JP2019053019A - 細胞の弾性特性を解析する方法、解析システム、細胞の弾性特性を可視化する方法およびプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】細胞の弾性特性を精密に解析するための新規な手法を提供する。
【解決手段】解析対象となる個々の細胞の表面に原子間力顕微鏡の探針を押し当てた際に得られる細胞の変形量と探針にかかる力を対応付けたデータを、細胞の変形量をＸ軸とし、探針にかかる力をＹ軸とする直交座標上にプロットして複数のフォースカーブを取得するステップと、取得した各フォースカーブについて、フォースカーブをＸ軸方向に分割する複数の変形区間を定義し、各変形区間に対応する曲線に対してフィッティングを行ってヤング率を算出し、算出したヤング率と該変形区間を対応付けるステップと、各変形区間に対応付けられた複数のヤング率に基づいて相対度数分布を作成するステップと、作成された複数の相対度数分布に基づいて、変形区間をＸ軸に取り、ヤング率の階級をＹ軸に取り、相対度数を色で表現した２次元ヒートマップを生成するステップとを含む方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞の解析技術に関し、より詳細には、細胞の弾性特性を解析する技術に関する。

近年、細胞の機能と細胞の硬さが大きく関係しているという事実に鑑み、細胞の機能の指標として、細胞の硬さを測定することが広く行われている。

この点につき、非特許文献１は、がん細胞の転移能の指標として、原子間力顕微鏡（AFM:Atomic Force Microscope）を用いて、がん細胞のヤング率を測定する方法を開示する。

ここで、細胞は、細胞膜、細胞骨格、核といった異なる複数の要素で構成されており、その硬さは全体に均一なわけではない。これに対し、非特許文献１が開示する方法は、細胞の硬さを均一と仮定するものであり、細胞の硬さに関して、十分な情報を提供するものではなかった。

T. Watanabe, H. Kuramochi, A. Takahashi, K. Imai, N. Katsuta, T. Nakamura, H. Fujiki, and M. Suganuma,"Higher cell stiffness indicating lower metastatic potential in B16 melanoma cell variants and in (-)-epigallocatechin gallate-treated cells",J. Cancer Res. Clin. Oncol., 138 (2012) 859-866.

本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、細胞の弾性特性を精密に解析するための新規な手法を提供することを目的とする。

本発明者は、細胞の弾性特性を精密に解析するための構成につき鋭意検討した結果、以下の構成に想到し、本発明に至ったのである。

すなわち、本発明によれば、細胞の弾性特性を解析する方法であって、解析対象となる個々の細胞の表面に原子間力顕微鏡の探針を押し当てた際に得られる、細胞の変形量と探針にかかる力を対応付けたデータを、細胞の変形量をＸ軸とし、探針にかかる力をＹ軸とする直交座標上にプロットして複数のフォースカーブを取得するステップと、取得した各フォースカーブについて、フォースカーブをＸ軸方向に分割する複数の変形区間を定義し、各変形区間に対応するフォースカーブの一部をなす曲線に対してフィッティングを行ってヤング率を算出し、算出したヤング率と該変形区間を対応付けるステップと、各変形区間に対応付けられた複数のヤング率に基づいて相対度数分布を作成するステップと、作成された複数の相対度数分布に基づいて、変形区間をＸ軸に取り、ヤング率の階級をＹ軸に取り、相対度数を所定の色スケール上の色で表現した２次元ヒートマップを生成するステップと、を含む方法が提供される。

上述したように、本発明によれば、細胞の弾性特性を精密に解析するための新規な手法が提供される。

本実施形態の細胞解析システムのシステム構成図。 フォースカーブ取得処理を示すフローチャート。 フォースカーブ取得処理を説明するための図。 ヒートマップ生成処理を示すフローチャート。 ヒートマップ生成処理を説明するための図。 ヒートマップ生成処理を説明するための図。 サンプル１（未処理）のヒートマップを示す図。 サンプル２（EGCG処理）のヒートマップを示す図。 サンプル３（Cur処理）のヒートマップを示す図。 サンプル４（MβCD処理）のヒートマップを示す図。 サンプル５（siAXL処理）のヒートマップを示す図。

以下、本発明を図面に示した実施の形態をもって説明するが、本発明は、図面に示した実施の形態に限定されるものではない。なお、以下に参照する各図においては、共通する要素について同じ符号を用い、適宜、その説明を省略するものとする。

図１は、本発明の実施形態である細胞解析システム１００のシステム構成を模式的に示す。図１に示すように、本実施形態の細胞解析システム１００は、原子力間力顕微鏡２０（AFM:Atomic Force Microscope）と、位置調整手段３０と、コンピュータ１０とを含んで構成されている。

