JP2019020297A - 被検物質を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
被検物質を検出する方法であって、
前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第1接触工程、
前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第1解離工程、
前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第2接触工程、
前記第2接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第2解離工程、及び
前記第1解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する検出工程、
を含む方法。
被検物質を検出する方法であって、
前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第1接触工程、
前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第1解離工程、
前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第2接触工程、及び
前記第1接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する検出工程、
を含む方法。
被検物質を検出する装置であって、
反応液を収容する反応部と、前記反応液は、前記被検物質と前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを含み、前記反応部の底部は前記被検物質に対する結合性を有する捕捉体1が固定化された基板であり、
前記捕捉体2に対する外力を付与する外力付与部と、
基板上の標識由来シグナル配置パターンを撮像する撮像部と、
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整し、且つ
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する
処理部と、
を備える装置。
被検物質を検出する装置であって、
前記被検物質に対する結合性を有する捕捉体1が底部に固定化された基板を有し、前記被検物質と前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを含む反応液を収容する反応部と、
前記捕捉体2に対する外力を付与する外力付与部と、
基板上の標識由来シグナル配置パターンを撮像する撮像部と、
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整する制御部と、
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する処理部と、
を備える装置。
本発明は、その一態様として、被検物質を検出する方法であって、第1接触工程、第1解離工程、第2接触工程、及び第2解離工程、及び検出工程1を含む方法(本明細書において「本発明の検出方法1」と示すこともある。)に関する。以下に、これについて説明する。
第1接触工程は、被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する工程である。
第1解離工程は、前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる工程である。
第2接触工程は、前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する工程である。
第2解離工程は、前記第2接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる工程である。
本発明の検出方法1は、第1接触工程の前に、接触工程および解離工程を含んでいてもよい。また、第1解離工程と第2接触工程との間に1又は複数の接触工程および解離工程を含んでいてもよい。また、第2解離工程と検出工程との間に1又は複数の接触工程および解離工程を含んでいてもよい。
本発明の検出方法1における検出工程(本明細書において、「検出工程1」と示すこともある。)は、前記第1解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、特異シグナルとして検出する工程である。
例えば、図5に示される例であれば、第1解離工程後のウェルプレート及び第2解離工程後のウェルプレートにおける2列B行の陽性ウェルを、同位置のシグナルとして判定することができる。
本発明の検出方法1の実施形態の一例を図6を用いて、本発明の検出方法1の原理を説明する。図6は捕捉体2を有する担体粒子として磁性粒子を用いた場合である。
本発明は、その一態様として、被検物質を検出する方法であって、第1接触工程、第1解離工程、第2接触工程、及び検出工程2を含む方法(本明細書において「本発明の検出方法2」と示すこともある。)に関する。以下に、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、被検物質を検出する装置であって、反応部と、外力付与部と、撮像部と、処理部と、を備える装置(本明細書において、「本発明の検出装置」と示すこともある。)に関する。本発明の検出方法1及び2は、例えば、本発明の検出装置によって行うことができる。以下に、本発明の検出装置について添付の図面を参照しながら説明するが、本発明の検出装置は、かかる実施形態のみに限定されるものではない。なお、本発明の検出装置において、本発明の検出方法1及び2について既に説明されている用語については、説明を省略するが、本発明の検出方法1及び2における各用語についての説明は、本発明の検出装置にも援用される。
図8は、本発明の検出装置の一実施形態(検出装置1)の構成を示す概略図である。
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整し、且つ
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する。
次に図10を用いて、本発明の検出装置の動作を説明する。本発明の検出装置の動作は、コンピュータシステム3の処理部(CPU)30が制御する。
本発明は、その一態様において、反応部と、外力付与部と、撮像部と、制御部と、処理部と、を備える装置にも関する。
1-1.接触工程1
