組収集し、上記収集された複数組の基画像および染色画像を用いてディープラーニングのアルゴリズムに学習させ、
計数対象の細胞の数をカウントする際には、当該細胞を収容した容器に試薬を投入せずに当該容器を撮影して、撮影した画像から学習済みの上記アルゴリズムによって細胞の細胞核を認識し、さらに当該細胞核の数をカウントすることを特徴としている。
また、請求項２の発明にかかる細胞培養方法は、細胞を培養する培養操作の途中に、当該細胞を収容した容器を撮影して、撮影した画像から上記細胞の数をカウントするカウント工程を行う細胞培養方法において、
上記カウント工程では、上記請求項１に記載の細胞カウント方法を用いて細胞の数をカウントすることを特徴としている。
そして請求項６の発明にかかる細胞カウント装置は、細胞を収容した容器を撮影する撮影手段と、撮影された画像から上記細胞の数をカウントするカウント部とを備えた細胞カウント装置において、
同じ容器の同じ箇所について撮影された、容器に試薬を投入していない基画像と、当該容器に試薬を投入して上記細胞の細胞核を染色した染色画像とを予め複数収集し、上記収集された複数組の基画像および染色画像を用いて学習されたディープラーニングのアルゴリズムを有する解析部を備え、
計数対象の細胞の数をカウントする際には、上記解析部によって上記撮影手段が撮影した計数対象となる細胞の画像を上記アルゴリズムを用いて解析することにより細胞の細胞核を認識するとともに、上記カウント部によって上記解析部の解析結果に基づいて上記細胞核の数をカウントすることを特徴としている。
That is, the cell counting method according to the invention of claim 1 is a cell counting method for photographing a container containing cells and counting the number of cells from the photographed image.
Collected in advance a plurality of sets of a base image in which the reagent is not put into the container and a stained image in which the reagent is put into the container and the cell nucleus of the cell is stained. The deep learning algorithm is trained using multiple sets of base images and stained images.
When counting the number of cells to be counted, photograph the container without putting the reagent into the container containing the cell, and recognize the cell nucleus of the cell by the learned algorithm from the photographed image, Furthermore, the number of the cell nuclei is counted.
The cell culturing method according to the invention of claim 2 performs a counting step of photographing the container containing the cells and counting the number of the cells from the photographed image during the culturing operation for culturing the cells. In the cell culture method,
In the counting step, the number of cells is counted using the cell counting method according to claim 1.
And the cell counting device according to the invention of claim 6 is a cell counting device comprising imaging means for imaging a container containing cells, and a count unit for counting the number of cells from the captured image.
A plurality of pre-collected images of a base image in which the reagent was not put into the container and a stained image in which the reagent was put into the container and the cell nucleus of the cell was stained were collected and collected. An analysis unit having a deep learning algorithm learned using a plurality of sets of base images and stained images,
When counting the number of cells to be counted, the analysis unit recognizes the cell nucleus of the cell by analyzing the image of the cell to be counted captured by the imaging unit using the algorithm, and The number of the cell nuclei is counted based on the analysis result of the analysis unit.
請求項１および請求項６の発明によれば、ディープラーニングのアルゴリズムを用いることで、細胞を染色することなく細胞の数をカウントすることができるため、染色による細胞の無駄を生じさせず、また染色作業が不要となるため迅速な細胞のカウントを行うことが可能となる。
また請求項２の発明によれば、上記請求項１の発明にかかる細胞カウント方法を採用したことで、細胞培養操作をより効率的に行うことが可能となる。
According to the invention of claim 1 and claim 6, by using the deep learning algorithm, the number of cells can be counted without staining the cells. Since the staining work is not necessary, it is possible to perform quick cell counting.
In addition, according to the invention of claim 2, by adopting the cell counting method according to the invention of claim 1, the cell culture operation can be performed more efficiently.
以下図示実施例について説明すると、図１は細胞Ｃの培養を行う自動培養操作装置１の正面図を示し、この自動培養操作装置１は内部に形成された作業室２ａが無菌状態に維持されるアイソレータ２と、その内部で細胞Ｃを培養するとともにアイソレータ２との間で細胞Ｃを収容した容器３を受け渡すインキュベータ４とを備えている。
上記アイソレータ２の内部にはロボット５が設けられており、上記アイソレータ２とインキュベータ４との間で、細胞Ｃを収容した容器３の移送を行うなど、細胞Ｃの培養に必要な培養操作を自動的に行うことが可能となっている。
また本実施例の自動培養操作装置１で行う培養操作には、上記細胞Ｃの培養途中に、上記容器３に収容された細胞Ｃの数をカウントするカウント工程が含まれ、当該カウント工程を行うため、上記アイソレータ２の作業室２ａには本発明にかかる細胞カウント装置６が設けられている。
そして上記ロボット５や細胞カウント装置６は制御手段７（図３参照）によって制御されるようになっている。
なお、アイソレータ２の作業室２ａには細胞Ｃの培養に必要なその他の手段も設けられているが、これらについての詳細な説明は省略し、また培養のための培養操作の一部についても説明を省略する。
The illustrated embodiment will be described below. FIG. 1 shows a front view of an automatic culture operation device 1 for culturing cells C. The automatic culture operation device 1 maintains a working chamber 2a formed therein in a sterile state. An isolator 2 and an incubator 4 for culturing the cells C therein and delivering the containers 3 containing the cells C to and from the isolators 2 are provided.
