JP2019097530A

JP2019097530A - 新規微生物及びそれを用いた水生動物用病害防除資材

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Publication number: JP2019097530A
Application number: JP2017235300A
Authority: JP
Inventors: 宮坂　均; Hitoshi Miyasaka; 均宮坂; 博史奥畑; Hiroshi Okuhata; 牧　孝昭; Takaaki Maki; 孝昭牧; 尾崎　健一; Kenichi Ozaki; 健一尾崎
Original assignee: MATSUMOTO BISEIBUTSU KENKYUSHO KK; TAKUSUI KK; Kansai Electric Power Co Inc; Kimigafuchi Gakuen
Current assignee: MATSUMOTO BISEIBUTSU KENKYUSHO KK; TAKUSUI KK; Kansai Electric Power Co Inc; Kimigafuchi Gakuen
Priority date: 2017-12-07
Filing date: 2017-12-07
Publication date: 2019-06-24
Anticipated expiration: 2037-12-07
Also published as: JP6980226B2

Abstract

【課題】少ない投与量でも水生動物の病害防除に効果を発揮することのできる新規微生物、及びそれを用いた水生動物用病害防除資材を提供する。【解決手段】ロドブラム・エスピー（Rhodovulum sp.）ＫＫＭＩ０１菌株（ＮＩＴＥＰ−０２５４８）及び前記菌株を有効成分として含有することを特徴とする水生動物用病害防除資材。前記ＫＫＭＩ０１菌株は、特にクルマエビの病害防除に関して優れた効果を示す。【選択図】図１

Description

本発明は、水生動物の病害防除に優れた効果を有する新規微生物、及びそれを用いた水生動物用病害防除資材に関する。

近年では、食用又は観賞用として多様な水生動物、すなわち魚類、甲殻類、及び貝類等が養殖又は飼育されている。しかし、養殖池や水槽のように、水生動物が高密度に生息し、しかも水の入れ替わりが少ないといった、本来の自然生態系と異なる特殊な人為的環境下では、その環境に適応した微生物が異常発生し、これが水生生物の病害を引き起こす場合がある。例えば、世界的な養殖エビの生産地である東南アジアでは、近年、養殖エビが稚エビの段階で死亡する「早期死亡症候群／急性肝すい臓壊死病」（Early Mortality Syndrome/Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease、EMS/AHPND）とよばれる感染症が蔓延して養殖エビの生産量が激減している。このEMS/AHPNDは、病原性のビブリオ菌によって引き起こされることが分かっている。

従来、水生動物の病原菌感染の予防や病原菌に感染した水生動物の治療（すなわち病害防除）のための手段として、抗生物質を餌に混入して水生生物に投与することが行われている。しかしながら、抗生物質の投与には、耐性菌の出現を促すという問題や、抗生物質を投与した水生生物を食用とする場合の安全性への懸念がある。

そこで、近年、抗生物質に代わるものとして、有用微生物を用いた水生動物の病害防除資材（いわゆる水産プロバイオティクス）に関する研究が盛んに行われている。例えば、非特許文献１には、紅色硫黄細菌であるEctothiorhodospira shaposhnikovii WF株をバナメイエビの幼生の飼育水に添加することにより、幼生の生残率が向上したことが記載されている。また、非特許文献２には、枯草菌であるBacillus licheniformis と Bacillus subtilisの1:1調製物をバナメイエビの幼生の飼育水に投与することにより、幼生の生残率が向上したことが記載されている。更に、非特許文献３には、同じく枯草菌であるBacillus subtilis E20株をバナメイエビの幼生の飼育水に投与することにより幼生の生残率が向上したことが記載されている。

"ベネフィシャル・マイクローブス（Beneficial microbes）", 2015年, 第6巻, 第4号, pp.525-533 "プロバイオティクス・アンド・アンティマイクロバイアル・プロテインズ（Probiotics and Antimicrobial Proteins）"，2015年, 第7巻, 第2号, pp.118-125 "フィッシュ・アンド・シェルフィッシュ・イムノロジー（Fish & Shellfish Immunology）"，2010年, 第28巻, 第5-6号, pp.837-844

