JP2019033745A - 網膜血管疾患の非ヒトモデル動物とその作製方法、及び、網膜血管疾患の治療又は予防用薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔2〕前記恒常活性化型Aktが、恒常活性化型Akt-Merである上記〔1〕の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物。
〔3〕前記恒常活性化型Aktは、前記発現がCre-LoxP系の制御下にある恒常活性化型Aktである上記〔1〕の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物。
〔4〕前記網膜血管疾患が、糖尿病網膜症である上記〔1〕〜〔3〕の何れかの網膜血管疾患の非ヒトモデル動物。
〔5〕前記網膜血管疾患が、網膜浮腫、網膜出血、網膜毛細血管瘤、及び、網膜血管の拡張から選択される少なくとも1の症状を呈する上記〔1〕〜〔4〕の何れかの網膜血管疾患の非ヒトモデル動物。
Akt活性を人為的操作により制御が可能なように恒常活性化型AktをコードするDNAを含むコンストラクトが導入されたトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程、
前記恒常活性化型AktのAkt活性を制御することにより、網膜血管疾患を誘導する工程、
を含む、網膜血管疾患非ヒトモデル動物の作製方法。
〔7〕前記恒常活性化型Aktが恒常活性化型Akt-Merであり、前記恒常活性化型AktのAkt活性の制御を前記トランスジェニック非ヒト動物への4-ヒドロキシタモキシフェンの投与により行う上記〔6〕の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法。
〔8〕前記4-ヒドロキシタモキシフェンを、生後1日〜14日までの任意の期間に5〜50 μg/g 体重/日投与する上記〔7〕の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法。
〔9〕前記恒常活性化型Aktが、発現がCre-LoxP系の制御下にある恒常活性化型Aktであり、
前記トランスジェニック非ヒト動物の作製を、LoxP配列の介在により前記恒常活性化型Aktの発現が阻止された状態で前記恒常活性化型AktをコードするDNAが配置されたコンストラクトを導入することにより行い、
前記恒常活性化型AktのAkt活性の制御を、前記トランスジェニック非ヒト動物と、血管特異的又は時期特異的にCreリコンビナーゼを発現するトラスジェニック非ヒト動物とを交配させ、前記コンストラクトを含む細胞内で血管特異的又は時期特異的にCreリコンビナーゼを発現又は活性誘導できる子孫を得ることにより行う、上記〔6〕の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法。
上記〔1〕〜〔5〕の何れかの網膜血管疾患の非ヒトモデル動物に被験物質を投与する工程、
前記被験物質の治療効果又は予防効果を判定する工程を有する、網膜血管疾患の治療又は予防用薬剤のスクリーニング方法。
(網膜血管疾患の非ヒトモデル動物)
本実施形態に係る非ヒトモデル動物は、網膜血管疾患の病態を呈する網膜血管疾患の非ヒトモデル動物に関する。本実施形態に係る網膜血管疾患の非ヒトモデル動物は、恒常活性化型Aktを発現する。
・ハイブリダイゼーション条件
ハイブリダイゼーション液(100mM Tris-HCl pH8.0、1 M NaCl、10mM EDTA、0.2 mMウシ血清アルブミン、0.2% Ficoll400、0.2%ポリビニルピロリドン、100μg/mlサケ精子DNA)中、65℃で、一晩(16時間以上)のハイブリダイゼーション。
・洗浄条件
洗浄液(0.2×SSC(6.67mM NaCl、6.67mMクエン酸トリナトリウム二水和物pH7.0、0.1% SDS))で65℃、30分間での2回の洗浄。
本実施形態に係る非ヒトモデル動物は、糖尿病腎症の症状を呈する糖尿病腎症の非ヒトモデル動物に関する。本実施形態に係る糖尿病腎症の非ヒトモデル動物は、恒常活性化型Aktを発現する。
(網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法)
本実施形態に係る非ヒトモデル動物の作製方法は、ヒト網膜血管疾患に類似する症状を呈する網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法に関する。本実施形態に係る網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法は、Akt活性を人為的操作により制御が可能なように恒常活性化型AktをコードするDNAを含むコンストラクトが導入されたトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程(トランスジェニック非ヒト動物の作製工程)と、前記恒常活性化型AktのAkt活性を制御することにより網膜血管疾患を誘導する工程(網膜血管疾患の誘導工程)を含む。以下、各工程について詳述する。
恒常活性化型Akt発現トランスジェニック動物は、Akt活性を人為的操作により制御が可能なように恒常活性化型AktをコードするDNAを含むコンストラクトが導入されている。
網膜血管疾患の誘導は、トランスジェニック非ヒト動物に導入された恒常活性化型Aktを人為的操作により活性化状態にすることにより行う。活性化状態への移行は、導入された恒常活性化型Aktの形態に応じて操作される。
本実施形態に係る非ヒトモデル動物の作製方法は、ヒト糖尿病腎症の症状を呈する糖尿病腎症の非ヒトモデル動物の作製方法に関する。本実施形態に係る非ヒトモデル動物の作製方法は、Akt活性を人為的操作により制御が可能なように恒常活性化型AktをコードするDNAを含むコンストラクトが導入されたトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程(トランスジェニック非ヒト動物の作製工程)と、前記恒常活性化型AktのAkt活性を制御することにより糖尿病腎症を誘導する工程(糖尿病腎症の誘導工程)を含む。