A robot 5 is provided inside the isolator 2, and a culture operation necessary for culturing the cell C, such as transferring the container 3 containing the cell C between the isolator 2 and the incubator 4, is automatically performed. Can be done automatically.
Further, the culturing operation performed in the automatic culturing operation apparatus 1 of the present embodiment includes a counting step of counting the number of cells C accommodated in the container 3 during the culturing of the cells C, and the counting step is performed. Therefore, the cell counting device 6 according to the present invention is provided in the working chamber 2a of the isolator 2.
The robot 5 and the cell counting device 6 are controlled by a control means 7 (see FIG. 3).
The working chamber 2a of the isolator 2 is provided with other means necessary for culturing the cells C. However, detailed description thereof will be omitted, and a part of the culturing operation for culturing will also be described. Is omitted.
図２に示すように、上記容器３としては例えば底の浅い円形の皿形容器であるディッシュを使用することができる。またこの容器３で培養される細胞Ｃはそれぞれ細胞核（図示せず）を有し、さらに上記細胞Ｃは培養すると容器３の底面に密着して移動しなくなり、密着した後にさらに培養が進むと、細胞核が分裂して増殖する性質を有している。
ここで、上記細胞Ｃの数をカウントするカウント工程では、細胞Ｃの細胞核を認識することで細胞Ｃの数をカウントするようになっているが、従来は上記特許文献１のように容器３にトリパンブルー等の試薬を投入して当該細胞Ｃの細胞核を染色し、画像認識の際に細胞核を認識しやすくする作業が行われていた。
しかしながら、試薬により染色された細胞Ｃはその後の培養に使用することができず、従ってカウント工程のたびに細胞Ｃを廃棄しなければならず、またカウント工程の度に試薬を投入して細胞Ｃを染色する作業が必要となることから、その手順が煩雑であるという問題があった。
これに対し、本実施例のカウント装置６は、容器３に試薬を投入することなく細胞核を認識して細胞Ｃの数をカウントすることが可能であり、細胞Ｃの廃棄や染色する作業を省くことが可能となっている。
As shown in FIG. 2, as the container 3, for example, a dish that is a circular dish container having a shallow bottom can be used. Further, each cell C cultured in the container 3 has a cell nucleus (not shown), and when the cell C is cultured, the cell C does not move in close contact with the bottom surface of the container 3, It has the property that cell nuclei divide and proliferate.
Here, in the counting step for counting the number of cells C, the number of cells C is counted by recognizing the cell nucleus of the cells C. A reagent such as trypan blue has been added to stain the cell nucleus of the cell C so that the cell nucleus can be easily recognized during image recognition.
However, the cells C stained with the reagent cannot be used for the subsequent culture, and therefore, the cells C must be discarded at every counting step. Since the work which dye | stains is needed, there existed a problem that the procedure was complicated.
On the other hand, the counting device 6 of this embodiment can recognize the cell nucleus without counting the reagent in the container 3 and count the number of cells C, and eliminates the work of discarding and staining the cells C. It is possible.
上記アイソレータ２の内部に形成された作業室２ａは予め除染ガス（過酸化水素蒸気）よって除染処理されており、その後清浄な空気が供給されて無菌状態を維持している。
また上記アイソレータ２の側面には図示しないグローブが複数設けられており、作業者は上記作業室２ａにおいて作業を行う際に当該グローブを装着するようになっている。
上記インキュベータ４は内部に複数の容器３を収容可能となっており、内部は細胞Ｃの培養に最適な温度や湿度に維持されている。そして台車４ａによって移動可能に設けられることで、アイソレータ２より離隔した位置において細胞Ｃの培養を行うことが可能となっている。
また培養操作の途中には、上記アイソレータ２とインキュベータ４とを接続手段８によって接続するとともに、当該接続手段８の開閉扉を開閉することで、無菌状態を維持したままアイソレータ２とインキュベータ４との間で上記容器３の受け渡しを行い、アイソレータ２において細胞Ｃの数のカウントや、培地交換といった作業を行うことが可能となっている。
The working chamber 2a formed inside the isolator 2 is previously decontaminated with a decontamination gas (hydrogen peroxide vapor), and then clean air is supplied to maintain the aseptic state.
In addition, a plurality of gloves (not shown) are provided on the side surface of the isolator 2, and an operator wears the gloves when working in the work chamber 2a.
The incubator 4 can accommodate a plurality of containers 3 therein, and the inside is maintained at a temperature and humidity optimum for the culture of the cells C. The cell C can be cultured at a position separated from the isolator 2 by being provided so as to be movable by the carriage 4a.