しかしながら、非特許文献１〜３に記載された微生物が効果を発揮するためには、いずれも上記微生物をエビの飼育水に1×10⁶cells/ml程度の濃度となるように投与する必要がある。微生物の価格は種類によって異なるが、通常は1×10⁹cells/mlの濃度で1リットルあたり50円〜500円程度である。仮に養殖池の面積を5,000m²、水深を2mとすると、その水量は10,000トンとなり、1リットル50円で計算しても、微生物添加に掛かるコストは500,000円と非常に高額になってしまう。このため、上記従来の微生物を大規模な養殖池や大型水槽に適用するのはコスト面から困難であり、例えば幼生育成の際に用いられる小型タンクでしか利用することができなかった。

本発明は上記の点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、少ない投与量でも水生動物の病害防除に効果を発揮することのできる新規微生物、及びそれを用いた水生動物用病害防除資材を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、海水中から単離した新規菌株が水生生物の病害防除に優れた効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、新規微生物であるロドブラム・エスピー（Rhodovulum sp.）ＫＫＭＩ０１菌株（ＮＩＴＥＰ−０２５４８）を提供する。

上記本発明に係る新規微生物は、3×10²cells/ml程度の濃度（すなわち上記従来の微生物の約3000分の1の投与量）でも水生動物の病害防除効果を発揮できる。そのため、微生物投与に掛かるコストを抑えることができ、大規模な養殖池や大型水槽への適用も可能である。また、上記本発明に係る新規微生物は、餌に混合して水生動物に投与した場合であっても病害防除効果を発揮することができるため、投与量を更に抑えることも可能である。

また、本発明は、ロドブラム・エスピー（Rhodovulum sp.）ＫＫＭＩ０１菌株（ＮＩＴＥＰ−０２５４８）を有効成分として含有する水生動物用病害防除資材を提供する。

なお、上記水生動物用病害防除資材は、ロドブラム・エスピー（Rhodovulum sp.）ＫＫＭＩ０１菌株（ＮＩＴＥＰ−０２５４８）を乾燥菌体の状態で含有するものとすることができる。

上記の通り、本発明に係る新規微生物及びそれを用いた水生動物用病害防除資材によれば、少ない投与量でも水生動物の病害防除を行うことができ、病害防除に掛かるコストを低減することが可能となる。

最尤法によって作成した本発明に係る微生物の分子系統樹。図中のスケールバーは塩基置換率(substitution/site)を表す。

本発明者らは、熊本県上天草市大矢野町の海岸から採取した海水中の細菌の中から、１種類の菌株を単離し、これをＫＫＭＩ０１と命名した。

上記ＫＫＭＩ０１株の16S rRNA遺伝子配列に基づく最尤法分子系統樹解析の結果を図１に示す。この分子系統樹解析の結果から、ＫＫＭＩ０１株は、海洋性の光合成細菌であるロドブラム（Rhodovulum）属に属する互いに近縁な菌株であることが示された。また、前記分子系統樹から前記菌株はロドブラム・サルフィドフィルム（Rhodovulum sulfidophilum）に最も近縁であることが示された。
この菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている（受託日は２０１７年９月２７日、受託番号はＮＩＴＥＰ−０２５４８である）。

本発明者は、上記菌株をクルマエビに投与することにより、該菌株が水生動物の病害防除に優れた効果を発揮することを確認した（後述の実施例１〜実施例３を参照）。本発明に係る水生動物用病害防除資材は、このＫＫＭＩ０１株を有効成分として含有するものである。