(網膜血管疾患の治療又は予防用薬剤のスクリーニング方法)
本実施形態の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物は、網膜血管疾患の治療又は予防用薬剤のスクリーニング方法に好適に使用でき、当該スクリーニング方法も本発明の実施形態に含まれる。
本実施形態の糖尿病腎症の非ヒトモデル動物は、糖尿病腎症の治療又は予防用薬剤のスクリーニング方法に好適に使用でき、当該スクリーニング方法も本発明の実施形態に含まれる。本実施形態に係る糖尿病腎症の治療又は予防用薬剤のスクリーニング方法は、本実施形態に係る網膜血管疾患の治療又は予防用薬剤のスクリーニング方法の項で説明したスクリーニング方法に準じて行うことができる。これにより、糖尿病腎症の治療又は予防用薬剤として有用な候補物質を探索することができる。
本実施例において、Akt活性を可逆的に制御できる恒常活性化型Akt-Merを発現するトランスジェニックマウス(以下、「恒常活性化型Akt-Mer TGマウス」と称する場合がある)の作製について検討した。
CAGプロモーターの支配下に、キメラ遺伝子恒常活性化型Akt-MerとIRES-EGFP(mRNA内部のリボソーム進入サイト−強化型緑色蛍光タンパク質:塩基配列を配列番号19に示す。)を連結した遺伝子発現プラスミド(以下、「恒常活性化型Akt-Mer発現ベクター」と称する)を構築した(特開2005-304487号を参照)。構築した恒常活性化型Akt-Mer発現ベクターをBDF1マウスの受精卵の前核にインジェクションした。図1に、恒常活性化型Akt-Mer TGマウスの構築を、図2に恒常活性化型Akt-Mer発現ベクターの構築を模式的に示す。
5’-cggaattcaccatggggagtagcaag-3’(配列番号20)、
5’-cggaattcggatccagcgtaatctggaacatcgtatgggtaggccgtgctgctggccgag-3’(配列番号21)
のプライマーを用いてPCRを行い、5’末端にEcoRIサイト、3’末端にBamHIサイトをもち、stopコドンを除いた恒常活性化型Akt cDNAを増幅した。
5’- cgggatccggagatccacgaaatgaaatg-3’ (配列番号22)、
5’- cgggatccgtcgactcagatcgtgttggggaagcc-3’ (配列番号23)
のプライマーを用いてPCRを行い、5’末端に活性化型Merにインフレームで連結できるBamHIサイト、3’末端にSalIサイトをもつMer cDNA(Mer)を増幅した。
恒常活性化型Akt-Mer は、4-ヒドロキシタモキシフェン(以下、「4-OHT」と略する)の存在によりAktの活性化状態の制御を行うことができる。そこで、本実施例では、実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜におけるAkt活性を確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり10μg/μlの 4-OHT 10μl(総量100μg/日×3日)を腹腔内に投与した。生後7日目に潅流固定をせずに摘出した網膜からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティング法を用いてAktリン酸化を確認した。コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行ってAktリン酸化を確認した。
結果を図3に示す。図3の各パネルにおいて、上方のバンドは導入された恒常活性化型Akt由来であり、下方のバンドは内在性Akt由来である。恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)の網膜ではコントロールに比較してThr-308とSer-473が強くリン酸化されていることが確認できた。これにより、恒常活性型Aktが発現していることが確認でき、Akt活性が持続的に活性化されていることが理解できる。一方、コントロール、及び、恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの何れにおいても内在性Aktが発現し、一部はリン酸化されていることをも確認できる。
本実施例では、実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスにおいて、Aktの持続活性化により網膜に与える影響を検討した。ここでは、網膜への影響は、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜を光学顕微鏡で観察することにより確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり10μg/μlの4-OHT 10μl(総量100μg/日×3日)を腹腔内に投与した。生後7日目に4% パラホルムアルデヒド(以下、「PFA」と略する)を用いて心臓から潅流固定を行った後、摘出した眼球から網膜カップを作成し、MZ16F(Leica社)を用いて網膜の光学顕微鏡画像を取得した。コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行って画像を取得した。
結果を図4に示す。図中、濃灰色の細かな点状変化は出血を示す。その結果、4-OHTを投与することにより、Aktを持続活性化した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)では点状の網膜出血が認められた。網膜出血は、ヒト糖尿病網膜症の重症度に関係なく生じる所見である。一方、コントロールでは網膜出血が認められなかったことから、網膜出血はAktの持続活性化に起因するものであることが理解できる。
