JP2018534914A - ホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｆｐｅ）対照試薬 - Google Patents
ホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｆｐｅ）対照試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018534914A JP2018534914A JP2018514429A JP2018514429A JP2018534914A JP 2018534914 A JP2018534914 A JP 2018534914A JP 2018514429 A JP2018514429 A JP 2018514429A JP 2018514429 A JP2018514429 A JP 2018514429A JP 2018534914 A JP2018534914 A JP 2018534914A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- variants
- nucleic acid
- control
- sequence
- variant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 8
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 title claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title abstract description 78
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 74
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 36
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 11
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 35
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 28
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 17
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 14
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 13
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 5
- 101000628562 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase STK11 Proteins 0.000 description 5
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 5
- 102100026715 Serine/threonine-protein kinase STK11 Human genes 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 5
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 4
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 4
- 101000916644 Homo sapiens Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Proteins 0.000 description 4
- 102100028198 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Human genes 0.000 description 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 102100028138 F-box/WD repeat-containing protein 7 Human genes 0.000 description 3
- 101710105178 F-box/WD repeat-containing protein 7 Proteins 0.000 description 3
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 3
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 description 3
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 3
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 3
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102100038332 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Human genes 0.000 description 3
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 3
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 3
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 3
- 108700031765 Von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Proteins 0.000 description 3
- 102000053200 Von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Human genes 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- -1 controls Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 2
- 101000827746 Homo sapiens Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000584633 Homo sapiens GTPase HRas Proteins 0.000 description 2
- 101001072407 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Proteins 0.000 description 2