原子力間力顕微鏡２０は、半導体レーザー２２と、先端にピラミッド型の探針２４を備えたカンチレバー２３と、フォトディテクタ２５と、プリアンプ２６とを含んで構成されている。原子力間力顕微鏡２０においては、半導体レーザー２２から出射したレーザー光がカンチレバー２３の背面に照射され、その反射光が４分割された受光面を有するフォトディテクタ２５に入射する。これを受けて、フォトディテクタ２５から入射光のパワーに比例した電流が出力され、これがプリアンプ２６を介して電圧値に変換される。プリアンプ２６は、フォトディテクタ２５が有する４分割された各受光面に対応する電圧値のうち、上側２つの受光面に対応する電圧値の和と、下側２つの受光面に対する電圧値の和をとり、さらに、上側２つの受光面に対する電圧値の和と下側２つの受光面に対する電圧値の和の差をとることで、カンチレバー２３のたわみ量を電圧値として出力し、出力されたたわみ量を表す電圧値をコンピュータ１０に入力する。

位置調整手段３０は、ＸＹＺの３軸方向にミリオーダーの移動量を持つＸＹＺ軸ステージ３２と、ＸＹＺ軸ステージ３２の上に配置され、ＸＹＺの３軸方向にナノメートルオーダーの分解能を持つピエゾスキャナ３４と、ＸＹＺ軸ステージ３２およびピエゾスキャナ３４を制御するコントローラ３５とを含んで構成されている。ここで、解析対象となる細胞種に属する複数の細胞を播種したディッシュ４０は、ピエゾスキャナ３４のＺ軸ピエゾ素子の上に設置され、コントローラ３５は、ピエゾスキャナ３４を構成する３つのピエゾ素子（Ｘ、Ｙ、Ｚ）を個別に制御するとともに、少なくともＺピエゾ素子の移動量（変位量）をコンピュータ１０に入力する。

コンピュータ１０は、コントローラ３５を介して位置調整手段３０を制御するとともに、プリアンプ２６およびコントローラ３５からの入力に基づいて後述する細胞の解析処理を実行する情報処理装置である。なお、コンピュータ１０は、その態様を限定するものではなく、パーソナルコンピュータであってもよいし、本発明の用途に特化した組み込みコンピュータであってもよい。

以上、細胞解析システム１００のシステム構成について説明してきたが、続いて、コンピュータ１０が実行する細胞の解析処理について説明する。なお、以下の説明においては、図１を適宜参照するものとする。

本実施形態では、コンピュータ１０が、大きく分けて２つの処理を実行する。第１の処理では、ディッシュ４０に播種された細胞のうち、予め決められた数の個々の細胞に対して、カンチレバー２３の探針２４を押し当てるという作業を繰り返して複数のフォースカーブを取得する。続く第２の処理では、取得した複数のフォースカーブに基づいて、解析対象となる細胞の弾性特性を可視化するヒートマップを生成する。

ここでは、まず、図２に示すフローチャートに基づいて、フォースカーブを取得する処理を説明する。

ステップ１０１では、位置調整手段３０を制御して、ディッシュ４０に播種された測定対象となる細胞のうち、１番目の細胞の測定領域に探針２４を位置づける。ここで、本実施形態では、図３（ａ）に示すように、細胞の核の直上の表面に矩形の測定領域を定義し、当該測定領域の内側に複数の測定位置を定義する。図３（ａ）に示す例では、細胞の表面に、核の中心を中心とする４μm×４μmの範囲を測定領域として定義し、この測定領域を１μm×１μmの正方形で１６分割した各区画の中心を１６個の測定位置として定義している。

続くステップ１０２では、ピエゾスキャナ３４のＸＹピエゾ素子を駆動して、カンチレバー２３の探針２４を１６個の測定位置の中の１番目の測定位置に合わせる。

続くステップ１０３では、ピエゾスキャナ３４のＺピエゾ素子を駆動して、所定単位量だけ上方に移動させる。

続くステップ１０４では、下記（１）〜（３）を算出し、これらを要素とする組データを所定の記憶領域に保存する。
（１）Ｚピエゾ素子の原点からの移動量ｚ（以下、移動量ｚという）
（２）カンチレバー２３のたわみ量Δ（以下、たわみ量Δという）
（３）探針２４にかかる力Ｆ（以下、力Ｆという）

続くステップ１０５では、力Ｆが所定の閾値を超えているか否かを判断し、力Ｆが所定の閾値を超えるまで（ステップ１０５、Ｎｏ）、ステップ１０３〜１０４を繰り返し実行する。

