JP2019011254A - Epidermal thickening inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、表皮肥厚抑制剤に関する。 The present invention relates to an epidermal thickening inhibitor.
顔や手の甲などに見られる慢性的な紫外線曝露により生じる皮膚異常の一つに表皮肥厚が挙げられる。一方、臀部などの紫外線非曝露部の表皮層は加齢に伴い徐々に委縮することが知られている（非特許文献１参照）。 Epidermal thickening is one of the skin abnormalities caused by chronic UV exposure on the face and back of hands. On the other hand, it is known that an epidermis layer of an unexposed part such as a buttock gradually contracts with aging (see Non-Patent Document 1).
表皮が肥厚すると、病理学的側面における人体への影響のみならず、キメが粗くなるなどの美容的損失を伴うことから、特に女性にとって生活の質（ＱＯＬ）を低下させる原因の一つであると考えられる。 Thickening of the epidermis is one of the causes of lowering the quality of life (QOL), especially for women, because it involves not only the effects on the human body in pathological aspects but also cosmetic losses such as rough texture. it is conceivable that.
表皮肥厚の発症に関与すると言われている物質として、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）やＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子−２）、トリプターゼ、インターロイキン−２２などのサイトカインや、フィブロネクチン、ＡＤＡＭ（Ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）といった生体物質が挙げられるが、その発症機序の全貌はいまだ解明されていない（非特許文献２及び特許文献１、２、３参照）。 Substances that are said to be involved in the development of epidermis thickening include cytokines such as EGF (epidermal growth factor), FGF-2 (fibroblast growth factor-2), tryptase, interleukin-22, fibronectin, ADAM ( A biological substance such as A disintegrin and metalloprotease) can be mentioned, but the entire mechanism of the onset mechanism has not yet been elucidated (see Non-Patent Document 2 and Patent Documents 1, 2, and 3).
表皮肥厚はすなわち表皮層が厚くなる現象であることから、肥厚化した表皮を正常な状態に戻すことを期待して、表皮のターンオーバーを促進する効果があるレチノイドやトコフェロールを含有する表皮肥厚促進剤や、ピーリング効果があるα−ヒドロキシカルボン酸を含有する化粧用製剤などが提案されている（特許文献４及び５参照）。 Epidermis thickening is a phenomenon that the epidermis layer becomes thicker, so in the hope of returning the thickened epidermis to a normal state, promoting epidermis thickening containing retinoids and tocopherol that has the effect of promoting epidermis turnover An agent and a cosmetic preparation containing α-hydroxycarboxylic acid having a peeling effect have been proposed (see Patent Documents 4 and 5).
しかしながら、前記表皮肥厚促進剤や化粧用製剤は紫外線曝露により生じた症状を治療することを目的に適用するものであり、表皮肥厚を未然に防止することを目的に適用するものではない。 However, the above-mentioned epidermal thickening promoter and cosmetic preparation are applied for the purpose of treating symptoms caused by exposure to ultraviolet rays, and not for the purpose of preventing epidermal thickening in advance.
また、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する目的で、スフィンゴシンからなる表皮肥厚抑制剤などが知られているが（特許文献６参照）、スフィンゴシンはそれ自体が不安定な物質であることや製剤の経時安定性の確保が難しいことに加え、安全面の観点から配合できる油剤や界面活性剤の種類及び配合量が限られるなどの理由から、産業上の利用可能性に多くの制約があることが問題であった（特許文献７、８、９参照）。 In addition, for the purpose of suppressing epidermis thickening caused by exposure to ultraviolet rays, an epidermis thickening inhibitor composed of sphingosine is known (see Patent Document 6). In addition to difficulty in ensuring stability over time, there are many restrictions on industrial applicability due to the limited types and amounts of oils and surfactants that can be blended from the viewpoint of safety. It was a problem (see Patent Documents 7, 8, and 9).
