JP2018537992A - 風味を付けた乳製品 - Google Patents

Abstract

本発明は、（ａ）乳原料を準備するステップと、（ｂ）少なくとも１種の微生物を用いて乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、（ｃ）アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げ、アンモニアが反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成するステップと、を含む、風味を付けた乳製品の製造方法を提供する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、風味を付けた乳製品の製造方法に関する。特に、本発明は、チョコレート風味を有する風味を付けた乳製品の製造方法に関する。乳原料（ｍｉｌｋ ｓｏｕｒｃｅ）の発酵中に微生物を用い、乳ベースの製品における風味の生成が達成される。本明細書に記載の本発明の方法は、チョコレート又はココア製品の添加を必要とせずに、乳製品中におけるチョコレート風味の生成を可能とする。

［背景技術］
発酵乳製品は主要な消費者製品である。発酵乳製品は、例えば、チーズ、バターミルク及びヨーグルトであり得る。発酵乳製品は、乳を発酵させることによって製造される。

発酵は、細菌株を用い、炭水化物を有機酸又は他の化合物に変換することである。

乳は、炭水化物である乳糖を含む。乳の発酵中に、細菌等の微生物が炭水化物である乳糖を発酵させ、乳酸を生成する。乳酸の生成により、発酵乳製品の製造中に乳の酸性化が生じる。乳の発酵中に、乳中に存在する他の物質と微生物との間に他の反応が生じ得る。これらの反応は、異なる風味及び香気に関連する多くの異なる化合物を生成させ得る。

乳の発酵に用いられる微生物は、乳酸菌株、例えば、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びレンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、並びにより周辺的なアエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、スポロラクトバチルス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、テラゲノコッカス属（Ｔｅｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バゴコッカス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）及びワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）等であり得る。これらの乳酸菌株は、ラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）に属する。

発酵乳製品は、用いられる乳原料と、乳原料の発酵に用いられる微生物とに応じて、多種多様な風味及び香気を有する。

消費者は、チョコレートの風味又は香気等の、特定の風味及び／又は香気を有する乳製品及び関連製品を好む。消費者は、人工（すなわち、合成）の風味又は香気関連化合物を好ましいと知覚しないことが多く、消費者は、このような化合物の添加を必要とせずに、自然に生成された風味及び／又は香気を有する食品製品を好む。

チョコレート風味及び／又は香気は、ココアパウダーの添加によって、乳製品又は他の食品製品に加えることができる。しかしながら、これは製品の褐色化を来たし、望ましくない場合がある。代わりに、特定の香味料が、製品に添加される場合があるが、これらは本質的に人工であることが多く、製品が非天然成分を含むことを表示する必要がある。

そのため、特定の風味及び／又は香気を有する、風味を付けた乳製品の、代わりの、かつ／又は改善された製造方法を提供する必要がある。

国際公開第２００８／０４９５８１号は、乳ベースの製品における自然な味わい及び風味を高めるための方法を記載している。

国際公開第２０１２／０８５００９号は、乳原料をラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）によって発酵させ、風味及び香気を有する発酵乳製品を生成させることを記載している。
［発明の概要］

本発明は、特許請求の範囲に明記した通り、風味を付けた乳製品と共に、風味を付けた乳製品の製造方法を提供することによって、上記の従来技術の問題に対処する。

一態様において、（ａ）乳原料を準備するステップと、（ｂ）少なくとも１種の微生物を用いて乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、（ｃ）アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げ、アンモニアが発酵乳原料と反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成することによって、風味を付けた乳製品を製造するステップと、を含む、風味を付けた乳製品の製造方法が提供される。

一実施形態において、ステップ（ｃ）におけるアンモニアは、ウレアーゼを発酵乳原料に添加することによって生成され、かつ／又は、ステップ（ｃ）は、アンモニア又はアンモニウム塩を発酵乳原料に添加するステップを含む。

一実施形態において、ステップ（ｃ）におけるｐＨは、約６〜約８．０、好ましくは約６．２５〜約７．７、より好ましくは約６．５〜約７．５、最も好ましくは約６．７〜約７．３である。

一実施形態において、ステップ（ｃ）は、前記発酵乳原料に熱処理を施すステップを更に含み、好ましくは、熱処理が、超高温（ＵＨＴ）処理、噴霧乾燥、ローラー乾燥、真空ベルト乾燥、連続乾燥又はバッチ乾燥、好ましくはＵＨＴ処理又は噴霧乾燥、のうちの少なくとも１つを含む。

一実施形態において、熱処理は、好ましくは、約１３０℃超、好ましくは約１３５〜１５５℃、より好ましくは約１４０〜１５０℃、最も好ましくは約１４５〜１４８℃の温度で実施されるＵＨＴ処理を含む。

ＵＨＴ処理は、約１０秒未満、好ましくは約１〜７秒、特に約２〜６秒、より好ましくは約２〜５秒、最も好ましくは約２〜４秒の時間にわたって実施され得る。

一実施形態において、上記の少なくとも１種の微生物は、乳酸菌（ラクトバチルス目）、好ましくは、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属、レンサ球菌属、アエロコッカス属、カルノバクテリウム属、エンテロコッカス属、オエノコッカス属、スポロラクトバチルス属、テトラゲノコッカス属（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バゴコッカス属、及びワイセラ属からなる群から選択される、より好ましくは、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、及びレンサ球菌属からなる群から選択される、最も好ましくは、ラクトバチルス属及びラクトコッカス属の群から選択される。

一実施形態において、上記の少なくとも１種の微生物は、ラクトコッカス属細菌、好ましくはラクトコッカス・ラクティス、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｌａｃｔｉｓ）、最も好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｌａｃｔｉｓ ｂｉｏｖａｒ． Ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）である。

一実施形態において、乳酸菌は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに、以下の受託番号、すなわち、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５、好ましくはＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５で寄託されている細菌から選択される。

一実施形態において、２，３，５，６−テトラメチルピラジンは、少なくとも約１百万分率（ｐｐｍ）、好ましくは少なくとも約５ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０ｐｐｍ、最も好ましくは少なくとも約２５ｐｐｍ、特に少なくとも約５０ｐｐｍの濃度で存在する。

一実施形態において、２，３，５，６−テトラメチルピラジンは、約１〜約１０００ｐｐｍ、好ましくは約５〜約５００ｐｐｍ、より好ましくは約１０〜約２５０ｐｐｍ、最も好ましくは約２０〜約１５０ｐｐｍ、特に約５０〜約１００ｐｐｍの濃度で存在する。

一実施形態において、ステップ（ａ）における乳原料はアミノ酸補充乳原料である。

一実施形態において、ステップ（ａ）における乳原料は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンからなる群から選択される１種以上のアミノ酸を含むアミノ酸補充乳原料である。

一実施形態において、アミノ酸補充乳原料は、少なくともＬ−フェニルアラニン、又は少なくともＬ−フェニルアラニンとＬ−ロイシンとの組み合わせを含む。

一実施形態において、アミノ酸補充乳原料は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２で寄託されている細菌を用いて発酵される。