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000960234 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 description 2
- 101000605639 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 description 2
- 102100039905 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Human genes 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 101710087603 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 102100028286 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Human genes 0.000 description 2
- 102100038042 Retinoblastoma-associated protein Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 108010003374 fms-Like Tyrosine Kinase 3 Proteins 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000872 ATM Human genes 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 201000010028 Acrocephalosyndactylia Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010004586 Ataxia Telangiectasia Mutated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001042041 Bos taurus Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 1
- 101710167766 C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 1
- 101150029409 CFTR gene Proteins 0.000 description 1
- ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F Chemical compound Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101710091881 GTPase HRas Proteins 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 101710137155 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Proteins 0.000 description 1
- 108010086512 Hepatocyte Nuclear Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000006754 Hepatocyte Nuclear Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 description 1
- 101000579425 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000742859 Homo sapiens Retinoblastoma-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823316 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ABL1 Proteins 0.000 description 1
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 101710143112 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000004014 Pfeiffer syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101710093328 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 description 1
- 101710148465 Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 1
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 1
- 230000009948 RNA mutation Effects 0.000 description 1
- 241000713810 Rat sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108700028341 SMARCB1 Proteins 0.000 description 1
- 101150008214 SMARCB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025746 SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily B member 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000049937 Smad4 Human genes 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 101100115701 Theileria annulata TACP gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022596 Tyrosine-protein kinase ABL1 Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 208000029664 classic familial adenomatous polyposis Diseases 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000002991 molded plastic Substances 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 239000011807 nanoball Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 1
