JP2019040185A - 断面厚を改善した高分解能２ｄ顕微鏡法 - Google Patents

Abstract

【課題】２Ｄエアリースキャン顕微鏡法での光学断面厚を改善する。【解決手段】試料Ｐは、ポイントにおいて回折限界照明スポット１４を形成するように照明放射線Ｂで照明され、ポイントは、空間分解表面検出器１７上の回折像１８に撮像され、表面検出器１７は、回折像１８の回折構造１８ａを分解する空間分解能を有し、ポイントは、照明スポット１４の直径の半分未満の増分で試料Ｐ上で走査され、試料Ｐの２Ｄ像が生成され、２Ｄ像は、撮像の分解能限界を超えて増大される分解能を有し、ｚ位置における複数の走査位置に割り当てられた表面検出器１７のデータは、暫定深さ分解３Ｄ像を提供する三次元逆重畳の実行に使用され、撮像により生成される断面厚さ未満の低断面厚が指定又は予め決定され、暫定深さ分解３Ｄ像において、ｚ位置の周囲の低断面厚に位置する部分のみが選択され、ｚ位置の周囲の低断面厚外にある部分は、２Ｄ像を生成するために破棄される。【選択図】図１

Description

本発明は、試料の高分解能２Ｄ走査顕微鏡の方法に関し、試料は、試料内又は試料上で集束して、ポイントにおいて回折限界照明スポット（diffraction-limited illumination spot）を形成するような照明放射線（illumination radiation）で照明され、ポイントは、空間分解表面検出器（spatially resolving surface detector）上の回折像に回折限界的に撮像され、表面検出器は、回折像の回折構造を分解する空間分解能を有し、撮像点広がり関数（imaging point spread function）も照明点広がり関数（illumination point spread function）も、非対称を生成するように操作されず、ポイントは、照明スポットの直径の半分未満の増分で試料に相対して異なる走査位置に変位され、撮像の焦点面のｚ位置を固定したまま、複数の走査位置が走査され、表面検出器は読み取られ、試料の２Ｄ像が、表面検出器のデータ及び上記データに割り当てられた走査位置から生成され、上記２Ｄ像は、撮像の分解能限界を超えて増大される分解能を有する。

本発明は、試料の高分解能２Ｄ走査顕微鏡法の顕微鏡に更に関し、顕微鏡は、照明放射線で試料を照明する照明ビーム路（illumination beam path）であって、照明放射線は、試料内又は試料上で集束して、ポイントにおいて回折限界照明スポットを形成し、照明ビーム路は、照明点広がり関数を操作する要素を有さない、照明ビーム路と、空間分解表面検出器上の回折像にポイントを回折限界撮像する撮像ビーム路（imaging beam path）であって、撮像ビーム路は、撮像点広がり関数を操作する要素を有さず、表面検出器は、回折像の回折構造を分解する空間分解能を有する、撮像ビーム路と、照明スポットの直径の半分未満の増分で試料に相対してポイントを異なる走査位置に変位させる走査デバイスであって、走査デバイスは、像の焦点面のｚ位置を固定したまま、複数の走査位置を走査する、走査デバイスと、表面検出器のデータ及び上記データに割り当てられた走査位置から試料の２Ｄ像を生成する評価デバイスであって、上記２Ｄ像は、撮像ビーム路の分解能限界を超えて増大される分解能を有する、評価デバイスとを備える。

光顕微鏡法の従来の応用分野は、レーザ走査顕微鏡法（略してＬＳＭ）であり、ＬＳＭは、共焦点検出構成を使用して、対物レンズの焦点面に位置する試料の平面のみを撮像する。これは、厚さが共焦点ストップのサイズに依存する光学断面を得る。試料の異なる深さでの複数の光学断面を記録することにより、異なる光学断面で構成される試料の三次元像を生成することができる。したがって、レーザ走査顕微鏡法は、厚い標本の調査に適する。