一実施形態において、風味を付けた乳製品は、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールを、好ましくは、１ｐｐｍ超、約１〜１０００ｐｐｍ、約５〜５００ｐｐｍ、約１０〜２００ｐｐｍ、約１０〜１００ｐｐｍ、約２０〜約１００ｐｐｍ又は約２０〜５０ｐｐｍの量で更に含む。

アミノ酸補充乳原料は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに以下の受託番号、すなわち、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２及びＣＮＣＭ Ｉ−２１１６で寄託されている細菌を共に又は順次用いて発酵され得る。

風味を付けた乳製品は、２−フェニルブテナールを、好ましくは、０．１ｐｐｍ超、約０．２〜１００ｐｐｍ、約０．５〜５０ｐｐｍ、約１〜５０ｐｐｍ、約１〜２０ｐｐｍ、又は約１０〜２０ｐｐｍの量で更に含み得る。

一実施形態において、ステップ（ａ）におけるアミノ酸補充乳原料は、乳原料中の乳タンパク質の加水分解によって、好ましくは、少なくとも１種のプロテアーゼを乳原料に添加することによって調製され、これによってアミノ酸補充乳原料がもたらされる。

一実施形態において、少なくとも１種のアミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンからなる群から選択される。

一実施形態において、アミノ酸補充乳原料は、少なくともＬ−フェニルアラニン、又は少なくともＬ−フェニルアラニンとＬ−ロイシンとの組み合わせを含む。

一実施形態において、上記の少なくとも１種のプロテアーゼは、エンドプロテアーゼ及び／又はエキソペプチダーゼ、好ましくは真菌プロテアーゼ／ペプチダーゼ複合体である。

上記の少なくとも１種のプロテアーゼは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、好ましくはＡ．オリゼ株ＡＴＣＣ ４２１４９／ＲＩＢ ４０（黄麹菌）由来であり得る。

一実施形態において、ステップ（ａ）におけるアミノ酸補充乳原料は、少なくとも１種のアミノ酸を乳原料に添加することによって調製され、アミノ酸補充乳原料がもたらされる。

上記の少なくとも１種のアミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンからなる群から選択され得る。

一実施形態において、アミノ酸補充乳原料は、少なくともＬ−フェニルアラニン、又は少なくともＬ−フェニルアラニンとＬ−ロイシンとの組み合わせを含む。

本方法は、風味を付けた乳製品を乾燥する、かつ／又は、均質化するステップを更に含み得る。

別の態様において、（ａ）風味を付けた乳製品を上記の方法によって調製するステップと、（ｂ）風味を付けた乳製品を食品に添加し、食品製品を生成させるステップと、を含む、風味を付けた乳製品を含む食品製品の調製方法が提供される。

更なる態様において、（ａ）風味を付けた乳製品を上記の方法によって調製するステップと、（ｂ）風味を付けた乳製品を食品に添加するステップと、を含む、食品製品に風味を付けるための方法が提供される。

また更なる態様において、２，３，５，６−テトラメチルピラジンを、少なくとも約１０百万分率（ｐｐｍ）、好ましくは少なくとも約２０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約３０ｐｐｍ、最も好ましくは少なくとも約４０ｐｐｍ、特に少なくとも約５０ｐｐｍの濃度で含む、風味を付けた乳製品が提供される。一実施形態において、上記の風味を付けた乳製品は、ココア及びチョコレートを含まない。

２，３，５，６−テトラメチルピラジンは、約１０〜約１０００ｐｐｍ、好ましくは約２０〜約５００ｐｐｍ、より好ましくは約３０〜約２５０ｐｐｍ、最も好ましくは約４０〜約１５０ｐｐｍ、特に約５０〜約１００ｐｐｍの濃度で存在し得る。

風味を付けた乳製品は、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールを、好ましくは、約５ｐｐｍ超、約１〜１０００ｐｐｍ、約５〜５００ｐｐｍ、約１０〜２００ｐｐｍ、約１０〜１００ｐｐｍ、約２０〜約１００ｐｐｍ又は約２０〜５０ｐｐｍの量で更に含み得る。

風味を付けた乳製品は、２−フェニルブテナールを、好ましくは、約５ｐｐｍ超、約１０〜１０００ｐｐｍ、約２０〜５００ｐｐｍ、約２０〜２００ｐｐｍ、又は約５０〜２００ｐｐｍの量で更に含み得る。

また更なる態様において、上記の風味を付けた乳製品を含む食品製品が提供される。

また更なる態様において、２，３，５，６−テトラメチルピラジンを含み、上記の方法によって得ることが可能である又は得られる、風味を付けた乳製品若しくは食品製品が提供される。

また更なる態様において、２，３，５，６−テトラメチルピラジンは、少なくとも約１０百万分率（ｐｐｍ）、好ましくは少なくとも約２０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約３０ｐｐｍ、最も好ましくは少なくとも約４０ｐｐｍ、特に少なくとも約５０ｐｐｍの濃度で、本発明の方法によって得ることが可能である又は得られる、風味を付けた乳製品若しくは食品製品中に存在する。

一実施形態において、２，３，５，６−テトラメチルピラジンは、約１０〜約１０００ｐｐｍ、好ましくは約２０〜約５００ｐｐｍ、より好ましくは約３０〜約２５０ｐｐｍ、最も好ましくは約４０〜約１５０ｐｐｍ、特に約５０〜約１００ｐｐｍの濃度で存在する。

一実施形態において、上記の方法によって得ることが可能である又は得られる、風味を付けた乳製品は、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールを、好ましくは、５ｐｐｍ超、約１〜１０００ｐｐｍ、約５〜５００ｐｐｍ、約１０〜２００ｐｐｍ、約１０〜１００ｐｐｍ、約２０〜約１００ｐｐｍ又は約２０〜５０ｐｐｍの量で更に含む。

一実施形態において、上記の方法によって得ることが可能である又は得られる、風味を付けた乳製品は、２−フェニルブテナールを、好ましくは、約５ｐｐｍ超、約１０〜１０００ｐｐｍ、約２０〜５００ｐｐｍ、約２０〜２００ｐｐｍ、又は約５０〜２００ｐｐｍの量で更に含む。

一実施形態において、上記の風味を付けた乳製品又は上記の食品製品は、液体又は固体、好ましくは固体、より好ましくは粉末の形態である。

また更なる態様において、好ましくは、発酵乳製品中の２，３，５，６−テトラメチルピラジンの濃度を高めることによって、発酵乳製品の風味を高めるための、アンモニア又はアンモニウム塩の使用が提供される。好ましくは、風味はチョコレート風味である。

ある実施形態において、好ましくは、発酵乳製品中の２，３，５，６−テトラメチルピラジンの濃度を高めることによって、発酵乳製品においてチョコレート風味を付与する、かつ／又は、チョコレート風味を高めるための、アンモニア又はアンモニウム塩の使用が提供される。

