JP2018537089A - 組換えｆｖｉｉｉ変異型をコードする血友病ａ遺伝子治療用高発現ウイルスベクター - Google Patents

Abstract

本開示は、特に、哺乳類細胞で発現させるための、第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳類の遺伝子治療用ベクター及び血友病Ａの治療方法も提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／２５５，３２３号に対する優先権を主張するものであり、その記載内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年１１月７日作成のかかるＡＳＣＩＩファイルの写しのファイル名は００８０７３＿５１１５＿ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズ１８３，３１１バイトである。

本開示の背景技術
血液凝固は、凝固カスケードと呼ばれる、複数の生化学反応が相互に依存する複雑かつ動的な生物学的経路を介して進行する。凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）はカスケードの主要成分である。第ＶＩＩＩ因子は出血部位に動員され、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）及び因子×（ＦＸ）とＸａｓｅ（テナーゼ）複合体を形成する。Ｘａｓｅ複合体はＦＸを活性化し、それによりプロトロンビンが活性化されてトロンビンとなり、次いで、凝固カスケードの他成分が活性化され安定な血餅を生成する（Ｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，９：１８５−１９２（１９９９）（非特許文献１）；Ｌｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３−３９９６（１９９８）（非特許文献２）に概説されている）。

血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子活性の欠乏を特徴とする先天性のＸ連鎖性出血性障害である。第ＶＩＩＩ因子活性の低下は、凝固カスケード内の正のフィードバックループを阻害する。これにより凝固が不完全となり、出血時間の延長、広範な出血斑、口と鼻の自然出血、関節硬直、及び慢性疼痛を伴う出血エピソードとして出現し、重度の場合は内出血及び貧血の可能性がある（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：１１４−１２４（２００９）（非特許文献３））。

従来より、血友病Ａは、血友病Ａに罹患した個人に対する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば、血漿由来または遺伝子組換えにより作製された第ＶＩＩＩ因子）の投与からなる第ＶＩＩＩ因子補充療法によって治療される。第ＶＩＩＩ因子は、出血エピソードの予防もしくは発症頻度を低減させるための予防的投与、急性出血エピソードに応じた投与、及び／または術中の出血管理のための周術期投与が行われる。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子補充療法の特徴には望ましくないものがいくつかある。

第１に、第ＶＩＩＩ因子補充療法は血友病Ａの治療または管理に使用されるが、基礎にある第ＶＩＩＩ因子の欠乏は治癒しない。このため、血友病Ａに罹患した個人は、生涯を通じて第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けなければならない。継続的な治療は高価である上、予防投与量を数回投与しないだけで、重症の血友病Ａに罹患する個人に重篤な結果をもたらし得るため、罹患者は厳しいコンプライアンスを維持しなければならない。

第２に、第ＶＩＩＩ因子は生体内での半減期が比較的短いため、従来の予防的第ＶＩＩＩ因子補充療法では２日または３日ごとの投与を要する。これは、生涯を通じてコンプライアンスを維持する個人にとっては負担となる。第三世代の「長時間作用型」第ＶＩＩＩ因子薬により投与頻度が低減され得るが、これらの薬物を用いた予防的第ＶＩＩＩ因子補充療法でも毎月、毎週、またはより頻回の投与を永久的に行わなければならない。例えば、ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）［抗血友病因子（組換え型）、Ｆｃ融合タンパク質］を用いた予防治療では、３日〜５日ごとの投与を要する（ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）処方情報、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．（２０１５）（非特許文献４））。さらに、化学的に修飾した生物製剤（例えば、ＰＥＧ化ポリペプチド）の長期的効果は依然として十分に解明されていない。

第３に、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けた全個人の１５％〜３０％に抗第ＶＩＩＩ因子インヒビター抗体が産生され、この療法による効果が無効になってしまう。インヒビター抗体が産生される個人の血友病治療には第ＶＩＩＩ因子バイパス療法（例えば、血漿由来または遺伝子組換えにより作製されたプロトロンビン複合体濃縮物の投与）を使用することができる。しかし、第ＶＩＩＩ因子バイパス療法は第ＶＩＩＩ因子補充療法よりも効果が少なく（Ｍａｎｎｕｃｃｉ Ｐ．Ｍ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（７）：１３４９−５５（２００３）（非特許文献５））、心血管系合併症のリスクの増加を伴う場合がある（Ｌｕｕ ａｎｄ Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１０ Ｓｕｐｐｌ．２：１０−１６（２００４）（非特許文献６））。

体細胞遺伝子治療は、第ＶＩＩＩ因子活性の１回用量を個人に提供するのではなく、基礎にある第ＶＩＩＩ因子活性機能の低発現（例えば、ミスセンス変異またはナンセンス変異による）を治療すると思われることから、血友病Ａ治療にとって非常に有望である。こうした作用機序の相違から、第ＶＩＩＩ因子補充療法と比較すると、第ＶＩＩＩ因子遺伝子治療ベクターを１回投与することにより、第ＶＩＩＩ因子が数年間は個人に提供され、治療費用が削減されるとともに、患者の継続的コンプライアンスを不要にすることができる。

凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）遺伝子治療は、第ＩＸ因子活性の低下を特徴とする関連血液凝固状態である血友病Ｂに罹患した個人の治療に有効に使用されてきた（Ｍａｎｎｏ Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．，１２（３）：３４２−４７（２００６）（非特許文献７））。しかし、第ＶＩＩＩ因子遺伝子治療には固有の課題がいくつか示されている。例えば、完全長野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（２３５１アミノ酸；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ００４５１）は、完全長野生型第ＩＸ因子ポリペプチド（４６１アミノ酸；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７４０）よりも５倍大きい。したがって、野生型第ＶＩＩＩ因子のコード配列は７０５３塩基対となり、従来のＡＡＶ遺伝子治療ベクターにパッケージングするには大き過ぎる。さらに、第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失変異型（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）について報告されている組換え体発現は不良であった。そのため、いくつかのグループがＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ構成体のコドン使用頻度の改変を試みてはみたが、それほど成功してはいない。

Ｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，９：１８５−１９２（１９９９） Ｌｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３−３９９６（１９９８） Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：１１４−１２４（２００９） ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）処方情報、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．、（２０１５） Ｍａｎｎｕｃｃｉ Ｐ．Ｍ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（７）：１３４９−５５（２００３） Ｌｕｕ ａｎｄ Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１０ Ｓｕｐｐｌ．２：１０−１６（２００４） Ｍａｎｎｏ Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．，１２（３）：３４２−４７（２００６）

開示の概要
したがって、コード配列がより効率的に遺伝子治療ベクターにパッケージングされ、その遺伝子治療ベクターを介して送達される第ＶＩＩＩ因子変異型が必要とされている。また、第ＶＩＩＩ因子をより効率的に発現するコドン改変合成核酸も必要とされている。そのような第ＶＩＩＩ因子変異型及びコドン改変核酸により、第ＶＩＩＩ因子欠乏症（例えば、血友病Ａ）の改善された治療が可能になる。開示のコドン改変第ＶＩＩＩ因子変異型により、上記の欠乏症及び第ＶＩＩＩ因子欠乏症（例えば、血友病Ａ）治療に関連した他の問題が軽減または取り除かれる。

いくつかの実施形態によれば、本開示は、第ＶＩＩＩ因子の重鎖（例えば、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、またはＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ）及び軽鎖（ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、またはＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ）の開示コドン改変配列に対する配列同一性の高い第ＶＩＩＩ因子変異型をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、これらの核酸にはさらに、第ＶＩＩＩ因子の重鎖をコードする配列と軽鎖をコードする配列とに挟まれた天然型第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインに置き換わるリンカー配列（例えば、ｆｕｒｉｎ切断部位を含むリンカー配列）をコードする配列が含まれる。

一態様では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、軽鎖、重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第１のヌクレオチド配列によってコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第２のヌクレオチド配列によってコードされる。ポリペプチドリンカーは、ｆｕｒｉｎ切断部位を含む。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第３のヌクレオチド配列によってコードされる。

一態様では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、軽鎖、重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第１のヌクレオチド配列によってコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第２のヌクレオチド配列によってコードされる。ポリペプチドリンカーは、ｆｕｒｉｎ切断部位を含む。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＢＤＬＯ０１（配列番号５）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第３のヌクレオチド配列によってコードされる。

一態様では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、軽鎖、重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第１のヌクレオチド配列によってコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第２のヌクレオチド配列によってコードされる。ポリペプチドリンカーは、ｆｕｒｉｎ切断部位を含む。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＢＤＬＯ２３（配列番号７）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第３のヌクレオチド配列によってコードされる。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）、またはＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２））に対して少なくとも９６％の同一性を有し、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）、またはＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３））に対して少なくとも９６％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）、またはＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２））に対して少なくとも９７％の同一性を有し、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）、またはＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３））に対して少なくとも９７％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）、またはＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２））に対して少なくとも９８％の同一性を有し、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）、またはＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３））に対して少なくとも９８％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）、またはＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２））に対して少なくとも９９％の同一性を有し、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）、またはＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３））に対して少なくとも９９％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）、またはＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２））に対して少なくとも９９．５％の同一性を有し、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）、またはＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３））に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列は、それぞれの重鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）、またはＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２））に対して少なくとも９９．９％の同一性を有し、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列は、それぞれの軽鎖配列（例えば、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）、またはＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３））に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）であり、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列はＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）であり、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列はＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列はＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２）であり、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列はＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３）である。

一態様では、本開示は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、かかるポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

一態様では、本開示は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、かかるポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

一態様では、本開示は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、かかるポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）、またはＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０））に対して少なくとも９６％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）、またはＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０））に対して少なくとも９７％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）、またはＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０））に対して少なくとも９８％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）、またはＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０））に対して少なくとも９９％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）、またはＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０））に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）、またはＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０））に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

一態様では、本開示は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、かかるポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする。

一態様では、本開示は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、かかるポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする。

一態様では、本開示は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、かかるポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする。

一態様では、本開示は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、かかるポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする。

一態様では、本開示は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、かかるポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする。

一態様では、本開示は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、かかるポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）、またはＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９））に対して少なくとも９６％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）、またはＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９））に対して少なくとも９７％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）、またはＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９））に対して少なくとも９８％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）、またはＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９））に対して少なくとも９９％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）、またはＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９））に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、それぞれの完全長ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）、またはＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９））に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）である。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ、及びＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ、及びＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ、及びＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ、及びＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ、及びＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ、及びＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ、及びＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ、及びＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡからなる群から選択される。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、コードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、連続する２つのアミノ酸の間に位置するグリコシル化ポリペプチドを含む。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドには、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターエレメントも含まれる。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドには、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたエンハンサーエレメントも含まれる。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドには、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたポリアデニル化エレメントも含まれる。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、ポリヌクレオチドには、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたイントロンも含まれる。

上記ポリヌクレオチドの一実施形態では、イントロンは、プロモーターエレメントと、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始部位（例えば、最初にコードするＡＴＧ）との間に位置する。

別の態様では、本開示は、上記のようなポリヌクレオチドを含む哺乳類遺伝子治療ベクターを提供する。

上記哺乳類遺伝子治療ベクターの一実施形態では、哺乳類遺伝子治療ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