ところで、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩としては、アスコルビン酸を含有した組成物に皮膚肥厚抑制効果があることや、２−Ｏ−α−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸に表皮肥厚抑制効果があることなどがすでに知られている（特許文献１０及び１１参照）。しかし、前記アスコルビン酸を含有した組成物の表皮に対する抑制効果は明確ではなく、２−Ｏ−α−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸以外のアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩に実質的な表皮肥厚の抑制作用が確認されたという報告はなされていない。 By the way, ascorbic acid, ascorbic acid derivatives or salts thereof, the composition containing ascorbic acid has an effect of suppressing skin thickening, and 2-O-α-glucopyranosyl-L-ascorbic acid has an effect of suppressing epidermal thickening. It is already known (see Patent Documents 10 and 11). However, the inhibitory effect on the epidermis of the composition containing ascorbic acid is not clear, and substantial epidermal thickening occurs in ascorbic acid, ascorbic acid derivatives or salts thereof other than 2-O-α-glucopyranosyl-L-ascorbic acid. There has been no report that the inhibitory action has been confirmed.
そこで、本発明は、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を有効成分として配合することを特徴とする、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制剤を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。 Therefore, the present invention provides an epidermis thickening inhibitor that suppresses thickening of skin caused by exposure to ultraviolet rays, characterized in that it comprises ascorbic acid, an ascorbic acid derivative or a salt thereof as an active ingredient. Let it be a challenge.
本発明者らは、上記の課題を解決しようとして、鋭意検討を重ねた結果、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩に紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する作用があることを見出した。 As a result of intensive investigations aimed at solving the above-mentioned problems, the present inventors have found that ascorbic acid, ascorbic acid derivatives or salts thereof have an action of suppressing epidermal thickening caused by exposure to ultraviolet rays.
したがって、本発明は、以下のものに関する。
（１） アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制剤。
（２） 前記アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩が、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸硫酸エステル、アスコルビン酸脂肪酸エステル及びアスコルビン酸アルキルエーテルのいずれかであることを特徴とする、前記（１）に記載の表皮肥厚抑制剤。
（３） 前記（１）又は（２）のいずれかに記載の表皮肥厚抑制剤を含有する、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品。
Accordingly, the present invention relates to the following.
(1) An epidermis thickening inhibitor that suppresses epidermis thickening caused by ultraviolet exposure, comprising ascorbic acid, an ascorbic acid derivative or a salt thereof as an active ingredient.
(2) The ascorbic acid, ascorbic acid derivative or a salt thereof is any one of ascorbic acid, sodium ascorbate, ascorbic acid phosphate, ascorbic acid sulfate, ascorbic acid fatty acid ester, and ascorbic acid alkyl ether. The epidermis thickening inhibitor as described in (1) above, which is characterized.
(3) Cosmetics, quasi-drugs, pharmaceuticals, or foods and drinks containing the epidermis thickening inhibitor according to either (1) or (2).
本発明であるアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を含有することを特徴とする、紫外線により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品として、種々の形態に広く汎用的に利用され得る。 Ascorbic acid, ascorbic acid derivative or a salt thereof according to the present invention, an epidermal thickening inhibitor that suppresses epidermal thickening caused by ultraviolet rays is a cosmetic, quasi-drug, pharmaceutical, or food and drink, It can be widely used in various forms.
以下に、本発明の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の形態をとり得る。 The details of the present invention will be described below, but the technical scope of the present invention is not limited only to the matters of this item, and the present invention can take various forms as long as the object is achieved.
本発明者らは、本発明に至るにあたり、紫外線曝露により生じる表皮肥厚の現象について、以下の通り、明らかにした。すなわち、表皮層が紫外線に曝露された時、曝露量などの条件に応じて、表皮細胞は、核酸やタンパク質及び脂質などの生体分子が受けた損傷の修復や再合成、並びに活性酸素種（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）の生成やサイトカインなどの分泌といった挙動を示して、周辺の環境を変化させうることに着目した。紫外線曝露の影響は、細胞死（アポトーシス、ネクローシスなど）などももたらすが、表皮層における細胞死は表皮細胞の減少を表すものであり、実質的に表皮の委縮をもたらすものであることを鑑みると、非特許文献１で示されるような表皮肥厚が生じる要因は、細胞死に至らなかった細胞自身及び周辺の細胞が増殖することによるものであることが明らかとなった。 In order to reach the present invention, the present inventors have clarified the phenomenon of epidermal thickening caused by ultraviolet exposure as follows. That is, when the epidermis layer is exposed to ultraviolet rays, depending on the conditions such as the exposure amount, epidermal cells can repair and re-synthesize damage received by biomolecules such as nucleic acids, proteins and lipids, and reactive oxygen species (ROS). : Reactive oxygen species) and the secretion of cytokines, etc., and showed that the surrounding environment can be changed. Although the effects of UV exposure also lead to cell death (apoptosis, necrosis, etc.), cell death in the epidermis layer represents a decrease in epidermal cells, and in view of the fact that epidermal atrophy is caused. It has been clarified that the cause of the thickening of the epidermis as shown in Non-Patent Document 1 is due to the proliferation of cells themselves and surrounding cells that did not cause cell death.