本実施例では、実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスにおいて、Aktの持続活性化により網膜血管新生に与える影響を検討した。ここでは、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜をホールマウント免疫染色により確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり10μg/μlの4-OHT 10μl(総量100μg/日×3日)を腹腔内に投与した。生後7日目に4% PFAを用いて心臓から潅流固定を行った後、摘出した眼球から網膜カップを作成した。抗PECAM-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1:CD31)抗体を用いた蛍光免疫染色を行って、血管内皮細胞を染色した。続いて、フラットマウント網膜の画像を、AxioObserver(Zeiss社)により取得した。コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行って画像を取得した。
結果を図5に示す。コントロールに比べて、4-OHTを投与してAktを持続活性化した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)では密な血管網が形成されていることが認められた。
本実施例では、実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスにおいて、Aktの持続活性化により網膜毛細血管形状に与える影響を検討した。ここでも、先の実施例と同様に、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜をホールマウント免疫染色により確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり1μg/μlの4-OHT 10μl(総量10μg/日×3日)を腹腔内に投与した。かかる投与量は、先の実施例での投与量の10分の1である。生後7日目に4% PFAを用いて心臓から潅流固定を行った後、網膜カップを作成した。抗PECAM-1(CD31)抗体を用いた蛍光免疫染色を行い、フラットマウント網膜の画像をAxioObserver(Zeiss社)により取得した。コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行って画像を取得した。
結果を図8に示す。4-OHTを投与してAktを持続活性化した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)では、先の実施例における投与量の1/10量の低濃度の4-OHTの投与によっても毛細血管瘤の形成が誘導されていることが認められた。一方、コントロールにおいては、このような所見が認められなかった。また、先の実施例で認められた毛細血管瘤に比べて、小さく、また、数も少なかったことから、Aktの活性化の程度により、発現する網膜血管疾患の重症度を制御できることも判明した。
本実施例では、実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスにおいて、Aktの持続活性化により網膜の血管透過性に与える影響を検討した。ここでは、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜の色素漏出を実体顕微鏡で観察することにより確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり10μg/μlの4-OHT 10μl(総量100μg/日×3日)を腹腔内に投与した。生後7日目に、20μlのエバンスブルーを腹腔内に投与し、1時間後に4% PFAを用いて心臓から潅流固定を行い眼球を摘出した。摘出した眼球を、MZ16F 実体顕微鏡(Leica社)を用いて画像を取得した。コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行って画像を取得した。
結果を図11に示す。図中、実線(黒)の内部が硝子体側から見た網膜を示し、点線(白)の内部は、光学顕微鏡下で青色色素であるエバンスブルーが漏出していることが確認できる領域を示す。その結果、4-OHTを投与してAktを持続活性化した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)では、色素の血管外漏出が観察され、血管透過性が亢進していることが認められた。一方、コントロールでは血管透過性の亢進が認められなかったことから、血管透過性の亢進はAktの持続活性化に起因するものであることが理解できる。
本実施例では、実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスにおいて、Aktの持続活性化により網膜の網膜表層に与える影響を検討した。ここでは、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜切片画像を観察することにより確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり10μg/μlの4-OHT 10μl(総量100μg/日×3日)を腹腔内に投与した。生後7日目に、4% PFAを用いて心臓から潅流固定を行って眼球を摘出した後、網膜凍結切片を作成した。Hoechst染色により核を可視化して、顕微鏡(Zeiss社)を用いて画像を取得した。コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行って画像を取得した。