原理上、ＬＳＭを含む光学顕微鏡の光学分解能は、物理法則により回折限界（diffraction-limited）される。本明細書での「高分解能」という用語は、回折限界を超えた分解能に使用される。回折限界の克服は、例えば、欧州特許出願公開第２３１７３６２号明細書に記載されるエアリースキャン（Airyscan：登録商標）顕微鏡法として知られているものにより達成される。この文献は、文献の図５に示され説明される実施形態において、試料の回折限界照明を表面検出器と組み合わせ、走査デバイスは、照明スポットで照明されるポイントの回折像が表面検出器上にあるように構成される。この構成は「デスキャン（de-scanned）」検出器構成と呼ばれる。これは通常、照明デバイスと照明デバイスとの結合点と試料との間のビーム路を偏向させるスキャナを構成することにより達成される。そのようなスキャナは、照明スポット及び照明スポットで照明されるポイントの撮像の両方に作用し、その結果、スキャナ後の撮像方向におけるビーム路は静的である。そのようなスキャナへの代替は、試料を変位させる可動式試料ステージの使用である。その場合、回折像はまた表面検出器上にある。欧州特許出願公開第２３１７３６２号明細書の概念では、表面検出器には、撮像スケールを参照して、回折像のオーバーサンプリングを生じさせ、したがって、回折像の構造を分解できるようにする空間分解能が提供される。

従来の共焦点顕微鏡法では、深さ分解能は共焦点ピンホールストップ（confocal pinhole stop）のサイズと密接にリンクする。このストップは、焦点外光をフィルタリングし、光学断面を生成する。したがって、限りなく薄い光学断面への経路上で、ストップは光を大きく遮蔽するため、光損失は増大する。非常に小さな共焦点ストップの使用は実際に、非常に薄い光学断面を生成するが、信号対雑音比は非常に不良になる。

この問題は、従来の方法（米国特許出願公開第３０１３４６７号明細書参照）で使用されるピンホールストップを２Ｄセンサで置換し、又はストップ平面をそのような検出器上に撮像するエアリースキャン顕微鏡法でも等しく生じる。米国特許第８７０５１７２号明細書、独国特許出願公開第１０２０１００４９６２７号明細書、米国特許出願第２０１１／０２６７６８８号明細書、及びＣ． Ｍｕｅｌｌｅｒらによる公開物，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，１０４，１９８１０１，２０１０、Ａ．Ｙｏｒｋら，“Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｉｎ ｌｉｖｅ， ｍｕｌｔｉ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｖｉａ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌ．９，２０１２、Ｄｅ Ｌｕｃａら，“Ｒｅ−ｓｃａｎ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｗｉｃｅ ｆｏｒ ｂｅｔｔｅｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ”， Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ，４（１１），ｐｐ．２６４４−２６５６、Ｓ．Ｒｏｔｈ，“Ｏｐｔｉｃａｌ ｐｈｏｔｏｎ ｒｅａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （ＯＰＲＡ）”，ａｒＸｉｖ： １３０６．６２３０、Ａ． Ｙｏｒｋら，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９，７４９，２０１２，Ｉ．Ｇｒｅｇｏｒら，Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ １００７１，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｘ” １００７１０Ｃ，２４ Ａｐｒｉｌ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１１１７／１２．２２５５８９１、Ａ．Ｊｅｓａｃｈｅｒら，“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｃａｎｓ：ａ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｗｉｔｈ ｐｏｓｔａｃｑｕｉｓｔｉｏｎ ｒｅｆｏｒｃｕｓｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ”，Ｏｐｔｉｃａ ２，ｐｐ．２１０−２１３，２０１５もこの手法に対処している。後者の公開物はｚ符号化深さ情報に位相マスクを使用する。

エアリースキャン顕微鏡法では、いわゆる像スタック（image stacks）が記録され、すなわち、複数の２Ｄ像が異なる焦点面において捕捉される３Ｄ像記録が既知である。次に、これらの像スタックを３Ｄ逆重畳において使用して、深さ分解像を生成することができる。像スタックは、点広がり関数の標的改変に起因して、普通なら存在する不明確さ、すなわち、デフォーカスポイントが焦点面の上にあるか、それとも下にあるかが事前に分からないことが除去される場合、省くことができる。ｚ改変点広がり関数を用いて、この不明確さはなくなり、３Ｄ再構築において、１つの２Ｄ像から三次元像を再構築することが可能である。

一般に、三次元像改善策がある程度、共焦点ストップサイズと光学断面厚とが結びつくという導入部に記載される問題に対処する。したがって、三次元像がまず生成され、次に、所望の切断面が三次元像から選択される。この欠点は、三次元像スタックが上手く機能しなければならないこと又は操作される点広がり関数を使用しなければならないことである。したがって、本発明は、これらの２つの要件のいずれもなく、２Ｄエアリースキャン顕微鏡法での光学断面厚を改善するという目的に基づく。