本発明者らは、上記の事実から、紫外線曝露がきっかけとなって起こる細胞増殖を抑制することができれば、表皮肥厚を抑制できると考え、鋭意検討を重ねた結果、検討した様々な成分の中でもアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩に紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する作用があることを見出すに至った。 Based on the above facts, the inventors considered that if cell proliferation caused by UV exposure can be suppressed, epidermal thickening can be suppressed, and as a result of intensive studies, among the various components studied It has been found that ascorbic acid, ascorbic acid derivatives or salts thereof have an action to suppress epidermal thickening caused by exposure to ultraviolet rays.
本発明において用いられる有効成分は、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体若しくはそれらの塩又はこれらの組み合わせであれば特に限定されない。アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸を基本骨格とするものとして通常知られているとおりの意味のものであれば特に限定されず、例えば、生理的作用を有するものとして知られているアスコルビン酸誘導体などが挙げられ、具体的にはアスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸硫酸エステル、アスコルビン酸脂肪酸エステル、アスコルビン酸アルキルエーテルなどが挙げられる。表皮肥厚の抑制作用を勘案すれば、アスコルビン酸リン酸エステルが好ましく、リン酸アスコルビルマグネシウムがより好ましい。アスコルビン酸の塩としては、例えば、アスコルビン酸ナトリウムなどが挙げられる。アスコルビン酸の塩やアスコルビン酸誘導体は、上記例示したものなどの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。一般的に、アスコルビン酸リン酸エステルなどのアスコルビン酸誘導体やアスコルビン酸ナトリウムなどのアスコルビン酸の塩は、生体内においてアスコルビン酸イオンとして存在することなどにより、アスコルビン酸と同様の生理的作用を有し得ることが知られている。 The active ingredient used in the present invention is not particularly limited as long as it is ascorbic acid, an ascorbic acid derivative or a salt thereof, or a combination thereof. The ascorbic acid derivative is not particularly limited as long as it has a meaning as commonly known as having ascorbic acid as a basic skeleton. For example, an ascorbic acid derivative known as having a physiological action, etc. Specifically, ascorbic acid phosphate ester, ascorbic acid sulfate ester, ascorbic acid fatty acid ester, ascorbic acid alkyl ether and the like can be mentioned. Considering the inhibitory action on epidermis thickening, ascorbic acid phosphate is preferable, and ascorbyl magnesium phosphate is more preferable. Examples of the salt of ascorbic acid include sodium ascorbate. Ascorbic acid salts and ascorbic acid derivatives may be used alone or in combination of two or more, such as those exemplified above. In general, ascorbic acid derivatives such as ascorbic acid phosphates and ascorbic acid salts such as sodium ascorbate have the same physiological effects as ascorbic acid due to the presence of ascorbic acid ions in vivo. It is known to get.