本実施形態では、上述したステップ１０３〜１０４が繰り返し実行されることにより、Ｚピエゾ素子が上方へ一定速度で移動し、これに伴って、Ｚピエゾ素子の上に配置されたディッシュ４０が上方に移動する。すると、ある時点で、カンチレバー２３の探針２４が、先のステップ１０２で位置合わせした１番目の測定位置において細胞の表面に接触し、その後、ディッシュ４０がさらに上方に移動することに伴って、細胞表面が探針２４に押し当てられて弾性変形し、これに伴って、カンチレバー２３にたわみが生じる。

この間、コンピュータ１０は、コントローラ３５からの入力に基づいて「移動量ｚ」を算出し、プリアンプ２６から入力される電圧値に基づいて「たわみ量Δ」を取得し、取得した「たわみ量Δ」にカンチレバー２３のバネ定数を乗じることにより「力Ｆ」を算出する。

その後、力Ｆが所定の閾値を超えた時点で（ステップ１０５、Ｙｅｓ）、処理はステップ１０６に進み、組データ（移動量ｚ、たわみ量Δ、力Ｆ）の保存を終了するとともに、ピエゾスキャナ３４のＺピエゾ素子を原点復帰して、探針２４を細胞から引き離す。この時点で、所定の記憶領域には、複数の組データ（移動量ｚ、たわみ量Δ、力Ｆ）からなるデータセットが保存されることになる。

続くステップ１０７では、所定の記憶領域に保存された複数の組データ（移動量ｚ、たわみ量Δ、力Ｆ）からなるデータセットに基づいてＦ-ｚ曲線を取得する。具体的には、所定の記憶領域に保存された複数の組データ（移動量ｚ、たわみ量Δ、力Ｆ）から複数の組データ（移動量ｚ、力Ｆ）を抽出し、抽出した複数の組データ（移動量ｚ、力Ｆ）を、移動量ｚをＸ軸とし、力ＦをＹ軸とする直交座標上にプロットしてＦ-ｚ曲線を取得する。

続くステップ１０８では、先のステップ１０７で取得したＦ-ｚ曲線を利用して、以下の手順で、Ｆ-δ曲線を取得する。

カンチレバー２３が細胞表面に接触した時点におけるＺピエゾの原点からの移動量ｚ_０、細胞の変形量δ、移動量ｚ、たわみ量Δの間には、下記式（１）が成り立つ。

そこで、ステップ１０８では、まず、カンチレバー２３が細胞表面に接触した時点に対応するＦ-ｚ曲線上のプロット点（以下、接触点という）を特定し、特定した接触点のＸ座標値から移動量ｚ_０を求める。次に、所定の記憶領域に保存された複数の組データ（移動量ｚ、たわみ量Δ、力Ｆ）の各々について、その要素である移動量ｚおよびたわみ量Δと、求めた移動量ｚ_０を上記式（１）に代入して変形量δを算出した上で、算出した変形量δと、組データのもう一つの要素である力Ｆとを対応付けた組データ（変形量δ、力Ｆ）を生成する。最後に、このようにして生成された複数の組データ（変形量δ、力Ｆ）を、変形量δをＸ軸とし、力ＦをＹ軸とする直交座標上にプロットしてＦ-δ曲線を取得する。

続くステップ１０９では、先のステップ１０８で取得したＦ-δ曲線を、１番目の測定位置に係る“フォースカーブ”として、所定の記憶領域に保存する。その後、処理は、再びステップ１０２に戻り、ピエゾスキャナ３４のＸＹピエゾを駆動して、カンチレバー２３の探針２４を２番目の測定位置に合わせる。その後、上述したステップ１０３〜１０８を実行してＦ-δ曲線を取得し、続くステップ１０９で、取得したＦ-δ曲線を、２番目の測定位置に係るフォースカーブとして、所定の記憶領域に保存する。以降、１番目の細胞の表面に定義された全ての測定位置に係るフォースカーブを取得するまで、上述したステップ１０２〜１０９を繰り返す。

１番目の細胞の表面に定義された全ての測定位置に係るフォースカーブを取得した時点で、処理は、再びステップ１０１に戻り、位置調整手段３０を制御して、２番目の細胞の測定領域の上に探針２４を位置づける。その後、２番目の細胞の表面に定義された全ての測定位置に係るフォースカーブを取得するまで、上述したステップ１０２〜１０９を繰り返し実行する。２番目の細胞の表面に定義された全ての測定位置に係るフォースカーブを取得した時点で、処理は、再びステップ１０１に戻る。以降、上述したステップ１０１〜１０９を繰り返し実行し、予定した数の細胞に係るフォースカーブを取得した時点で、処理を終了する。この時点で、所定の記憶領域には、測定した細胞の数に測定位置の数を乗じた数のフォースカーブが保存されることになる。