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/02—Devices for withdrawing samples
- G01N1/04—Devices for withdrawing samples in the solid state, e.g. by cutting
- G01N1/06—Devices for withdrawing samples in the solid state, e.g. by cutting providing a thin slice, e.g. microtome
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N2001/2893—Preparing calibration standards
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
- G01N2001/364—Embedding or analogous mounting of samples using resins, epoxy
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本開示は、参照配列の複数の変異形を含む複数の核酸配列を提供する。本開示は、それを含むプラスミド、細胞、方法、及びキットをさらに提供する。一実施形態では、参照の複数の変異形を含む核酸分子が開示される。他の実施形態では、参照配列の変異形を含む核酸分子の混合物または組み合わせが開示される。ある特定の実施形態では、核酸分子または核酸分子の混合物は、高頻度または低頻度で存在する１つ以上の変異形を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、複数の核酸分子を含む対照試薬を提供する。【選択図】なし
Description
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／２３２，２６１号の優先権を主張する。
試験研究所が直面している重要な課題は、品質管理である。いくつかの報告は、試験研究所の７０％だけが癌遺伝子における突然変異を正しく特定したことを示した（Ｂｅｌｌｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ ＫＲＡＳ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｉｓ Ｎｅｅｄｅｄ：Ｓｅｔｕｐ ｏｆ ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｊｏｉｎｅｄ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｒｏｕｎｄｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２０１１ Ａｐｒｉｌ；１６（４）：４６７−４７８）。次世代シーケンシング及びアッセイのモニタリング方法、ならびに複数のプラットフォームにわたる変異形コールの一致、ライブラリー調製方法、及び生物情報学パイプラインに関して、質問が提起された。特定の遺伝的変異形を表す柔軟な単一試薬を提供する組成物及び方法は、当業者によって所望され、本明細書に記載される。
Ｂｅｌｌｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ ＫＲＡＳ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｉｓ Ｎｅｅｄｅｄ：Ｓｅｔｕｐ ｏｆ ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｊｏｉｎｅｄ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｒｏｕｎｄｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２０１１ Ａｐｒｉｌ；１６（４）：４６７−４７８
本開示は、核酸分子を含む組成物、対照、プラスミド、細胞、方法、及びキットを提供する。
一実施形態では、参照の複数の変異形を含む核酸分子が開示される。他の実施形態では、参照配列の変異形を含む核酸分子の混合物または組み合わせが開示される。
一実施形態では、参照の複数の変異形を含む核酸分子が開示される。他の実施形態では、参照配列の変異形を含む核酸分子の混合物または組み合わせが開示される。
ある特定の実施形態では、核酸分子または核酸分子の混合物は、高頻度または低頻度で存在する１つ以上の変異形を含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、複数の核酸分子を含む対照試薬を提供する。
さらに別の実施形態では、変異形を含む少なくとも１つの核酸分子または核酸分子の混合物を含むキットが開示される。
別の実施形態では、シーケンシング反応の有効性の確認方法が開示される。この方法は、既知数の代表的な配列及び／またはその変異形を、潜在的に試験核酸配列を含む試験試料を含む混合物に含めることと、混合物中の核酸をシーケンシングすることと、を含み、混合物中の代表的な配列及び／または変異形の全ての検出は、シーケンシング反応が正確であったことを示す。
本開示はまた、複数の核酸種を含む組成物を提供し、各種の核酸配列は、その近接種とは所定の割合だけ異なる。
ある特定の実施形態では、シーケンシング計器を較正するために、核酸種をシーケンシングすることを含む方法が提供される。
さらに他の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される核酸または核酸の混合物をコードするプラスミド及び細胞を提供する。
本開示はまた、複数の核酸種を含むプラスミド及び／または細胞を提供し、各種の核酸配列は、その近接種とは所定の割合だけ異なる。
本開示は、頻度ラダーをさらに提供する。頻度ラダーは、複数の変異形を異なる頻度で含む。
本開示はまた、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）対照を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）定義された濃度の細胞材料を得ることと、ｂ）その細胞材料に、参照配列の複数の変異形または参照配列との変異形の混合物を含む核酸分子または核酸分子の混合物を導入することと、ｃ）ｂ）の細胞材料をゲル化ポリマーと混合し、ゲル／細胞材料を作製することと、ｄ）ゲル化ポリマーが凝固するまで、ゲル／細胞材料を定義された形状を有する型に添加することと、を含む。
ある特定の実施形態では、この方法は、変異形の混合物で実行され、この変異形は、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、多塩基多型（ＭＮＰ）、挿入、欠失、コピー数変異、遺伝子融合、重複、反転、反復多型、参照配列のホモポリマー、及び／または非ヒト配列を含む。
さらに他の実施形態では、この方法は、少なくとも３０個の変異形を含む複数の変異形を含む、核酸分子または核酸分子の混合物で実行される。他の実施形態では、この方法で使用される核酸分子または核酸分子の混合物は、癌、遺伝性疾患、感染性疾患に関連する変異形を含む。