上記哺乳類遺伝子治療ベクターの一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ−８ベクターである。

別の態様では、本開示は、それを必要とする患者に対し上記のような哺乳類遺伝子治療ベクターを投与することを含む、血友病Ａを治療する方法を提供する。

別の態様では、本開示は、血友病Ａを治療するための上記のような哺乳類遺伝子治療ベクターを提供する。

別の態様では、本開示は、血友病Ａ治療用医薬を製造するための上記のような哺乳類遺伝子治療ベクターの使用を提供する。

野生型及びＲｅＦａｃｔｏ型のヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質構成体の概略図を示す。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１）を示す（完全長コード配列の「ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１）を示す（完全長コード配列の「ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態によるＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列によってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型アミノ酸配列（配列番号２）を示す（完全長アミノ酸配列の「ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型の重鎖をコードするＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列の部分（配列番号３）を示す（「ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型の軽鎖をコードするＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列の部分（配列番号４）を示す（「ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態によるＢドメイン置換リンカーの例示的コード配列（配列番号５〜７）を示す。ＢＤＬＯ０１（配列番号５）、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）、及びＢＤＬＯ２３（配列番号７）はそれぞれ、Ｂドメイン置換リンカーをコードするコドン改変ヌクレオチド配列ＣＳ０１、ＣＳ０４、及びＣＳ２３の各部分である。 いくつかの実施形態によるＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列が含まれたＡＡＶベクター配列（配列番号８）を示す（「ＣＳ０４−ＡＶ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態によるＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列が含まれたＡＡＶベクター配列（配列番号８）を示す（「ＣＳ０４−ＡＶ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態によるＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列が含まれたＡＡＶベクター配列（配列番号８）を示す（「ＣＳ０４−ＡＶ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０４Δ（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０４Δ（７４１〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号９）を示す（「ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０４Δ（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０４Δ（７４１〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号９）を示す（「ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態によるＣＳ０１Δ（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０１Δ（７４１〜１６４８））、ＣＳ０４Δ（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０４Δ（７４１〜１６４８））、及びＣＳ２３Δ（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ２３Δ（７４１〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列によってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型アミノ酸配列（配列番号１０）を示す（それぞれ、「ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ」、「ＣＳ０４−ＳＣ１−ＡＡ」、及び「ＣＳ２３−ＳＣ１−ＡＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０４Δ（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０４Δ（７５３〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す（「ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０４Δ（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０４Δ（７５３〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す（「ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態によるＣＳ０１Δ（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０１Δ（７５３〜１６４８））、ＣＳ０４Δ（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０４Δ（７５３〜１６４８））、及びＣＳ２３Δ（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ２３Δ（７５３〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列によってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型アミノ酸配列（配列番号１２）を示す（それぞれ、「ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ」、「ＣＳ０４−ＳＣ２−ＡＡ」、及び「ＣＳ２３−ＳＣ２−ＡＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０１コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す（「ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０１コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す（「ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０８コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す（「ＣＳ０８−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０８コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す（「ＣＳ０８−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ１０コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す（「ＣＳ１０−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ１０コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す（「ＣＳ１０−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ１１コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す（「ＣＳ１１−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ１１コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す（「ＣＳ１１−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態によるＣＳ４０野生型ＲｅＦａｃｔｏコード配列（配列番号１７）を示す（「ＣＳ４０−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態によるＣＳ４０野生型ＲｅＦａｃｔｏコード配列（配列番号１７）を示す（「ＣＳ４０−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＨ２５コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す（「ＣＨ２５−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＨ２５コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す（「ＣＨ２５−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列（配列番号１９）を示す（「ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ」）。 ベクター骨格ｐＣｈ−ＢＢ０１にＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ両制限部位を介してＲｅｆａｃｔｏ型合成ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのＤＮＡ配列を挿入することによって、ｐＣＳ４０、ｐＣＳ０１、ｐＣＳ０４、ｐＣＳ０８、ｐＣＳ１０、ｐＣＳ１１、及びｐＣｈ２５の各構成体をクローニングするスキームを示す。 アガロースゲル電気泳動によって分析した、ＡＡＶベクターのゲノム調製物の完全性を示す。レーン１はＤＮＡマーカー、レーン２はｖＣＳ４０、レーン３はｖＣＳ０１、レーン４はｖＣＳ０４である。ＡＡＶベクターはすべて同一サイズのゲノムを有し、約５ｋｂ移動する（右側矢印）。左側の目盛りは、ＤＮＡ断片の大きさをキロベース（ｋｂ）単位で示す。 ＰＡＧＥ及び銀染色によるＡＡＶベクター調製物のタンパク質分析を示す。レーン１はタンパク質マーカー（Ｍ）、レーン２はｖＣＳ４０、レーン３はｖＣＳ０１、及びレーン４はｖＣＳ０４である。いずれの構成体もＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる同一ＡＡＶ８カプシドを有している（右側矢印）。左側の目盛りは、タンパク質マーカーのサイズをキロダルトン（ｋＤａ）で示している。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ２３コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す（「ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ２３コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す（「ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態によるＣＳ２３コドン改変ヌクレオチド配列によってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型アミノ酸配列（配列番号２１）を示す（「ＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型の重鎖をコードするＣＳ２３コドン改変ヌクレオチド配列の部分（配列番号２２）を示す（「ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型の軽鎖をコードするＣＳ２３コドン改変ヌクレオチド配列の部分（配列番号２３）を示す（「ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型の重鎖をコードするＣＳ０１コドン改変ヌクレオチド配列の部分（配列番号２４）を示す（「ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型の軽鎖をコードするＣＳ０１コドン改変ヌクレオチド配列の部分（配列番号２５）を示す（「ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０１Δ（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０１Δ（７４１〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２６）を示す（「ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０１Δ（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０１Δ（７４１〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２６）を示す（「ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０１Δ（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０１Δ（７５３〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２７）を示す（「ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ０１Δ（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ０１Δ（７５３〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２７）を示す（「ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ２３Δ（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ２３Δ（７４１〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す（「ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ２３Δ（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ２３Δ（７４１〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す（「ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ２３Δ（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ２３Δ（７５３〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す（「ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ」）。 いくつかの実施形態による一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするＣＳ２３Δ（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＣＳ２３Δ（７５３〜１６４８））コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す（「ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ」）。

開示の詳細な説明
Ｉ．緒言
ＡＡＶを用いた遺伝子治療は血友病患者の治療にとって有望である。血友病Ｂの場合、最初の臨床データは期待できるものであり、約１０％のＦＩＸレベルを少なくとも数人の患者で１年以上維持することができる。しかし、血友病Ａの場合、ＡＡＶベクターによる治療的発現レベル５〜１０％を達成することはさまざまな理由により依然として困難である。第１に、第ＶＩＩＩ因子コード配列は従来のＡＡＶを用いたベクターには大き過ぎる。第２に、工学的操作によるＢドメイン欠失型または切断型の第ＶＩＩＩ因子構成体は、コドンが最適化されている場合でも生体内での発現が低いという問題がある。第３に、これらのＢドメイン欠失型または切断型の第ＶＩＩＩ因子変異型構成体は生体内での半減期が短く、低発現という影響をさらに悪化させる。第４に、たとえ発現した場合でも、ＦＶＩＩＩは第ＩＸ因子などの他の凝固因子のようには効率的に細胞から分泌されない。

さらに、これらの問題は、単純に遺伝子治療構成体を高用量にして投与することでは対処できない。現在の知識によると、ＡＡＶを用いた遺伝子治療ベクターのベクター用量を体重１ｋｇあたり２ｘ１０^１２ｖｇに増量しなければならない。そのような高用量ではＴ細胞の免疫応答が誘発されるため、形質導入細胞が破壊され、その結果、導入遺伝子の発現が低下するかまたは消失すらしてしまう。したがって、ＦＶＩＩＩ遺伝子治療を血友病Ａ患者の実行可能な治療選択肢にするため、ＦＶＩＩＩ発現を改善する戦略が求められている。

本開示は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子治療に関連するこれらの問題及び他の問題を解決する、コドン改変第ＶＩＩＩ因子変異型コード配列の発見に関する。例えば、本明細書に開示するポリヌクレオチドは、哺乳類細胞における発現を顕著に改善し、安定化されたパッキング相互作用による改善されたビリオンパッケージングを表す。いくつかの実施態様では、これらの利点を、コドン改変型構成体ＣＳ０１、ＣＳ０４、及びＣＳ２３に対する配列同一性の高い（例えば、重鎖コード配列ＣＳ０１−ＨＣ、ＣＳ０４−ＨＣ、及びＣＳ２３−ＨＣの１つに対する配列同一性が高く、軽鎖コード配列ＣＳ０１−ＬＣ、ＣＳ０４−ＬＣ、及びＣＳ２３−ＬＣの１つに対する配列同一性が高い）第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖のコード配列の使用によって実現する。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載するポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子分子は、野生型Ｂドメインの切断、欠失、または置換によって短縮されている。したがって、かかるポリヌクレオチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子のような大きいポリペプチドの発現効率が悪い従来の遺伝子治療ベクターを介した第ＶＩＩＩ因子の発現にさらに適している。

有利なことに、コドン改変第ＶＩＩＩ因子変異型コード配列であるＣＳ０１、ＣＳ０４、及びＣＳ２３は、生体内におけるＢドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子構成体の優れた発現を提供することが本明細書で示されている。例えば、第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスにおいて、コード配列ＣＳ０１（配列番号１３）、ＣＳ０４（配列番号１）、及びＣＳ２３（配列番号２０）を有するＡＡＶを用いた遺伝子治療ベクターを静脈内投与すると、第ＶＩＩＩ因子の発現が野生型ポリヌクレオチド配列（配列番号１７）でコードされる対応するＣＳ４０構成体と比較して、１８倍、７４倍、及び３０倍高まることが実施例２及び表４で実証されている（表４）。

さらに、コドン改変第ＶＩＩＩ因子変異型コード配列ＣＳ０１及びＣＳ０４は、優れたビリオンパッケージング及びウイルス産生を提供することも本明細書で示されている。例えば、同量の細胞ペレットから単離した場合、構成体ＣＳ０１及びＣＳ０４を含有するＡＡＶベクター構成体は、野生型ポリヌクレオチド配列でコードされる対応するＣＳ４０構成体と比較して、ウイルス収量が５〜７倍大きいことが実施例１で実証されている。

ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は、他に明記しない限り、それらに与えられている意味を有する。

本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」という用語は、同じ意味で使用され、第ＶＩＩＩ因子活性のある任意のタンパク質（例えば、しばしばＦＶＩＩＩａと呼ばれる活性ＦＶＩＩＩ）または第ＶＩＩＩ因子活性、特に第ＩＸａ因子補因子活性のあるタンパク質のタンパク質前駆体（例えば、プロタンパク質またはプレプロタンパク質）を指す。例示的な一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖及び軽鎖に対する配列同一性の高い（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上）配列を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのサイズを短縮するため、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインは欠失している、切断されている、またはリンカーポリペプチドと置換されている。例示的な一実施形態では、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡのアミノ酸２０〜１４５７は第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを構成する。

野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの非限定的な例には、ヒトプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５２４８５、ＣＡＡ２５６１９、ＡＡＡ５８４６６、ＡＡＡ５２４８４、ＡＡＡ５２４２０、ＡＡＶ８５９６４、ＢＡＦ８２６３６、ＢＡＧ３６４５２、ＣＡＩ４１６６０、ＣＡＩ４１６６６、ＣＡＩ４１６７２、ＣＡＩ４３２４１、ＣＡＯ０３４０４、ＥＡＷ７２６４５、ＡＡＨ２２５１３、ＡＡＨ６４３８０、ＡＡＨ９８３８９、ＡＡＩ１１９６８、ＡＡＩ１１９７０、またはＡＡＢ６１２６１）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びその自然変異型；ブタのプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｆ１ＲＺ３６またはＫ７ＧＳＺ５）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びその自然変異型；マウスプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３７３８５、ＣＡＭ１５５８１、ＣＡＭ２６４９２、またはＥＤＬ２９２２９）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びその自然変異型；ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＱ２１５８０）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びその自然変異型；ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子；及び他の哺乳類の第ＶＩＩＩ因子ホモログ（例えば、サル、類人猿、ハムスター、モルモットなど）が挙げられる。