In the middle of the culturing operation, the isolator 2 and the incubator 4 are connected by the connecting means 8 and the opening / closing door of the connecting means 8 is opened and closed, so that the isolator 2 and the incubator 4 are maintained in a sterile state. The container 3 is transferred between them, and the isolator 2 can perform operations such as counting the number of cells C and exchanging the medium.
上記ロボット５には産業用多関節ロボットを使用することができ、複数の軸から構成されたアーム５ａと、当該アーム５ａの先端に設けられたグリッパ５ｂとを備え、これらは上記除染ガスに対して防護されている。
上記ロボット５は上記グリッパ５ｂを用いて様々な作業を行うことが可能となっており、上記容器３を保持してインキュベータ４とアイソレータ２との間での容器３の受け渡しを行ったり、ピペット等を操作して容器３の培地交換を行ったりすることができる。
図３に示すように、上記容器３はホルダー９に支持された状態でロボット５に保持されるようになっており、当該ホルダー９は容器３の底部に沿って円弧状に設けられた円弧状部分９ａと、当該円弧状部分９ａより外方に突出した部分に設けられて上記ロボット５のグリッパ５ｂによって把持可能な把持部分９ｂとを有している。
上記円弧状部分９ａは容器３の側面の周方向に沿って略Ｌ字形の断面形状を有しており、上記円弧状部分９ａによって容器３の底面の外周縁と側面とを支持することで、当該容器３を保持するようになっている。
このような構成により、容器３の底面はホルダー９によって遮られず、以下に説明する細胞カウント装置６によって容器３の下方から細胞Ｃを撮影することが可能となっている。
An industrial articulated robot can be used as the robot 5 and includes an arm 5a composed of a plurality of axes and a gripper 5b provided at the tip of the arm 5a. Protected against it.
The robot 5 can perform various operations using the gripper 5b. The robot 5 holds the container 3 and transfers the container 3 between the incubator 4 and the isolator 2, or a pipette or the like. The medium of the container 3 can be exchanged by operating.
As shown in FIG. 3, the container 3 is held by the robot 5 while being supported by the holder 9, and the holder 9 is formed in an arc shape along the bottom of the container 3. A portion 9 a and a grip portion 9 b provided at a portion protruding outward from the arc-shaped portion 9 a and gripped by the gripper 5 b of the robot 5 are provided.
The arcuate portion 9a has a substantially L-shaped cross-section along the circumferential direction of the side surface of the container 3, and the arcuate portion 9a supports the outer peripheral edge and the side surface of the bottom surface of the container 3, The container 3 is held.
With such a configuration, the bottom surface of the container 3 is not blocked by the holder 9, and the cell C can be photographed from below the container 3 by the cell counting device 6 described below.
上記細胞カウント装置６は、保持手段１１によって保持された照明手段１２と、その下方に対向して設けられた撮影手段１３と、図３に示すように上記制御手段７に設けられて上記撮影手段１３が撮影した画像を解析する解析部１４と、解析部１４の解析結果に基づいて画像を作成する画像作成部１５と、画像作成部１５が作成した画像から細胞Ｃの細胞核の数をカウントするカウント部１６とを備えている。
上記ロボット５は、上記ホルダー９ごと容器３を移動させて、当該容器３を上記照明手段１２と撮影手段１３との間に位置させるようになっており、上記照明手段１２が上方から光を照射するとともに、上記撮影手段１３が容器３の底部から内部の細胞Ｃを撮影するようになっている。
上記撮影手段１３には従来公知のＣＣＤカメラを使用することが可能であり、容器３の一部の範囲を撮影するようになっている。また撮影手段１３は昇降手段１３ａによって昇降可能に設けられ、焦点の調整が可能となっている。
The cell counting device 6 is provided with the illumination means 12 held by the holding means 11, the imaging means 13 provided facing the lower side thereof, and the control means 7 as shown in FIG. The analysis unit 14 that analyzes the image captured by the image capturing unit 13, the image creation unit 15 that creates an image based on the analysis result of the analysis unit 14, and the number of cell nuclei of the cell C are counted from the image created by the image creation unit 15. And a count unit 16.
The robot 5 moves the container 3 together with the holder 9 so that the container 3 is positioned between the illumination means 12 and the photographing means 13, and the illumination means 12 emits light from above. At the same time, the photographing means 13 photographs the internal cell C from the bottom of the container 3.
A conventionally known CCD camera can be used as the photographing means 13, and a part of the container 3 is photographed. The photographing means 13 is provided so as to be lifted and lowered by the lifting means 13a, and the focus can be adjusted.