本発明は請求項１〜５に定義される。

本発明は、エアリースキャン原理に従って試料の高分解能走査顕微鏡法の方法を提供する。試料は照明放射線で照明される。このステップにおいて、照明放射線は、試料内又は試料上のポイントにおいて回折限界照明スポットを形成するように集束される。このポイントは、表面検出器上の回折像に回折限界的に撮像される。表面検出器はピクセルを有し、したがって、回折像の回折構造を分解する空間分解能を有する。このポイントは、試料に相対して異なる走査位置に変位される。連続した走査位置間の増分は、照明スポットの直径未満であり、試料の各点は、異なる位置にある照明スポット及び回折像に数回、含まれる。表面検出器は読み取られる。試料の像が、取得されたデータ及び上記データに割り当てられた走査位置から生成される。像は、撮像の分解能限界を超えて増大したエアリースキャン原理に従った分解能を有する。したがって、回折限界が克服される。純粋な２Ｄ走査が実行される。

深さ分解能を改善するために、回折像のサイズ（共焦点ストップの直径に対応する）と光学断面厚との従来の相互依存性が再び生じるため、２Ｄ像は、表面検出器のデータから直接生成されない。その代わり、複数の走査位置に関する表面検出器のデータからの三次元再構築がまず実行される。純粋な２Ｄ走査に起因して、データは焦点面の固定されたｚ位置から生じる。三次元再構築は既知であるが、従来は、上述した不明確さを回避するために、撮像及び／又は照明ビーム路における操作要素により特定の程度標的されて非対称になる点広がり関数においてのみ使用されてきた。そのような要素は使用されない。このため、１つの焦点面位置が操作なしで使用されたことにより、３Ｄ再構築は暫定の深さ分解３Ｄ像のみを提供する。不明確さの問題は、照明点広がり関数及び撮像点広がり関数の両方が標的されて操作されず、したがって、光軸に対して実質的に対称である（不完全な構成要素に起因して、不可避の残留非対称性がなお生じ得る。すなわち問題なのは、非標的ＰＳＦ操作が行われることである）ため、存在する。この不明確さは、意図的に受け入れられる。続けて、低断面厚が指定され、又は低断面厚は予め決定されている。低断面厚は、光学撮像から生じる断面厚よりも低い。暫定深さ分解３Ｄ像から、焦点面の固定されたｚ位置周囲の低断面厚内に位置する部分のみが選択される。低断面厚外に位置する部分は破棄される。これらは、上述した不明確さの問題を受ける部分である。

点広がり関数は変更されないため、実質的に対称である。この対称性は一般に、焦点面に対する対称性である。一般に、点広がり関数は、光軸に対しても対称であり、特に、回転対称である。大半の顕微鏡では、点広がり関数は砂時計形に対応し、くびれた部分は焦点面にある。撮像要素の実際の実施に起因して生じるいかなる残留非対称性も、１つの像からの三次元再構築が特異性を有する深さ分解像を生成するように標的される変更に繋がらない。既知の再構築アルゴリズムが、点広がり関数を変更せずに、焦点面の一定位置で得られた像データからの３Ｄ再構築に使用される。これらのアルゴリズムは、点広がり関数を標的操作する顕微鏡の深さ分解３Ｄ像の生成に向けて開発された。それにより、深さ分解される３Ｄ像が生成されるが、不明確さに起因して、この像は完全な３Ｄ像ではなく、アーチファクトがない３Ｄ像ではない。このため、本明細書では、同じ再構築アルゴリズムが、点広がり関数が標的され、かつ広範囲で操作される場合に提供するアーチファクトのない深さ分解３Ｄ像とこの像とを区別するために、この像は暫定深さ分解３Ｄ像と呼ばれる。

撮像及び照明のビーム路は、例えば、Ｊｅｓａｃｈｅｒらによる公開物において説明されるような既知の深さ分解手法で必要であり使用される点広がり関数を操作し、標的される確定可能な程度の非対称性をもたらす要素を有さない。特に、ビーム路は、点広がり関数を非対称に改変し、標的されて深さに依存する非点収差レンズ又は位相マスクを含まない。