結果を図13に示す。4-OHTを投与してAktを持続活性化した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)では、網膜全体、特には、血管層が存在する表層に顕著な膨化が認められた。一方、コントロールではそのような所見が認められなかったことから、表層の膨化はAktの持続活性化に起因するものであることが理解できる。
本実施例では、先の実施例において確認されたAktの持続活性化による血管形態の異常の要因について検討した。ここでは、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜をホールマウント免疫染色により確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり10μg/μlの4-OHT 10μl(総量100μg/日×3日)を腹腔内に投与した。生後7日目に4% PFAを用いて心臓から潅流固定を行った後、網膜カップを作成した。抗PECAM-1(CD31)抗体、及び、抗GFAP抗体を用いた蛍光免疫染色を行い、フラットマウント網膜の画像をLSM710(Zeiss社)により取得した。
結果を図14に示す。図14の上段の画像は、抗PECAM-1(CD31)抗体及び抗GFAP抗体による二重染色、下段は抗PECAM-1(CD31)抗体による染色の結果を示す。その結果、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)の網膜血管網において、血管伸長の足場となるアストロサイト(GFAP)の形態に、コントロールとの相違は認められなかった。したがって、先の実施例で確認されたAktの持続活性化による血管構造の異常は、内皮細胞の異常に起因することが理解できる。
本実施例では、先の実施例において確認されたAktの持続活性化による血管形態の異常の要因について検討した。ここでは、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜のVEGF発現量を測定した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり10μg/μlの4-OHT 10μl(総量100μg/日×3日)を腹腔内に投与した。生後7日目に潅流固定をせずに摘出した網膜からRNAを抽出し、逆転写からDNAを合成し、定量PCRにてVEGF遺伝子の発現を解析した。このとき、ハウスキーピング遺伝子としてβ-アクチンの発現についても解析した。同様に、コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行って解析した。
Vegf用:
5’-tacacaattcagagcgatgtgtggt-3’(配列番号24)
5’-ctggttcctccaatgggatatcttc-3’(配列番号25)
β-アクチン用:
5’-ggctgtaattcccctccatcg-3’(配列番号26)
5’-ccagttggtaacaatgccatgt-3’(配列番号27)
結果を図15に示す。VEGF遺伝子の発現量について測定したグラフを示すが、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)において、VEGF遺伝子の発現にコントロールとの相違は認められず、血管形態の異常は過剰VEGFに誘導される二次的な変化ではないことが理解できる。
本実施例では、実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスにおいて、Aktの長期間の持続活性化により網膜毛細血管形状に与える影響を検討した。ここでは、先の実施例よりも長期間のAkt活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜をホールマウント免疫染色により確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり1μg/μlの4-OHT 10μl(総量10μg/日×3日)を腹腔内に投与し、生後14日目に抗PECAM-1(CD31)抗体を用いた蛍光免疫染色を行い、フラットマウント網膜の画像を取得した。LSM710(Zeiss社)で取得した画像をZ方向の深度により濃淡によって色分けした画像を取得した。コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行って画像を取得した。
結果を図16に示す。生後14日目では、Aktの持続活性化後の恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)において、網膜の血管径の拡張と血管密度の低下が認められた。
本実施例では、実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスにおいて、Aktの持続活性化の活性度及び活性期間により網膜毛細血管形態に与える影響を検討した。ここでは、Aktの持続活性化の活性度及び活性期間を4-OHTの投与量と投与期間の変更により制御し、恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜血管の形態変化を網膜のホールマウント免疫染色により確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり10μg/μlの4-OHT 10μl(総量100μg/日×3日)、生後4〜6日目まで1日当たり1μg/μlの4-OHT 10μl(総量10μg/日×3日)、生後4日目のみ10μg/μlの4-OHT 10μl(総量100μg/日×1日)、の何れかの投与量及び期間で腹腔内に投与し、生後7日目に4% PFAを用いて心臓から潅流固定を行った後、網膜カップを作成した。続いて、抗PECAM-1抗体を用いた蛍光免疫染色を行った。フラットマウント網膜の画像をAxioObserver(Zeiss社)により取得し、取得した画像を各群で比較した。コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行って画像を取得した。