また更なる態様において、好ましくは、発酵乳製品中の２，３，５，６−テトラメチルピラジンの濃度を高めることによって、乳製品の風味を高めるための、ウレアーゼの使用が提供される。好ましくは、風味はチョコレート風味である。

ある実施形態において、好ましくは、発酵乳製品中の２，３，５，６−テトラメチルピラジンの濃度を高めることによって、発酵乳製品においてチョコレート風味を付与する、かつ／又は、チョコレート風味を高めるための、ウレアーゼの使用が提供される。

２，３，５，６−テトラメチルピラジンの生成に関連する化学経路を示す図である。 アルドラーゼで触媒される、フェニルアセトアルデヒド及び３−メチルブタナールからの５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールの生成を示す反応式である。 アルドラーゼで触媒される、フェニルアセトアルデヒド及びアセトアルデヒドからの２−フェニルブテナールの生成を示す反応式である。 異なる継続時間の乾燥後の、風味を付けた乳製品２つの組成を示すグラフ図である。 アンモニア中和及び水酸化カリウム中和後に噴霧乾燥を用いて得られた２，３，５，６−テトラメチルピラジンの濃度を示すグラフ図である。 乳製品の発酵によって得られた５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールの濃度の推移を示すグラフ図である。

［発明を実施するための形態］
本発明は、（ａ）乳原料を準備するステップと、（ｂ）少なくとも１種の微生物を用いて乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、（ｃ）アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げ、アンモニアが発酵乳原料と反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成することによって、風味を付けた乳製品を製造するステップと、を含む、風味を付けた乳製品の製造方法を提供する。

本発明者らは、発酵乳原料のｐＨを上げるためにアンモニアを用いることによって、チョコレートの風味及び／又は香気、特に、芳醇な若しくは深みのあるチョコレートの風味及び／又は香気に関連する化合物である２，３，５，６−テトラメチルピラジンの乳原料中での生成が、改善されることを見出した。例えば、本発明の方法により、人工香味料又はココアパウダーの添加を必要とせずに、チョコレートの風味及び／又は香気を有する風味を付けた乳製品の製造が、有利に可能となる。

例えば、一実施形態において、本発明の方法に従って製造された風味を付けた乳製品は、ココアパウダー又はチョコレートを含まない。

理論による束縛を望むものではないが、２，３，５，６−テトラメチルピラジンは、アンモニアが、発酵乳原料中で化合物アセトインと反応する際に生成されるものと考えられる（図１）。アセトインは、乳原料の発酵に用いられる微生物に存在する酵素によって触媒される、いくつもの化学経路を経て生成される（ＭｃＳｗｅｅｎｅｙ Ｐ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００４）Ｖｏｌ ５７，Ｎｏ ２／３，１２７−１４４を参照）。

発酵プロセスによって、乳製品の酸味が高まり、乳製品のｐＨが低下する。発酵後、発酵乳製品のｐＨは約４．５〜約５．８、例えば、約５．０〜約５．８、又は約５．４〜約５．７であり得る。

本明細書で用いる場合、「発酵乳のｐＨを上げる」とは、発酵乳の酸味を低減させるという意味である。ｐＨは、約６．０〜約８．０、例えば、約６．２〜約７．７、約６．５〜約７．５、又は約６．７〜約７．３の値に上げられる。一実施形態において、ｐＨは、６〜７（例えば６．０〜７．０、６．２〜７．０、６．４〜７．０、若しくは６．６〜７．０、又は約６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８若しくは６．９）のｐＨ値に上げられる。

好ましい実施形態において、ｐＨ値は、室温、例えば約２０〜約３０℃（例えば約２０〜約２５℃）で測定される。

好ましくは、発酵乳は中和される。すなわち、発酵乳のｐＨは、約７（例えば、約６．７〜約７．３、好ましくは約６．８〜約７．２、より好ましくは約６．９〜約７．１、より好ましくは約７．０）に調整される。例えば、一実施形態において、発酵乳はアンモニアを用いて中和される。

アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げるため、アンモニアを、発酵乳原料に直接添加してもよい、又は、発酵乳原料中で、例えば酵素の作用により、ｉｎ ｓｉｔｕで生成させてもよい。一実施形態において、アンモニアは、乳原料にアンモニア（ＮＨ_３）の形態で添加され、液体アンモニア又はアンモニア水（水酸化アンモニウムＮＨ_４ＯＨとも知られ、アンモニウムイオンＮＨ_４ ^＋を含む）であり得る。アンモニア水は、１０〜２８％（例えば、１０、１５、２０、２５、又は２８％）のＮＨ_３の水溶液であり得る。一実施形態において、アンモニアは、アンモニウム塩（ＮＨ_４ ^＋イオンを含む）、例えば炭酸アンモニウム（Ｅ５０３）又は塩化アンモニウム等のアンモニア源の形態で、乳に添加される。発酵乳原料に添加されるアンモニア溶液（又はアンモニア源の溶液）の量は、発酵後の初期のｐＨと、生成した有機酸の量に対する全乳固形分と、発酵乳の緩衝能とに応じて、１リットル当たり約４〜約４０グラムの範囲であり得る。用いられるアンモニアの量は、発酵中に生成される乳酸を中和するのに必要な量に基づいて算出され得る。

アンモニアはまた、酵素の作用により、発酵乳原料中で生成され得る。好適な酵素はウレアーゼであり、以下の反応において、尿素が二酸化炭素及びアンモニアに加水分解されるのを触媒する：（ＮＨ_２）_２ＣＯ＋Ｈ_２Ｏ→ＣＯ_２＋２ＮＨ_３。本発明の方法において用いる場合、ウレアーゼは、乳製品中に自然に存在する尿素を加水分解する。

ウレアーゼ製剤は市販されており、例えば、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）から得られるウレアーゼである。ウレアーゼは、最適範囲ｐＨ６．５〜７．５のｐＨ値の範囲で作用する。ウレアーゼは、約３５０ｇ〜約４５０Ｕ／ｋｇ（例えば、約４００Ｕ／ｋｇ）の乳濃縮物の濃度で発酵乳原料に添加され得、乳濃縮物は、乳濃縮物１ｋｇ当たり尿素約１ｇを自然に含む。ウレアーゼは、約２０〜約３０℃（例えば、約２０、約２５又は約３０℃）の温度で、約２０〜約４０分間（例えば、約２０、約２５、約３０、約２５、又は約４０分間）インキュベートされ得る。

任意に、ウレアーゼを用いる場合、塩基、例えば水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、アンモニア又はアンモニア源を添加することによって、発酵乳原料のｐＨを上げ、上記の好ましいｐＨ範囲を達成できる。好ましくは、ウレアーゼを用いる場合、アンモニアの添加及びウレアーゼ酵素の使用の両方を、順次又は組み合わせのいずれかで用いることにより、発酵乳原料のｐＨを上げることができる。ｐＨは、ウレアーゼの添加前に、最適範囲の６．５〜７．５に（例えば、水酸化カリウム又は水酸化ナトリウムを用いて）上げることができる。