本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、第ＩＸ因子補因子活性のある自然変異型及び人工構成体が含まれる。本開示で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子には、ある程度の第ＩＸ因子補因子基礎活性（例えば、対応する野生型活性の少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれ以上）を保持している任意の自然変異型、代替配列、アイソフォーム、または変異タンパク質が包含される。ヒト集団に見られる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸変異（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ（配列番号１９）に関連して）の例には、限定することなく、Ｓ１９Ｒ、Ｒ２２Ｔ、Ｙ２４Ｃ、Ｙ２５Ｃ、Ｌ２６Ｐ／Ｒ、Ｅ３０Ｖ、Ｗ３３Ｇ、Ｙ３５Ｃ／Ｈ、Ｇ４１Ｃ、Ｒ４８Ｃ／Ｋ、Ｋ６７Ｅ／Ｎ、Ｌ６９Ｐ、Ｅ７２Ｋ、Ｄ７５Ｅ／Ｖ／Ｙ、Ｐ８３Ｒ、Ｇ８９Ｄ／Ｖ、Ｇ９２Ａ／Ｖ、Ａ９７Ｐ、Ｅ９８Ｋ、Ｖ９９Ｄ、Ｄ１０１Ｇ／Ｈ／Ｖ、Ｖ１０４Ｄ、Ｋ１０８Ｔ、Ｍ１１０Ｖ、Ａ１１１Ｔ／Ｖ、Ｈ１１３Ｒ／Ｙ、Ｌ１１７Ｆ／Ｒ、Ｇ１２１Ｓ、Ｅ１２９Ｖ、Ｇ１３０Ｒ、Ｅ１３２Ｄ、Ｙ１３３Ｃ、Ｄ１３５Ｇ／Ｙ、Ｔ１３７Ａ／Ｉ、Ｓ１３８Ｒ、Ｅ１４１Ｋ、Ｄ１４５Ｈ、Ｖ１４７Ｄ、Ｙ１５５Ｈ、Ｖ１５９Ａ、Ｎ１６３Ｋ、Ｇ１６４Ｄ／Ｖ、Ｐ１６５Ｓ、Ｃ１７２Ｗ、Ｓ１７６Ｐ、Ｓ１７９Ｐ、Ｖ１８１Ｅ／Ｍ、Ｋ１８５Ｔ、Ｄ１８６Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｓ１８９Ｌ、Ｌ１９１Ｆ、Ｇ１９３Ｒ、Ｌ１９５Ｐ、Ｃ１９８Ｇ、Ｓ２０２Ｎ／Ｒ、Ｆ２１４Ｖ、Ｌ２１７Ｈ、Ａ２１９Ｄ／Ｔ、Ｖ２２０Ｇ、Ｄ２２２Ｖ、Ｅ２２３Ｋ、Ｇ２２４Ｗ、Ｔ２５２Ｉ、Ｖ２５３Ｆ、Ｎ２５４Ｉ、Ｇ２５５Ｖ、Ｌ２６１Ｐ、Ｐ２６２Ｌ、Ｇ２６３Ｓ、Ｇ２６６Ｆ、Ｃ２６７Ｙ、Ｗ２７４Ｃ、Ｈ２７５Ｌ、Ｇ２７８Ｒ、Ｇ２８０Ｄ、Ｅ２８４Ｋ、Ｖ２８５Ｇ、Ｅ２９１Ｇ／Ｋ、Ｔ２９４Ｉ、Ｆ２９５Ｌ、Ｖ２９７Ａ、Ｎ２９９Ｉ、Ｒ３０１Ｃ／Ｈ／Ｌ、Ａ３０３Ｅ／Ｐ、Ｉ３０７Ｓ、Ｓ３０８Ｌ、Ｆ３１２Ｓ、Ｔ３１４Ａ／Ｉ、Ａ３１５Ｖ、Ｇ３２３Ｅ、Ｌ３２６Ｐ、Ｌ３２７Ｐ／Ｖ、Ｃ３２９Ｆ、Ｉ３３１Ｖ、Ｍ３３９Ｔ、Ｅ３４０Ｋ、Ｖ３４５Ａ／Ｌ、Ｃ３４８Ｒ／Ｓ／Ｙ、Ｙ３６５Ｃ、Ｒ３９１Ｃ／Ｈ／Ｐ、Ｓ３９２Ｌ／Ｐ、Ａ３９４Ｓ、Ｗ４０１Ｇ、Ｉ４０５Ｆ／Ｓ、Ｅ４０９Ｇ、Ｗ４１２Ｇ／Ｒ、Ｋ４２７Ｉ、Ｌ４３１Ｆ／Ｓ、Ｒ４３７Ｐ／Ｗ、Ｉ４３８Ｆ、Ｇ４３９Ｄ／Ｓ／Ｖ、Ｙ４４２Ｃ、Ｋ４４４Ｒ、Ｙ４５０Ｄ／Ｎ、Ｔ４５４Ｉ、Ｆ４５５Ｃ、Ｇ４６６Ｅ、Ｐ４７０Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｇ４７４Ｅ／Ｒ／Ｖ、Ｅ４７５Ｋ、Ｇ４７７Ｖ、Ｄ４７８Ｎ、Ｔ４７９Ｒ、Ｆ４８４Ｃ、Ａ４８８Ｇ、Ｒ４９０Ｇ、Ｙ４９２Ｃ／Ｈ、Ｙ４９２Ｈ、Ｉ４９４Ｔ、Ｐ４９６Ｒ、Ｇ４９８Ｒ、Ｒ５０３Ｈ、Ｇ５１３Ｓ／Ｖ、Ｉ５２２Ｙ、Ｋ５２９Ｅ、Ｗ５３２Ｇ、Ｐ５４０Ｔ、Ｔ５４１Ｓ、Ｄ５４４Ｎ、Ｒ５４６Ｗ、Ｒ５５０Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｓ５５３Ｐ、Ｓ５５４Ｃ／Ｇ、Ｖ５５６Ｄ、Ｒ５６０Ｔ、Ｄ５６１Ｇ／Ｈ／Ｙ、Ｉ５６７Ｔ、Ｐ５６９Ｒ、Ｓ５７７Ｆ、Ｖ５７８Ａ、Ｄ５７９Ａ／Ｈ、Ｎ５８３Ｓ、Ｑ５８４Ｈ／Ｋ／Ｒ、Ｉ５８５Ｒ／Ｔ、Ｍ５８６Ｖ、Ｄ５８８Ｇ／Ｙ、Ｌ５９４Ｑ、Ｓ５９６Ｐ、Ｎ６０１Ｄ／Ｋ、Ｒ６０２Ｇ、Ｓ６０３Ｉ／Ｒ、Ｗ６０４Ｃ、Ｙ６０５Ｈ／Ｓ、Ｎ６０９Ｉ、Ｒ６１２Ｃ、Ｎ６３１Ｋ／Ｓ、Ｍ６３３Ｉ、Ｓ６３５Ｎ、Ｎ６３７Ｄ／Ｉ／Ｓ、Ｙ６３９Ｃ、Ｌ６４４Ｖ、Ｌ６５０Ｆ、Ｖ６５３Ａ／Ｍ、Ｌ６５９Ｐ、Ａ６６３Ｖ、Ｑ６６４Ｐ、Ｆ６７７Ｌ、Ｍ６８１Ｉ、Ｖ６８２Ｆ、Ｙ６８３Ｃ／Ｎ、Ｔ６８６Ｒ、Ｆ６９８Ｌ、Ｍ６９９Ｔ／Ｖ、Ｍ７０１Ｉ、Ｇ７０５Ｖ、Ｇ７１０Ｗ、Ｎ７１３Ｉ、Ｒ７１７Ｌ／Ｗ、Ｇ７２０Ｄ／Ｓ、Ｍ７２１Ｉ／Ｌ、Ａ７２３Ｔ、Ｌ７２５Ｑ、Ｖ７２７Ｆ、Ｅ７３９Ｋ、Ｙ７４２Ｃ、Ｒ７９５Ｇ、Ｐ９４７Ｒ、Ｖ１０１２Ｌ、Ｅ１０５７Ｋ、Ｈ１０６６Ｙ、Ｄ１２６０Ｅ、Ｋ１２８９Ｑ、Ｑ１３３６Ｋ、Ｎ１４６０Ｋ、Ｌ１４８１Ｐ、Ａ１６１０Ｓ、Ｉ１６９８Ｔ、Ｙ１６９９Ｃ／Ｆ、Ｅ１７０１Ｋ、Ｑ１７０５Ｈ、Ｒ１７０８Ｃ／Ｈ、Ｔ１７１４Ｓ、Ｒ１７１５Ｇ、Ａ１７２０Ｖ、Ｅ１７２３Ｋ、Ｄ１７２７Ｖ、Ｙ１７２８Ｃ、Ｒ１７４０Ｇ、Ｋ１７５１Ｑ、Ｆ１７６２Ｌ、Ｒ１７６８Ｈ、Ｇ１７６９Ｒ、Ｌ１７７１Ｐ、Ｌ１７７５Ｆ／Ｖ、Ｌ１７７７Ｐ、Ｇ１７７９Ｅ／Ｒ、Ｐ１７８０Ｌ、Ｉ１７８２Ｒ、Ｄ１７８８Ｈ、Ｍ１７９１Ｔ、Ａ１７９８Ｐ、Ｓ１７９９Ｈ、Ｒ１８００Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｐ１８０１Ａ、Ｙ１８０２Ｃ、Ｓ１８０３Ｙ、Ｆ１８０４Ｓ、Ｌ１８０８Ｆ、Ｍ１８４２Ｉ、Ｐ１８４４Ｓ、Ｔ１８４５Ｐ、Ｅ１８４８Ｇ、Ａ１８５３Ｔ／Ｖ、Ｓ１８５８Ｃ、Ｋ１８６４Ｅ、Ｄ１８６５Ｎ／Ｙ、Ｈ１８６７Ｐ／Ｒ、Ｇ１８６９Ｄ／Ｖ、Ｇ１８７２Ｅ、Ｐ１８７３Ｒ、Ｌ１８７５Ｐ、Ｖ１８７６Ｌ、Ｃ１８７７Ｒ／Ｙ、Ｌ１８８２Ｐ、Ｒ１８８８Ｉ、Ｅ１８９４Ｇ、Ｉ１９０１Ｆ、Ｅ１９０４Ｄ／Ｋ、Ｓ１９０７Ｃ／Ｒ、Ｗ１９０８Ｌ、Ｙ１９０９Ｃ、Ａ１９３９Ｔ／Ｖ、Ｎ１９４１Ｄ／Ｓ、Ｇ１９４２Ａ、Ｍ１９４５Ｖ、Ｌ１９５１Ｆ、Ｒ１９６０Ｌ／Ｑ、Ｌ１９６３Ｐ、Ｓ１９６５Ｉ、Ｍ１９６６Ｉ／Ｖ、Ｇ１９６７Ｄ、Ｓ１９６８Ｒ、Ｎ１９７１Ｔ、Ｈ１９７３Ｌ、Ｇ１９７９Ｖ、Ｈ１９８０Ｐ／Ｙ、Ｆ１９８２Ｉ、Ｒ１９８５Ｑ、Ｌ１９９４Ｐ、Ｙ１９９８Ｃ、Ｇ２０００Ａ、Ｔ２００４Ｒ、Ｍ２００７Ｉ、Ｇ２０１３Ｒ、Ｗ２０１５Ｃ、Ｒ２０１６Ｐ／Ｗ、Ｅ２０１８Ｇ、Ｇ２０２２Ｄ、Ｇ２０２８Ｒ、Ｓ２０３０Ｎ、Ｖ２０３５Ａ、Ｙ２０３６Ｃ、Ｎ２０３８Ｓ、２０４０Ｙ、Ｇ２０４５Ｅ／Ｖ、Ｉ２０５１Ｓ、Ｉ２０５６Ｎ、Ａ２０５８Ｐ、Ｗ２０６５Ｒ、Ｐ２０６７Ｌ、Ａ２０７０Ｖ、Ｓ２０８２Ｎ、Ｓ２０８８Ｆ、Ｄ２０９３Ｇ／Ｙ、Ｈ２１０１Ｄ、Ｔ２１０５Ｎ、Ｑ２１０６Ｅ／Ｐ／Ｒ、Ｇ２１０７Ｓ、Ｒ２１０９Ｃ、Ｉ２１１７Ｆ／Ｓ、Ｑ２１１９Ｒ、Ｆ２１２０Ｃ／Ｌ、Ｙ２１２４Ｃ、Ｒ２１３５Ｐ、Ｓ２１３８Ｙ、Ｔ２１４１Ｎ、Ｍ２１４３Ｖ、Ｆ２１４５Ｃ、Ｎ２１４８Ｓ、Ｎ２１５７Ｄ、Ｐ２１６２Ｌ、Ｒ２１６９Ｃ／Ｈ、Ｐ２１７２Ｌ／Ｑ／Ｒ、Ｔ２１７３Ａ／Ｉ、Ｈ２１７４Ｄ、Ｒ２１７８Ｃ／Ｈ／Ｌ、Ｒ２１８２Ｃ／Ｈ／Ｐ、Ｍ２１８３Ｒ／Ｖ、Ｌ２１８５Ｓ／Ｗ、Ｓ２１９２Ｉ、Ｃ２１９３Ｇ、Ｐ２１９６Ｒ、Ｇ２１９８Ｖ、Ｅ２２００Ｄ、Ｉ２２０４Ｔ、Ｉ２２０９Ｎ、Ａ２２１１Ｐ、Ａ２２２０Ｐ、Ｐ２２２４Ｌ、Ｒ２２２８Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｌ２２２９Ｆ、Ｖ２２４２Ｍ、Ｗ２２４８Ｃ／Ｓ、Ｖ２２５１Ａ／Ｅ、Ｍ２２５７Ｖ、Ｔ２２６４Ａ、Ｑ２２６５Ｒ、Ｆ２２７９Ｃ／Ｉ、Ｉ２２８１Ｔ、Ｄ２２８６Ｇ、Ｗ２２９０Ｌ、Ｇ２３０４Ｖ、Ｄ２３０７Ａ、Ｐ２３１９Ｌ／Ｓ、Ｒ２３２３Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｒ２３２６Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｑ２３３０Ｐ、Ｗ２３３２Ｒ、Ｉ２３３６Ｆ、Ｒ２３３９Ｔ、Ｇ２３４４Ｃ／Ｄ／Ｓ、及びＣ２３４５Ｓ／Ｙが含まれる。第ＶＩＩＩ因子タンパク質には、翻訳後修飾が含まれているポリペプチドも含まれる。

一般に、第ＶＩＩＩ因子をコードするポリヌクレオチドは、不活性な一本鎖ポリペプチド（例えば、プレプロタンパク質）をコードし、これが翻訳後プロセシングを受けて活性第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩａ）を形成する。例えば、図１を参照にすると、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子プレプロタンパク質はまず切断されてコード済みシグナルペプチド（図示せず）を放出し、第１の一本鎖プロタンパク質（「ヒト野生型ＦＶＩＩＩ」として表示）を形成する。その後、プロタンパク質はＢドメインとＡ３ドメインの間で切断され、第ＶＩＩＩ因子の重鎖（例えば、Ａ１ドメイン及びＡ２ドメイン）とＢドメインが含まれている第１のポリペプチド、及び第ＶＩＩＩ因子の軽鎖（例えば、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、及びＣ３ドメインを含む）が含まれている第２のポリペプチドを形成する。第１のポリペプチドはさらに切断を受け、Ｂドメインが除去されるとともにＡ１ドメインとＡ２ドメインも分離され、この部分は成熟第ＶＩＩＩａ因子タンパク質では第ＶＩＩＩ因子の軽鎖との会合が維持されている。第ＶＩＩＩ因子の成熟プロセスの概説については、その記載内容があらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．，６（６）：４８８−５０１（２００５）を参照のこと。

ただし、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドである。第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドは、工学的に操作されて天然の切断部位が除去され、任意選択で、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインの除去、切断、または置換が行われる。したがって、それらは、切断（任意選択のシグナルペプチド及び／またはリーダーペプチドの切断以外の切断）により成熟状態ではなく、一本鎖として活性状態である。第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドの非限定的な例は、Ｚｏｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ，１３４（１）：１２５−３１（２０１４））及びＤｏｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３１２（１）：４９−５５（１９９５））に記載されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子の重鎖」または単に「重鎖」という用語は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ１ドメインとＡ２ドメインの集合体を指す。例示的な一実施形態では、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸２０〜７５９は第ＶＩＩＩ因子の重鎖を構成する。