実施形態では、三次元再構築は、複数の離散した切断面において３Ｄ像を生成する。このため、複数の離散した切断面を含むような暫定深さ分解３Ｄ像を生成する改良が好ましい。次に、焦点面の固定されたｚ位置に対応する切断面が、選択部分として選ばれる。

照明放射線は、蛍光放射線（fluorescence radiation）の放射を励起することができ、これは、信号対雑音比を改善し、全体的にアルゴリズムを補強する。特に、低断面厚を非常に薄くすることができる。

本方法と同様に提供される顕微鏡は、方法ステップを実行し、方法ステップに適するように実施される評価デバイスを有する。本方法と同様に、対応する顕微鏡が提供され、本顕微鏡は、上記特徴で試料を照明する照明ビーム路と、ピクセルを有する表面検出器上の回折像にポイントの回折限界撮像を行う撮像ビーム路とを備える。既に述べたように、照明ビーム路及び撮像ビーム路は、点広がり関数を非対称にする操作要素を含まず、特に、非点収差レンズ又は位相マスクは提供されない。本明細書では、操作という用語は、特に３Ｄ再構築において、焦点面の下にある層と焦点面の上にある層との間での不明確さを回避する非対称性を生み出す点広がり関数の標的影響に関連する。したがって、操作とは、焦点面の下の層が、焦点面の上にある層から明確に異なる点広がり関数を有することを意味する。そのような操作は通常、ビーム路での位相マスク及び／又は非点収差要素の使用を必要とする。

以下の文章において、顕微鏡についての方法の態様を説明する場合、上記態様は、対応する方法ステップを実行するように構成される評価デバイスにも等しく関連する。評価デバイスは、対応するソフトウェア又は対応するプログラムコードを用いて実施されるコンピュータであり得る。逆に、顕微鏡及びその動作に基づいて説明される態様は、顕微鏡の方法に等しく関連する。

上記特徴及び以下にこれから説明する特徴が、本発明の範囲から逸脱せずに、指定された組み合わせのみならず、他の組み合わせ又はそれら自体でも使用可能なことは言うまでもない。

本発明について、本発明にとって重要な特徴を同様に開示する添付図面を参照して例示的な実施形態に基づいて以下により詳細に説明する。これらの例示的な実施形態は単に例示として機能し、限定として解釈されるべきではない。例として、複数の要素又は構成要素を有する例示的な実施形態の説明は、これら全ての要素又は構成要素が実施目的で必要とされる旨で解釈されるべきではない。むしろ、他の例示的な実施形態は、代替の要素及び構成要素、より少数の要素若しくは構成要素、又は追加の要素若しくは構成要素を含むこともできる。異なる例示的な実施形態の要素又は構成要素は、別段のことが示される場合を除き、互いと組み合わせることができる。例示的な実施形態の１つで説明された変更及び発展は、他の例示的な実施形態にも適用し得る。繰り返しを避けるために、様々な図での同じ要素又は対応する要素は、同じ参照符号で示され、何度も説明されない。

図１は、高分解能顕微鏡法の顕微鏡の概略図を示す。 図２ａは、図１の顕微鏡の検出器のピクセルの配置の概略図を示す。 図２ａは、図１の顕微鏡の検出器のピクセルの配置の概略図を示す。 図３は、顕微鏡法に関する信号伝搬チャートを示す。 図４は、高分解能共焦点顕微鏡のデータ処理の例示的な実施形態を示す。

図１は、例えば、欧州特許出願公開第２３１７３６２号明細書から既知のようないわゆるエアリースキャンの原理により、高分解能、すなわち、回折限界を超えて増大された分解能を提供する共焦点顕微鏡２０を概略的に示す。共焦点顕微鏡２０は、照明スポット１４で試料Ｐを照明する光源６を有する。照明光Ｂは、ビーム整形手段７、ミラー８を介してビームスプリッタ９に導波される。ビームスプリッタ９は、照明光Ｂをできるだけ多く反射し、スキャナ１０に導波するように実施される。照明光Ｂは、更なるビーム整形光学ユニット１１及び１２によりスキャナ１０から対物レンズ１３に導波される。対物レンズ１３は、照明光Ｂを試料Ｐの照明スポット１４に集束させる。