例えば、一実施形態において、ウレアーゼを発酵乳原料に添加することによって、発酵乳原料中でアンモニアが生成される。ウレアーゼをこのように用いることによって、外因性のアンモニア又はアンモニウム塩を発酵乳製品に添加する必要性が回避される。これは、外因性のアンモニア又はアンモニウム塩の使用に適用され得る食品規制又は表示規定があるため、有利であり得る。

本発明の方法において用いられる乳原料は、牛乳、羊乳、山羊乳、水牛乳、又はこれらの任意の混合物等の、任意の種類の乳とすることができる。乳原料は、ＵＨＴ処理乳、低温殺菌乳、又は非低温殺菌乳であり得る。乳原料は、全脂肪乳、脱脂乳又は半脱脂乳であり得る。更に、乳原料は、生乳、還元乳、又は植物性脂肪若しくはこれらの任意の混合物を含む乳であり得る。

上記の少なくとも１種の微生物による乳原料の発酵が、風味及び／又は香気関連化合物の生成に必要である。

発酵プロセス中に生成され得る風味及び／又は香気関連化合物の例としては、３−メチル−ブタナール、２−メチル−ブタナール、２−メチル−１−プロパナール、２−フェニルアセトアルデヒド、２，３−ブタンジオン（ｂｕｔａｎｄｉｏｎｅ）（ジアセチル）、３−ヒドロキシ−２−ブタネオン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｂｕｔａｎｅｏｎｅ）（アセトイン）、２−フェニル−２−ブテナール及び他のフェニルアルデヒド（Ｃ１０〜１６）、ベンズアルデヒド、５−メチル−２−フェニル−シス−２−ヘキセナール（コカール（ｃｏｃａｌ））、２，４，５−トリメチルオキサゾール、δ−オクタラクトン（５−オクタノリド）、δ−デカラクトン（５−デカノリド）、δ−ドデカラクトン（５−ドデカノリド）、ブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、４−ヒドロキシ−２，５−ジメチル−３（２Ｈ）−フラノン（フラネオール）が挙げられる。フェニルアルデヒド（Ｃ１０〜１６）は、炭素原子１０〜１６個の炭素鎖を有するフェニルアルデヒドを意味する。

特定の風味及び／又は香気関連化合物は、上記の少なくとも１種の微生物によって代謝されるアミノ酸から最終的に誘導され得る。特定の実施形態において、乳原料は、アミノ酸が補充され得る。本発明の文脈において、アミノ酸の補充は、自然に存在する任意のアミノ酸の他に、追加のアミノ酸が乳原料中にもたらされるという意味である。自然に存在するアミノ酸についての言及は、遊離アミノ酸のみを意味し、タンパク質等のポリペプチドの一部であるアミノ酸残基を含まない。

乳原料へのアミノ酸の補充は、アミノ酸を乳原料に直接添加する、又は、乳原料タンパク質をタンパク質消化することのいずれかにより、乳原料中の遊離アミノ酸の濃度を高めることによって達成することができる。乳原料に補充するため、アミノ酸、プロテアーゼ（又はペプチダーゼ）、又はこれらの任意の混合物のうちの少なくとも１つを、乳原料に添加してもよい。

アミノ酸補充乳原料は、少なくとも１種のアミノ酸を乳原料に添加することによって調製してもよい。上記の少なくとも１種のアミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及び／又はＬ−バリンであり得る。好ましくは、上記の少なくとも１種のアミノ酸は、これらのアミノ酸が５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナール及び２−フェニル−２−ブテナールの特に有利な前駆体であるため、Ｌ−フェニルアラニン及び／又はＬ−ロイシンから選択される。

アミノ酸補充乳原料はまた、少なくとも１種のプロテアーゼを乳原料に添加することによって調製してもよい。このプロテアーゼは、乳原料中に自然に存在するタンパク質を加水分解して遊離アミノ酸を生成することによって、乳原料にアミノ酸を補充する。プロテアーゼの作用によって生成される遊離アミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、又はＬ−バリンを含み得る。

プロテアーゼはエキソプロテアーゼであってもよく、このプロテアーゼは、ポリペプチドの末端又は末端から２番目のペプチド結合を切断することによって、ポリペプチドの末端から遊離アミノ酸を放出する。あるいは、プロテアーゼは、エンドプロテアーゼであってもよく、このプロテアーゼは、非末端ペプチド結合（すなわち、ポリペプチド鎖の末端ではなく、ポリペプチド鎖内の結合）を切断する。

乳原料のアミノ酸の補充は、乳原料に、少なくとも１種のエキソプロテアーゼ及び少なくとも１種のエンドプロテアーゼを含む混合物を添加することによって達成することができる。

上記の少なくとも１種のプロテアーゼは、微生物、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ． ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、若しくはＬ．ラクティス亜種由来、又はパイナップル（Ananas comosus）等の植物由来であり得る。アスペルギルス・オリゼ株は、ＡＴＣＣ ４２１４９／ＲＩＢ４０（黄麹菌）であり得る。

上記の少なくとも１種のプロテアーゼは、真菌プロテアーゼ／ペプチダーゼ複合体であってもよい。

上記の少なくとも１種のプロテアーゼは、アスペルギルス・オリゼ由来であり得る。

上記の少なくとも１種のプロテアーゼは、アスペルギルス・オリゼ由来の酵素製剤、例えば、エンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼ活性の両方を含む酵素製剤であってもよい。このようなアスペルギルス・オリゼ由来の酵素製剤の例は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社製のＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標）である。Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（商標）は中性又は酸性条件下でのタンパク質の加水分解に好適な真菌プロテアーゼ／ペプチダーゼ複合体であり、エンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼ活性の両方を含む。

上記の少なくとも１種のプロテアーゼ（又はペプチダーゼ）は、上記の少なくとも１種のアミノ酸と共に、又は、上記の少なくとも１種のアミノ酸なしで添加される場合がある。上記の少なくとも１種のアミノ酸、上記のプロテアーゼ（又はペプチダーゼ）、又はこれらの任意の混合物は、乳原料に、０．０１〜５重量％、好ましくは０．００１〜２重量％の量、より好ましくは０．０３〜１．０重量％、最も好ましくは０．０５〜０．３重量％の量で添加される。

アミノ酸補充乳原料を、補充された乳原料に添加された少なくとも１種の微生物を用いて発酵させ、酸性のｐＨを有する発酵乳原料を生成させる。発酵後、発酵乳製品のｐＨは約４．５〜約５．８、例えば、約５．０〜約５．８、又は約５．４〜約５．７であり得る。