本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子の軽鎖」または単に「軽鎖」という用語は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ３ドメインと、Ｃ１ドメインと、Ｃ２ドメインとの集合体を指す。例示的な一実施形態では、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸７７４〜１４５７は第ＶＩＩＩ因子の軽鎖を構成する。いくつかの実施形態では、生体内で成熟中に放出される酸性のａ３ペプチドは第ＶＩＩＩ因子の軽鎖から除外される。

一般に、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖を一本のポリペプチド鎖として、例えば、任意選択のＢドメインまたはＢドメイン置換リンカーと共に発現させる。ただし、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び第ＶＩＩＩ因子の軽鎖を別々のポリペプチド鎖として発現させ（例えば、共発現）、再構成して第ＶＩＩＩ因子タンパク質を（例えば、生体内または試験管内で）形成させる。

本明細書で使用する場合、「Ｂドメイン置換リンカー」及び「第ＶＩＩＩ因子リンカー」という用語は同じ意味で使用され、野生型第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（例えば、ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ（配列番号１９）のアミノ酸７６０〜１６６７）の切断型、または第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインを置換するよう工学的に操作されたペプチドを指す。本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子リンカーは、いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子変異型ポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子の重鎖Ｃ末端と第ＶＩＩＩ因子の軽鎖Ｎ末端の間に位置する。Ｂドメイン置換リンカーの非限定的な例は、米国特許第４，８６８，１１２号、第５，１１２，９５０号、第５，１７１，８４４号、第５，５４３，５０２号、第５，５９５，８８６号、第５，６１０，２７８号、第５，７８９，２０３号、第５，９７２，８８５号、第６，０４８，７２０号、第６，０６０，４４７号、第６，１１４，１４８号、第６，２２８，６２０号、第６，３１６，２２６号、第６，３４６，５１３号、第６，４５８，５６３号、第６，９２４，３６５号、第７，０４１，６３５号、及び第７，９４３，３７４号；米国特許出願公開第２０１３／０２４９６０号、第２０１５／００７１８８３号、及び第２０１５／０１５８９３０号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／０６４２７７及びＷＯ２０１４／１２７２１５に開示されており、それらの開示内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で特に明記しない限り、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸の番号付けは、図１８に配列番号１９として提示される完全長野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ）における対応アミノ酸を指す。したがって、本明細書に開示する第ＶＩＩＩ因子変異型タンパク質におけるアミノ酸置換に言及される場合、その記載アミノ酸番号は、完全長野生型第ＶＩＩＩ因子配列における類似（例えば、構造的または機能的に同等）アミノ酸及び／または相同（例えば、一次アミノ酸配列で進化的に保存された）アミノ酸を指す。例えば、アミノ酸置換Ｔ２１０５Ｎは、完全長野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ；配列番号１９）の位置２１０５におけるＴからＮへの置換、及びＣＳ０４（ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ；配列番号２）によってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型タンパク質の位置１２１１におけるＴからＮへの置換を指す。

本明細書に記載の場合、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸番号付けシステムは、第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチド（例えば、完全長野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列のアミノ酸１〜１９）が含まれているか否かによって異なる。シグナルペプチドが含まれている場合、番号付けは「シグナルペプチド含有」または「ＳＰＩ」とする。シグナルペプチドが含まれていない場合、番号付けは「シグナルペプチド除外」または「ＳＰＥ」とする。例えば、Ｆ３２８Ｓは、ＳＰＥ番号付けでＦ３０９Ｓとされる同一アミノ酸をＳＰＩ番号付けで表したものである。特に明記しない限り、すべてのアミノ酸の番号付けは、図１８に配列番号１９として提示される完全長野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ）における対応アミノ酸を指す。

本明細書に記載の場合、コドン改変型ポリヌクレオチドは、自然にコードされた第ＶＩＩＩ因子構成体（例えば、野生型ヒトコドンを使用して同一の第ＶＩＩＩ因子構成体をコードするポリヌクレオチド）で得られる第ＶＩＩＩ因子発現レベルと比較して、トランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の生体内での発現を増加させる（例えば、遺伝子治療ベクターの一部として投与した場合）。本明細書で使用する場合、「発現増加」という用語は、自然にコードされた第ＶＩＩＩ因子構成体を投与された動物のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子血中活性レベルと比較した場合に、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを投与された動物のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子血中活性レベルが上昇していることを指す。活性レベルは、当技術分野で公知の任意の第ＶＩＩＩ因子活性を使用して測定することができる。第ＶＩＩＩ因子活性を決定する例示的アッセイは、Ｔｅｃｈｎｏｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩＩアッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、オーストリア、ウィーン）である。

いくつかの実施形態では、発現増加とは、自然にコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子血中活性レベルと比較して、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血中トランスジェニック第ＶＩＩＩ因子活性が少なくとも２５％高いことを指す。いくつかの実施形態では、発現増加とは、自然にコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子血中活性レベルと比較して、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血中トランスジェニック第ＶＩＩＩ因子活性が少なくとも５０％高い、少なくとも７５％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも１５倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも２５倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、少なくとも１２５倍高い、少なくとも１５０倍高い、少なくとも１７５倍高い、少なくとも２００倍高い、少なくとも２２５倍高い、または少なくとも２５０倍高いことを指す。

本明細書に記載の場合、コドン改変型ポリヌクレオチドは、自然にコードされた第ＶＩＩＩ因子構成体（例えば、野生型ヒトコドンを使用して同一の第ＶＩＩＩ因子構成体をコードするポリヌクレオチド）で得られるベクター産生レベルと比較して、ベクター産生を増加させる。本明細書で使用する場合、「ウイルス産生増加」という用語は、自然にコードされた第ＶＩＩＩ因子構成体と共に植菌された細胞培養におけるベクター収量（例えば、培養液１リットルあたりの力価）と比較して、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン改変型ポリヌクレオチドと共に植菌された細胞培養におけるベクター収量が増加していることを指す。ベクター収量は、当技術分野で公知の任意のベクター力価アッセイを使用して測定することができる。ベクター収量（例えば、ＡＡＶベクターの収量）を決定する例示的アッセイは、ＡＡＶ２末端逆位反復配列を標的にするｑＰＣＲである（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐａｒｔ Ｂ ２３：１８−２８（２０１２））。

いくつかの実施形態では、ウイルス産生増加とは、同種の培養において、自然にコードされた第ＶＩＩＩ因子構成体の収量よりもコドン改変ベクター収量が少なくとも２５％大きいことを指す。いくつかの実施形態では、ベクター産生増加とは、同種の培養において、自然にコードされた第ＶＩＩＩ因子構成体の収量よりもコドン改変ベクター収量が少なくとも５０％大きい、少なくとも７５％大きい、少なくとも１００％大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも１５倍大きい、または少なくとも２０倍大きいことを指す。

本明細書で使用する場合、「血友病」という用語は、血液の凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）または凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）の低下により広く特徴付けられる一群の疾患状態を指す。血友病は、Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型の血友病、または３つの疾患型すべての複合型を指し得る。Ａ型血友病（血友病Ａ）は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性の低下または欠損によって生じ、血友病サブタイプのうち最も顕著なものである。Ｂ型血友病（血友病Ｂ）は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の凝固機能の欠損または低下から生じる。Ｃ型血友病（血友病Ｃ）は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）の凝固活性が欠損または低下した結果として生じる。血友病Ａ及びＢはＸ連鎖性疾患であるが、血友病Ｃは常染色体性疾患である。従来の血友病治療には、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ（Ｂｅｂｕｌｉｎ（登録商標）−ＶＨを含む）、及びＦＸＩなどの凝固因子、ならびにＦＥＩＢＡ−ＶＨ、デスモプレシンの予防的かつ必要に応じた（ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ）投与、及び血漿注入が含まれる。

本明細書で使用する場合、「ＦＶＩＩＩ遺伝子治療」という用語には、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸を患者に提供して血友病に伴う１つ以上の症状（例えば、臨床因子）の再発を緩和、軽減、または予防する任意の治療法が含まれる。かかる用語は、血友病個人の健康を維持または改善するための、第ＶＩＩＩ因子の任意の修飾形態（例えば、第ＶＩＩＩ因子変異型）を含めた第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸を含む、任意の化合物の投与、薬物、処置、またはレジメンを包含する。ＦＶＩＩＩ療法の期間、ＦＶＩＩＩ治療剤の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られた結果に基づいて、変更が可能であることを当業者は理解するであろう。

本明細書で使用する場合、「バイパス療法」という用語には、第ＶＩＩＩ因子ではない止血薬、化合物または凝固因子を患者に提供して血友病に伴う１つ以上の症状（例えば、臨床因子）の再発を緩和、軽減、または予防する任意の治療法が含まれる。第ＶＩＩＩ因子ではない化合物及び凝固因子には、第ＶＩＩＩ因子インヒビター迂回活性（ＦＥＩＢＡ）、組換え活性型第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮物、及び活性型プロトロンビン複合体濃縮物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。第ＶＩＩＩ因子ではないこれらの化合物及び凝固因子は組換えであっても血漿由来であってもよい。当業者は、バイパス療法の期間、バイパス療法の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られた結果に基づいて、変更が可能であることを理解するであろう。

本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸及び従来の血友病Ａ治療剤の投与が含まれる「併用療法」には、第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸と第ＶＩＩＩ因子分子の両方及び／または第ＶＩＩＩ因子ではない止血薬（例えば、バイパス治療剤）を患者に提供して血友病に伴う１つ以上の症状（例えば、臨床因子）の再発を緩和、軽減、または予防する任意の治療法が含まれる。かかる用語は、血友病個人の健康を維持または改善するために有用であり、本明細書に記載する治療剤のいずれかが含まれる第ＶＩＩＩ因子の任意の修飾形態を含めた第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸が含まれた、任意の化合物の投与、薬物、処置、またはレジメンを包含する。

「治療的に有効な量または用量」または「治療的に十分な量または用量」または「有効または十分な量または用量」という用語は、被投与体に対し治療効果を生み出す用量を指す。例えば、血友病治療に有用な薬物の治療的有効量は、血友病に伴う１つ以上の症状を予防または軽減できる量であり得る。正確な用量は、治療目的に応じて異なることになり、公知の技術を使用して当業者により確認可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照のこと）。

本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖（例えば、コード領域）をコードするＤＮＡ分子のセグメントを指す。いくつかの実施形態では、遺伝子に、ポリペプチド鎖の生成に関与するコード領域の直前、直後、及び／または介在する領域を配置する（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、またはイントロンなどの調節エレメント）。

本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化配列、イントロン等のような細胞にコード配列を発現させるヌクレオチド配列を指す。

本明細書で使用する場合、「プロモーターエレメント」という用語は、コード配列の発現制御を助けるヌクレオチド配列を指す。一般に、プロモーターエレメントは、遺伝子の翻訳開始部位の５’末端に位置する。ただし、ある実施形態では、プロモーターエレメントは、イントロン配列内、またはコード配列の３’末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターに有用なプロモーターは、標的タンパク質の天然遺伝子由来である（例えば、第ＶＩＩＩ因子プロモーター）。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターに有用なプロモーターは、標的生物の特定の細胞または組織に特異的に発現する（例えば、肝臓特異的プロモーター）。さらに別の実施形態では、特徴が十分に明らかになっている複数あるプロモーターエレメントの１つを本明細書に記載の遺伝子治療ベクターにおいて使用する。特徴が十分に明らかになっているプロモーターエレメントの非限定的な例には、ＣＭＶ初期プロモーター、β−アクチンプロモーター、及びメチル化ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターであり、これは標的タンパク質の実質的に一定の発現を誘導する。他の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターであり、これは特定の刺激（例えば、特定の治療または薬剤への曝露）に応答して標的タンパク質の発現を誘導する。ＡＡＶ介在性遺伝子治療用プロモーターの設計の概説については、その記載内容があらゆる目的のために参照によりその全体が明示的に組み込まれるＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１１４３−５３（２０１１））を参照のこと。

本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞に核酸（例えば、第ＶＩＩＩ因子遺伝子治療構成体をコードするもの）を導入するために使用される任意の媒体を指す。いくつかの実施形態では、ベクターにはレプリコンが含まれ、これは、標的核酸と共に媒体を複製する機能がある。遺伝子治療に有用なベクターの非限定的な例には、プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、及びウイルスが挙げられ、これらは生体内において自律的複製単位として機能する。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的核酸（例えば、第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするコドン改変型ポリヌクレオチド）を導入するためのウイルス媒体である。遺伝子治療に有用な真核生物の改変型ウイルスが多数、当技術分野で公知である。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はヒトの遺伝子治療での使用に特に好適であり、理由として、ヒトはウイルスの自然宿主であること、このウイルスの野生型が寄与する疾患は知られていないこと、及びこのウイルスは穏やかな免疫応答を引き起こすことが挙げられる。

本明細書で使用する場合、「ＣｐＧアイランド」という用語は、ＣｐＧジヌクレオチドの密度が統計的に高いポリヌクレオチド内領域を指す。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド（例えば、コドン改変第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の領域がＣｐＧアイランドであるのは、２００塩基対枠にわたり、（ｉ）領域のＧＣ含量が５０％より大きく、（ｉｉ）下記関係式で定義される実測ＣｐＧジヌクレオチドと予測ＣｐＧジヌクレオチドの比が少なくとも０．６である場合である。