上記制御手段７に設けられた解析部１４には、ディープラーニングのアルゴリズムが登録されており、計数対象となる細胞Ｃが収容された容器３を上記撮影手段１３が撮影すると、当該画像を上記アルゴリズムによって解析して、当該画像から細胞Ｃの細胞核を認識するものとなっている。
本実施例では、同じ容器３の同じ箇所について撮影された、容器３に試薬を投入していない基画像と、当該容器３に試薬を投入して上記細胞Ｃの細胞核を染色した染色画像とを、それぞれ複数組収集し、さらに従来公知の画像処理装置を用いて上記染色画像から細胞核を目立たせた強調画像を作成している。
また本実施例においては、上記基画像および染色画像の撮影を、実際に計数対象となる細胞Ｃの撮影を行う自動培養操作装置１を用いて事前に行っている。つまり、容器３に収容された基画像用の細胞Ｃを上記細胞カウント装置６の撮影手段１３へと移動する作業や、容器３に試薬を投入して染色する作業や、染色した細胞を収容した容器３を上記撮影手段１３へと移動する作業を上記ロボット５によって行うことが可能となっている。
なお、基画像と染色画像の撮影は必ずしも実際に計数対象となる細胞Ｃを撮影する装置で行う必要は無く、別の撮影手段で撮影しても良い。ただし、その場合は画像に違いが生じないように、同じ型式のカメラ、レンズ等を用いて実際に撮影する装置と同じ条件とする必要がある。
The analysis unit 14 provided in the control means 7 has a deep learning algorithm registered. When the photographing means 13 photographs the container 3 containing the cells C to be counted, the image is captured by the algorithm. And the cell nucleus of the cell C is recognized from the image.
In the present embodiment, a base image in which the reagent is not put into the container 3 and a stained image in which the reagent is put into the container 3 and the cell nucleus of the cell C is stained is photographed in the same portion of the same container 3. A plurality of sets are collected, and an enhanced image in which cell nuclei are conspicuous is created from the stained image using a conventionally known image processing apparatus.
In the present embodiment, the base image and the stained image are captured in advance using the automatic culture operation device 1 that actually captures the cells C to be counted. That is, the operation of moving the cell C for the base image stored in the container 3 to the photographing means 13 of the cell counting device 6, the operation of putting the reagent into the container 3 and staining, and the stained cells are stored. The operation of moving the container 3 to the photographing means 13 can be performed by the robot 5.
Note that the base image and the stained image need not be captured by an apparatus that actually captures the cells C to be counted, and may be captured by another imaging means. However, in this case, it is necessary to set the same conditions as those of an apparatus that actually shoots using the same type of camera, lens, or the like so as not to cause a difference in images.
図４は、収集した画像の一例を示し、（ａ）は基画像を、（ｂ）は上記染色画像を、（ｃ）は上記強調画像を示し、図４において横一列に整列した画像は同じ容器３の同じ箇所を撮影した画像となっている。
上記基画像は、収容された細胞Ｃがある程度培養が進み、当該細胞Ｃの細胞核の分裂が行われていなければならない時期に、上記撮影手段１３において撮影された画像であり、この基画像を見ただけでは細胞核の位置を判別することはできない。また、基画像で撮影された容器３には試薬等が投入されておらず非侵襲となっている。
上記染色画像は、上記基画像を撮影した容器３に対して、当該基画像を撮影した直後にトリパンブルー等の試薬を投入し、当該試薬によって細胞Ｃの細胞核が染色されたら、当該容器３における同じ箇所を上記撮影手段１３において撮影した画像となっている。
ここで、本実施例で培養する細胞Ｃは容器３の底面に付着して移動しない性質を有していることから、所要の容器３について基画像を撮影した直後に、当該容器３に試薬を投入して細胞核を染色しても、当該容器３の同じ箇所を撮影すれば、上記基画像と比較して細胞Ｃの位置が変化していない染色画像を得ることができる。
上記強調画像は、上記染色画像を所要の輝度に基づいて画像全体を２値化して細胞核を白色、それ以外を黒色とした画像となっており、当該強調画像は上記染色画像を画像処理したものであることから、上記基画像に対し同じ容器３の同じ箇所を撮影した画像となっている。
FIG. 4 shows an example of collected images, (a) shows a base image, (b) shows the stained image, (c) shows the enhanced image, and the images aligned in a horizontal row in FIG. 4 are the same. This is an image of the same part of the container 3 taken.
The base image is an image photographed by the photographing means 13 at a time when the accommodated cell C has been cultured to some extent and the nucleus of the cell C must be divided. It is not possible to determine the position of the cell nucleus only by simple operation. In addition, the container 3 photographed with the base image is not invasive because no reagent or the like is loaded.
The stained image is obtained by adding a reagent such as trypan blue to the container 3 in which the base image is captured and immediately after capturing the base image, and staining the cell nucleus of the cell C with the reagent. The same portion is an image taken by the photographing means 13.
Here, since the cell C cultured in the present embodiment has a property that it adheres to the bottom surface of the container 3 and does not move, the reagent is put into the container 3 immediately after taking the base image of the required container 3. Even if the cells are loaded and stained, if the same portion of the container 3 is photographed, a stained image in which the position of the cells C is not changed as compared with the base image can be obtained.
The emphasized image is an image in which the entire image is binarized based on the required luminance and the cell nucleus is white and the others are black, and the emphasized image is obtained by performing image processing on the stained image. Therefore, it is an image obtained by photographing the same portion of the same container 3 with respect to the base image.