以上、フォースカーブ取得処理について説明したので、続いて、図４に示すフローチャートに基づいて、ヒートマップを生成する処理を説明する。

ステップ２０１では、所定の記憶領域から、解析対象の細胞について取得したＰ個（Ｐ＝測定した細胞の数に測定位置の数を乗じた数）のフォースカーブを読み出す。

続くステップ２０２では、Ｐ個のフォースカーブの中から、１番目のフォースカーブを選出し、当該フォースカーブを、接触点（０，０）を起点として、Ｘ軸方向に等分割するｎ個の変形区間δ_i(i=１,２,…,ｎ)を定義する。なお、別の実施形態では、接触点（０，０）からＸ軸方向に所定距離だけ離間した点を分割の起点としてもよい。

続くステップ２０３では、１番目の変形区間δ_１に対応するフォースカーブの一部をなす曲線に対してフィッティングを行ってヤング率Ｅ_１を算出し、続くステップ２０４で、算出したヤング率Ｅ_１を変形区間δ_１に対応付けて所定の記憶領域に保存する。

その後、処理は、再びステップ２０３に戻り、２番目の変形区間δ_２に対応するフォースカーブの一部をなす曲線に対してフィッティングを行ってヤング率Ｅ_２を算出し、続くステップ２０４で、算出したヤング率Ｅ_２を変形区間δ_２に対応付けて所定の記憶領域に保存する。以降、ｎ番目の変形区間δ_ｎに対応するヤング率Ｅ_ｎを取得するまで、上述したステップ２０３〜２０４を繰り返す。

なお、先述したフォースカーブ取得処理（図２参照）では、探針２４にかかる力Ｆが所定の閾値を超えた時点で、探針２４を細胞から引き離すようにしているので、フォースカーブによっては、変形区間δ_ｉに対応する曲線が存在しない場合がある。本実施形態では、そのような場合、対応する曲線が存在しない変形区間δ_ｉのヤング率Ｅ_ｉの値としてブランクを対応付けて所定の記憶領域に保存する。

ここで、上述したステップ２０２〜２０４で実行される処理の内容を、図５（ａ）を参照して具体的に説明する。

ステップ２０２では、フォースカーブを、接触点（０，０）を起点として、Ｘ軸方向に距離Δｄで等分割することにより、４個の変形区間δ_１、δ_２、δ_３、δ_４を定義する。ただし、図６（ａ）に示す例では、最後の変形区間δ_４の長さがΔｄに満たないためΔｄ’となっている。

ここで、ヘルツの接触理論によれば、図３（ｂ）に示すように、半頂角θの円錐形状を有する物体（ヤング率：Ｅ_ｔ、ポアソン比：ν_t）の先端が、平面形状の物体（ヤング率：Ｅ_ｓ、ポアソン比：ν_s）をδだけ変形させたときに、２つの物体の間に働く力Ｆは下記式（２）、（３）で表される。

この点、ナノメートルレベルで先鋭な探針２４に対するマイクロメートルレベルの細胞の表面は、円錐形状に対する平面形状とみなすことができることから、ステップ２０３では、上述したヘルツの接触理論に基づき、以下の手順で細胞のヤング率（上記式（３）におけるＥ_ｓ）を算出する。

まず、変形区間δ_１に対応するフォースカーブの一部をなす曲線Ｌ_１に対して、上記式（２）をフィッティングすることで、Ｋの値を見積もる。なお、フィッティングに際しては、上記式（２）のθに探針２４の先端の半頂角を代入し、上記式（２）が必ず接触点（０，０）を通るようにフィッティングする。

次に、フィッティングで見積もったＫの値、探針２４のヤング率Ｅ_ｔ、探針２４のポアソン比ν_ｔ、細胞のポアソン比ν_ｓ（＝０．５）を上記式（３）に代入してヤング率Ｅ_ｓを算出する。そして、続くステップ２０４で、算出したヤング率Ｅ_ｓ（この場合、ヤング率Ｅ_１）を変形区間δ_１に対応付けて所定の記憶領域に保存する。

その後、残りの曲線Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４に対しても、上述したのと同様の手順でフィッティングを行い、その結果として算出されたヤング率Ｅ_２、Ｅ_３、Ｅ_４を、それぞれ、変形区間δ_２、δ_３、δ_４に対応付けて所定の記憶領域に保存する。図５（ｂ）は、変形区間δ_１〜δ_４に対応するヤング率Ｅ_１〜Ｅ_４をプロットしたグラフを示す。

なお、ここでは、便宜上、フォースカーブを４個の変形区間に基づいて４分割した場合を例にとって説明したが、実際の運用では、要求される解析の解像度に応じて、変形区間の数（フォースカーブの分割数）を適切な値に設定する。