ＣｐＧアイランドの同定方法に関するさらなる情報については、その記載内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれるＧａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９６（２）：２６１−８２（１９８７）を参照のこと。

本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそのポリマーの一本鎖または二本鎖形態のもの、及びその相補鎖を指す。かかる用語は、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または骨格結合を含有する合成、天然に生じる、及び天然には生じない核酸であって、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例には、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホルアミダート、メチルホスホナート、キラル−メチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。

「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸及び非天然アミノ酸を指し、それらには、天然に生じるアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物が含まれる。天然に生じるアミノ酸には、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後に修飾を受けるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ｙ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンが含まれる。天然に生じるアミノ酸には、例えば、Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸が含まれ得る。本明細書で使用するアミノ酸には、非天然アミノ酸も含まれ得る。アミノ酸類似体とは、天然に生じるアミノ酸と同一の基本化学構造を有する化合物、すなわち、任意の炭素が水素、カルボキシル基、アミノ基、Ｒ基に結合しているもの、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、またはメチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有しているが、天然に生じるアミノ酸と同一の基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に生じるアミノ酸と同様の方法で機能する化学物質を指す。アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字表記またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する１文字表記によって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらに対して一般に認められている１文字コードで言及され得る。

アミノ酸配列に関し、コードされた配列中の単一アミノ酸もしくはごく一部のアミノ酸を改変する、付加する、または欠失させる核酸もしくはペプチドの配列に対する個々の置換、欠失または付加は、かかる改変によってあるアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換される「保存的に修飾された変異型」であることを当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸が記載された保存的置換表は当技術分野において周知である。そのような保存的に修飾された変異型は、本開示の多形変異型、種間のホモログ、及び対立遺伝子に対する追加であって、これらを除外するものではない。

機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換は当技術分野において周知である。特定のアミノ酸、例えば、触媒アミノ酸、構造アミノ酸、または立体的に重要なアミノ酸の機能性に応じて、異なる分類のアミノ酸を互いに保存的な置換とみなしてよい。表１に、アミノ酸の電荷と極性、アミノ酸の疎水性、アミノ酸の表面露出／構造上の性質、及びアミノ酸の二次構造の傾向に基づいて保存的置換とされるアミノ酸分類を記載する。

（表１）タンパク質の残基の機能性に基づく保存的アミノ酸置換の分類

核酸またはペプチドの２つ以上の配列において「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、例えばＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０の配列比較アルゴリズムを以下に記載のデフォルトのパラメータで使用して測定するか、または手作業でアラインメントし目視確認した場合に、２つ以上の配列またはサブ配列が同一であるか、または同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを明示された割合で有している（すなわち、比較枠または指定領域にわたり最大一致度について比較及びアラインメントを行った場合に、明示された領域にわたり、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性がある）ことを指す。

当技術分野で公知のように、タンパク質（または以下に考察する核酸）が既知配列に対して配列同一性または配列類似性を有するか否かを確認するために数あるさまざまなプログラムを使用してよい。配列の同一性及び／または類似性は、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して決定され、それらには、好ましくはデフォルト設定値を使用した、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズムによるもの、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によるもの、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州、マディソン、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ）同梱ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によるもの、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５（１９８４）に記載のＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、または検査確認による方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、同一性パーセントは、ミスマッチペナルティ（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｐｅｎａｌｔｙ）１；ギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）１；ギャップサイズペナルティ（ｇａｐ ｓｉｚｅ ｐｅｎａｌｔｙ）０．３３；及び結合ペナルティ（ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）３０、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，というパラメータに基づくＦａｓｔＤＢによって計算され、そのいずれも参照により組み込まれる。

有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰでは、プログレッシブ・アラインメント、ペアワイズアラインメントを使用して一群の関連配列から多重配列アラインメントを作成する。アラインメント作成に使用されたクラスタリング関係を示す木のプロットも行われ得る。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）のプログレッシブ・アラインメント法を簡便化したものを使用しており、かかる方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）によって記載された方法と類似しており、いずれも参照により組み込まれる。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとして、デフォルトのギャップ重み（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）３．００、デフォルトのギャップ長重み（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）０．１０、及び加重末端ギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐｓ）が挙げられる。

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、いずれも参照により組み込まれる。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ］から入手したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用するが、そのほとんどはデフォルト値に設定されている。調整可能パラメータは以下の値に設定される：オーバーラップスパン（ｏｖｅｒｌａｐ ｓｐａｎ）＝１、オーバーラップフラクション（ｏｖｅｒｌａｐ ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝０．１２５、文字列閾値（ｗｏｒｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳとＨＳＰ Ｓ２のパラメータは、動的な値であり、特定配列の組成、及び関心対象配列の検索を行う特定データベースの組成に応じてプログラム自身により確定されるが、感度が増すよう各値を調整してよい。

さらなる有用アルゴリズムは、参照により組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２により報告されているギャップドＢＬＡＳＴ（ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）である。ギャップドＢＬＡＳＴ（ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）は、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用し、閾値のＴパラメータは９に設定され、２ヒット法（ｔｗｏ−ｈｉｔ ｍｅｔｈｏｄ）でギャップなしの伸長（ｕｎｇａｐｐｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を発生させ、ギャップ長ｋをコスト１０＋ｋにかけ、Ｘｕを１６に設定し、Ｘｇはデータベース検索段階では４０に、またアルゴリズムの出力段階では６７に設定する。ギャップドアラインメントは、約２２ビットに相当するスコアにより発生させる。

アミノ酸配列同一性の％値は、一致する同一残基数をアラインメントを行った領域中の「より長い」配列の残基総数で除算することによって求められる。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中、実在残基を最も多く有する配列である（アラインメントスコアを最大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２で導入したギャップは無視する）。同様の方法で、同定されたポリペプチドのコード配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、候補配列中の、細胞周期タンパク質のコード配列のヌクレオチド残基と同一なヌクレオチド残基の割合として定義される。好ましい方法では、オーバーラップスパン（ｏｖｅｒｌａｐ ｓｐａｎ）及びオーバーラップフラクション（ｏｖｅｒｌａｐ ｆｒａｃｔｉｏｎ）がそれぞれ１及び０．１２５であるデフォルトのパラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。

アラインメントには、アラインメント対象配列へのギャップ導入を含めてよい。さらに、図２（配列番号１）の配列によってコードされるタンパク質よりも多いまたは少ないアミノ酸を含有する配列の場合、一実施形態では、配列同一性の割合は、アミノ酸またはヌクレオチドの総数に対する同一なアミノ酸またはヌクレオチドの数に基づいて決定されることになると理解される。したがって、例えば、以下に考察するように、図２（配列番号１）に示す配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施形態では、かかる短い配列中のヌクレオチド数を使用して決定されることになる。同一性パーセントの計算では、挿入、欠失、置換等といった配列変異のさまざまな発現に相対的重みを割り付けない。

一実施形態では、同一性のみ正のスコア（＋１）とし、ギャップを含む配列変異のすべての形態に値「０」を割り付け、これにより、配列類似性計算に以下に記載のような重みを付けたスケールまたはパラメータが不要になる。配列同一性パーセントは、例えば、一致同一残基数をアラインメントを行った領域中の「短い」配列の総残基数で除算したものに１００を乗算して計算してよい。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中、実在残基を最も多く有する配列である。

「対立遺伝子多型」という用語は、特定の遺伝子座における遺伝子の多型形態、ならびに遺伝子のｍＲＮＡ転写産物に由来するｃＤＮＡ、及びそれらによってコードされるポリペプチドを指す。「好ましい哺乳類コドン」という用語は、あるアミノ酸をコードするコドンセットのうち、哺乳類細胞に発現するタンパク質において使用頻度が最も高い、以下の一覧から選ばれるコドンセットのコドンサブセットを指す：Ｇｌｙ（ＧＧＣ、ＧＧＧ）；Ｇｌｕ（ＧＡＧ）；Ａｓｐ（ＧＡＣ）；Ｖａｌ（ＧＴＧ、ＧＴＣ）；Ａｌａ（ＧＣＣ、ＧＣＴ）；Ｓｅｒ（ＡＧＣ、ＴＣＣ）；Ｌｙｓ（ＡＡＧ）；Ａｓｎ（ＡＡＣ）；Ｍｅｔ（ＡＴＧ）；Ｉｌｅ（ＡＴＣ）；Ｔｈｒ（ＡＣＣ）；Ｔｒｐ（ＴＧＧ）；Ｃｙｓ（ＴＧＣ）；Ｔｙｒ（ＴＡＴ、ＴＡＣ）；Ｌｅｕ（ＣＴＧ）；Ｐｈｅ（ＴＴＣ）；Ａｒｇ（ＣＧＣ、ＡＧＧ、ＡＧＡ）；Ｇｌｎ（ＣＡＧ）；Ｈｉｓ（ＣＡＣ）；及びＰｒｏ（ＣＣＣ）。

本明細書で使用する場合、コドン改変という用語は、あるポリペプチド（例えば、第ＶＩＩＩ因子変異型タンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列であって、かかるポリペプチドをコードする野生型ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコドンが、そのポリヌクレオチド配列の特性が改善されるよう変更されているポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、改善された特性により、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写増強、ｍＲＮＡの安定性増大（例えば、ｍＲＮＡ半減期の改善）、ポリペプチドの翻訳増強、及び／またはベクター内のポリヌクレオチドのパッケージング増大が促進される。改善された特性を達成するために使用可能な改変の非限定的な例には、特定アミノ酸に対するコドンの使用及び／または分布の変更、全体及び／または局所のＧＣ含量の調節、ＡＴに富んだ配列の除去、反復配列エレメントの除去、全体及び／または局所のＣｐＧジヌクレオチド含量の調節、潜在的な調節エレメント（例えば、ＴＡＴＡボックス及びＣＣＡＡＴボックスエレメント）の除去、イントロン／エキソンのスプライス部位の除去、制御配列の改善（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の導入）、及び転写されたｍＲＮＡ内で二次構造（例えば、ステムループ）を形成することができる配列エレメントの除去が挙げられる。

本明細書の考察において、本開示の構成要素を指すさまざまな命名法がある。「ＣＳ−数字」（例えば、「ＣＳ０４」、「ＣＳ０１」、「ＣＳ２３」など）は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチド及び／またはそのコードされた、変異型を含めたポリペプチドを指す。例えば、ＣＳ０１−ＦＬは、ＣＳ０１ポリヌクレオチド配列によってコードされる完全長（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）のコドンが改変されたＣＳ０１ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列（本明細書では場合により、アミノ酸配列（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）については「ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ」、また核酸配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）については「ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ」と呼ぶ）を指す。同様に、「ＣＳ０１−ＬＣ」は、ＦＶＩＩＩポリペプチドの軽鎖をコードするコドン改変型核酸配列（「ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ」）、またはＣＳ０１ポリヌクレオチド配列によってコードされるＦＶＩＩＩ軽鎖のアミノ酸配列（本明細書では場合により、「ＣＳ０１−ＬＣ−ＡＡ」とも呼ばれる）を指す。同様に、ＣＳ０１−ＨＣ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＡＡ及びＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡは、ＦＶＩＩＩ重鎖について同一である。当業者には理解されるように、コドンのみが改変された（例えば、Ｒｅｆａｃｔｏと比較した場合に、さらなるアミノ酸置換を含んでいない）ＣＳ０１、ＣＳ０４、ＣＳ２３などの構成体の場合、アミノ酸配列はコドン最適化によって改変されないので、同一のアミノ酸配列となる。したがって、開示の配列構成体には、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＡＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＡＡ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＡＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＡＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＡＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＡＡ及びＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡが含まれるが、これらに限定されるものではない。

ＩＩＩ．コドン改変第ＶＩＩＩ因子変異型
いくつかの実施形態では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするコドン改変型ポリヌクレオチドを提供する。これらのコドン改変型ポリヌクレオチドは、ＡＡＶを用いた遺伝子治療構成体にして投与した場合、第ＶＩＩＩ因子の発現を顕著に改善する。また、コドン改変型ポリヌクレオチドは、従来の方法でコドンを最適化した構成体と比較して改善されたＡＡＶ−ビリオンパッケージングも示す。実施例２及び表４で実証されるように、出願人らは、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子の重鎖と軽鎖と、生体内で活性ＦＶＩＩＩａタンパク質の成熟を促進するｆｕｒｉｎ切断部位が含有される１４アミノ酸の短いＢドメイン置換リンカー（「ＳＱ」リンカー）とを有した、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする３つのコドン改変型ポリヌクレオチド（ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ、及びＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ）の発見により、上記利点を達成している。

一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドは、少なくとも、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードするＣＳ０１、ＣＳ０４、またはＣＳ２３内の配列（それぞれ、配列番号１３、１、及び２０）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。当技術分野で公知のように、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは生体内での活性に必要ではない。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドは第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインを完全に欠失している。いくつかの実施形態では、天然型第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインを、ｆｕｒｉｎ切断部位を含有する短いアミノ酸リンカー、例えば、ＣＳ０１、ＣＳ０４、またはＣＳ２３（それぞれ、配列番号２、２、及び２１）構成体のアミノ酸７６０〜７７３からなる「ＳＱ」リンカーで置換する。「ＳＱ」リンカーはＢＤＬＯ０４とも呼ぶ（アミノ酸配列は−ＡＡ、ヌクレオチド配列は−ＮＡとなる）。