より具体的な例としては、アスコルビン酸（ＢＡＳＦジャパン社）、アスコルビン酸（結晶）（ＤＳＭニュートリションズ社）、アスコルビン酸ナトリウム（ＢＡＳＦジャパン社）、アスコルビン酸ナトリウム（結晶）（ＤＳＭニュートリションズ社）、「ＶＣエチル」（日本精化社）などの３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、「ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＶＣ−ＩＰ」（日光ケミカルズ社）などのテトラ２−ヘキシルデカン酸アスコルビル、「ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＶＣ−ＰＭｇ」（日光ケミカルズ社）や「アスコルビン酸ＰＭ」（昭和電工社）、「ＡＰＭ（リン酸アスコルビルＭｇ」（アイ・ティー・オー社）などのリン酸アスコルビルマグネシウム；「ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＣＰ」（日光ケミカルズ社）などのジパルミチン酸アスコルビル；「Ｌ−アスコルビン酸パルミチンエステル」（ＤＳＭニュートリションズ社）などのパルミチン酸アスコルビル；「ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＶＣ−ＳＳ」（日光ケミカルズ社）などのアスコルビン酸硫酸２ナトリウム；「ステイＣ−５０」（ＤＳＭニュートリションズ社）や「リン酸Ｌ−アスコルビルナトリウム」（ＢＡＳＦジャパン社）などのリン酸アスコルビルナトリウム；「アプレシエ（登録商標）（ＡＰＰＳ）」（昭和電工社）などのパルミチン酸アスコルビルリン酸３ナトリウム；ステアリン酸アスコルビルなどが挙げられるが、これらに限定されない。 More specific examples include ascorbic acid (BASF Japan), ascorbic acid (crystal) (DSM Nutritions), sodium ascorbate (BASF Japan), sodium ascorbate (crystal) (DSM Nutritions), 3-O-ethylascorbic acid such as “VC ethyl” (Nippon Seika Co., Ltd.), ascorbyl tetra-2-hexyldecanoate such as “NIKKOL (registered trademark) VC-IP” (Nikko Chemicals), “NIKKOL (registered trademark)” Ascorbyl magnesium phosphate such as “VC-PMg” (Nikko Chemicals), “Ascorbic acid PM” (Showa Denko), “APM (ascorbyl phosphate Mg” (IT Corporation)); “NIKKOL (registered trademark)” Dipalmitin such as CP (Nikko Chemicals) Ascorbyl; Ascorbyl palmitate such as “L-ascorbic acid palmitic ester” (DSM Nutritions); Ascorbic acid disodium sulfate such as “NIKKOL (registered trademark) VC-SS” (Nikko Chemicals); “Stay C-50” "Ascorbyl sodium phosphate such as" DSM Nutritions Corporation "and" L-ascorbyl sodium phosphate "(BASF Japan); Ascorbyl palmitate such as" Apressie (registered trademark) (APPS) "(Showa Denko) Trisodium; ascorbyl stearate and the like, but not limited thereto.
アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩の含有量は、表皮肥厚の抑制作用が認められる量であれば特に限定されないが、例えば、皮膚に適用する場合であれば、組成物の総量に対して、０．００１〜５質量％であり、０．０１〜４質量％が好ましく、０．１〜３質量％がより好ましく、０．５〜３質量％がさらに好ましい。一方、投与する場合であれば、一日当たりの投与量として５０〜３０００ｍｇが好ましく、３００〜２０００ｍｇがより好ましく、５００〜１０００ｍｇがさらに好ましい。投与する手段としては、経口又は注射等を介して実行することができる。 The content of ascorbic acid, an ascorbic acid derivative or a salt thereof is not particularly limited as long as an inhibitory effect on epidermis thickening is recognized, but for example, when applied to the skin, the total amount of the composition 0.001 to 5 mass%, preferably 0.01 to 4 mass%, more preferably 0.1 to 3 mass%, and still more preferably 0.5 to 3 mass%. On the other hand, in the case of administration, the daily dose is preferably 50 to 3000 mg, more preferably 300 to 2000 mg, and even more preferably 500 to 1000 mg. As a means for administration, it can be carried out orally or via injection.
アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を含有する表皮肥厚抑制剤は、それ自体として、又は他の成分とともに用いることにより、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品として利用され得る。 The epidermal thickening inhibitor containing ascorbic acid, an ascorbic acid derivative or a salt thereof can be used as a cosmetic, a quasi-drug, a pharmaceutical, or a food or drink as it is or with other components.
化粧品及び薬用化粧品の具体的な形態は、例えば、スキンケア化粧品、メイクアップ化粧品、フレグランス化粧品、ボディケア化粧品、ヘアケア化粧品などが挙げられるが、これらに特に限定されない。 Specific examples of cosmetics and medicinal cosmetics include, but are not limited to, skin care cosmetics, makeup cosmetics, fragrance cosmetics, body care cosmetics, hair care cosmetics, and the like.