再び、図４に戻って説明を続ける。

上述したステップ２０３〜２０４を繰り返し実行して、１番目のフォースカーブからｎ個のヤング率Ｅ_１〜Ｅ_ｎを取得すると、処理は、再びステップ２０２に戻る。続くステップ２０２では、２番目のフォースカーブを、接触点（０，０）を起点として、Ｘ軸方向に等分割するｎ個の変形区間δ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)を定義した後、２番目のフォースカーブからｎ個のヤング率Ｅ_１〜Ｅ_ｎを取得するまで、上述したステップ２０３〜２０４を繰り返し実行する。２番目のフォースカーブからｎ個のヤング率Ｅ_１〜Ｅ_ｎを取得すると、処理は、再びステップ２０２に戻る。以降、上述したステップ２０２〜２０４を繰り返し実行し、Ｐ番目のフォースカーブからｎ個のヤング率Ｅ_１〜Ｅ_ｎを取得した時点で、処理はステップ２０５に進む。

続くステップ２０５では、所定の記憶領域に保存されている（Ｐ×ｎ）個のヤング率を変形区間毎にまとめて、ｎ個の変形区間δ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)の各々に対してＰ個のヤング率Ｅ_ｉを対応付けたデータセットを生成する。

続くステップ２０６では、先のステップ２０５で生成したデータセットに基づき、１番目の変形区間δ_１に対応するＰ個のヤング率Ｅ_１を所定の階級幅を持つｍ個の階級Ｃ_ｑ(ｑ=１,２,…,ｍ)に分けて相対度数分布Ｄ_１を作成する。なお、階級分けに際しては、データの数Ｐ（＝測定した細胞の数に測定位置の数を乗じた数）に応じて適切な階級幅を設定することが好ましい。また、相対度数分布の作成にあたり、ヤング率の値がブランクとなっているデータについては、解析の目的に応じて、これを度数合計に含めるようにしても良いし、含めないようにしても良い。

その後、上述したステップ２０６を繰り返し実行し、ｎ個の変形区間δ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)の各々に対応するｎ個の相対度数分布Ｄ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)を作成した時点で、処理はステップ２０７に進む。

続くステップ２０７では、先のステップ２０６で作成したｎ個の相対度数分布Ｄ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)に基づいて、変形区間δ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)をＸ軸に取り、ヤング率の階級Ｃ_ｑ(ｑ=１，２，…，ｍ)をＹ軸に取り、相対度数を所定の色スケール上の色で表現した２次元ヒートマップを生成する。

以下、ステップ２０７の具体的な内容を説明する。ステップ２０７では、まず、先のステップ２０６で作成したｎ個の相対度数分布Ｄ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)の各々から、変形区間δ_ｉと、階級Ｃ_ｑと、階級Ｃ_ｑの相対度数とを対応付けた組データ（δ_i,Ｃ_ｑ,相対度数）を生成する。ここでは、階級Ｃ_ｑがｍ個あることから、結果として、（ｍ×ｎ）個の組データ（δ_ｉ,Ｃ_ｑ,相対度数）からなるデータセットが取得されることになる。

図６（ａ）は、ｎ個の変形区間δ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)に対応するｎ個の相対度数分布Ｄ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)をヒストグラムとして表す。図６（ａ）に示すように、相対度数分布Ｄ_ｉを表すヒストグラムは、ｍ個の柱（高さ０の柱を含む）で構成されており、柱の一つ一つが組データ（δ_ｉ,Ｃ_ｑ,相対度数）に対応している。

次に、ｎ個の変形区間δ_ｉ(i=１,２,…,ｎ)をＸ軸に割り当て、ｍ個の階級Ｃ_ｑ(ｑ=１,２,…,ｍ)をＹ軸に割り当てた、ｍ行ｎ列の２次元マトリックスを定義する。

次に、２次元マトリックスの、変形区間δ_ｉと階級Ｃ_ｑに対応するセル（ｘ_ｉ，ｙ_q）に対して、取得したデータセットから対応する組データ（δ_ｉ,Ｃ_ｑ,相対度数）の相対度数を割り当てる（i=１,２,…,ｎ、ｑ=１,２,…,ｍ）。

次に、セル（ｘ_ｉ，ｙ_q）に割り当てた相対度数の値を所定の色スケールに照らし、相対度数の値に対応する色を当該セル（ｘ_ｉ，ｙ_q）の表示色として決定する（i=１,２,…,ｎ、ｑ=１,２,…,ｍ）。なお、ここでいう「色スケール」は、カラースケールならびにグレースケールを含む概念であり、本実施形態では、予め、所定の色スケールに相対度数の値域を対応付けておく。最後に、各セル（ｘ_ｉ，ｙ_q）を決定した表示色で表示して、処理を終了する。