照明スポット１４において試料により生成される試料光Ｄは、対物レンズ１３により集光され、照明光Ｂとは逆の経路でビームスプリッタ９に導波される。ビームスプリッタ９は、試料光Ｄのできるだけ多くの部分を伝達するように実施される。ビームスプリッタ９により伝達される試料光Ｄは、更なるフィルタ１５及び更なるビーム整形光学ユニット１６を介して検出器１７に渡される。検出器１７は試料光Ｄを検出し、そこから電気信号を生成し、伝導体２３、２４、２５を介して制御・評価デバイスＣ、例えば、コンピュータに電気信号を渡す。このようにして、回折構造１８ａが示すように、回折限界である回折像１８が記録される。

試料Ｐの像を得るために、照明スポット１４は、スキャナ１０により試料Ｐにわたり段階的に移動する。そうして得られる段階的試料信号から、制御・評価デバイスＣは、例えば、モニタを使用して提示することができる３Ｄ像を合成する。

ここで、スキャナ１０は、横方向に、すなわち、対物レンズの光軸に直交する平面に広がる二次元像を記録できるようにする。

既に述べたように、照明ビーム路及び撮像ビーム路は、標的されて点広がり関数非対称性を作る操作要素を含まず、特に、非点収差レンズ又は位相マスクは提供されない。本明細書では、操作という用語は、特に３Ｄ再構築において、焦点面の下にある層と焦点面の上にある層との間での不明確さを回避する非対称性を生み出す点広がり関数の標的影響に関連する。したがって、標的操作とは、焦点面の下の層が、焦点面の上にある層から明確に異なる点広がり関数を有することを意味する。そのような操作は通常、ビーム路での位相マスク及び／又は非点収差要素の使用を必要とする。

図２ａ及び図２ｂは、共焦点顕微鏡の検出器を概略的に示す。図２ａは、１つの感度表面３０を有する従来の検出器を示す。高分解能を達成するために、共焦点顕微鏡２０の検出器１７は、図２ｂのように複数の検出要素又はピクセル３１を有する。要素は付番され、例での構成は３２個のピクセルを有する。

ピクセル３１のサイズは、検出器１７で生成される回折像１８よりもはるかに小さいように設計される。同時に、ピクセル３１の数、ひいては検出器１７の全表面は、回折像１８の試料光Ｄの大部分を検出することができるように設計される。

比較のため、図２ａは、典型的な分解能の共焦点顕微鏡で使用されるように、１つのみの要素３０を有する検出器を示す。典型的な分解能という用語は、本明細書では、達成される分解能が少なくともアッベ限界（Abbe limit）に対応することを意味するものと理解されるべきである。これとは対照的に、分解能が増大された共焦点顕微鏡２０では、照明及び検出は、理論上、２倍の分解能を達成することができるように一緒に機能する。実際には、回折限界に近い構造は非常に不良なコントラストでのみ伝達可能であるため、分解能の増大はいくらか低くなる。現実では、アッベ限界の最高で１．７倍の分解能を達成することができる。

各走査点

で、高分解能共焦点顕微鏡２０の検出器１７は、検出器要素３１の数に対応する多くの検出信号

を捕捉する。

は横方向試料位置を示し、ｚは軸方向試料位置を示し、インデックスｈは検出器要素（ピクセル）を示す。以下、説明は３２個のピクセルに基づくが、異なる数のピクセルを使用することも可能である。

検出器要素３１のそれぞれは、試料Ｐから生の像信号（raw image signal）を捕捉し、信号

を生成する。生の像信号は互いと異なり、差異は、各検出器要素により検出される試料領域に相対する照明光スポットの個々の横方向距離に起因する。生の像信号は、「実際」の試料像

と各検出要素ｈの点広がり関数（ＰＳＦ）

との重畳により数学的に記述される。

評価ユニットＣの機能は、試料の原本

に可能な限り正確に対応する像

の全て

から再構築することである。逆重畳（ＤＣＶ）及びそうして逆重畳された生の像信号の続く結合をこのために使用し、逆重畳及び結合のプロセスは、プロセス技術的に互いと統合することができる。

図３は、信号伝搬チャートにおける全てのステップを示す。開始点は

及び生の像信号

である。光学系の特性から、ＰＳＦは既知である。ＰＳＦは、システムパラメータから計算することができるか、又は一度計測して記憶することができる。信号は線１４０、１４１を介して評価ユニット５０に渡され、評価ユニット５０は対応して、生の全ての像信号を逆重畳し、一緒に結合し、試料の原本