一実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖はそれぞれ、ヒト第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖である。他の実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖は、別の哺乳類に由来する重鎖配列及び軽鎖配列（例えば、ブタの第ＶＩＩＩ因子）である。さらに別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖は、キメラの重鎖及び軽鎖である（例えば、ヒトと第２の哺乳類との組み合わせ配列）。さらに別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖は、別の哺乳類の重鎖及び軽鎖のヒト化型、例えば、ヒトに投与した場合に、得られるペプチドの免疫原性が低くなるよう選択位置でヒト残基が置換されている、別の哺乳類由来の重鎖配列及び軽鎖配列である。

ヒト遺伝子のＧＣ含量は、２５％未満から９０％超までばらつきが大きい。しかし、一般に、ＧＣ含量の高いヒト遺伝子は高レベルで発現する。例えば、Ｋｕｄｌａら（ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．，４（６）：８０（２００６））は、主に転写を高め、定常状態のｍＲＮＡ転写産物量を高めることによって、遺伝子のＧＣ含量を上げるとコードされたポリペプチドの発現が増加することを実証している。一般に、コドンが最適化された遺伝子構成体の所望ＧＣ含量は６０％以上である。しかしながら、野生型ＡＡＶゲノムはＧＣ含量が約５６％である。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドは、野生型ＡＡＶビリオンのＧＣ含量との一致度がより高いＣＧ含量（例えば、約５６％のＧＣ）を有し、これは、哺乳類細胞での発現用に従来の方法でコドンが最適化されたポリヌクレオチドの好ましいＣＧ含量（例えば、６０％以上のＧＣ）よりも低い。実施例１に概説されているように、ＧＣ含量が約５６％であるＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）は、同様にコドンを改変したＧＣ含量の高いコード配列と比較して、ビリオンパッケージングが改善されている。

したがって、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は６０％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５９％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５８％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５７％未満である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６％以下である。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５４％〜５９％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５５％〜５９％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６％〜５９％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５４％〜５８％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５５％〜５８％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６％〜５８％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５４％〜５７％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５５％〜５７％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６％〜５７％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５４％〜５６％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５５％〜５６％である。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６±０．５％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６±０．４％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６±０．３％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６±０．２％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６±０．１％である。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドの全体的ＧＣ含量は５６％である。

Ａ．第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン置換リンカー
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖の間の結合（例えば、野生型第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン）をさらに改変する。ＡＡＶパッケージング量の大きさは限られているため、Ｂドメインが欠失している、切断されている、及びまたはリンカーが置換された変異型にはＦＶＩＩＩ遺伝子治療構成体の効率改善が必要である。従来より最も使用されているＢドメイン置換リンカーはＳＱ ＦＶＩＩＩのリンカーであり、わずか１４アミノ酸のＢドメインをリンカー配列として保持している。ブタ第ＶＩＩＩ因子（「ＯＢＩ−１」、米国特許第６，４５８，５６３号に記載）の別の変異型はＣＨＯ細胞で良好に発現し、２４アミノ酸というわずかに長いリンカーを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子構成体には、ＳＱ型Ｂドメインリンカー配列が含まれる。他の実施形態では、本明細書に記載のコドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子構成体には、ＯＢＩ−１−型Ｂドメインリンカー配列が含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ；配列番号１９）のアミノ酸７６０〜７６２／１６５７〜１６６７を含む、ＳＱ型Ｂドメインリンカー

が含まれる（Ｓａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：９３（２００１））。いくつかの実施形態では、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ；配列番号１９）のアミノ酸７６０／１５８２〜１６６７を含む、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカー（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１７：１９９９（２００１））が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ；配列番号１９）のアミノ酸７６０〜７６９／１６５７〜１６６７を含む、伸長ＳＱ型Ｂドメインリンカーが含まれる（Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１６：３４９（２０１０））。いくつかの実施形態では、伸長ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、伸長ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、野生型ブタ第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン由来のアミノ酸

を含む、ブタＯＢＩ−１−型Ｂドメインリンカー（Ｔｏｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：５１７（２０１０））が含まれる。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ−１−型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ−１−型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ−ＦＬ−ＡＡ；配列番号１９）のアミノ酸７６０〜７７２／１６５５〜１６６７を含む、ヒトＯＢＩ−１−型Ｂドメインリンカーが含まれる。いくつかの実施形態では、ヒトＯＢＩ−１−型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＢＩ−１−型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、野生型ブタ第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン由来のアミノ酸

を含む、Ｏ８型Ｂドメインリンカー（Ｔｏｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：５１７（２０１０））が含まれる。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ−１−型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ−１−型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して２つのアミノ酸置換を有する。

第ＶＩＩＩ因子構成体からＢドメインを除去しても活性化酵素（例えば、ＦＶＩＩＩａ）の活性には影響を与えないようであり、恐らく活性化中にＢドメインが除去されたことが理由と思われる。しかし、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは、例えば、Ｎ−結合型またはＯ−結合型グリコシル化によって、翻訳後修飾を受ける残基をいくつか含有している。インシリコでの分析（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｒ．Ｇｕｐｔａ，Ｅ．Ｊｕｎｇ ａｎｄ Ｓ．Ｂｒｕｎａｋ， ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（２００４））を野生型第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインで行うと、これらの部位の少なくとも４つが生体内でグリコシル化されると予測される。Ｂドメイン内のこうした修飾は、生体内では、第ＶＩＩＩ因子の翻訳後調節及び／または半減期に寄与すると考えられている。

成熟第ＶＩＩＩａ因子タンパク質には第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインは存在しないが、前駆体の第ＶＩＩＩ因子分子のＢドメイン内のグリコシル化は、活性化に先立ちタンパク質の循環血中半減期を延長させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされた第ＶＩＩＩ因子構成体のポリペプチドリンカーには、生体内でのグリコシル化を可能にするために１つ以上のグリコシル化配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーには、少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列（例えば、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のグリコシル化コンセンサス配列）が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーには、少なくとも２つのグリコシル化コンセンサス配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーには、少なくとも３つのグリコシル化コンセンサス配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーには、少なくとも４つのグリコシル化コンセンサス配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーには、少なくとも５つのグリコシル化コンセンサス配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーには、少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のグリコシル化コンセンサス配列が含まれる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、Ｎ−結合型グリコシル化配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを少なくとも１つ含有し、その場合、ＸはＰ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、Ｎ−結合型グリコシル化配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを少なくとも２つ含有し、その場合、ＸはＰ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、Ｎ−結合型グリコシル化配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを少なくとも３つ含有し、その場合、ＸはＰ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、Ｎ−結合型グリコシル化配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを少なくとも４つ含有し、その場合、ＸはＰ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、Ｎ−結合型グリコシル化配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを少なくとも５つ含有し、その場合、ＸはＰ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、Ｎ−結合型グリコシル化配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上含有し、その場合、ＸはＰ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。

Ｂ．切断可能なリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子変異型をコードするコドン改変型ポリヌクレオチド
コドン改変型ポリヌクレオチドＣＳ０４
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、生体内で切断可能なリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子変異型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖、第ＶＩＩＩ因子の重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の重鎖をコードするＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）に対する配列同一性の高い、第１のヌクレオチド配列によってコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードするＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）に対する配列同一性の高い、第２のヌクレオチド配列によってコードされる。ポリペプチドリンカーには、生体内での成熟（例えば、生体内での発現後または前駆体ポリペプチドの投与後）を可能にするｆｕｒｉｎ切断部位が含まれる。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）と同一である。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子構成体のポリペプチドリンカーは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸７６０〜７７３に対応する１４アミノ酸リンカーをコードするＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対する配列同一性の高い、第３のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列はＢＤＬＯ０４（配列番号６）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ０４−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）と同一である。

コドン改変型ポリヌクレオチドＣＳ０１
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、生体内で切断可能なリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子変異型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖、第ＶＩＩＩ因子の重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の重鎖をコードするＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）に対する配列同一性の高い、第１のヌクレオチド配列によってコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードするＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）に対する配列同一性の高い、第２のヌクレオチド配列によってコードされる。ポリペプチドリンカーには、生体内での成熟（例えば、生体内での発現後または前駆体ポリペプチドの投与後）を可能にするｆｕｒｉｎ切断部位が含まれる。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）と同一である。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子構成体のポリペプチドリンカーは、ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸７６０〜７７３に対応する１４アミノ酸リンカーをコードするＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対する配列同一性の高い、第３のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列はＢＤＬＯ０４（配列番号６）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）と同一である。

コドン改変型ポリヌクレオチドＣＳ２３
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、生体内で切断可能なリンカーを有する第ＶＩＩＩ因子変異型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖、第ＶＩＩＩ因子の重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の重鎖をコードするＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２）に対する配列同一性の高い、第１のヌクレオチド配列によってコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードするＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３）に対する配列同一性の高い、第２のヌクレオチド配列によってコードされる。ポリペプチドリンカーには、生体内での成熟（例えば、生体内での発現後または前駆体ポリペプチドの投与後）を可能にするｆｕｒｉｎ切断部位が含まれる。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）と同一である。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子構成体のポリペプチドリンカーは、ＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２１）のアミノ酸７６０〜７７３に対応する１４アミノ酸リンカーをコードするＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対する配列同一性の高い、第３のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチド配列はＢＤＬＯ０４（配列番号６）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２１）に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２１）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２１）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２１）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２１）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２１）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ２３−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２１）と同一である。

Ｃ．第ＶＩＩＩ因子一本鎖タンパク質をコードするコドン改変型ポリヌクレオチド
ＢドメインのＣ末端に位置するｆｕｒｉｎ切断部位が除去されている第ＶＩＩＩ因子構成体は、第ＶＩＩＩ因子分子が正常に成熟できないにもかかわらず一本鎖ポリペプチドとしての活性を保持する（Ｌｅｙｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１））。同様に、弱いｆｕｒｉｎ部位（アミノ酸置換Ｒ１６６４Ｈを含有）を有するＢドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子構成体は、野生型ｆｕｒｉｎ切断部位を有する対応する第ＶＩＩＩ因子構成体よりも生物学的に活性である（Ｓｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３））。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、第ＶＩＩＩ因子変異型一本鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドには、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖、第ＶＩＩＩ因子の重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーが含まれる。ポリペプチドリンカーには、ｆｕｒｉｎ切断部位は含まれない。

コドン改変型一本鎖ポリヌクレオチドＣＳ０４
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、第ＶＩＩＩ因子変異型一本鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖、第ＶＩＩＩ因子の重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させる任意選択ポリペプチドリンカーが含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の重鎖をコードするＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）に対する配列同一性の高い、第１のヌクレオチド配列によってコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードするＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）に対する配列同一性の高い、第２のヌクレオチド配列によってコードされる。任意選択のポリペプチドリンカーには、ｆｕｒｉｎ切断部位は含まれない。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）に対し少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号３及び４）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０；ヒト第ＶＩＩＩΔ因子（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＨｓＦＶＩＩＩΔ（７４１〜１６４８）））に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ０４−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２；ヒト第ＶＩＩＩΔ因子（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＨｓＦＶＩＩＩΔ（７５３〜１６４８）））に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０４−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ０４−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）と同一である。

コドン改変型一本鎖ポリヌクレオチドＣＳ０１
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、第ＶＩＩＩ因子変異型一本鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖、第ＶＩＩＩ因子の重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させる任意選択ポリペプチドリンカーが含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の重鎖をコードするＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）に対する配列同一性の高い、第１のヌクレオチド配列によってコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードするＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）に対する配列同一性の高い、第２のヌクレオチド配列によってコードされる。任意選択のポリペプチドリンカーには、ｆｕｒｉｎ切断部位は含まれない。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）に対し少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２４及び２５）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０；ヒト第ＶＩＩＩΔ因子（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＨｓＦＶＩＩＩΔ（７４１〜１６４８）））に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２；ヒト第ＶＩＩＩΔ因子（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＨｓＦＶＩＩＩΔ（７５３〜１６４８）））に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）と同一である。

コドン改変型一本鎖ポリヌクレオチドＣＳ２３
一実施形態では、本明細書で提供するコドン改変型ポリヌクレオチドには、第ＶＩＩＩ因子変異型一本鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドには、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖、第ＶＩＩＩ因子の重鎖、及び重鎖のＣ末端を軽鎖のＮ末端に連結させる任意選択ポリペプチドリンカーが含まれる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の重鎖をコードするＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２）に対する配列同一性の高い、第１のヌクレオチド配列によってコードされる。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの軽鎖は、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）の一部であり第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードするＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３）に対する配列同一性の高い、第２のヌクレオチド配列によってコードされる。任意選択のポリペプチドリンカーには、ｆｕｒｉｎ切断部位は含まれない。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９７％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９８％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）に対し少なくとも９９．９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ及びＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２２及び２３）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ２３−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２８）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドは、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）に対する配列同一性の高いヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）に対して少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はＣＳ２３−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２９）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０；ヒト第ＶＩＩＩΔ因子（７６０〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＨｓＦＶＩＩＩΔ（７４１〜１６４８）））に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ２３−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）と同一である。

いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる一本鎖第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２；ヒト第ＶＩＩＩΔ因子（７７２〜１６６７）（ＳＰＩの場合；ＳＰＥではＨｓＦＶＩＩＩΔ（７５３〜１６４８）））に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コドン改変型ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子変異型は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対する配列同一性の高いアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＣＳ２３−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列はＣＳ２３−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）と同一である。

Ｄ．第ＶＩＩＩ因子発現ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変型ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込む。発現ベクターの非限定的な例には、ウイルスベクター（例えば、遺伝子治療に好適なベクター）、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、人工染色体等が含まれる。

ウイルスベクターの非限定的な例には、レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ならびにポリオウイルスが含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変型ポリヌクレオチドを遺伝子治療ベクターに組み込む。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターはレトロウイルス、具体的には複製欠損レトロウイルスである。複製欠損レトロウイルスの作製プロトコルは当技術分野で公知である。概説については、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）を参照のこと。

一実施形態では、遺伝子治療ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いた遺伝子治療ベクターである。ＡＡＶ系についてはこれまでに記載があり、当技術分野において一般に周知である（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０−１７（１９９４）；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９（１３）：６０９４−９８（１９９２）；Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２−３）：１４１−６４（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７−１２９（１９９２）；及びＡｓｏｋａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９−７０８（２０１２）。なお、これらは各々、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｒＡＡＶベクターの作製及び使用に関する詳細は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記載されており、各々、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ−８ベクターである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変型ポリヌクレオチドをレトロウイルス発現ベクターに組み込む。これらの系についてはこれまでに記載があり、当技術分野において一般に周知である（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９，１９８３；Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４−５１３，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８，１９８６）。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３−２６７，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５（９）：８７１−８７５，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７１（９）：６６４１−６６４９，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号及び第５，９９４，１３６号を参照のこと）。

細胞培養においてコドン改変ポリペプチドから第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現させるために多種多様なベクターを使用することができ、それらには真核生物及び原核生物の発現ベクターが含まれる。ある実施形態では、細胞培養で第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現に使用されるものにはプラスミドベクターが意図される。一般に、宿主との関連では、それらの宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコン及び制御配列を含有しているプラスミドベクターを使用する。ベクターは、複製部位、ならびに形質転換を行った細胞において表現型の選択を可能にできるマーキング配列を担持することができる。プラスミドには、１つ以上の制御配列、例えば、プロモーターに機能的に連結された、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変型ポリヌクレオチドが含まれるであろう。

原核生物発現用ベクターの非限定的な例には、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤ等のようなプラスミドが含まれ、その場合、原核生物発現ベクターで使用するプロモーターには、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ等が含まれる。真核生物発現用ベクターの例として、（ｉ）酵母での発現には、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１等のようなプロモーターを使用する、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなどのベクター；（ｉｉ）昆虫細胞での発現には、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈ等のようなプロモーターを使用する、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣ等のようなベクター、ならびに（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現には、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、及びβ−アクチンのようなプロモーターを使用する、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶ等のようなベクター、及び、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス等のようなウイルス系に由来するベクター、といったベクターが含まれる。

ＩＶ．実施例
実施例１−コドン改変第ＶＩＩＩ因子変異型発現配列の構築
血友病Ａの遺伝子治療に有効な第ＶＩＩＩ因子コード配列を作製するために、２つの障害を乗り越える必要があった。第１に、遺伝子治療用の従来の送達ベクター（例えば、ＡＡＶビリオン）ゲノムサイズには限界があるため、コードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを大幅に短縮する必要があった。第２に、（ｉ）送達ベクター内でのパッケージング相互作用の安定化、（ｉｉ）ｍＲＮＡ仲介の安定化、及び（ｉｉｉ）ｍＲＮＡの転写／翻訳の堅牢性改善を図るために、コード配列を改変する必要があった。

第１の目標を達成するため、出願人らは、本明細書で「ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱ」と呼ばれるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子変異型構成体から開始した。この構成体では、Ｂドメインは、「ＳＱ」配列と呼ぶ１４アミノ酸配列で置換されている。組換え型ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱは、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）の商品名で市販されており、血友病Ａの管理に有効であることが示されている。しかし、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖についてのヒト野生型核酸配列を含む、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱの野生型コード配列は、遺伝子治療ベクターでは発現効率が良くない。

野生型ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱの発現不良に対処するため、Ｆａｔｈ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，６：ｅ１７５９６（２０１１））に記載のコドン最適化アルゴリズムを、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ，１１７：７９８（２０１１））及びＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ，１２１，３３３５−３３４４（２０１３））に記載のように修正したものをＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱ配列に応用して、第１の中間コード配列ＣＳ０４ａを作製した。しかし、出願人らは、修正アルゴリズムを使用して作製したＣＳ０４ａ配列は、さらなる配列修正によって改善され得ることを認めた。したがって、出願人らは、ＣｐＧジヌクレオチドの再導入、アルギニンのＣＧＣコドンの再導入、ロイシンとセリンのコドン分布の変更、高度に保存されたコドン対の再導入、ならびに潜在的なＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックス、及びスプライス部位エレメントの除去を行う一方、ＣｐＧアイランド、及びＡＴに富む伸展部とＧＣに富む伸展部の局所的過剰提示を回避した。

第１に、修正アルゴリズムでは、ＣｐＧ−ジヌクレオチドを含有するコドン（例えば、アルギニンのコドン）は、ＣｐＧ−ジヌクレオチドではないコドンで体系的に置換され、かつ隣接コドンによって作製されたＣｐＧ−ジヌクレオチドが排除／回避される。こうした厳密なＣｐＧジヌクレオチド回避は通常、ＤＮＡワクチンを筋肉内注射した後のＴＬＲ誘導性免疫を防ぐために行われる。しかし、そのようにするとコドン最適化の可能性が制限される。例えば、修正アルゴリズムでは、アルギニンのコドンＣＧＸのセット全体の使用が除外される。これは、ヒト細胞で発現させる場合の遺伝子コーディングでは特に破壊的である。なぜなら、ＣＧＣは、高発現ヒト遺伝子においてアルギニンのコドンとして最も高い頻度で使用されるからである。その上、隣接コドンによるＣｐＧの作製が回避されることにより、最適化の可能性がさらに制限される（例えば、一緒に使用され得るコドン対の数が制限される）。

ＡＡＶを用いた肝臓指向性の遺伝子治療に関連して、ＴＬＲにより誘導される免疫が問題となることはないと予測されることから、中間コード配列ＣＳ０４ａ内に、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードする配列中に（例えば、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＳＱコード配列の３’末端に）選択的にＣｐＧを含むコドン、及びＣｐＧを作製する隣接コドンを再導入した。これにより、好ましいヒトコドン、特にアルギニンのコドンをより高頻度で使用できるようになった。ただし、ＣｐＧ部位を高頻度で有するコード配列の領域であるＣｐＧアイランドが生じないよう注意を払った。これは、転写開始部位の下流のＣｐＧドメインは高レベルの遺伝子発現を促進することを示唆するＫｒｉｎｎｅｒらの教示（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２（６）：３５５１−６４（２０１４））に反する。

第２に、修正アルゴリズムでは、ロイシンにはＣＴＧ、バリンにはＧＴＧ、及びグルタミンにはＣＡＧというように特定のコドンのみが適用される。しかし、これは、例えばＨａａｓら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６（３）：３１５−２４（１９９６））で提案されているようなバランスのとれたコドン使用の原則に背く。修正アルゴリズムによる好ましいコドンの過剰使用に対応するため、コドン改変に適用される他の規則（例えば、ＣｐＧ頻度及びＧＣ含量）で認められている場合にロイシンの代替コドンを再導入した。

第３に、修正アルゴリズムでは、特定の基準（例えば、ＣＧ−ジヌクレオチドの存在）が満たされていると、自然界における保存の程度に関係なくコドン対が置換される。進化によって保存されている可能性のある有益な特性を考慮するため、アルゴリズムによって置換された最も保存されているコドン対、及び最も保存されている好ましいコドン対、例えば、Ｔａｔｓら（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ９：４６３（２００８））の記載にあるようなコドン対を分析し、コドン改変に適用される他の規則（例えば、ＣｐＧ頻度及びＧＣ含量）で認められている場合は調整した。

第４に、中間コード配列に使用するセリンのコドンも工学的に再操作した。具体的には、全体的にヒトのコドン使用頻度により良く一致させるため（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．、前掲）、改変コード配列にセリンのコドンＡＧＣ、ＴＣＣ、及びＴＣＴを高頻度で導入した。

第５に、ＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックスの両エレメント、及びイントロン／エキソンのスプライス部位のスクリーニングを行い、改変コード配列から除去した。コード配列の改変に際し、ＡＴに富む伸展部またはＧＣに富む伸展部が局所的に過剰提示されないよう注意を払った。

最後に、コード配列内部のコドン使用頻度の最適化に加え、中間コード配列ＣＳ０４ａをさらに精製する場合に、基礎となるＡＡＶビリオンの構造上の要件を検討した。ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶビリオンの核酸部分）をそのカプシド内に一本鎖ＤＮＡ分子としてパッケージングする（概説については、Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．，２１（４）：５８３−９３（２００８）を参照のこと）。したがって、ベクターのＧＣ含量は、ゲノムのパッケージング、ひいては産生の間のベクター収量を左右する可能性がある。多くのアルゴリズム同様、ここで使用した修正アルゴリズムでは、ＧＣ含量が少なくとも６０％の最適化遺伝子配列が作製される（Ｆａｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６（３）：ｅ１７５９６（２０１１）（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，（６）３（２０１１）内の正誤表を参照のこと））。しかし、ＡＡＶ８カプシドタンパク質は、約５６％という低いＧＣ含量のヌクレオチド配列によってコードされる。したがって、野生型ＡＡＶ８カプシドタンパク質コード配列をより良く模倣するために、中間コード配列ＣＳ０４ａのＧＣ含量を５６％に下げた。

図２に示す得られたＣＳ０４コード配列は全体のＧＣ含量が５６％である。かかる配列のＣｐＧ−ジヌクレオチド含量は中等量である。ただし、ＣｐＧジヌクレオチドは、コード配列の下流部分、例えば、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードする部分。ＣＳ０４配列は、野生型第ＶＩＩＩ因子の対応するコード配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託Ｍ１４１１３）に対し、７９．７７％のヌクレオチド配列同一性を有する。

比較するため、コドンを最適化した他のＲｅＦａｃｔｏ構成体をいくつか調製した。ＣＳ０１は、ＣＳ０４について実施したように、Ｆａｔｈらのコドン最適化アルゴリズムをＷａｒｄらによる修正のように応用して構築した。ただし、ＣＳ０４とは異なり、ＣＳ０１構成体にはＣｐＧアイランドは含有されていない。その記載内容が本明細書であらゆる目的のために参照することによりその全体が本明細書に明示的に組み込まれるＲａｄｃｌｉｆｆ Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５：２８９−９７（２００８）に記載のように、ＲｅＦａｃｔｏ構成体ＣＳ０８のコドン最適化を行った。コドンが最適化されたＲｅＦａｃｔｏ構成体ＣＳ１０は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ドイツ、エーバースベルク）から入手した。コドンが最適化されたＲｅＦａｃｔｏ構成体ＣＳ１１は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国、コーラルビル）から入手した。コドンが最適化されたＲｅＦａｃｔｏ構成体ＣＨ２５は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ’ｓ ＧｅｎｅＡｒｔ ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ドイツ、レーゲンスブルク）から入手した。ＲｅＦａｃｔｏ構成体ＣＳ４０は、野生型第ＶＩＩＩ因子コード配列からなる。ＣＳ２３の構築に使用されたアルゴリズムは、コドン最適化用オンラインツール（Ｇｒｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｗ５２６−３１）であるＪＣＡＴツール（ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ）に基づいている。アルブミンスーパーファミリーのコドン使用頻度がより反映されるよう配列をさらに修正した（Ｍｉｒｓａｆｉａｎ ｅｔ ａｌ．２０１４：Ｓｃ．Ｗｏｒｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１４，ＩＤ ６３９６８２）。各ＲｅＦａｃｔｏコード配列間で共有される配列同一性を下記表２に示す。

（表２）コドン改変第ＶＩＩＩ因子構成体の同一性パーセント行列

同一のベクター骨格プラスミド（ｐＣｈ−ＢＢ０１）に異なる合成ＤＮＡ断片をクローニングすることによって各構成体のプラスミドを構築した。ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩの各酵素制限部位を隣接させたＲｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ断片のＤＮＡ合成がＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって行われた。ベクター骨格は２つの隣接するＡＡＶ２由来末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含有し、これらは、肝臓特異的マウストランスサイレチン遺伝子由来のプロモーター／エンハンサー配列、それぞれのＲｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを挿入するためのＡｓｃＩ及びＮｏｔＩの各酵素制限部位、ならびに合成ポリＡ部位を包含する。調製したベクター骨格のライゲーション及びＡｓｃＩとＮｏｔＩの両部位を介した挿入を行った後、得られるプラスミドをミリグラム規模で増幅させた。ダイレクト・シーケンシング（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、スイス、バルガッハ）によって構成体のＲｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ配列を検証した。クローニングにより、ｐＣＳ４０、ｐＣＳ０１、ｐＣＳ０４、ｐＣＳ０８、ｐＣＳ１０、ｐＣＳ１１、ｐＣｈ２５及びｐＣＳ２３（図１９）とした７つの異なるプラスミド構成体を得た。各構成体は、同一のベクター骨格を有し、かつ同一のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質（Ｒｅｆａｃｔｏ型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）をコードするが、そのＦＶＩＩＩコード配列において異なる。