上記解析部１４には、上述したように予め学習されたディープラーニングのアルゴリズムが登録されている。
ここで、ディープラーニングとは、機械学習の１種である「ニューラルネットワーク」の階層を深めたアルゴリズムであり、本実施例では、畳み込みニューラルネットワークと逆畳み込みニューラルネットワークという種類のニューラルネットワーク（アルゴリズム）を用いている。
設計者は、計数対象となる細胞Ｃの細胞核を認識するのに適したアルゴリズムを設計すると、当該アルゴリズムに収集した複数組の基画像とその基画像に対応する強調画像とを学習データとして入力し、当該アルゴリズムに学習させる。
学習の手法はディープラーニングのアルゴリズムの学習で良く用いられている手法であり、収集された画像を多数回（例えば１０，０００回ほど）反復して取り込んで精度を上げていくものである。
なお、学習に用いる画像は強調画像である必要は無く、基画像と染色画像であっても良い。
The analysis unit 14 registers a deep learning algorithm learned in advance as described above.
Here, deep learning is an algorithm that deepens the hierarchy of a “neural network” that is a type of machine learning. In this embodiment, a neural network (algorithm) of a type called a convolutional neural network or a deconvolutional neural network is used. Used.
When the designer designs an algorithm suitable for recognizing the cell nucleus of the cell C to be counted, a plurality of sets of base images collected by the algorithm and an emphasized image corresponding to the base image are input as learning data. Let the algorithm learn.
The learning method is a method often used in deep learning algorithm learning, in which the collected image is repeatedly captured many times (for example, about 10,000 times) to increase the accuracy.
Note that the image used for learning need not be an emphasized image, and may be a base image and a stained image.
そして上記学習済みのアルゴリズムが登録された解析部１４において、計数対象となる細胞Ｃが収容された、試薬の投入されていない容器３の画像を上記アルゴリズムにより解析することで、試薬によって染色されていない細胞Ｃの画像から、当該細胞Ｃの細胞核の位置を認識することが可能となっている。
上記画像作成部１５は、上記解析部１４によって解析した細胞核の位置に基づいて、当該細胞核の位置を反映した画像を作成し、例えば図４（ｃ）に示す上記強調画像のような細胞核のみが表示された画像を作成するようになっている。
そして上記カウント部１６は、上記画像作成部１５が作成した画像から、細胞核の数をカウントし、これを細胞Ｃの数と認識するようになっている。また上記撮影手段１３が容器３の一部を撮影している場合、従来公知の方法を用いることで、上記画像の撮影範囲内でカウントされた細胞Ｃの数から、容器３全体における細胞Ｃの数を算出するようになっている。
なお、本実施例では撮影手段１３が撮影した画像を上記解析部１４で解析し、その後上記画像作成部１５で作成した画像から、上記カウント部１６が細胞核の数をカウントしているが、これらを一つの手段によって一括処理するようにしてもよく、例えば解析部１４で解析した解析結果から直接細胞核の数をカウントするようにしてもよい。
Then, in the analysis unit 14 in which the learned algorithm is registered, the image of the container 3 in which the cells C to be counted are accommodated and in which the reagent is not charged is analyzed by the algorithm, so that it is stained with the reagent. It is possible to recognize the position of the cell nucleus of the cell C from the image of the cell C that is not present.
The image creation unit 15 creates an image reflecting the position of the cell nucleus based on the position of the cell nucleus analyzed by the analysis unit 14, and only the cell nucleus such as the emphasized image shown in FIG. The displayed image is created.
The counting unit 16 counts the number of cell nuclei from the image created by the image creating unit 15 and recognizes this as the number of cells C. Further, when the photographing means 13 is photographing a part of the container 3, by using a conventionally known method, from the number of cells C counted within the photographing range of the image, The number is calculated.
In the present embodiment, the image taken by the photographing means 13 is analyzed by the analyzing unit 14, and then the counting unit 16 counts the number of cell nuclei from the image created by the image creating unit 15. The number of cell nuclei may be counted directly from the analysis result analyzed by the analysis unit 14, for example.
そして上記制御手段７には、上記カウント部１６がカウントした細胞Ｃの個数に基づいて、容器３に収容された細胞Ｃの培養状態を判定する判定部１７が設けられている。
例えば、撮影された画像において所定個数以上の細胞Ｃが認められた場合、当該容器３の細胞Ｃについては再度上記インキュベータ４に収容して細胞Ｃの培養を継続することを判定し、もしくは十分に培養が行われたとして、当該容器３についての追加の培養操作を省略する判定を行うことができる。
一方、撮影された画像において所定個数の細胞Ｃが認められなかった場合、当該容器３の細胞Ｃについては今後培養操作を行わないことを判定し、もしくは当該容器３をアイソレータ２よりリジェクトする判定を行うことができる。
The control means 7 is provided with a determination unit 17 that determines the culture state of the cells C stored in the container 3 based on the number of cells C counted by the counting unit 16.
For example, when a predetermined number or more of cells C are observed in the photographed image, it is determined that the cells C in the container 3 are again accommodated in the incubator 4 and the culture of the cells C is continued or sufficiently. It can be determined that the additional culture operation for the container 3 is omitted as the culture is performed.