医薬品及び医薬部外品の具体的な形態は、特に限定されないが、皮膚に適用する形態であれば、上記した化粧品及び薬用化粧品の具体的な形態に加えて、例えば、腋臭防止剤、てんか粉剤、育毛剤（養毛剤）、除毛剤、染毛剤（脱色剤、脱染剤）、パーマネント・ウェーブ用剤、浴用剤、忌避剤などが挙げられ、より具体的な剤形としては軟膏、クリームなどが挙げられる。また、皮膚に適用しない形態は、例えば、注射剤（筋肉、皮下、皮内）、輸液剤、経口剤、点鼻剤などが例示される。 Specific forms of pharmaceuticals and quasi-drugs are not particularly limited. However, as long as they are applied to the skin, in addition to the above-described specific forms of cosmetics and medicinal cosmetics, for example, anti-smell agents, garlic powders , Hair restorer (hair restorer), hair remover, hair dye (depigmenting agent, decoloring agent), permanent wave agent, bath agent, repellent, etc. More specific dosage forms include ointments, creams Etc. Examples of forms not applied to the skin include injections (muscular, subcutaneous, intradermal), infusions, oral preparations, nasal drops and the like.
本発明の抑制剤と抑制剤を含有する組成物は、その製造方法について特に限定されず、当業者に通常知られる方法にて製造できる。 The inhibitor and the composition containing the inhibitor of the present invention are not particularly limited with respect to the production method, and can be produced by a method generally known to those skilled in the art.
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to these Examples.
［１．調製］
リン酸アスコルビルマグネシウム（アイ・ティー・オー社）を５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に終濃度４００μｇ／ｍＬになるように溶解し、これを被験溶液とした。コメ抽出物についても、同様の操作により、終濃度５０μｇ／ｍＬになるように溶解し、これを被験溶液とした。
[1. Preparation]
Ascorbyl magnesium phosphate (ITO) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Life technologies) containing 5% (v / v) fetal bovine serum (FBS; Life technologies) to a final concentration of 400 μg / mL This was dissolved and used as a test solution. The rice extract was also dissolved by a similar operation to a final concentration of 50 μg / mL, and this was used as a test solution.
［２．不死化ヒト表皮細胞株ＨａＣａＴ細胞の培養と紫外線の照射］
１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いてＨａＣａＴ細胞を懸濁し、３５ｍｍシャーレに９．０×１０５ｃｅｌｌｓになるように播種した。その後、３５ｍｍシャーレを３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２４時間培養した。
[2. Culture of immortalized human epidermal cell line HaCaT cells and irradiation with ultraviolet rays]
HaCaT cells were suspended using DMEM containing 10% (v / v) FBS, and seeded in a 35 mm petri dish at 9.0 × 10 5 cells. Thereafter, the 35 mm petri dish was cultured for 24 hours under the conditions of 37 ° C. and CO 2 concentration of 5%.
培養後の培養上清を除去した各シャーレに、前述で調製した被験溶液 ０．１ｍＬを添加して、さらに２４時間培養した。培養後の培養上清を除去した各シャーレをハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；日水製薬社） ２ｍＬで２度洗浄し、各シャーレにフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ ２ｍＬを添加した。その後、紫外線を照射し、２４時間培養した。紫外線Ａ波（ＵＶＡ）の照射強度は、０（照射なし）、１０Ｊ／ｃｍ２とし、紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）の照射強度は、０（照射なし）、２５ｍＪ／ｃｍ２とした。ＵＶＡ灯は（ＦＬ２０Ｓ−ＢＬＢ；東芝社）を、ＵＶＢ灯は（ＴＬ２０Ｗ／１２ＲＳ、ＵＶＢ Ｂｒｏａｄｂａｎｄ；Ｐｈｉｌｉｐｓ社）を用いた。強度測定には、デジタル式ＵＶＸ紫外線強度計ＵＶＸ Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ（ＵＶＰ社）とＵＶ照射強度センサーＵＶＸ−３１（ＵＶＰ社）を用いた。 0.1 mL of the test solution prepared above was added to each petri dish from which the culture supernatant after culture was removed, and further cultured for 24 hours. Each petri dish from which the culture supernatant after the culture was removed was washed twice with 2 mL of Hanks balanced salt solution (HBSS; Nissui Pharmaceutical), and 2 mL of DMEM without phenol red was added to each petri dish. Then, it irradiated with the ultraviolet-ray and culture | cultivated for 24 hours. The irradiation intensity of ultraviolet A wave (UVA) was 0 (no irradiation) and 10 J / cm 2, and the irradiation intensity of ultraviolet B wave (UVB) was 0 (no irradiation) and 25 mJ / cm 2 . (FL20S-BLB; Toshiba Corporation) was used as the UVA lamp, and (TL20W / 12RS, UVB Broadband; Philips) was used as the UVB lamp. For the intensity measurement, a digital UVX ultraviolet intensity meter UVX Radiometer (UVP) and a UV irradiation intensity sensor UVX-31 (UVP) were used.