発酵プロセスの一環として、アミノ酸が反応し、特定の風味に寄与する直接的又は間接的な変換産物をもたらす。

一実施形態において、アミノ酸補充乳原料は、乳酸菌（ラクトバチルス目）から選択される少なくとも１種の微生物を用いて発酵される。乳酸菌は、共通の代謝特性を有する、グラム陽性、耐酸性、桿状又は球状の細菌の群である。乳酸菌は、炭水化物発酵の主要な最終産物として、乳酸を生成する。

本開示は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に以下の受託番号、すなわち、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０５で寄託されている乳酸菌を記載している。

ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２ ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４、及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５は、ＮＥＳＴＥＣ ＳＡ（Ａｖｅｎｕｅ Ｎｅｓｔｌｅ（’）５５，ＣＨ−１８００ Ｖｅｖｅｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって寄託された。ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６は、ＳＯＣＩＥＴＥ ＤＥＳ ＰＲＯＤＵＩＴＳ ＮＥＳＴＬＥ ＳＡ（Ａｖｅｎｕｅ Ｎｅｓｔｌｅ（’）５５，ＣＨ−１８００ Ｖｅｖｅｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって寄託された。

細菌ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２は国際公開第２０１２／０８５０１０号及び同第２０１２／０８５００９号に記載されており、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。細菌ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５は、国際公開第２０１２／０８５０１０号に記載されている。

ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２を含む細菌を用いた発酵乳製品の製造方法が、国際公開第２０１２／０８５００９号に記載されている。

本発明者らは、乳酸菌の特定の株を用いてアミノ酸補充乳原料を発酵させる場合、特に有利な結果が得られることを見出した。例えば、一実施形態において、乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ （ｓｕｂｓｐ．） ｌａｃｔｉｓ）細菌である。一実施形態において、乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ｂｉｏｖａｒ． ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）細菌である。一実施形態において、乳酸菌は、ＣＮＣＭに以下の受託番号、すなわち、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５、好ましくはＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５で寄託されている細菌から選択される。本発明者らは、これらの細菌のそれぞれを用いることによって、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナール及び／又は２−フェニルブテナールの生成が有利に増加することを見出した。

少なくとも１種の微生物が添加された補充乳原料は、好ましくは、温度約３０℃（例えば、約２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６又は３８℃）で、６〜２４時間（例えば、６、８、１２、１６、２０又は２４時間）発酵される。任意に、α−ケトグルタル酸塩、マンガン塩及び／又はマグネシウム塩等の発酵改善補助因子もまた、発酵前に添加してもよい。

一実施形態において、本発明の方法により、２，３，５，６−テトラメチルピラジンを、少なくとも１０百万分率（ｐｐｍ）、好ましくは少なくとも約２０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約３０ｐｐｍ、最も好ましくは少なくとも約４０ｐｐｍ、特に少なくとも約５０ｐｐｍの濃度で有する、風味を付けた乳製品が製造される。一実施形態において、２，３，５，６−テトラメチルピラジンは、濃度が、約１０〜約１０００ｐｐｍ、好ましくは約２０〜約５００ｐｐｍ、より好ましくは約３０〜約２５０ｐｐｍ、最も好ましくは約４０〜約１５０ｐｐｍ、特に約５０〜約１００ｐｐｍである。

一実施形態において、風味を付けた乳製品は、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナール及び／又は２−フェニルブテナールを含み、好ましくは、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナール及び／又は２−フェニルブテナールは、発酵乳原料中で生成される。

一実施形態において、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナール及び／又は２−フェニルブテナールは、更なるかつ／又は高められたチョコレート風味及び／若しくは香気を、風味を付けた乳製品にもたらす。

一実施形態において、アミノ酸補充乳は、ＣＮＣＭに以下の受託番号、すなわち、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２で寄託されている少なくとも１種の細菌によって発酵される。本発明者らは、この細菌を用いることによって、チョコレートの風味及び／又は香気に関連する別の化合物である５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナール（コカールとしても知られる）の生成を有利に増加させることを見出した。

５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールは、フェニルアセトアルデヒドの３−メチルブテナール（３−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｅｎａｌ）との反応によって生成され、この誘導は、酵素アルドラーゼによって触媒される。この酵素は、細菌ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２に内在する。フェニルアセトアルデヒドは、アミノ酸Ｌ−フェニルアラニン及び／又はＬ−ロイシンから誘導される。この誘導はアミド基転移反応を受けてフェニルピルビン酸を生成し、フェニルピルビン酸は次いで脱炭酸され、フェニルアセトアルデヒドを生成する。３−メチルブテナールは、アミド基転移反応を経て、アミノ酸Ｌ−ロイシンから誘導される。これらの反応は、上記の少なくとも１種の微生物に存在する酵素によって触媒される。

例えば、一実施形態において、風味を付けた乳製品は、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールを更に含む。一実施形態において、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールは、約１ｐｐｍ超、約１〜１０００ｐｐｍ、約５〜５００ｐｐｍ、約１０〜２００ｐｐｍ、約１０〜１００ｐｐｍ、約２０〜約１００ｐｐｍ又は約２０〜５０ｐｐｍの濃度で存在する。

一実施形態において、アミノ酸補充乳は、ＣＮＣＭに以下の受託番号、すなわち、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２及びＣＮＣＭ Ｉ−２１１６で寄託されている細菌を、共に又は順次（いずれかの順番で）のいずれかで用いて発酵される。一実施形態において、アミノ酸補充乳は、細菌ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６及びＣＮＣＭ Ｉ−１９６２を共に用いて発酵される、又は、最初に細菌ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２で発酵された後、細菌ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６で発酵される。本発明者らは、これらの細菌を共に又は順次用いることによって、チョコレートの風味及び／又は香気に関連する更なる化合物である２−フェニルブテナールの生成が有利に増加することを見出した。

２−フェニルブテナールは、フェニルアセトアルデヒドとアセトアルデヒドとの反応から生成され、また、酵素アルドラーゼにより触媒される。細菌ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６は、必要なアセトアルデヒドを効率的に生成させることによって、２−フェニルブテナールの生成を増加させることが、本発明者らにより見出された。フェニルアセトアルデヒドは、上記の通り、Ｌ−フェニルアラニンに由来し、アセトアルデヒドは、ピルビン酸由来を含め、いくつもの異なる化学経路を経て誘導され得る。

例えば、一実施形態において、風味を付けた乳製品は、２−フェニルブテナールを更に含む。一実施形態において、２−フェニルブテナールは、約５ｐｐｍ超、約１０〜１０００ｐｐｍ、約２０〜５００ｐｐｍ、約２０〜２００ｐｐｍ、又は約５０〜２００ｐｐｍの濃度量で存在する。

アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げるステップに次いで、風味を付けた乳製品は、乾燥され、かつ／又は、均質化され得る。