前記水生動物用病害防除資材は、上記の菌体を含む培養液又は培養液を除いた菌体の形で使用される。なお、上記本発明に係る菌株は、生菌の状態で使用した場合に限らず、乾燥菌体の状態で使用した場合にも水生動物に対する病害防除効果を発揮することができる（後述の実施例３を参照）。上記菌株を乾燥菌体とした上で使用する場合、生菌の状態で使用する場合に比べて本発明に係る病害防除資材の保管や投与に掛かる手間及びコストを低減することができる。また、本発明に係る病害防除資材は、上記菌株の生菌又は乾燥菌体を、所定の液体やゲルに分散させて液体製剤又はゲル状製剤としたものや、所定の固体から成る担体に保持させて粒剤や粉剤などの剤型としたものであってもよい。

上記水生動物用病害防除資材は、水生動物の飼育水に添加するほか、水生動物の餌に混入することによっても、その効果を発揮させることができる。その使用量は水生動物の種類や飼育環境又は使用時期などに応じて適宜調整することが望ましい。なお、上述の通り、本発明に係る微生物は、従来の病害防除資材に用いられる微生物に比べて少ない投与量で効果を発揮することができ、飼育水に添加して使用する場合には、3×10²cells/ml(最終濃度)/日程度の添加量で病害防除効果を得ることができる（後述の実施例２を参照）。

また、上記本発明に係る水生動物用病害防除資材は、魚類、甲殻類、貝類等の種々の水生動物の病害防除、特に、クルマエビ、バナメイエビ、ウシエビ（ブラックタイガー）を始めとするクルマエビ科のエビの病害防除に好適に使用することができる。なお、本発明の病害防除資材の適用対象とする水生動物は、海水、淡水、又は汽水のいずれに生息するものであってもよい。

本発明に係る微生物による病害防除効果を確認するため、クルマエビへの投与試験を行った。具体的には、布濾過した実海水を収容した150トン培養槽で飼育されているクルマエビに、ロドブラム・エスピー（Rhodovulum sp.）ＫＫＭＩ０１菌株の生菌を湿重量で0.01%混合した餌を、70日間、毎日エビの体重の10質量％給与した（これを投与区とよぶ）。また、対照として、別の150トン培養槽で飼育されているクルマエビに、菌体を含有しない餌を、70日間、毎日エビの体重の10質量％給与した（これを無投与区とよぶ）。表１に、試験開始時及び試験終了時における各試験区のクルマエビの平均体重及び尾数と、試験終了時における各試験区のクルマエビの生残率とを示す。

表１のデータをカイ二乗検定で分析したところ、カイ二乗値＝36.10, Ｐ値＝1.88×10^-9 という結果となり、投与区と無投与区のクルマエビの生残率には高度な有意差が認められた。すなわち、上記試験により、本発明に係る微生物の投与によってクルマエビの生残率が有意に向上することが確認された。

本発明に係る微生物の投与によるクルマエビの遺伝子発現の変化を調べた。具体的には、まず以下の３つの試験区でクルマエビの飼育を行った。なお、いずれの試験区においても、30リットル水槽中に布濾過した実海水を収容して10尾のクルマエビ（平均体重約11g）を飼育した。
投与区１：ＫＫＭＩ０１菌株の生菌を湿重量で0.01％混合した餌を毎日エビの体重の10質量％給与。
投与区２：ＫＫＭＩ０１菌株の生菌を飼育水槽中へ3×10²cells/ml(最終濃度)/日の条件で投与し、前記菌株を含まない餌を毎日エビの体重の10質量％給与。
無投与区：飼育水槽への前記菌体の投与は行わず、且つ前記菌株を含まない餌を毎日エビの体重の10質量％給与。

続いて、各試験区で2週間飼育したクルマエビの中腸腺組織から常法に従ってRNAを抽出し、該RNAから合成したcDNAを用いて次世代シーケンサー（フローセルによる可逆的ターミネーター法を用いた1塩基伸長反応）によるトランスクリプトーム解析（遺伝子発現解析）を行った。