に可能な限り正確に対応する試料の像

を出力する。

図３及び他の全ての信号伝搬チャートは、矢印１４０、１４１、１５１の厚さにより伝達されるデータ量を示す。３２個の生の像信号

及び３２個のＰＳＦ

がある。評価中に生成されるのは、試料の像

であり、この像のデータ量は、生の全ての像信号のデータ量の１／３２である。これは細い矢印１５１で象徴される。同様に、矢印に示されるのは、１つの像に対するデータ量の係数である。すなわち、生の像信号及びＰＳＦでは／／３２であり、試料の像では／／１である。

破線６０は、生の像信号のデータを送信しなければならない領域（region）間で共焦点顕微鏡２０全体のドメイン（domain）を分ける。ここでは、ドメインＬＳＭ（レーザ走査顕微鏡）は、共焦点顕微鏡のハードウェア依存ドメイン、すなわち、ドメインＰＣへのデータ送信を可能にする光学系、構造、及び電子機器を含む。領域ＰＣは、制御・評価デバイスＣ、ひいては共焦点顕微鏡２０の制御、データの更なる処理及び表現に必要な全てを記述する。このドメインのコアは通常、パーソナルコンピュータＣである。具体的な名称では、生の全ての像信号のデータはＬＳＭからＰＣに送信されなければならない。このために必要なのは、強力なインターフェースであり、換言すれば、データ送信の速度は特定のインターフェースにより制限され得る。

図４は、高分解能共焦点顕微鏡２０のデータ処理の実施形態を示す。ここで、評価ユニット５０ａは、例えば、ウィーナーフィルタリング（Wiener filtering）として知られるものを実行する。このフィルタリングでは、空間座標で表現される生の像信号

はまず、フーリエ変換を受け、それにより、生の像信号はここで、空間周波数座標

で利用可能になる。同じことがＰＳＦでも行われる。フーリエ領域に変換されたＰＳＦ

は、物体伝達関数ＯＴＦと呼ばれる。

５０ａにおける逆重畳式を理解するには、２つの様相が重要である。
（１）生の像信号は、既に上で示したように、ＰＳＦ系で重畳された試料に対応する。
（２）空間領域での重畳は、フーリエ領域での乗算に対応する。すなわち、生の像信号は、フーリエ領域において試料とＯＴＦとの積として表すことができる。

の式が逆重畳式に挿入される場合、その結果は、

であり、

は共役複素位相を有するＯＴＦを示し、（元の）ＯＴＦとの積は絶対二乗値を生成する。

ｗは正の実数であり、本明細書ではウィーナーパラメータとして示される。ウィーナーパラメータが

と比較して小さい場合、分数は略１になり、

は試料の原本

に略対応する。他方、小さすぎないｗは、

が小さい場合、位置

における分数が発散しないことを保証する。そのような発散は、必然的に存在し、生の像信号

において本明細書では示されないノイズを計測できないほど増大させ、生成される像

を使用不可能にする。

像を提示することができるように、空間周波数座標において利用可能な像

は、逆フーリエ変換により空間領域に再び変換しなければならない。

検出された信号

は、検出ＰＳＦ

で重畳された励起ＰＳＦ

と物体

との積としてモデリングすることができる。

式中、

は励起ＰＳＦの位置であり、

は検出ＰＳＦの位置（カメラピクセル又はファイバ要素）である。

２Ｄのケース（ｐ_ｚ＝０，ｚ＝０）から得られるのは三次元式：

である。

ｐ_ｘ及びｐ_ｙでの（２）のフーリエ変換は

を生成する。

（３）における

を

に代入すると、

が与えられる。

標記を簡易化するために、ｘ及びｙがピクセルｉの位置に対応すると仮定する。

（５）におけるｚにわたる積分を離散化すると、

が生成される。

式（６）は、物体空間におけるｚ次元を測定データにおけるｘ−ｙ次元に変換する。変換は全体的に、「共焦点」ＯＴＦ、

により定義される。物体空間におけるｚ次元は、例えば、フーリエ領域における線形回帰により再構築することができる。

操作されないことに起因して、特に対称点広がり関数では、この三次元再構築後でのみ、焦点面に一意の解が利用可能である。したがって、この平面を問題なく選ぶことができる。焦点外平面、すなわち、所定の断面厚外であり、特に焦点面の上及び下にある平面は破棄される。一意に割り当てることがいずれの場合でも可能であるわけではない。しかしながら、本顕微鏡法は２Ｄ像を生成することができるため、これは問題ではない。フーリエ領域における線形回帰分析後にこのために選ばれるのは、取得されたｚスタックの中心像である。これは以下の式に対応する。