本発明者らは、２，３，５，６−テトラメチルピラジンの生成が、アンモニアを用いてｐＨを上げた後に発酵乳原料を加熱した場合に、特に効率的であることを見出した。

例えば、好ましい実施形態において、本発明の方法は、発酵乳原料に熱処理を施すステップを更に含む。

熱処理ステップは、本発明の方法のステップ（ｃ）と同時に、又は、ステップ（ｃ）に次いでのいずれかで実施される。熱処理ステップが本発明の方法のステップ（ｃ）に次いで実施される場合、上記の熱処理ステップが、本方法のステップ（ｄ）を形成する場合がある。

熱処理ステップを用いることによって、２，３，５，６−テトラメチルピラジンの生成を、少なくとも約２倍、４倍、５倍、又は１０倍増加させることができる。

一実施形態において、熱処理は、噴霧乾燥を含む。噴霧乾燥において、液体（乳原料等）が、小型ノズルを通し、加熱された乾燥ガス中に噴霧される。これにより、その後に回収可能な、乾燥粉末又は粒子が生成される。

一実施形態において、熱処理は、超高温（ＵＨＴ）処理、噴霧乾燥、ローラー乾燥、真空ベルト乾燥、連続乾燥又はバッチ乾燥、好ましくはＵＨＴ処理又は噴霧乾燥、のうちの少なくとも１つを含む。

ＵＨＴ加工処理において、食品製品（乳原料由来の製品等）に、約１３０℃超（好ましくは約１３５〜１５５℃、より好ましくは約１４０〜１５０℃、最も好ましくは約１４５〜１４８℃）の高温が施される。ＵＨＴ処理は、約１０秒未満（好ましくは約１〜７秒、特に約２〜６秒、より好ましくは約２〜５秒、最も好ましくは約２〜４秒）の時間にわたって実施され得る。

例えば、好ましい実施形態において、本発明は、（Ａ）風味を付けた乳製品の製造方法であって、方法が、
（ａ）乳原料を準備するステップと、
（ｂ）少なくとも１種の微生物を用いて乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、
（ｃ）アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げるステップと、
（ｄ）発酵乳原料に熱処理を施すステップと、を含み、
アンモニアが発酵乳原料と反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成する、方法を提供する。

更に好適な実施形態において、本発明は、（Ｂ）風味を付けた乳製品の製造方法であって、方法が、
（ａ）乳原料を準備するステップと、
（ｂ）少なくとも１種の微生物を用いて乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、
（ｃ）アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げるステップと、
（ｄ）発酵乳原料に、噴霧乾燥を含む熱処理を施すステップと、を含み、
アンモニアが発酵乳原料と反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成する、方法を提供する。

例えば、更にまた好ましい実施形態において、本発明は、（Ｃ）風味を付けた乳製品の製造方法であって、方法が、
（ａ）乳原料を準備するステップと、
（ｂ）少なくとも１種の微生物を用いて乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、
（ｃ）アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げるステップと、
（ｄ）発酵乳原料に、ＵＨＴ処理を含む熱処理を施すステップと、を含み、
アンモニアが発酵乳原料と反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成する、方法を提供する。

例えば、好ましい実施形態において、本発明は、風味を付けた乳製品の製造方法（Ｄ）を提供し、本方法は、
（ａ）アミノ酸補充乳原料を準備するステップと、
（ｂ）少なくとも１種の微生物を用いてアミノ酸補充乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、
（ｃ）アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げるステップと、
（ｄ）発酵乳原料に熱処理を施すステップと、を含み、
アンモニアが発酵乳原料と反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成する。

例えば、更に好ましい実施形態において、本発明は、（Ｅ）風味を付けた乳製品の製造方法であって、方法が、
（ａ）アミノ酸補充乳原料を準備するステップと、
（ｂ）少なくとも１種の微生物を用いてアミノ酸補充乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、
（ｃ）アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げるステップと、
（ｄ）発酵乳原料に、噴霧乾燥を含む熱処理を施すステップと、を含み、
アンモニアが発酵乳原料と反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成する、方法を提供する。

例えば、更にまた好ましい実施形態において、本発明は、（Ｆ）風味を付けた乳製品の製造方法であって、方法が、
（ａ）アミノ酸補充乳原料を準備するステップと、
（ｂ）少なくとも１種の微生物を用いてアミノ酸補充乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、
（ｃ）アンモニアを用いて発酵乳原料のｐＨを上げるステップと、
（ｄ）発酵乳原料に、ＵＨＴ処理を含む熱処理を施すステップと、を含み、
アンモニアが発酵乳原料と反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成する、方法を提供する。

上記の方法（Ａ）〜（Ｆ）のいずれにおいても、ステップ（ｂ）における上記の少なくとも１種の微生物は、本明細書に開示したいずれかの実施形態で規定した乳酸菌である。好ましくは、乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクティス、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、最も好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクティス、最も好ましくは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに以下の受託番号、すなわち、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５、好ましくは、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５で寄託されている細菌から選択される乳酸菌である。ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、又は、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２とＣＮＣＭ Ｉ−２１１６との共に若しくは順次用いられる組み合わせから選択される乳酸菌が、特に好ましい。これらの細菌は、特に、ステップ（ａ）における乳原料がアミノ酸補充乳原料である場合［すなわち、実施形態（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）］、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナール及び／又は２−フェニルブテナールの生成を有利に増加させる。

方法（Ａ）〜（Ｆ）のいずれにおいても、アンモニアは、水酸化アンモニウム又はアンモニウム塩の形態で添加され得る。また、アンモニアを、上記のように、ウレアーゼ酵素の添加により、ｉｎ ｓｉｔｕで生成させる場合もある。ウレアーゼ酵素を用いてアンモニアをｉｎ ｓｉｔｕで生成させる場合、ウレアーゼ活性に対して最適条件をもたらすため、塩基（例えば、水酸化カリウム又は水酸化ナトリウム）を用い、ｐＨを約６．５〜７．５に調整する場合がある。

方法（Ｄ〜Ｆ）のいずれにおいても、アミノ酸補充乳原料は、好ましくは、少なくとも１種のプロテアーゼを乳原料に添加することによって、特に遊離Ｌ−フェニルアラニンの量を増加させ、また、任意に、Ｌ−Ｌロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの量を更に増加させて調製される。プロテアーゼは、微生物、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、リゾプス・オリゼ、枯草菌、Ｌ．ヘルベティカス、Ｓ．サーモフィルス、Ｌ．プランタルム、若しくはＬ．ラクティス亜種由来、又はパイナップル等の植物由来であり得る。好ましくは、プロテアーゼは、アスペルギルス・オリゼ、より好ましくは株ＡＴＣＣ ４２１４９／ＲＩＢ４０（黄麹菌）由来である。

また、アミノ酸を補充すると共に、発酵ステップの前に１種以上の追加の化合物を乳製品に更に補充し、上記の少なくとも１種の微生物によって直接又は間接的に更なる風味及び／若しくは香気関連化合物に変換され得る追加の基質をもたらすことができる。