1-1-1.捕捉体1の調製
シリコンゴムシート(タイガースポリマー社製、SR-50、厚み5 mm)に直径5 mmの貫通孔を開け、得られたシートをMASコートガラス(松浪硝子工業株式会社製)に貼り付けて、ガラス基板上にウェルを作製した。BSA(Proliant biologicals社製、#68700)に定法に従ってビオチンを結合させ、ビオチン結合BSAを得た。30μg/mLビオチン結合BSA/PBS溶液 0.5μLをウェルに滴下して、室温で1時間静置した。HISCL洗浄液(シスメックス社製) 50μLをウェルに滴下後、ピペッティングによりウェルを洗浄した。この洗浄操作を計3回行った(以下、この3回の洗浄を、単に「洗浄操作」と示す。)。1%BSA/PBS溶液 50μLをウェルに滴下し、4℃で一晩静置した後、洗浄操作を行った。10μg/mLストレプトアビジン/1%BSA/PBST溶液 20μLをウェルに滴下し、室温で1時間静置した後、洗浄操作を行った。一方で、ビオチン標識したAnti ApoA1 Antibody P1A5(Sysmex社製)をStartingBloc(登録商標) (PBS) Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific社製)で10μg/mLに希釈して、被検物質に対する抗体溶液を作製した。該抗体溶液 10μLをウェルに添加し、室温で1時間静置した後、洗浄操作を行った。上記操作により、被検物質(ApoA1)に対する結合性を有し且つ基板(ウェル底面)に固定されている捕捉体1を得た。
ApoA1, human recombinant(Sigma Aldrich製)をStartingBloc(登録商標) (PBS) Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific製)で1μg/mLに希釈して、サンプル溶液を作製した。一方で、ApoA1を含まないBlocking Bufferのみの液を準備し、これをバックグラウンド溶液とした。実施例1-1-1で得られたウェルに、サンプル溶液 20μL又はバックグラウンド溶液 20μLを添加し、室温で1時間静置した。上記操作により、被検物質を基板上に配置した。
Anti ApoA1 Antibody P1A5(Sysmex製)と磁性ビーズ(多摩川精機製、COOH FG beads、TAS8848N1140、直径180 nm)を、N-ヒドロキシスクシイミド(キシダ化学株式会社、010-38472)及び1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(同仁化学研究所、W001)と混合し、抗体にビーズを結合した。この操作により、被検物質(ApoA1)に対する結合性を有し且つ標識(ビーズ)を含む捕捉体2を得た。
実施例1-1-2の操作後のウェルに、捕捉体2溶液 40μLを添加し、室温で1時間静置した。この操作により、捕捉体2を基板上に配置した。操作終了後に、顕微鏡(BZX710、KEYENCE製)のステージ上に、ウェルを含む基板を設置し、焦点をウェル底面付近に設定し、×40, NA=0.95のレンズを用いて明視野像(接触工程1の明視野像)を取得した。
実施例1-1-4の操作後のウェルを、カバーガラス(松浪硝子株式会社製)で封止した。磁石(株式会社二六製作所製、N40、表面磁束密度400mT)をウェル底面から5mmの高さまで近づけることにより、捕捉体2(中の磁性ビーズ)を上方に引っ張る外力を、30秒間付与した。この操作により、捕捉体2を含む物質を基板上から解離して液中に遊離させた。なお、この間、磁石は、水平方向に僅かに揺らし続けた。外力付与直後に、実施例1-1-4と同様にして明視野像(解離工程1の明視野像)を取得した。
実施例1-2の操作後、ウェルに磁力が完全に及ばない位置まで磁石を離し、その状態で5分間静置した。この操作により、再度、捕捉体2を基板上に配置した。静置後に、実施例1-1-4と同様にして明視野像(接触工程2の明視野像)を取得した。
実施例1-3の操作後、実施例1-3と同様にして、接触工程3及び解離工程3を行い、それぞれの明視野像(接触工程3の明視野像及び解離工程3の明視野像)を取得した。
実施例1-4の操作後、実施例1-3と同様にして、接触工程4及び解離工程4を行い、それぞれの明視野像(接触工程4の明視野像及び解離工程4の明視野像)を取得した。
上記実施例で取得された明視野像は、標識(磁性ビーズ)が拡大され輝点シグナルとして判別可能な像である。明視野像の一部を図11に示す。図11中、矢印は輝点を示し、グレー矢印はいずれの解離工程同士を比較しても位置が不変の輝点を示し、白色矢印は異なる解離工程間で位置が変化している輝点を示す。また、複数の視野における輝点の数を積算した結果を、図12に示す。
従来から通常に実施されている、B/F分離によるELISA法に準じて、被検物質(ApoA1)を検出した。具体的には次のようにして行った。実施例1-1と同様にして捕捉体2を基板上へ配置した。続いて、上清を除去して、PBS 20μLを添加した。その後、焦点をウェル底面付近とした明視野像を取得した。
2. 測定装置
3. コンピュータシステム
3a.コンピュータ本体
3b.入力デバイス
3c.表示部
30.処理部(CPU)
Claims (18)
- 被検物質を検出する方法であって、
前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第1接触工程、
前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第1解離工程、
前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第2接触工程、
前記第2接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第2解離工程、及び
前記第1解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する検出工程、
を含む方法。 - 被検物質を検出する方法であって、
前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第1接触工程、
前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第1解離工程、
前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第2接触工程、及び