結果を図17に示す。4-OHTの投与量・投与期間によって毛細血管瘤の程度が異なることが確認された。
本実施例では、実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスにおいて、Aktの持続活性化により形成された網膜の毛細血管形態異常に、Akt阻害剤が与える影響を検討した。ここでは、Akt阻害剤投与による恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスの網膜血管の形態変化を網膜のホールマウント免疫染色により確認した。
実施例1において作製した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウスに、生後4〜6日目まで1日当たり10μg/μlの4-OHT 10μl(総量100μg/日×3日)を腹腔内に投与した。さらに、網膜採取24時間前に細胞増殖阻害作用のあるマイトマイシンC、Akt阻害剤1(Triciribine)、Akt阻害剤2(GSK)のいずれかを腹腔内に投与した。薬剤投与群及び薬剤非投与群(Akt-Mer)について、4% PFAを用いて心臓から潅流固定を行った後、網膜を採取して網膜カップを作成した。採取した網膜に対して抗PECAM-1抗体を用いた蛍光免疫染色を行った。フラットマウント網膜の画像をAxioObserver(Zeiss社)により取得し、取得した画像を各群で比較した。コントロールとして、4-OHT非投与のマウスについても同様に処理を行って画像を取得した。
結果を図19に示す。Akt阻害剤投与によってAkt持続活性化を介して形成された毛細血管瘤は減少し、Akt持続活性化による血管拡張も解消した。したがって、Aktを持続活性化した恒常活性化型Akt-Mer Tgマウス(Akt-Mer)モデルは、薬剤投与による網膜血管疾患の治療効果の判定に利用できることが理解できる。
Claims (10)
- 恒常活性化型Aktを発現している網膜血管疾患の非ヒトモデル動物。
- 前記恒常活性化型Aktが、恒常活性化型Akt-Merである請求項1に記載の網膜血管疾患の
非ヒトモデル動物。 - 前記恒常活性化型Aktは、前記発現がCre-LoxP系の制御下にある恒常活性化型Aktである請求項1に記載の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物。
- 前記網膜血管疾患が、糖尿病網膜症である請求項1〜3の何れか一項に記載の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物。
- 前記網膜血管疾患が、網膜浮腫、網膜出血、網膜毛細血管瘤、及び、網膜血管の拡張から選択される少なくとも1の症状を呈する請求項1〜4の何れか一項に記載の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物。
- 網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法であって、
Aktの活性を人為的操作により制御が可能なように恒常活性化型AktをコードするDNAを含むコンストラクトが導入されたトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程、
前記恒常活性化型AktのAkt活性を制御することにより、網膜血管疾患を誘導する工程、
を含む、網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法。 - 前記恒常活性化型Aktが恒常活性化型Akt-Merであり、前記恒常活性化型AktのAkt活性の制御を前記トランスジェニック非ヒト動物への4-ヒドロキシタモキシフェンの投与により行う請求項6に記載の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法。
- 前記4-ヒドロキシタモキシフェンを、生後1日〜14日までの任意の期間に5〜50 μg/g 体重/日投与する請求項7に記載の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法。
- 前記恒常活性化型Aktが、発現がCre-LoxP系の制御下にある恒常活性化型Aktであり、
前記トランスジェニック非ヒト動物の作製を、LoxP配列の介在により前記恒常活性化型Aktの発現が阻止された状態で前記恒常活性化型AktをコードするDNAが配置されたコンストラクトを導入することにより行い、
前記恒常活性化型AktのAkt活性の制御を、前記トランスジェニック非ヒト動物と、血管特異的又は時期特異的にCreリコンビナーゼを発現するトラスジェニック非ヒト動物とを交配させ、前記コンストラクトを含む細胞内で血管特異的又は時期特異的にCreリコンビナーゼを発現又は活性誘導できる子孫を得ることにより行う、請求項6に記載の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物の作製方法。 - 網膜血管疾患の治療又は予防用薬剤のスクリーニング方法であって、
請求項1〜5の何れか一項に記載の網膜血管疾患の非ヒトモデル動物に被験物質を投与する工程、
前記被験物質の治療効果又は予防効果を判定する工程を有する、網膜血管疾患の治療又は予防用薬剤のスクリーニング方法。
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