図６（ｂ）は、先のステップ２０７で生成される２次元ヒートマップを例示的に示す。図６（ｂ）に示すように、本実施形態の２次元ヒートマップでは、各セルが１つの変形区間の１つの階級を表しており、各セルの色が対応する階級の相対度数を表している。

以上、説明したように、本実施形態によれば、解析対象となる細胞の弾性特性を２次元ヒートマップによって可視化することができ、これにより、例えば、以下のようなことが期待できる。

近年、がん細胞の転移能とがん細胞の硬さの間に負の相関があることがわかってきており、これを受けて、細胞硬化作用を持つ物質（緑茶カテキンなど）を使用してがんの転移を抑制するための研究がなされている。このような研究において、候補物質の薬効を精密に評価するためには、候補物質の作用を受けたがん細胞の弾性特性を精密に解析する必要がある。この点につき、本実施形態の２次元ヒートマップは、細胞の弾性特性に関して豊富な情報を含んでおり、その精密な解析に寄与するものと考えられる。

また、今後、本実施形態の２次元ヒートマップが表すがん細胞の弾性特性とがんの転移性の間の相関が明らかになってくれば、本実施形態の２次元ヒートマップを使用したがんの悪性度診断が可能になるものと考えられる。

以上、本発明について実施形態をもって説明してきたが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、当業者が推考しうるその他の実施態様の範囲内において、本発明の作用・効果を奏する限り、本発明の範囲に含まれるものである。

例えば、上述した実施形態では、１つの細胞の表面上の異なる位置に探針２４を複数回押し当てる態様を示したが、他の実施形態では、１つの細胞につき１回だけ探針２４を押し当てるようにし、その分、測定する細胞の数を増やすようにしてもよい。

また、上述した実施形態では、細胞の弾性特性を表す２次元ヒートマップを解析結果として出力する態様を示したが、他の実施形態では、ｍ行ｎ列の２次元ヒートマップの元となる（ｍ×ｎ）個の組データ（δ_ｉ,Ｃ_ｑ,相対度数）からなるデータセットを解析結果として出力・保存するようにしてもよく、当該データセットを使用して、上述した候補物質の薬効の評価やがんの悪性度診断を行うようにしてもよい。

なお、図２および図４に示したフローチャートの手順は、適切なプログラム言語によってコンピュータが実行可能なプログラムとして記述することができ、当該プログラムをインストールしたコンピュータによって実行させることができる。また、本実施形態のプログラムは、ハードディスク装置、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ、フレキシブルディスク、ＥＥＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭなどの記録媒体に格納して頒布することができ、また、ネットワークを介して伝送することもできる。

以下、本発明について、実施例を用いてより具体的に説明を行なうが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。

＜細胞の硬化処理＞
本実施例では、ヒト非小細胞肺がん細胞（H1299）に対して、既往の研究により細胞を硬くすることが確認されている４種類の処理（EGCG処理、Cur処理、MβCD処理、siAXL処理）を施した４種類の細胞種と、未処理の細胞種を含む合計５種類のサンプルを用意した。以下、各処理の具体的な手順を説明する。

（未処理）
H1299細胞（1×10⁵cells）を6cmのディッシュに、10%のウシ胎児血清（FBS）を含むロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI 1640）で播種し、48時間後、無血清RPMI 1640培地に交換してサンプル１（未処理）を得た。

（EGCG処理）
H1299細胞（1×10⁵cells）を6cmのディッシュに、10%のウシ胎児血清（FBS）を含むロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI 1640）で播種し、48時間後、(-)-エピガロカテキンガレート（EGCG）を溶解した無血清RPMI 1640培地に交換した。4時間インキュベーションした後、化合物を含まない無血清RPMI 1640培地に交換してサンプル２（EGCG処理）を得た。

（Cur処理）
H1299細胞（1×10⁵cells）を6cmのディッシュに、10%のウシ胎児血清（FBS）を含むロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI 1640）で播種し、48時間後、クルクミン（Cur）を溶解した無血清RPMI 1640培地に交換した。4時間インキュベーションした後、化合物を含まない無血清RPMI 1640培地に交換してサンプル３（Cur処理）を得た。

（MβCD処理）
H1299細胞（1×10⁵cells）を6cmのディッシュに、10%のウシ胎児血清（FBS）を含むロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI 1640）で播種し、48時間後、メチル-β-サイクロデキストリン（MβCD）を溶解した無血清RPMI 1640培地に交換した。4時間インキュベーションした後、化合物を含まない無血清RPMI 1640培地に交換してサンプル４（MβCD処理）を得た。