一実施形態において、発酵ステップの前に、乳原料にシトレート（例えば、クエン酸三ナトリウムの形態）を補充する。シトレート（例えば、クエン酸三ナトリウム）は、乳原料に０．１〜５重量％、好ましくは０．０１〜２重量％、より好ましくは０．０３〜１．０重量％、最も好ましくは０．０５〜０．３重量％の量で添加され得る。

リパーゼを乳原料に添加し、更なる所望の風味を、乳製品中で生成させることができる。リパーゼは、乳原料中の脂肪を加水分解し、例えば、ジグリセリド、モノグリセリド及び遊離脂肪酸、又はこれらの任意の混合物を生成させる。ジグリセリド、モノグリセリド及び遊離脂肪酸は、発酵乳製品にクリーム様の風味を付与する。

また、ラクターゼを乳原料又は混合物に添加し、更なる所望の風味を、乳製品中で生成させることができる。ラクターゼは、乳原料中の二糖ラクトースを、ガラクトース及びグルコースに加水分解する。グルコース及びガラクトースは、カラメル様かつ加糖練乳様の風味を形成するための風味前駆体として用いることができる。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の通り、本発明の方法によって得ることが可能である、風味を付けた乳製品を提供する。

本発明の方法により製造された発酵乳製品には、食品製品中及び食品製品製造中の用途があり得る。例えば、本発明によってもたらされる風味を付けた乳製品を用い、別の食品又は飲料に、チョコレートの風味及び／又は香気を付与することができる。

風味を付けた乳製品を含む食品製品は、（ａ）風味を付けた乳製品を上記の方法によって調製するステップと、（ｂ）風味を付けた乳製品を食品に添加して食品製品を生成させるステップとを含む方法によって調製することができる。

（ａ）風味を付けた乳製品を上記の方法によって調製するステップと、（ｂ）風味を付けた乳製品を食品に添加するステップとを含む方法によって、本発明の風味を付けた乳製品を用い、食品製品に風味を付与することができる。

本明細書に記載の風味を付けた乳製品又は食品製品は、液体又は固体、好ましくは固体、より好ましくは粉末の形態であり得る。

本発明によって調製された発酵乳製品は、ココア製品若しくはチョコレート製品、又は香味料の添加を必要とせずに、チョコレート風味の生成が可能であることが理解されるであろう。特に、本発明の乳製品中のチョコレート風味は、発酵乳原料と、アンモニアを（アンモニアの溶液、アンモニウム塩等のアンモニア源の溶液として、又はウレアーゼ酵素の添加によってｉｎ ｓｉｔｕで生成されたものとして）反応させ、２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成させる、本発明の方法に起因させることができる。２，３，５，６−テトラメチルピラジンの生成は、発酵乳原料をアンモニアの存在下で熱処理することによって、更に高められる。熱処理は、アンモニアの添加前又は添加後に実施することができる。例えば、熱処理は、本明細書に記載の、噴霧乾燥ステップにより、又はＵＨＴ処理により、添加後に実施することができる。好ましくは、ウレアーゼを用いる場合、熱処理は、ウレアーゼ及び発酵乳原料を含む混合物を適切な時間、好ましくは上記の条件下でインキュベートした後に実施される。

食品製品は、好ましくは、乳製品デザート、ヨーグルト、乳製品ベースの栄養組成物又はアイスクリームから選択される。乳製品ベースの栄養組成物は、例えば、グローイングアップミルク、とろみのある食感を有する乳製品ベースの栄養組成物、及び穀物乳飲料を包含する。食品製品は、冷蔵してもよい、常温保存可能である、又は冷凍してもよい。ある実施形態において、食品製品は冷蔵される、又は常温保存可能である。

当業者であれば、本明細書に開示された本発明の全ての特徴が自由に組み合わせ可能であることを理解するであろう。特に、本発明の製品のために記載された特徴を、本発明の方法と組み合わせることができ、逆もまた同様である。更に、本発明の異なる実施形態について記載された特徴を組み合わせることができる。周知の同等物が特定の特徴について存在する場合、このような同等物は、本明細書で具体的に言及されているのと同様に組み込まれる。本発明の更なる利点及び特徴は、図面及び非限定的な実施例から明らかである。

次に、本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な実施例によって記載する。

実施例１
全乳粉末を３５％の濃度に再構成し、乳原料を準備した。アミノ酸Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−フェニルアラニンを、乳原料に、下記の表１に示した濃度で添加した。

アミノ酸補充乳原料を８０℃で予熱した後、アミノ酸補充乳原料を１４０℃の温度に４秒間加熱することを含むＵＨＴ処理を実施した。

ＵＨＴ処理に次いで、細菌ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２の培養物を、アミノ酸補充乳原料に、下記の表１に示したように、１％の濃度で添加した。

発酵は、３０℃で、好気条件下において約１０時間実施した。

ウレアーゼ酵素を添加した。ウレアーゼ酵素の良好な活性のためのｐＨを得るため、ｐＨを約７に調整した（例えば、水酸化カリウム又は水酸化ナトリウム等の塩基を用いる）。

発酵乳原料を冷やし、噴霧乾燥して粉末を生成させた。

化学分析により、２，３，５，６−テトラメチルピラジンの存在を確認した。

訓練されたパネルによる官能評価により、得られた発酵乳製品がチョコレート風味を呈することが明らかとなった。

実施例２
アミノ酸補充乳を、乳酸菌ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４で発酵させた。発酵に次いで、アンモニアを用いて乳を中和した後、乾燥した。

乾燥時間がより長いと、２，３，５，６−テトラメチルピラジンの生成が有意に増加することが見出された。

図４は、２つの実施例の粉末を示す。粉末２０９３．０５は、粉末２０９３．０６よりも長い乾燥を受け、２，３，５，６−テトラメチルピラジンの濃度（グラフの右側の最後の棒から２番目に示す）が有意に高い。

また、訓練されたパネルによる官能評価により、粉末２０９３．０５は、有意に強いチョコレート風味を特徴とすることが明らかとなった。

実施例３
発酵乳の中和に用いられる塩基性物質の、２，３，５，６−テトラメチルピラジンに対する効果を測定した。

発酵乳をアンモニア（水酸化アンモニウムＮＨ_４ＯＨの形態）で中和した場合の２，３，５，６−テトラメチルピラジンの生成を、発酵乳を水酸化カリウム（ＫＯＨ）で中和した場合の２，３，５，６−テトラメチルピラジンの生成と比較した。いずれの場合も、中和後に噴霧乾燥した。

図５は、水酸化カリウムに比べ、アンモニアを用いて中和を行った場合、２，３，５，６−テトラメチルピラジンの生成が有意に増加したことを示している。

実施例４
全乳粉末を３５％の濃度に再構成し、乳原料を準備した。アミノ酸Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−フェニルアラニンを、乳原料に、下記の表１に示した濃度で添加した。

次いで、細菌ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−１９６２の培養物を、アミノ酸補充乳原料に、下記の表１に示したように、１％の濃度で添加した。