トランスクリプトーム解析は、ユーロフィンジェノミクス株式会社に依託し、以下の条件で行った。
装置：HiSeq2500 (illumina社)
ソフトウエア：HiSeq Control Software 2.2.58、RTA 1.18.64、bcl2fastq 1.8.4
リード条件：2×125bp, 0.4-0.6億read/sample
マッピング対象遺伝子：クルマエビの273遺伝子のcDNA塩基配列
発現量の比較：ソフトウエアedgeR（ver. 3.16.1）によるリード数の正規化と発現量比較（尤法検定）

上記発現解析により、病害抵抗性タンパク質又は抗菌ペプチドをコードする複数の遺伝子（以下、これらを「病害抵抗性遺伝子」とよぶ）の発現量の増加が確認された。投与区１及び投与区２における前記病害抵抗性遺伝子の発現量を表２に示す。なお、表２において、各遺伝子の発現量は、無投与区を１とした場合の相対値で示している。

表２から明らかなように、投与区１及び投与区２の双方において様々な病害抵抗性遺伝子の発現量の増加が認められた（但し、抗菌ペプチドをコードする遺伝子については、投与区１のみで発現上昇が見られた）。これらの遺伝子は自然免疫（先天性免疫）に寄与するタンパク質又はペプチドをコードするものであることから、本発明に係る微生物の投与によりクルマエビの自然免疫が賦活化されたと推定される。

本発明に係る微生物の投与を行ったクルマエビに対し、病原性ビブリオ菌を強制感作させて病害抑制効果を確認した。具体的には、以下の３つの試験区で本発明に係る微生物を与えてクルマエビ（平均体重１g）を７日間飼育し、その後クルマエビ病原性ビブリオ菌であるビブリオ・ニグリプルクリチュード（Vibrio nigripulchritudo）を強制感作させ６日間飼育し、最終日における生残率を求めた。なお、いずれの試験区においても、人工海水（marine-salt、株式会社カイスイマレン製）を収容した水槽中でクルマエビを飼育した。
生菌餌投与区：ＫＫＭＩ０１菌株の生菌を湿重量で0.01％混合した餌を毎日エビの体重の10質量％給与。
乾燥菌体餌投与区：ＫＫＭＩ０１菌株の乾燥菌体を生菌換算で0.01％相当となるよう添加した餌を毎日エビの体重の10質量％給与。
無投与区：前記菌株を含まない餌を毎日エビの体重の10質量％給与。
なお、前記強制感作は、人工海水中にビブリオ・ニグリプルクリチュード（Vibrio nigripulchritudo）を終濃度が1×10⁶ cfu/mlとなるように添加したものに、クルマエビを３時間漬けることによって行った。試験開始時（０日目）及び試験終了時（６日目）における各試験区のクルマエビの尾数と、試験終了時における各試験区のクルマエビの生残率とを表３に示す。

表３に示す通り、生菌餌投与区及び乾燥菌体餌投与区の双方において、生残率が無投与区の２倍以上に上昇した。これは、本発明に係る微生物の投与により、病原性ビブリオ菌に対するクルマエビの抵抗性が高められたためと考えられる。

Claims

ロドブラム・エスピー（Rhodovulum sp.）ＫＫＭＩ０１菌株（ＮＩＴＥＰ−０２５４８）。
ロドブラム・エスピー（Rhodovulum sp.）ＫＫＭＩ０１菌株（ＮＩＴＥＰ−０２５４８）を有効成分として含有することを特徴とする水生動物用病害防除資材。
ロドブラム・エスピー（Rhodovulum sp.）ＫＫＭＩ０１菌株（ＮＩＴＥＰ−０２５４８）を乾燥菌体の状態で含有することを特徴とする請求項２に記載の水生動物用病害防除資材。
請求項２又は３に係る水生動物用病害防除資材を、餌に混合して水生動物に投与することを特徴とする水生動物の病害防除方法。
請求項２又は３に係る水生動物用病害防除資材を、水生動物の飼育水に添加することを特徴とする水生動物の病害防除方法。