On the other hand, when a predetermined number of cells C are not recognized in the photographed image, it is determined that the culture operation will not be performed for the cells C in the container 3 or the container 3 is rejected from the isolator 2. It can be carried out.
以下、上記構成を有する細胞培養装置１の動作を説明しながら、本発明にかかる細胞培養方法について説明する。
まず、上記アイソレータ２において、容器３内に細胞Ｃを播種する作業や、当該容器３に培地等を供給する培養準備工程を行い、さらに当該細胞Ｃの収容された容器３をインキュベータ４に移載する移載工程を行う。
その後、インキュベータ４をアイソレータ２より分離して、インキュベータ４の内部で所定期間容器３を保持して細胞Ｃの培養を行う培養工程を行い、これにより容器３内の細胞Ｃが培養されて、容器３の底面に付着することとなる。
Hereinafter, the cell culture method according to the present invention will be described while explaining the operation of the cell culture device 1 having the above-described configuration.
First, in the isolator 2, an operation of seeding the cells C in the container 3 and a culture preparation process for supplying a medium and the like to the container 3 are performed, and the container 3 containing the cells C is transferred to the incubator 4. The transfer process is performed.
Thereafter, the incubator 4 is separated from the isolator 2 and a culture process is performed in which the cells 3 are cultured while holding the containers 3 for a predetermined period inside the incubator 4, whereby the cells C in the containers 3 are cultured, 3 will adhere to the bottom surface of 3.
細胞Ｃの培養には所定の時間が必要であるが、上記培養工程の途中に細胞Ｃの培養状態を確認するため、容器３内の細胞Ｃの数をカウントするカウント工程を行うようになっている。
このカウント工程では、まず上記インキュベータ４をアイソレータ２まで移動させて接続し、上記ロボット５がインキュベータ４内の容器３をアイソレータ２へと移載する。
続いて、上記ロボット５は上記容器３を保持して上記カウント装置の照明手段１２と撮影手段１３との間に位置させ、上記撮影手段１３が下方から上記容器３内の細胞Ｃを撮影する。
このとき、上記容器３には細胞Ｃを染色するための試薬を投入する必要はなく、従ってこの容器３に収容された細胞Ｃは外部からの操作が行われない非侵襲の状態が維持されている。
撮影手段１３が撮影した画像は上記制御手段７に送信され、制御手段７では解析部１４に登録されたアルゴリズムによって上記画像を解析し、さらに解析結果に基づいて上記画像作成部１５が作成した画像から、上記カウント部１６が細胞Ｃの細胞核の数をカウントするようになっている。
また撮影手段１３が撮影した画像が容器３全体の画像ではない場合、カウント部１６は必要に応じて撮影された画像からカウントした細胞Ｃの数より、容器３全体での細胞Ｃの数を算出するようになっている。
Although a predetermined time is required for culturing the cells C, a counting step for counting the number of cells C in the container 3 is performed in order to confirm the culturing state of the cells C during the culturing step. Yes.
In this counting step, first, the incubator 4 is moved to the isolator 2 and connected, and the robot 5 transfers the container 3 in the incubator 4 to the isolator 2.
Subsequently, the robot 5 holds the container 3 and positions it between the illumination means 12 and the imaging means 13 of the counting device, and the imaging means 13 images the cells C in the container 3 from below.
At this time, it is not necessary to put a reagent for staining the cell C into the container 3, so that the cell C accommodated in the container 3 is maintained in a non-invasive state where no external operation is performed. Yes.
The image photographed by the photographing means 13 is transmitted to the control means 7, where the control means 7 analyzes the image by an algorithm registered in the analysis section 14, and further creates an image created by the image creation section 15 based on the analysis result. Thus, the counting unit 16 counts the number of cell nuclei of the cell C.
If the image captured by the imaging means 13 is not an image of the entire container 3, the counting unit 16 calculates the number of cells C in the entire container 3 from the number of cells C counted from the captured image as necessary. It is supposed to be.
このようにしてカウント部１６によって細胞Ｃの数をカウントすると、その結果に基づいて制御手段７に設けられた判定部１７が当該細胞Ｃを収容した容器３について、培養動作を継続するか否かについて判定を行う。
細胞Ｃの数が所定数であれば、判定部１７は当該細胞Ｃの培養（細胞核の分裂）が順調に行われているとして培養を続行させる判定を行い、上記ロボット５によって再度容器３を上記インキュベータ４に収容して上記培養工程を続行させる。
一方、細胞Ｃの数が所定数未満であった場合には、判定部１７は当該細胞Ｃに対してはこれ以上の培養操作を続行しないと判定する。なお、細胞Ｃの数が所定数未満であった場合、上記のように培養操作を続行しないという判定だけでなく、判定部１７は当該細胞Ｃの培養が順調に行われていないと判定して、当該細胞Ｃが収容されている容器３の培地を交換するなど培養を促進させる作業を行った後、上記ロボット５によって再度容器３を上記インキュベータ４に収容して上記培養工程を続行させ、次回のカウント時においても所定数未満であった場合に、これ以上の培養操作を続行しないと判定することも可能である。
また、細胞Ｃの数が予定している培養完了時の数に到達していた場合は、培養操作が完了したものと判定して、これ以上の培養操作を続行しないことを判定することもできる。
判定部１７が培養操作を続行しないと判定した細胞Ｃが収容された容器３については、インキュベータ４に戻しても良いが、インキュベータ４へは戻さずにアイソレータ２からリジェクトしても良い。
When the number of cells C is counted by the counting unit 16 in this way, whether or not the determination unit 17 provided in the control means 7 continues the culture operation for the container 3 containing the cells C based on the result. Make a decision.