本発明は、試料の高分解能２Ｄ走査顕微鏡の方法及び顕微鏡に関する。

試料は、試料内又は試料上で集束して、ポイントにおいて回折限界照明スポット（diffraction-limited illumination spot）を形成するような照明放射線（illumination radiation）で照明される。ポイントは、空間分解表面検出器（spatially resolving surface detector）上の回折像に回折限界的に撮像される。表面検出器は、回折像の回折構造を分解する空間分解能を有し、撮像点広がり関数（imaging point spread function）も照明点広がり関数（illumination point spread function）も、非対称を生成するように操作されない。ポイントは、照明スポットの直径の半分未満の走査ステップ増分で試料に相対して異なる走査位置に変位される。したがって、撮像の焦点面のｚ位置を固定したまま、複数の走査位置が走査される。表面検出器は読み取られ、試料の２Ｄ像が、表面検出器のデータ及び上記データに割り当てられた走査位置から生成される。この２Ｄ像は、撮像の分解能限界を超えて増大される分解能を有する。

顕微鏡は、照明放射線で試料を照明する照明ビーム路（illumination beam path）を備え、照明ビーム路は、照明点広がり関数を操作する要素を有さない。空間分解表面検出器上の回折像にポイントを回折限界撮像する撮像ビーム路は、撮像点広がり関数を操作する要素を有さない。表面検出器は、回折像の回折構造を分解する空間分解能を有する。照明スポットの直径の半分未満の増分で試料に相対してポイントを異なる走査位置に変位させる走査デバイスは、像の焦点面のｚ位置を固定したまま、複数の走査位置を走査する。評価デバイスは、表面検出器のデータ及び上記データに割り当てられた走査位置から試料の２Ｄ像を生成する。２Ｄ像は、撮像ビーム路の分解能限界を超えて増大される分解能を有する。

一般に、三次元像改善策がある程度、共焦点ストップサイズと光学断面厚とが結びつくという導入部に記載される問題に対処する。したがって、三次元像がまず生成され、次に、所望の切断面が三次元像から選択される。この欠点は、三次元像スタックが上手く機能しなければならないこと又は操作される点広がり関数を使用しなければならないことである。したがって、本発明の目的は、これらの２つの要件のいずれもなく、２Ｄエアリースキャン顕微鏡法での光学断面厚を改善することである。

実施形態では、三次元再構築は、複数の離散した切断面において３Ｄ像を生成する。このため、複数の離散した切断面を含むような暫定深さ分解３Ｄ像を生成する改良が好ましい。次に、焦点面の固定されたｚ位置に対応する切断面が、選択部分として選ばれる。

実施形態では、照明放射線は、蛍光放射線（fluorescence radiation）の放射を励起する。これは、信号対雑音比を改善し、全体的にアルゴリズムを補強する。そして特に、低断面厚を非常に薄くすることができる。

Claims (8)