前記第1接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する検出工程、
を含む方法。 - 前記解離工程において、基板上に配置された前記捕捉体2に対する外力の強さを調整することにより、前記捕捉体2を基板から解離させる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記外力が引力であり、且つ前記解離工程において、基板上に配置された前記捕捉体2に対して引力を付与することにより、前記捕捉体2を基板から解離させる、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記接触工程においては、前記解離工程で付与される引力よりも弱い引力が付与された状態、又は引力が付与されていない状態である、請求項4に記載の方法。
- 前記外力が、磁力、クーロン力、遠心力、流体力、光、及び音波からなる群より選択される少なくとも1種により引き起こされる外力である、請求項3〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記外力が、磁力、クーロン力、及び音波からなる群より選択される少なくとも1種により引き起こされる外力である、請求項3〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉体2が、前記被検物質と結合する抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも1種と、担体粒子とを含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記担体粒子が磁性粒子、及び荷電粒子からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項8に記載の方法。
- 前記捕捉体1が、前記被検物質と結合する抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記第1接触工程と前記第1解離工程の間にB/F分離工程を含まない、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記第2接触工程と前記第2解離工程の間にB/F分離工程を含まない、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記第1解離工程において捕捉体2を基板から解離した後に、基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す画像Pを撮影し、
前記第2解離工程において捕捉体2を基板から解離した後に、基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す画像Qを撮影し、且つ
前記検出工程において、前記画像P内の前記標識由来シグナルの位置と前記画像Q内の前記標識由来シグナルの位置とを比較して、前記画像Q内の前記標識由来シグナルの内、前記画像P内の前記標識由来シグナルと実質的に同位置の前記標識由来シグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する、
請求項1に記載の方法。 - 前記第1解離工程及び前記第2解離工程における基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す動画を撮影し、
前記検出工程において、前記動画内で、前記第1解離工程から前記第2解離工程まで実質的に同位置であり続ける前記標識由来シグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する、
請求項1に記載の方法。 - 前記第1接触工程において捕捉体2を基板上に配置した後に、基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す画像Xを撮影し、
前記第2接触工程において捕捉体2を基板上に配置した後に、基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す画像Yを撮影し、且つ
前記検出工程において、前記画像X内の前記標識由来シグナルの位置と前記画像Y内の前記標識由来シグナルの位置とを比較して、前記画像Y内の前記標識由来シグナルの内、前記画像X内の前記標識由来シグナルと実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する、
請求項2に記載の方法。 - 前記第1接触工程及び前記第2接触工程における基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す動画を撮影し、
前記検出工程において、前記動画内で、前記第1接触工程から前記第2接触工程まで実質的に同位置であり続ける前記標識由来シグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する、
請求項2に記載の方法。 - 被検物質を検出する装置であって、
反応液を収容する反応部と、前記反応液は、前記被検物質と前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを含み、前記反応部の底部は前記被検物質に対する結合性を有する捕捉体1が固定化された基板であり、
前記捕捉体2に対する外力を付与する外力付与部と、
基板上の標識由来シグナル配置パターンを撮像する撮像部と、
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整し、且つ
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する
処理部と、
を備える装置。 - 被検物質を検出する装置であって、
前記被検物質に対する結合性を有する捕捉体1が底部に固定化された基板を有し、前記被検物質と前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを含む反応液を収容する反応部と、
前記捕捉体2に対する外力を付与する外力付与部と、
基板上の標識由来シグナル配置パターンを撮像する撮像部と、
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整する制御部と、
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する処理部と、
を備える装置。
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