If the number of the cells C is a predetermined number, the determination unit 17 determines that the culture of the cells C (cell nucleus division) is being performed smoothly and continues the culture, and the robot 5 again holds the container 3 in the above-described manner. The culture process is continued in the incubator 4.
On the other hand, when the number of cells C is less than the predetermined number, the determination unit 17 determines that no further culturing operation is continued for the cells C. In addition, when the number of cells C is less than a predetermined number, not only the determination that the culture operation is not continued as described above, but also the determination unit 17 determines that the culture of the cells C is not performed smoothly. Then, after performing an operation for promoting the culture such as exchanging the culture medium of the container 3 in which the cells C are accommodated, the robot 3 accommodates the container 3 in the incubator 4 again to continue the culture process. When the number is less than the predetermined number, it can be determined that further culture operation is not continued.
Further, when the number of cells C has reached the planned number at the time of completion of culture, it can be determined that the culture operation has been completed, and it can be determined that further culture operation is not continued. .
The container 3 in which the cells C determined by the determination unit 17 not to continue the culture operation may be returned to the incubator 4, but may be rejected from the isolator 2 without returning to the incubator 4.
以上のように、本実施例では容器３に試薬を投入することなく、当該細胞Ｃの数をカウントすることができることから、当該細胞Ｃの数をカウントするために使用した容器３の細胞Ｃについても、その後の培養操作を続行することができ、細胞Ｃの無駄を生じさせないようになっている。
これに対し、従来は細胞Ｃの数をカウントするために容器３に試薬を投入しており、当該試薬によって染色された細胞Ｃはその後の培養操作が続行できないことから、細胞Ｃの無駄が生じていた。
また、本実施例のカウント工程によれば、撮影手段１３によって容器３に収容された細胞Ｃを撮影するだけで、その後は上記解析部１４やカウント部１６によって細胞Ｃの数をカウントすることができるため、従来のように容器３に試薬を投入する作業や、細胞核が染色されるまでの時間が不要となり、カウント工程と迅速に行うことができる。
また、試薬を投入する必要がないこと、カウント工程を迅速に行うことができるということから、インキュベータ４に収容されているすべての容器３についてその内部の細胞Ｃの数をカウントすることが可能となる。
したがって、より正確に培養中の細胞Ｃの数を管理することが可能となり、また上記判定部１７がこれ以上の培養が不要であると判定した場合には、当該容器３についての無駄な培養操作を省略することができ、より効率的な培養を行うことが可能となる。
As described above, in this embodiment, since the number of the cells C can be counted without introducing a reagent into the container 3, the cells C in the container 3 used for counting the number of the cells C are used. However, the subsequent culturing operation can be continued and the cells C are not wasted.
In contrast, conventionally, a reagent is put into the container 3 in order to count the number of cells C, and the cells C stained with the reagent cannot be continued, so that the cells C are wasted. It was.
Further, according to the counting step of the present embodiment, only the cells C accommodated in the container 3 are photographed by the photographing means 13, and thereafter the number of the cells C can be counted by the analyzing unit 14 and the counting unit 16. Therefore, it is not necessary to perform the operation of putting the reagent into the container 3 as in the prior art, or the time until the cell nucleus is stained, and the count process can be performed quickly.
In addition, since it is not necessary to supply a reagent and the counting process can be performed quickly, it is possible to count the number of cells C inside all the containers 3 accommodated in the incubator 4. Become.
Therefore, it becomes possible to manage the number of cells C in culture more accurately, and when the determination unit 17 determines that further culture is unnecessary, wasteful culture operation for the container 3 is performed. Can be omitted, and more efficient culture can be performed.
なお、上記実施例において上記細胞カウント装置６は上記細胞培養装置１の一部を構成しているが、上記細胞カウント装置６をインキュベータ４の内部に設けてもよく、上記細胞カウント装置６を単体で用いることも可能である。
例えば、上記細胞カウント装置６をアイソレータ２およびインキュベータ４の外部に設置するとともに、上記インキュベータ４に外部から容器３を確認できるような窓を設け、この窓を介してインキュベータ４内の容器の３の細胞Ｃの数をカウントすることができる。
このようにすることで、インキュベータ４をアイソレータ２に接続することなく、容器３に収容された細胞Ｃの数をカウントすることができるため、不必要にインキュベータ４をアイソレータ２に接続する必要がなくなることから、より適切なタイミングで培養操作を行うことが可能となる。
In addition, in the said Example, although the said cell count apparatus 6 comprises a part of said cell culture apparatus 1, you may provide the said cell count apparatus 6 in the inside of the incubator 4, and the said cell count apparatus 6 is single-piece | unit. Can also be used.