（siAXL処理）
H1299細胞（1 x 10⁵ cells）を6 cmのディッシュに、10%のウシ胎児血清（FBS）を含むロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI 1640）で播種し、24時間後、H1299細胞の受容体チロシンキナーゼ（AXL）をノックダウンするために、10 nMのAXL特異的siRNA（siAXL）をリポフェクション法で導入し、48時間培養した。その後、無血清RPMI 1640培地に交換して、サンプル５（siAXL処理）を得た。

＜Ｆ-ｚ曲線の取得＞
上述した手順で作製した５種類のサンプル１〜５のそれぞれについて、先述の実施形態で説明した方法でＦ-ｚ曲線を取得した。本実施例では、原子間力顕微鏡として、Oxford Instruments社製AFM、MFP-3Dを使用し、先端にピラミッド型の窒化シリコン（Si₃N₄）製探針を有するカンチレバー（オリンパス社製、OMCL-TR400PSA）を使用した。

Ｆ-ｚ曲線の取得に際しては、細胞の核を中心とする４μm×４μmの範囲を１μm×１μmの正方形で１６分割した各区画の中心を測定位置とし、１６個の測定位置に対して探針を押し当てた後、探針にかかる力Ｆが0.5pN（閾値）を超えたところで、細胞から探針を離すようにした。この作業を各サンプルの２０個の細胞のそれぞれに対して行って、サンプル毎に３２０個（１６×２０）のＦ-ｚ曲線を取得した。

＜従来法による細胞の硬さの評価＞
先述の実施形態で説明した方法により、各サンプルに係る３２０個のＦ-ｚ曲線をフォースカーブ（Ｆ-δ曲線）に変換した。各サンプルについて得られた３２０個のフォースカーブ（Ｆ-δ曲線）のそれぞれについて、おおよそ５０ｎｍ＜δ＜５００ｎｍの範囲でフィッティングを行い、細胞のヤング率を算出した。その上で、各サンプルの細胞の硬さを表す指標として、各サンプルについて算出された３２０個のヤング率の平均値を求めた。なお、ヤング率の算出に際しては、窒化シリコン製の探針のヤング率Ｅ_ｔ＝２９０ＧＰａとし、探針のポアソン比ν_t＝０．２５とし、探針先端の半頂角θ＝１７．５°とし、細胞のポアソン比ν_s＝０．５とした。下記表１に、各サンプルについて得られたヤング率（平均値）をまとめて示す。

＜ヒートマップの生成＞
上述した手順で各サンプルから得られた３２０個のフォースカーブ（Ｆ-δ曲線）に基づいて、以下の処理を行った。まず、各フォースカーブ（Ｆ-δ曲線）を接触点（０，０）を起点としてｘ軸方向（変形方向）にΔｄ＝５０ｎｍで等分割する５３個の変形区間を定義した。その上で、フォースカーブの各変形区間に対応する曲線に対して、接触点（０，０）を通る形でフィッティングを行い、各変形区間に対応するヤング率を算出した。その後、５３個の変形区間の各々について算出された３２０個のヤング率のデータ（ブランクを含む）を、０．４[ｋＰａ]の階級幅で、２５個の階級に分けて相対度数分布を作成した。なお、相対度数分布の作成にあたり、ヤング率の値がブランクとなっているデータを度数合計に含めた。最後に、各サンプルから得られた５３個の相対度数分布に基づいて、２５行５３列の２次元のヒートマップを生成した。なお、本実施例では、特許図面の制約があるため、グレースケールでヒートマップを生成した。

図７〜１１は、サンプル１〜５について生成されたヒートマップを示す。

図７に示すように、サンプル１（未処理）のヒートマップからは、600nm〜1.1μmの変形区間で1.2〜1.6kPaのヤング率を示す細胞が多数存在することが見て取れる。従来法によるサンプル１のヤング率（1.35 kPa）は、この変形区間のヤング率が反映されたものと考えられる。

一方、図８に示すように、サンプル２（EGCG処理）のヒートマップからは、600nm〜800nmの変形区間で2.8〜3.2kPaのヤング率を示す細胞が多数存在することが見て取れ、その分布の様相がサンプル１（未処理）のそれと全く異なっていることが見て取れる。

一方、図９および図１０に示すように、サンプル３（Cur処理）およびサンプル４（MβCD処理）のヒートマップからは、その分布の様相が他の３種類のサンプル（未処理・EGCG添加・siAXL処理）のサンプルのそれと異なっていることはもちろんのこと、他の３種類のサンプルと比べて、閾値（0.5pN）に至るまで探針を押し込んだときの細胞の変形量が小さいことが見て取れる。