各シャーレ内のＨａＣａＴ細胞にＵＶＡまたはＵＶＢを照射した同日に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いてＨａＣａＴ細胞を懸濁し、９６ウェル培養プレートに３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように播種した。その後、９６ウェル培養プレートを３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２４時間培養した。 On the same day when the HaCaT cells in each dish were irradiated with UVA or UVB, the HaCaT cells were suspended using DMEM containing 10% (v / v) FBS, and 3.5 × 10 4 cells / well in a 96-well culture plate. Sowing. Thereafter, the 96-well culture plate was cultured under the conditions of 37 ° C. and CO 2 concentration of 5% for 24 hours.
培養後の９６ウェル培養プレート内にある培養上清を除去し、ＨＢＳＳ ２ｍＬで２度洗浄した。その後、各ウェルに対し、ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した各シャーレから得られた培養上清を０．１ｍＬずつ添加し、２４時間培養した。ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した各シャーレから得られた培養上清は、各ウェルに添加する前に、室温、３，０００ｒｐｍの速度で５分間遠心にかけて、不要な物質を除去した。培養後の９６ウェル培養プレート内にある培養上清を除去し、ＨＢＳＳ ２ｍＬで２度洗浄した。培養後の各ウェルについて、後述するタンパク定量を実施した。１つのデータを取得するのに必要なウェル数は、７以上とした。 The culture supernatant in the 96-well culture plate after the culture was removed and washed twice with 2 mL of HBSS. Thereafter, 0.1 mL of the culture supernatant obtained from each petri dish irradiated with UVA or UVB was added to each well and cultured for 24 hours. The culture supernatant obtained from each petri dish irradiated with UVA or UVB was centrifuged at room temperature and a speed of 3,000 rpm for 5 minutes to remove unnecessary substances before being added to each well. The culture supernatant in the 96-well culture plate after the culture was removed and washed twice with 2 mL of HBSS. For each well after culture, protein quantification described below was performed. The number of wells required to acquire one data was 7 or more.
［３．タンパク定量（細胞増殖率の測定）］
０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むリン酸緩衝溶液を９６ウェル培養プレートの各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加して細胞を完全に溶解した。各ウェルにＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のＲｅａｇｅｎｔ ＡとＲｅａｇｅｎｔ Ｂの比を５０：１で混合した溶液を各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加して１分間シェイカーにかけて混合した。その後、３７℃で１０分間インキュベートして吸光マイクロプレートリーダーＶ ｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いて５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
[3. Protein determination (measurement of cell growth rate)]
0.05 mL of a phosphate buffer solution containing 0.5% (v / v) Triton X-100 was added to each well of a 96-well culture plate to completely lyse the cells. To each well, 0.05 mL of a solution prepared by mixing a ratio of Reagent A and Reagent B of Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) at a ratio of 50: 1 was added to each well and mixed on a shaker for 1 minute. Then, it incubated at 37 degreeC for 10 minute (s), and the light absorbency in 550 nm was measured using the light absorption microplate reader Vmax (Molecular Device).
［４．解析方法］
検量線をもとに、得られた吸光度からタンパク量を算出した。検量線の作成にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。ＢＳＡ濃度は２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０ｍｇ／ｍＬの５点とした。後述の結果（１）では、ＵＶＡまたはＵＶＢを照射していない時の細胞増殖率をコントロール１、後述の結果（２）では、試料なし且つＵＶＡあるいはＵＶＢ照射した時の細胞増殖率をそれぞれコントロール２、コントロール３とした。これらを対照として（細胞増殖率＝１００％）、それぞれの被験溶液を作用させた時の細胞増殖率を算出した。後述の統計解析を用いて、有意に細胞増殖を抑制した時、表皮肥厚抑制効果があったと判断した。
[4. analysis method]
The protein amount was calculated from the obtained absorbance based on the calibration curve. Bovine serum albumin (BSA; Sigma Aldrich) was used to prepare a calibration curve. The BSA concentration was 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, and 5 mg / mL. In the result (1) described later, the cell growth rate when UVA or UVB is not irradiated is controlled 1, and in the result (2) described later, the cell growth rate when there is no sample and UVA or UVB irradiation is controlled 2. Control 3 was used. Using these as controls (cell growth rate = 100%), the cell growth rate when each test solution was allowed to act was calculated. Using statistical analysis described later, it was determined that there was an effect of suppressing epidermal thickening when cell proliferation was significantly suppressed.