For example, the cell counting device 6 is installed outside the isolator 2 and the incubator 4, and a window is provided in the incubator 4 so that the container 3 can be confirmed from the outside. The number of cells C can be counted.
By doing in this way, since the number of the cells C accommodated in the container 3 can be counted without connecting the incubator 4 to the isolator 2, it is not necessary to connect the incubator 4 to the isolator 2 unnecessarily. Therefore, the culture operation can be performed at a more appropriate timing.
１ 細胞培養装置 ２ アイソレータ
３ 容器 ４ インキュベータ
５ ロボット ６ 細胞カウント装置
７ 制御手段 １３ 撮影手段
１４ 解析部 １５ 画像作成部
１６ カウント部 １７ 判定部
Ｃ 細胞
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Cell culture apparatus 2 Isolator 3 Container 4 Incubator 5 Robot 6 Cell counting apparatus 7 Control means 13 Imaging means 14 Analysis part 15 Image creation part 16 Count part 17 Determination part C cell
Claims (6)
同じ容器の同じ箇所について撮影された、容器に試薬を投入していない基画像と、当該容器に試薬を投入して上記細胞の細胞核を染色した染色画像とを予め複数組収集し、上記収集された複数組の基画像および染色画像を用いてディープラーニングのアルゴリズムに学習させ、
計数対象の細胞の数をカウントする際には、当該細胞を収容した容器に試薬を投入せずに当該容器を撮影して、撮影した画像から学習済みの上記アルゴリズムによって細胞の細胞核を認識し、さらに当該細胞核の数をカウントすることを特徴とする細胞カウント方法。 In the cell counting method of photographing a container containing cells and counting the number of cells from the photographed image,
Collected in advance a plurality of sets of a base image in which the reagent is not put into the container and a stained image in which the reagent is put into the container and the cell nucleus of the cell is stained. The deep learning algorithm is trained using multiple sets of base images and stained images.
When counting the number of cells to be counted, photograph the container without putting the reagent into the container containing the cell, and recognize the cell nucleus of the cell by the learned algorithm from the photographed image, Furthermore, the cell count method characterized by counting the number of the said cell nucleus.
上記カウント工程では、上記請求項１に記載の細胞カウント方法を用いて細胞の数をカウントすることを特徴とする細胞培養方法。 In the cell culturing method for culturing cells, in the cell culturing method, the container containing the cells is photographed, and the counting step of counting the number of cells from the photographed image is performed.
In the said count process, the number of cells is counted using the cell counting method of the said Claim 1, The cell culture method characterized by the above-mentioned.
培養状態が不良であると判断した場合には、その後当該細胞に対する培養操作を行わないことを特徴とする請求項２に記載の細胞培養方法。 Based on the result of the counting step, the determination step of determining the culture state of the cell,
The cell culturing method according to claim 2, wherein if it is determined that the culturing state is poor, the culturing operation for the cell is not performed thereafter.
培養状態が不良であると判断した場合には、当該細胞が収容された容器をリジェクトすることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養方法。 Based on the result of the counting step, the determination step of determining the culture state of the cell,
3. The cell culture method according to claim 2, wherein when it is determined that the culture state is poor, the container containing the cells is rejected.
当該容器の細胞が所定個数に達した場合には、培養を終了することを特徴とする請求項２に記載の細胞培養方法。 Based on the result of the counting step, the determination step of determining the culture state of the cell,
The cell culture method according to claim 2, wherein the culture is terminated when the number of cells in the container reaches a predetermined number.
同じ容器の同じ箇所について撮影された、容器に試薬を投入していない基画像と、当該容器に試薬を投入して上記細胞の細胞核を染色した染色画像とを予め複数収集し、上記収集された複数組の基画像および染色画像を用いて学習されたディープラーニングのアルゴリズムを有する解析部を備え、
計数対象の細胞の数をカウントする際には、上記解析部によって上記撮影手段が撮影した計数対象となる細胞の画像を上記アルゴリズムを用いて解析することにより細胞の細胞核を認識するとともに、上記カウント部によって上記解析部の解析結果に基づいて上記細胞核の数をカウントすることを特徴とする細胞カウント装置。 In a cell counting device comprising a photographing means for photographing a container containing cells, and a counting unit for counting the number of cells from the photographed image,
A plurality of pre-collected images of a base image in which the reagent was not put into the container and a stained image in which the reagent was put into the container and the cell nucleus of the cell was stained were collected and collected. An analysis unit having a deep learning algorithm learned using a plurality of sets of base images and stained images,
When counting the number of cells to be counted, the analysis unit recognizes the cell nucleus of the cell by analyzing the image of the cell to be counted captured by the imaging unit using the algorithm, and The cell counting device, wherein the number of the cell nuclei is counted by the unit based on the analysis result of the analysis unit.
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