1. −試料（Ｐ）は、照明放射線（Ｂ）が前記試料（Ｐ）内又は前記試料（Ｐ）上で集束して、ポイントにおいて回折限界照明スポット（１４）を形成するように照明放射線で照明され、
   −前記ポイントは、空間分解表面検出器（１７）上の回折像（１８）に回折限界的に撮像され、前記表面検出器（１７）は、前記回折像（１８）の回折構造（１８ａ）を分解する空間分解能を有し、
   −撮像点広がり関数も照明点広がり関数も、非対称を生成するように操作されず、
   −前記ポイントは、前記照明スポット（１４）の直径の半分未満の増分で前記試料（Ｐ）に相対して異なる走査位置に変位され、前記撮像の焦点面のｚ位置を固定したまま、複数の走査位置が走査され、
   −前記表面検出器（１７）は読み取られ、前記試料（Ｐ）の２Ｄ像が、前記表面検出器（１７）のデータ及び前記データに割り当てられた前記走査位置から生成され、前記２Ｄ像は、撮像の分解能限界を超えて増大される分解能を有する、前記試料（Ｐ）の高分解能２Ｄ走査顕微鏡方法において、
   −前記焦点面の前記固定されたｚ位置における前記複数の走査位置に割り当てられた前記表面検出器（１７）の前記データは、暫定深さ分解３Ｄ像を提供する三次元逆重畳の実行に使用され、
   −前記撮像により生成される断面厚さ未満の低断面厚が指定又は予め決定され、
   −前記暫定深さ分解３Ｄ像において、前記焦点面の前記固定されたｚ位置の周囲の前記低断面厚に位置する部分のみが選択され、前記焦点面の前記固定されたｚ位置の周囲の前記低断面厚外にある部分は、前記２Ｄ像を生成するために破棄される
   ことを特徴とする方法。
2. 前記暫定深さ分解３Ｄ像の前記三次元逆重畳は、複数の離散した切断面を含むように生成され、選択された部分として、前記焦点面の前記固定されたｚ位置に割り当てられ、又は最も近い前記切断面が使用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記撮像点広がり関数及び前記照明点広がり関数は、光軸に対して対称である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記試料（Ｐ）は前記照明放射線（Ｂ）により励起して、蛍光放射線を放射する、請求項１、２、又は３に記載の方法。
5. −照明放射線（Ｂ）で試料（Ｐ）を照明する照明ビーム路であって、前記照明放射線は、前記試料（Ｐ）内又は前記試料（Ｐ）上で集束して、ポイントにおいて回折限界照明スポット（１４）を形成し、前記照明ビーム路は、照明点広がり関数を操作する要素を有さない、照明ビーム路と、
   −空間分解表面検出器（１７）上の回折像（１８）に前記ポイントを回折限界撮像する撮像ビーム路であって、前記撮像ビーム路は、撮像点広がり関数を操作する要素を有さず、前記表面検出器（１７）は、前記回折像（１８）の回折構造（１８ａ）を分解する空間分解能を有する、撮像ビーム路と、
   −前記照明スポット（１４）の直径の半分未満の増分で前記試料（Ｐ）に相対して前記ポイントを異なる走査位置に変位させる走査デバイス（１０）であって、前記走査デバイスは、前記像の焦点面のｚ位置を固定したまま、複数の走査位置を走査する、走査デバイス（１０）と、
   −前記表面検出器（１７）のデータ及び前記データに割り当てられた前記走査位置から前記試料（Ｐ）の２Ｄ像を生成する評価デバイス（Ｃ）であって、前記２Ｄ像は、前記撮像ビーム路の分解能限界を超えて増大される分解能を有する、評価デバイス（Ｃ）と
   を備える、前記試料（Ｐ）の高分解能２Ｄ走査顕微鏡法の顕微鏡において、
   −前記評価デバイス（Ｃ）は、前記表面検出器（１７）の前記データ及び前記焦点面の前記固定されたｚ位置における前記複数の割り当てられた走査位置の三次元逆重畳を実行し、暫定深さ分解３Ｄ像を生成し、
   −前記評価デバイス（Ｃ）は低断面厚を指定し、又は低断面厚は、前記評価デバイスに対して予め決定され、前記低断面厚は、前記撮像により生成される断面厚未満であり、
   −前記評価デバイス（Ｃ）は、前記暫定深さ分解３Ｄ像において、前記焦点面の前記固定されたｚ位置の周囲の前記低断面厚に位置する部分のみを選択し、前記２Ｄ像を生成するために、前記焦点面の前記固定されたｚ位置の周囲の前記低断面厚外にある部分を破棄する
   ことを特徴とする顕微鏡。
6. 前記評価デバイス（Ｃ）は、複数の離散した切断面を含むように前記三次元逆重畳において前記暫定深さ分解３Ｄ像を生成し、選択された部分として、前記焦点面の前記固定されたｚ位置に割り当てられ、又は最も近い前記切断面を使用する、請求項５に記載の顕微鏡。
7. 前記撮像点広がり関数及び前記照明点広がり関数は、光軸に対して対称である、請求項５又は６に記載の顕微鏡。
8. 前記照明放射ビームは、前記試料（Ｐ）を励起させて、蛍光放射線を放射させる、請求項５、６又は７に記載の顕微鏡。

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