［５．統計解析］
試験における統計学的有意差検定にはスチューデントのｔ検定を用いて、対応のない、両側検定の条件で実施した。有意水準は５％とした（ｐ＜０．０５）。
[5. Statistical analysis]
For the statistical significance test in the test, Student's t-test was used, and the test was performed under unpaired two-sided test conditions. The significance level was 5% (p <0.05).
［６．結果（１）］
最初に、ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した影響により細胞増殖が誘導されるかどうか検討した結果、後述の表１に示すように、ＵＶＡまたはＵＶＢ非照射（コントロール１）と比較して、ＵＶＡまたはＵＶＢ照射により細胞増殖率が有意に高まることを確認した。
[6. Result (1)]
First, as a result of examining whether cell growth is induced by the effect of irradiation with UVA or UVB, as shown in Table 1 below, UVA or UVB irradiation was compared with non-UVA or UVB non-irradiation (control 1). As a result, it was confirmed that the cell proliferation rate was significantly increased.
［６．結果（２）］
次に、被験溶液添加時のＵＶＡまたはＵＶＢ照射下における細胞増殖率を算出した結果、後述の表２に示すように、ＵＶＡまたはＵＶＢ非照射（コントロール２及び３）と比較して、実施例１はＵＶＡまたはＵＶＢを照射した影響により誘導される細胞増殖を有意に抑制した。しかし、比較例１は有意な細胞増殖抑制効果は見られなかった。なお、使用した被験溶液の培養細胞に対する毒性は認められなかった。表１及び２が示すように、実施例１の被験溶液はＵＶＡまたはＵＶＢ照射の影響による細胞の増殖を有意に抑制した。
[6. Result (2)]
Next, as a result of calculating the cell proliferation rate under UVA or UVB irradiation at the time of adding the test solution, as shown in Table 2 described later, compared with UVA or UVB non-irradiation (controls 2 and 3), Example 1 Significantly suppressed cell proliferation induced by UVA or UVB irradiation effects. However, Comparative Example 1 did not show a significant cell growth inhibitory effect. In addition, the toxicity with respect to the cultured cell of the test solution used was not recognized. As Tables 1 and 2 show, the test solution of Example 1 significantly suppressed cell growth due to the influence of UVA or UVB irradiation.
以下に本発明の種々の処方例を挙げるが、本発明の技術的範囲はこれらの処方例に限定されない。 Various formulation examples of the present invention are given below, but the technical scope of the present invention is not limited to these formulation examples.
（処方例１〜４）化粧水
（処方例５〜８）クリーム
（処方例９〜１２）乳液
（処方例１３〜１６）美容液
本発明は、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制することが可能であることから、表皮肥厚に基づく人体への悪影響を軽減することが期待される。 Since the present invention can suppress the thickening of the skin caused by exposure to ultraviolet rays, it is expected to reduce the adverse effects on the human body based on the thickening of the skin.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017126897A JP2019011254A (en) | 2017-06-29 | 2017-06-29 | Epidermal thickening inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (1)
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|---|---|
| JP2019011254A true JP2019011254A (en) | 2019-01-24 |
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Family Applications (1)
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| JP2017126897A Pending JP2019011254A (en) | 2017-06-29 | 2017-06-29 | Epidermal thickening inhibitor |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2019011254A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022059763A1 (en) * | 2020-09-17 | 2022-03-24 | 昭和電工株式会社 | Autophagy activation agent |
-
2017
- 2017-06-29 JP JP2017126897A patent/JP2019011254A/en active Pending
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|---|---|---|---|---|
| WO2022059763A1 (en) * | 2020-09-17 | 2022-03-24 | 昭和電工株式会社 | Autophagy activation agent |
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