図１１に示すように、サンプル５（siAXL処理）のヒートマップからは、300nm〜700nmの変形区間で、4.4kPa前後のヤング率を示す細胞が多く存在していることが見て取れる。ここで、サンプル５（siAXL処理）とサンプル２（EGCG処理）の従来法によるヤング率は同値（2.91kPa）であるにもかかわらず、図１１と図７を比較するとわかるように、サンプル５（siAXL処理）の分布のばらつきは、サンプル２（EGCG処理）のそれに比べて大きく、両者のヒートマップの様相は明らかに異なっている。このことは、これまで識別できなかった細胞の硬さの状態を識別できるようになることを示唆する。

１０…コンピュータ、２０…原子力間力顕微鏡、２２…半導体レーザー、２３…カンチレバー、２４…探針、２５…フォトディテクタ、２６…プリアンプ、３０…位置調整手段、３２…ＸＹＺ軸ステージ、３４…ピエゾスキャナ、３５…コントローラ、４０…ディッシュ、１００…細胞解析システム

Claims (4)

1. 細胞の弾性特性を解析する方法であって、
   解析対象となる個々の細胞の表面に原子間力顕微鏡の探針を押し当てた際に得られる、細胞の変形量と探針にかかる力を対応付けたデータを、細胞の変形量をＸ軸とし、探針にかかる力をＹ軸とする直交座標上にプロットして複数のフォースカーブを取得するステップと、
   取得した各フォースカーブについて、フォースカーブをＸ軸方向に分割する複数の変形区間を定義し、各変形区間に対応するフォースカーブの一部をなす曲線に対してフィッティングを行ってヤング率を算出し、算出したヤング率と該変形区間を対応付けるステップと、
   各変形区間に対応付けられた複数のヤング率に基づいて相対度数分布を作成するステップと、
   作成された複数の相対度数分布に基づいて、変形区間をＸ軸に取り、ヤング率の階級をＹ軸に取り、相対度数を所定の色スケール上の色で表現した２次元ヒートマップを生成するステップと、
   を含む方法。
2. 細胞の弾性特性を解析する解析システムであって、
   解析対象となる個々の細胞の表面に原子間力顕微鏡の探針を押し当てた際に得られる、細胞の変形量と探針にかかる力を対応付けたデータを、細胞の変形量をＸ軸とし、探針にかかる力をＹ軸とする直交座標上にプロットして複数のフォースカーブを取得する手段と、
   取得した各フォースカーブについて、フォースカーブをＸ軸方向に分割する複数の変形区間を定義し、各変形区間に対応するフォースカーブの一部をなす曲線に対してフィッティングを行ってヤング率を算出し、算出したヤング率と該変形区間を対応付ける手段と、
   各変形区間に対応付けられた複数のヤング率に基づいて相対度数分布を作成する手段と、
   作成された複数の相対度数分布に基づいて、変形区間をＸ軸に取り、ヤング率の階級をＹ軸に取り、相対度数を所定の色スケール上の色で表現した２次元ヒートマップを生成する手段と、
   を含む解析システム。
3. 細胞の弾性特性を可視化する方法であって、
   解析対象となる個々の細胞の表面に原子間力顕微鏡の探針を押し当てた際に得られる、細胞の変形量と探針にかかる力を対応付けたデータを、細胞の変形量をＸ軸とし、探針にかかる力をＹ軸とする直交座標上にプロットして得られた複数のフォースカーブの各々について、フォースカーブをＸ軸方向に分割する複数の変形区間を定義し、各変形区間に対応するフォースカーブの一部をなす曲線に対してフィッティングを行ってヤング率を算出し、算出したヤング率と該変形区間を対応付けるステップと、
   各変形区間に対応付けられた複数のヤング率に基づいて相対度数分布を作成するステップと、
   作成された複数の相対度数分布に基づいて、変形区間をＸ軸に取り、ヤング率の階級をＹ軸に取り、相対度数を所定の色スケール上の色で表現した２次元ヒートマップを生成するステップと、
   を含む方法。
4. コンピュータに、
   解析対象となる個々の細胞の表面に原子間力顕微鏡の探針を押し当てた際に得られる、細胞の変形量と探針にかかる力を対応付けたデータを、細胞の変形量をＸ軸とし、探針にかかる力をＹ軸とする直交座標上にプロットして得られた複数のフォースカーブの各々について、フォースカーブをＸ軸方向に分割する複数の変形区間を定義し、各変形区間に対応するフォースカーブの一部をなす曲線に対してフィッティングを行ってヤング率を算出し、算出したヤング率と該変形区間を対応付けるステップ、
   各変形区間に対応付けられた複数のヤング率に基づいて相対度数分布を作成するステップ、
   作成された複数の相対度数分布に基づいて、変形区間をＸ軸に取り、ヤング率の階級をＹ軸に取り、相対度数を所定の色スケール上の色で表現した２次元ヒートマップを生成するステップ、
   を実行させるためのプログラム。