ＡＡＶ８を用いたベクターを、その記載内容はあらゆる目的のために本明細書で参照することによりその全体が明示的に本明細書に組み込まれるＧｒｉｅｇｅｒ ＪＣ、 ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ＨＥＫ２９３ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｈａｒｖｅｓｔ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＧＭＰ ＦＩＸ ａｎｄ ＦＬＴ１ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｅｃｔｏｒ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，Ｏｃｔ ６．（２０１５） ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．１８７．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］）に記載のように、３プラスミドトランスフェクション法によって調製した。対応するＦＶＩＩＩベクタープラスミド、ヘルパープラスミドｐＸＸ６−８０（アデノウイルスヘルパー遺伝子を担持）、及びパッケージングプラスミドｐＧＳＫ２／８（ｒｅｐ２遺伝子とｃａｐ８遺伝子に寄与）を使用するプラスミドトランスフェクションにはＨＥＫ２９３懸濁液細胞を使用した。ＡＡＶ８構成体を単離するため、Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５、前掲）に記載のようにイオジキサノールグラジエントを使用して、１リットル培養細胞ペレットを処理した。かかる手順により、ｖＣＳ０１、ｖＣＳ０４、ｖＣＳ０８、ｖＣＳ１０、ｖＣＳ１１、及びｖＣＨ２５としたベクター調製物を得た。ＡＡＶ２末端逆位反復配列を標的にするユニバーサルｑＰＣＲ手順を使用するｑＰＣＲ（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐａｒｔ Ｂ ２３：１８−２８（２０１２））によってベクターを定量した。ＡＡＶ２末端逆位反復配列を担持する対照ベクタープラスミドは、標準曲線の作成に使用した。得られるｖＣＳ０４構成体は図７Ａ〜７Ｃに配列番号８として提示されている。

ＡＡＶアガロースゲル電気泳動によってベクターゲノムの完全性を分析した。Ｆａｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３：１−７（２０１２）に記載のように電気泳動を実施した。簡単に言えば、ＡＡＶベクター調製物を０．５％ＳＤＳ存在下、７５℃で１０分インキュベートし、その後、室温まで冷却した。１％ １ｘＴＡＥアガロースゲルのレーンあたり約１．５Ｅ１０ベクターゲノム（ｖｇ）を載せ、ゲル長７Ｖ／ｃｍで６０分電気泳動にかけた。その後、２倍希釈ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍカタログ番号４１００３）溶液中でゲルを染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ（Ｂｉｏｒａｄ）で撮像した。図２０に示す結果は、ウイルスベクターｖＣＳ０１、ｖＣＳ０４、及びｖＣＳ４０は、５ｋｂの範囲にはっきりとしたバンドが示され（図２０、レーン２〜４）、ゲノムサイズが同じであることを示している。ゲノムは、約５．２ｋｂというベクターサイズにもかかわらず均一なバンドになっており、やや大きいサイズのゲノム（ＡＡＶ野生型ゲノムの４．７ｋｂとの対比）が適切にパッケージングされていることを裏付けている。他のｖＣＳベクター調製物もすべて同じゲノムサイズを示す（データ図示せず）。

カプシドタンパク質について予測パターンを確認するため、ベクターｖＣＳ０１、ｖＣＳ０４、及びｖＣＳ４０を用いてＳＤＳ ＰＡＧＥを行った後、銀染色を実施した（図２１）。図に示すように、下流の精製処理を行ったところ、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３について予測したタンパク質パターンを示す高度に精製された材料が得られた（図２１、レーン２〜４）。同じパターンが他のウイルス調製物すべてに関しても認められた（図示せず）。ＡＡＶ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を標準手順に従って行った。各レーンにそれぞれのウイルス構成体を１Ｅ１０ｖｇ入れ、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ゲル上で製造者の指示書に従って分離を行った。ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（商標）キット（Ｎｏｖｅｘ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造者の指示書に従って銀染色を実施した。

驚くべきことに、ＡＡＶベクターｖＣＳ０１及びｖＣＳ０４は、野生型コード構成体ｖＣＳ４０及び他のコドン最適化構成体と比較して、ＡＡＶウイルス産生において高収量が測定され、ビリオンのパッケージングが高かった。表３に示すように、ベクターｖＣＳ０１及びｖＣＳ０４は、ｖＣＳ４０よりも実質的に優れた複製を示し、収量が５〜７倍高いＡＡＶ力価が得られた。

（表３）細胞ペレットから精製した、ＡＡＶベクター構成体ｖＣＳ０１、ｖＣＳ０４、及びｖＣＤ４０を用いて得た細胞培養１リットルあたりの収量

実施例２−コドン改変第ＶＩＩＩ因子変異型発現配列の生体内発現
コドン改変第ＶＩＩＩ因子変異型配列の生物学的力価を検討するため、実施例１に記載のＲｅＦａｃｔｏ型ＦＶＩＩＩ構成体を第ＶＩＩＩ因子欠損マウスに投与した。簡単に言えば、Ｃ５７Ｂｌ／６系ＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウス（１群あたり６〜８匹）において、マウス体重１キログラムあたり４Ｅ１２ベクターゲノム（ｖｇ）を尾静脈注射して評価を実施した。注射１４日後に後眼窩への穿刺により採血して血漿を調製し、標準的手順を使用して凍結した。１４日目の発現レベルを選択した理由は、これ以降の時期にこのマウスモデルの一部の動物に見られる阻害抗体の影響がこの時期には最小であることによる。Ｔｅｃｈｎｏｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩＩアッセイを使用してマウス血漿中のＦＶＩＩＩ活性を測定し、その際、修正は軽微にとどめ、製造者（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、オーストリア、ウィーン）の勧奨に従って実施した。アッセイでは、血漿試料を適切に希釈し、トロンビン、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、リン脂質、第Ｘ因子及びカルシウムを含有するアッセイ試薬と混合した。トロンビンによるＦＶＩＩＩ活性化に続き、ＦＩＸａ、リン脂質及びカルシウムの複合体が生成する。この複合体によりＦＸが活性化されて活性化ＦＸ（ＦＸａ）となり、それが発色基質のパラ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）を切断する。ｐＮＡ生成動態を４０５ｎｍで測定する。比率は試料中のＦＶＩＩＩ濃度と直接比例している。基準曲線からＦＶＩＩＩ濃度を読み取り、結果をＦＶＩＩＩ ＩＵ／ミリリットルで与える。

下記表４に提示の結果は、商用アルゴリズムを使用して設計されたコドン改変配列（ＣＳ１０、ＣＳ１１、及びＣＨ２５）では、野生型ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子構成体（ＣＳ４０）と比較した場合、ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子の増加はわずかにすぎなかった（３〜４倍）ことが示されている。同様に、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅらの記載にあるように調製したコドン改変ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子構成体（ＣＳ０８）では、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ発現の増加は３〜４倍にすぎなかった。この結果は、Ｒａｄｃｌｉｆｆらの報告にある結果と一致している。驚くべきことに、構成体ＣＳ０１、ＣＳ０４、及びＣＳ２３は、生体内の生物学的力価試験でのＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ発現がはるかに高かった（それぞれ、１８倍、７４倍、及び３０倍の増加）。

（表４）各種ＡＡＶベクター構成体により誘導されたＦＶＩＩＩノックアウトマウス血漿中ＦＶＩＩＩ発現

本明細書に記載する実施例及び実施形態はあくまでも例示を目的としたものであること、また、それに鑑みたさまざまな修正または変更が当業者に示唆され、かつ、それらは本出願の趣旨と範囲及び添付の請求項の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用したすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (49)

1. ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡに対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
2. 前記ヌクレオチド配列が、ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 前記ヌクレオチド配列がＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、軽鎖、重鎖、及び前記重鎖のＣ末端を前記軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーを含み、
   前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの前記重鎖は、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第１のヌクレオチド配列によってコードされ、
   前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの前記軽鎖は、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第２のヌクレオチド配列によってコードされ、かつ
   前記ポリペプチドリンカーは、ｆｕｒｉｎ切断部位を含む、前記ポリヌクレオチド。
5. 前記ポリペプチドリンカーが、ＢＤＬＯ０１（配列番号５）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第３のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記第１のヌクレオチド配列が、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）に対して少なくとも９９％の同一性を有し、かつ
   前記第２のヌクレオチド配列が、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記第１のヌクレオチド配列が、ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２４）であり、かつ
   前記第２のヌクレオチド配列が、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２５）である、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
8. ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
9. 前記ヌクレオチド配列が、ＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
10. 前記ヌクレオチド配列がＣＳ０４−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１）である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
11. 第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、軽鎖、重鎖、及び前記重鎖のＣ末端を前記軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーを含み、
    前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの前記重鎖は、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第１のヌクレオチド配列によってコードされ、
    前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの前記軽鎖は、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第２のヌクレオチド配列によってコードされ、かつ
    前記ポリペプチドリンカーは、ｆｕｒｉｎ切断部位を含む、前記ポリヌクレオチド。
12. 前記ポリペプチドリンカーが、ＢＤＬＯ０４（配列番号６）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第３のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
13. 前記第１のヌクレオチド配列が、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）に対して少なくとも９９％の同一性を有し、かつ
    前記第２のヌクレオチド配列が、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチド。
14. 前記第１のヌクレオチド配列が、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ（配列番号３）であり、かつ
    前記第２のヌクレオチド配列が、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ（配列番号４）である、請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチド。
15. ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
16. 前記ヌクレオチド配列が、ＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
17. 前記ヌクレオチド配列がＣＳ２３−ＦＬ−ＮＡ（配列番号２０）である、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
18. 第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、軽鎖、重鎖、及び前記重鎖のＣ末端を前記軽鎖のＮ末端に連結させるポリペプチドリンカーを含み、
    前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの前記重鎖は、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第１のヌクレオチド配列によってコードされ、
    前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの前記軽鎖は、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第２のヌクレオチド配列によってコードされ、かつ
    前記ポリペプチドリンカーは、ｆｕｒｉｎ切断部位を含む、前記ポリヌクレオチド。
19. 前記ポリペプチドリンカーが、ＢＤＬＯ２３（配列番号７）に対して少なくとも９５％の同一性を有する第３のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
20. 前記第１のヌクレオチド配列が、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２）に対して少なくとも９９％の同一性を有し、かつ
    前記第２のヌクレオチド配列が、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３）に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１８または１９に記載のポリヌクレオチド。
21. 前記第１のヌクレオチド配列が、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ（配列番号２２）であり、かつ
    前記第２のヌクレオチド配列が、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡ（配列番号２３）である、請求項１８または１９に記載のポリヌクレオチド。
22. ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
23. ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
24. ＣＳ０１−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号２６）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
25. ＣＳ０４−ＳＣ１−ＮＡ（配列番号９）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
26. ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする、請求項２４または２５に記載のポリヌクレオチド。
27. ＣＳ０１−ＳＣ１−ＡＡ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする、請求項２４または２５に記載のポリヌクレオチド。
28. ＣＳ０１−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号２７）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
29. ＣＳ０４−ＳＣ２−ＮＡ（配列番号１１）に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
30. ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）に対して少なくとも９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチド。
31. ＣＳ０１−ＳＣ２−ＡＡ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子一本鎖ポリペプチドをコードする、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチド。
32. ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド。
33. ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド。
34. ＣＳ０１−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０１−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ０４−ＬＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＨＣ−ＮＡ、ＣＳ２３−ＬＣ−ＮＡからなる群から選択される配列を含む、ポリヌクレオチド。
35. ＣＳ０１−ＦＬ−ＮＡ（配列番号１３）に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
36. ＣＳ０１−ＦＬ−ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
37. 前記コードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、連続する２つのアミノ酸の間に位置するグリコシル化ポリペプチドを含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
38. 前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターエレメントをさらに含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
39. 前記プロモーターエレメントが、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列の上流の肝臓特異的プロモーター配列である、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
40. 前記肝臓特異的プロモーター配列と、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列との間に位置するイントロン配列をさらに含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
41. 請求項１〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
42. 請求項１〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
43. 請求項１〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子に感染した、宿主細胞。
44. 哺乳類の宿主細胞内に請求項１〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを導入する段階を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を作製するための方法であって、前記ポリヌクレオチドは前記哺乳類宿主細胞における複製能力がある、前記方法。
45. 血友病Ａを治療するための方法であって、それを必要とする患者に対し、請求項４２に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与する段階を含む、前記方法。
46. 宿主細胞に形質導入するための方法であって、前記宿主細胞を請求項４２に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させる段階を含む、前記方法。
47. 血友病Ａを治療するための、請求項４２に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
48. 宿主細胞に形質導入するための、請求項４２に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
49. 血友病Ａ治療用医薬を製造するための、請求項４２に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の使用。

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