本開示はまた、本発明の方法によって産生されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）対照を含むキットを提供する。
核酸参照配列及び参照配列の変異形を含む、組成物、方法、キット、プラスミド、及び細胞が、本明細書に提供される。本明細書に開示される組成物は、アッセイの最適化、検証、及び較正；ピア・ツー・ピア比較；トレーニング及びＰＴ／ＥＱＡ、ＱＣモニタリング、試薬ＱＣ、及びシステムインストレーションアセスメントを含むが、これらに限定されない様々な用途を有する。
市場において、ＮＧＳ試験のための柔軟な信頼できる対照材料の必要性が認識されている（Ａｓｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ（Ｎｅｘ−ＳＴｏＣＴ）Ｗｏｒｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２４０３、及びＡＣＭＧ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｉｍ．２０１３．９２を参照されたい）。本開示は、そのような対照材料を提供する。
本開示は、例えば、シーケンシング反応（例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）アッセイ）におけるアッセイ検証／品質管理などの様々な目的のために使用され得る参照配列及び／またはその変異（例えば、突然変異）を表す対照試薬に関する。シーケンシング反応の品質を特徴付けるために使用される従来のメトリクスとしては、例えば、読み取り長さ、最小品質スコア、ターゲットマップされた読み取りのパーセント、病原体特異的読み取りのパーセント、固有読み取りのパーセント、適用範囲レベル、均一性、非対象標的塩基のパーセント、及び／またはリアルタイムエラー率が挙げられる。品質に影響を及ぼし得るパラメータとしては、例えば、モニタリングされる検体の種類及び／または数（例えば、多型の種類及び数（一塩基多型もしくは多塩基多型（ＳＮＰ、ＭＮＰ））、挿入及び／または欠失、アンプリコン、アッセイのコンテキスト及び／または検出限界）、試料の種類（例えば、哺乳動物細胞、感染性生物、試料源）、交換可能性（例えば、複数の技術プラットフォーム及び／または利用されるスクリーニングパネルの種類にわたる検証）、試料の調製（例えば、ライブラリー調製の種類／品質、及び／またはシーケンシング反応の種類（例えば、実行条件、配列コンテキスト）、及び／または他のパラメータが挙げられる。当業者は、例えば、そのような反応の品質が、ガイドラインのわずかな相違、上述のメトリクス及びパラメータ、使用される参照標準、ならびに多くのＮＧＳ技術が非常に複雑であり、進化しているという事実に起因して研究所間で変動し得ることを認識する。この開示は、異なる研究所において、異なる条件下で、異なる種類の試料とともに、及び／または様々な技術プラットフォームにわたって使用され、そのアッセイが正しく実行されていること、及び異なる研究所からの結果が、互いに確実に比較され得ること（例えば、それぞれが好適な品質であること）を確認することができる、品質管理試薬を提供する。いくつかの実施形態では、シーケンシング反応の品質を確認することの問題は、それぞれが参照配列の異なる変異形を表す、複数の核酸断片を含む多重対照を使用して解決される。
ある特定の実施形態では、シーケンシング反応における使用のための対照試薬が提供される。対照試薬は、特定の反応の品質を評価するために単独で使用され得るか、または組み合わされ得る１つ以上の構成成分を含み得る。例えば、いくつかのアッセイを実行して、生体試料内に存在する遺伝的変異形を特定する。本明細書に記載される対照試薬はまた、研究所間で、技術プラットフォームにわたって、及び／または異なる試料の種類で結果を比較する能力をユーザーに提供することができる。例えば、いくつかの実施形態では、対照試薬は、単一アッセイにおいて多くの低率変異形を検出する、及び／またはアッセイの信頼性を確認するために使用され得る、異なる癌関連遺伝子の多くの低率（例えば、低頻度）変異形を表し得る。対照試薬を使用して、反応を比較（例えば、実行間比較）するための多数のデータ点を生成することができる。対照試薬を使用して、複数の変数にわたる経時的な変異形検出の再現性を決定することができる。対照試薬を使用して、シーケンシング実行の品質（すなわち、計器が所与の頻度で含まれる変異形を検出するために十分な感度を有すること）を評価することができる。対照試薬を使用して、それらのシーケンシング実行を比較することによって、熟達したユーザーと未熟なユーザーとを区別し、かつ／または異なるロット間の試薬の品質を区別することもできる。また対照試薬は、多くの変異形が１つの試料材料に組み合わされるため、アッセイ検証研究を助けることができる。これは、それぞれが１つまたは２つの変異形を含有する複数の試料の必要性を省き、アッセイを検証するために必要とされる作業及び時間を大幅に短縮する。
対照試薬は、典型的に、参照ゲノムの定義された参照配列（染色体及びヌクレオチド範囲として定義される）を含有する１つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ヘアピンＤＮＡ及び／もしくＲＮＡ）断片、ならびに／または参照配列の１つ以上の変異形を含む。変異形の原材料は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びそれらの組み合わせであり得る。変異形は、典型的に、参照配列に対するヌクレオチド配列変異を含む。変異形及び参照配列は、典型的に、少なくとも５０％または約７５〜１００％（例えば、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％のうちのいずれか）配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、しかしながら、共有される同一性は、例えば、変異形が欠失または挿入突然変異を表す場合（それらのうちのいずれかが最大で数キロベース以上であり得る）、著しく低いことがある。例示的な欠失は、例えば、Ｔａｎｇらによって記載されるように、ＣＦＴＲ遺伝子内にエクソン１７ａ及び１７ｂを伴う反復性３．８ｋｂ欠失であり得る（Ｊ．Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，１２（３）：２９０−２９４（２０１３）（ｃ．２９８８＋１６１６＿ｃ．３３６７＋３５６ｄｅｌ３７９６ｉｎｓ６２変化について説明している。３２個のヌクレオチドの完全に反転された反復の対に隣接した））。いくつかの実施形態では、変異形は、一塩基多型（ＳＮＰ）、多塩基多型（複数可）（ＭＮＶ）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、コピー数変異（複数可）、遺伝子融合（複数可）、重複（複数可）、反転（複数可）、反復多型（複数可）、ホモポリマー（複数可）、非ヒト配列（複数可）のうちの少なくとも１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。そのような変異形（参照により任意の組み合わせを含み得る）は、同じまたは異なる構成成分の一部として対照試薬に含まれ得る。参照配列（複数可）及び／または変異形は、カセットとして対照試薬内に配置され得る。