次いで、このアミノ酸補充乳原料を、３０℃で、好気条件下において、約１２時間発酵させた。

次いで、アンモニアを用いてｐＨを６．７に調整した。

発酵乳原料を冷やし、噴霧乾燥して粉末を生成させた。

５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールの濃度を、発酵中の異なる時点で測定した。結果を図６に示す。図６は、発酵の８時間後に、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールが生成し始めることを示している。

この実施例で得られた発酵乳製品を、訓練されたパネルによって官能評価したところ、この発酵乳は、チョコレート、麦芽及び蜂蜜の風味を特徴とすることが明らかとなった。

Claims (26)

1. （ａ）乳原料を準備するステップと、
   （ｂ）少なくとも１種の微生物を用いて前記乳原料を発酵させ、酸性ｐＨを有する発酵乳原料を生成させるステップと、
   （ｃ）アンモニアを用いて前記発酵乳原料の前記ｐＨを上げ、前記アンモニアが前記発酵乳原料と反応して２，３，５，６−テトラメチルピラジンを生成することによって、風味を付けた乳製品を製造するステップと、
   を含む、風味を付けた乳製品の製造方法。
2. ステップ（ｃ）における前記アンモニアが、前記発酵乳原料にウレアーゼを添加することによって生成され、かつ／又はステップ（ｃ）が、アンモニア又はアンモニウム塩を前記発酵乳原料に添加するステップを含む、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ｃ）における前記ｐＨが約６〜約８．０に上げられる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ステップ（ｃ）が、前記発酵乳原料に熱処理を施すステップを更に含み、好ましくは、前記熱処理が、超高温（ＵＨＴ）処理、噴霧乾燥、ローラー乾燥、真空ベルト乾燥、連続乾燥又はバッチ乾燥、好ましくはＵＨＴ処理又は噴霧乾燥、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記少なくとも１種の微生物が、乳酸菌（ラクトバチルス目）、好ましくは、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属、レンサ球菌属、アエロコッカス属、カルノバクテリウム属、エンテロコッカス属、オエノコッカス属、スポロラクトバチルス属、テトラゲノコッカス属、バゴコッカス属、及びワイセラ属からなる群から選択される、より好ましくは、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、及びレンサ球菌属からなる群から選択される、最も好ましくは、ラクトバチルス属及びラクトコッカス属の群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記少なくとも１種の微生物が、ラクトコッカス属細菌、好ましくはラクトコッカス・ラクティス、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、最も好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクティスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記乳酸菌が、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに以下の受託番号、すなわち、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５、好ましくはＣＮＣＭ Ｉ−１９６２、ＣＮＣＭ Ｉ−４４０４及びＣＮＣＭ Ｉ−４４０５で寄託されている細菌から選択される、請求項５又は６に記載の方法。
8. 前記２，３，５，６−テトラメチルピラジンが、少なくとも約１百万分率（ｐｐｍ）、好ましくは少なくとも約５ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０ｐｐｍ、最も好ましくは少なくとも約２５ｐｐｍ、特に少なくとも約５０ｐｐｍの濃度で存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. ステップ（ａ）における前記乳原料がアミノ酸補充乳原料である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. ステップ（ａ）における前記乳原料が、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンからなる群から選択される１種以上のアミノ酸を含むアミノ酸補充乳原料である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記アミノ酸補充乳原料が、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２で寄託されている細菌を用いて発酵される、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記風味を付けた乳製品が、５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールを、好ましくは、１ｐｐｍ超、約１〜１０００ｐｐｍ、約５〜５００ｐｐｍ、約１０〜２００ｐｐｍ、約１０〜１００ｐｐｍ、約２０〜約１００ｐｐｍ又は約２０〜５０ｐｐｍの濃度で更に含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記アミノ酸補充乳原料が、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに以下の受託番号、すなわち、ＣＮＣＭ Ｉ−１９６２及びＣＮＣＭ Ｉ−２１１６で寄託されている細菌を共に又は順次用いて発酵される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記風味を付けた乳製品が、２−フェニルブテナールを、好ましくは、０．１ｐｐｍ超、約０．２〜１００ｐｐｍ、約０．５〜５０ｐｐｍ、約１〜５０ｐｐｍ、約１〜２０ｐｐｍ、又は約１０〜２０ｐｐｍの濃度で更に含む、請求項１３に記載の方法。
15. ステップ（ａ）における前記アミノ酸補充乳原料が、乳原料中の乳タンパク質の加水分解によって、好ましくは、少なくとも１種のプロテアーゼを乳原料に添加することによって、調製され、これによってアミノ酸補充乳原料をもたらす、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記少なくとも１種のプロテアーゼが、アスペルギルス・オリゼ、好ましくはＡ．オリゼ株ＡＴＣＣ ４２１４９／ＲＩＢ ４０（黄麹菌）由来である、請求項１５に記載の方法。
17. （ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって、風味を付けた乳製品を調製するステップと、
    （ｂ）前記風味を付けた乳製品を食品に添加し、食品製品を生成させるステップと、
    を含む、風味を付けた乳製品を含む食品製品の調製方法。
18. （ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって、風味を付けた乳製品を調製するステップと、
    （ｂ）前記風味を付けた乳製品を食品製品に添加するステップと、
    を含む、食品製品に風味を付けるための方法。
19. 前記乳製品がチョコレート風味を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. ２，３，５，６−テトラメチルピラジンを、少なくとも約１０百万分率（ｐｐｍ）、好ましくは少なくとも約２０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約３０ｐｐｍ、最も好ましくは少なくとも約４０ｐｐｍ、特に少なくとも約５０ｐｐｍの濃度で含む、風味を付けた乳製品。
21. ５−メチル−２−フェニル−２Ｚ−ヘキセナールを、好ましくは、約５ｐｐｍ超、約１〜１０００ｐｐｍ、約５〜５００ｐｐｍ、約１０〜２００ｐｐｍ、約１０〜１００ｐｐｍ、約２０〜約１００ｐｐｍ又は約２０〜５０ｐｐｍの量で更に含む、請求項２０に記載の風味を付けた乳製品。
22. 請求項２０又は２１に記載の風味を付けた乳製品を含む、食品製品。
23. ２，３，５，６−テトラメチルピラジンを含む、風味を付けた乳製品又は食品製品であって、前記風味を付けた乳製品が、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能である又は得られる、風味を付けた乳製品又は食品製品。
24. 前記風味を付けた乳製品がチョコレート風味を有し、更に、前記風味を付けた乳製品が、チョコレート、チョコレート製品、ココア又は添加されたチョコレート香味料を含まない、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の風味を付けた乳製品又は食品製品。
25. 好ましくは発酵乳製品中の２，３，５，６−テトラメチルピラジンの濃度を高めることによって、発酵乳製品の風味を高めるための、アンモニア又はアンモニウム塩の使用。
26. 好ましくは発酵乳製品中の２，３，５，６−テトラメチルピラジンの濃度を高めることによって、乳製品の風味を高めるための、ウレアーゼの使用。