カセットは、１つ以上の制限酵素部位（複数可）、シーケンシングプライマー（複数可）部位、及び／またはヘアピン形成部位（複数可）に隣接した及び／または操作可能に結合した参照配列または変異形を含有する。いくつかの実施形態では、各カセットに隣接した異なる種類の配列を含むことが有用であり得、例えば、１つのカセットを、制限酵素及び／またはヘアピン配列に隣接するように設計することが有用であり得る。そうすることで、隣接した断片／カセット間の相互増幅などの問題を回避するのを助けることができる。そのようなものとして、各参照配列及び／または変異形は、任意の他の参照配列及び／または変異形とは別個に放出可能かつ／または検出可能であり得る。典型的なカセットは、約４００ｂｐの長さであり得るが、５０〜２０，０００ｂｐで変動し得る（例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８００、９００、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、１２５００、１５０００、１７５００、または２００００ｂｐのうちのいずれかなど）。各対照試薬は、１つ以上のカセットを含み得、それぞれが１つ以上の参照配列（複数可）及び／または変異形（複数可）を表す（例えば、それぞれが「対照配列」と称される）。各参照配列及び／または変異形は、約０．１％〜１００％のうちのいずれかの割合で対照配列及び／または対照試薬中に存在し得る（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％のうちのいずれか）。例えば、１００％参照配列または変異形である対照配列または対照試薬は、１つの参照配列または変異形のみを表す試薬である。同様に、変異形を５０％含む対照配列または対照試薬は、最大２つの参照配列及び／または変異形のみを表す対照試薬である。残りの割合は、例えば対照配列等の他の配列からなり得る。
ある特定の実施形態では、Ｔ７または他のプロモーターは、各カセットの上流に存在し得る。これは、多くの遺伝子領域の大規模並列転写を可能にする。この技法は、当量の各標的配列を含有する対照の構成を容易にする。当量の多くの標的がある場合、対照の使い易さが高まる。例えば、患者試料中の対照における汚染は、全ての転写が汚染試料中に出現するため、より検出し易い。患者試料が、例えば、多数の融合転写を含有する可能性は非常に低く、そのようなアッセイ結果は、汚染問題が存在することをユーザーに合図する。これは、１つの転写のみが汚染された試料中にはるかに豊富に存在する状況（汚染が真の正信号と間違われることにつながり得る）とは対照的である。当量の各標的配列で対照を構成する能力は、この種のエラーの可能性を排除する。
ある特定の実施形態では、参照配列（複数可）及び／または変異形は、１つ以上の異なる制限酵素部位、シーケンシングプライマー部位（複数可）、及び／またはヘアピン形成部位に隣接及び／または操作可能に結合され得る。上記のとおり、ある特定の設計を使用して、参照配列及び／または変異形間の相互増幅などの問題を回避することができる。いくつかの実施形態では、対照配列及び／またはカセットは、それらが対照試薬から放出可能であるように任意に配置され得る。これは、例えば、制限酵素（ＲＥ）部位を対照配列のいずれかの末端に含めることによって達成され得る。したがって、対照試薬は、ＲＥ部位／対照配列／ＲＥ部位のように配置され得る。ＲＥは、同じでも互いに異なっていてもよい。１つのカセットにおけるＲＥ部位もまた、任意の他のカセットに存在するものと同じでも異なっていてもよい。そのようなものとして、対照配列は、対照配列を１つ以上の特定の制限酵素で処理することによって、ユーザーにより所望されるようにカセットから放出され得る。
いくつかの実施形態では、対照試薬は、併せて使用され得る複数の構成成分を含み得る。ある特定の実施形態では、複数の構成成分は、異なる対照配列及び／または同じ対照配列の異なる配置を含むプラスミドであり得る、第１及び第２の構成成分を含む。したがって、構成成分は、同じまたは異なる参照配列及び／または変異形を表し得る。そのような構成成分は、パネルとして一緒に使用されてもよく、例えば、それにより様々な参照配列及び／または変異形を一緒にアッセイすることができる。参照配列及び／または変異形が同じである場合、各構成成分は、それらの変異形を異なるカセット配置及び／または形態で含み得る。いくつかの実施形態では、複数の構成成分は、１つ以上のＳＮＰ変異形を表す第１の構成成分と、１つ以上の多塩基多型（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、コピー数変異（複数可）、遺伝子融合（複数可）、重複（複数可）、反転（複数可）、反復多型（複数可）、ホモポリマー（複数可）、及び／または非ヒト配列（複数可）を表す第２の構成成分と、を含み得る。構成成分は、プラスミドなどの同じまたは異なる種類の核酸であってよく、それぞれが、本明細書に記載されるように、またはそうでなければ当業者によって適切であると判断され得るように配置された１つ以上の参照配列の同じまたは異なる変異形を含む。いくつかの実施形態では、異なる種類のプラスミドを組み合わせて、多くの異なる参照配列及び／または変異形を表す多成分対照試薬を提供することができる。
プラスミドは、任意の既知の手段によって定量化され得る。一実施形態では、各プラスミドの定量化は、非ヒト「異種」デジタルＰＣＲ標的配列を使用して行われる。プラスミドの正確なコピー数を決定する。ゲノムＤＮＡの正確なコピー数も決定する（ゲノム標的部位（複数可）の定量化によって得られる）。この情報を用いて、狭い頻度範囲内に全ての標的／変異形を含有する対照を、正確かつ再現可能に開発することができる。
変異形は、ＤＮＡ断片として対照試薬内に含有されてもよく、それぞれが参照ゲノムに由来する定義された配列（染色体及びヌクレオチド範囲として定義される）を、断片に導入された１つ以上の変化（例えば、ヌクレオチド差）とともに含有する。変異形は、例えば、定義された配列（例えば、参照配列）から１つ以上のヌクレオチド配列差を有する配列であり得る。例えば、例示的な参照配列は、修飾に好適な「ホットスポット」を含み得る。そのようなホットスポットは、天然に存在する参照配列におけるヌクレオチド及び／または位置（例えば、癌細胞内で観測される突然変異）を表し得る。そのようなホットスポットのうちの１つ以上は、内部の１つ以上のヌクレオチドを変更することによって修飾して、対照配列（またはその部分）を生成することができ、それを対照試薬に組み込むことができる。例えば、対照配列（ホットスポット１、２、３、４、５）を生成するための例示的な上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）Ｅｘ１９参照配列の修飾を下に示す（図１も参照されたい）。
野生型（例えば、ＥＧＦＲ Ｅｘ１９） ＣＣＡＡＧＣＴＣ（配列番号１）…ＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡ（配列番号２）…ＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣ（配列番号３）…ＡＡＡＡＡＧ（配列番号４）…ＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣ（配列番号５）（４００ｂｐ）
ホットスポット番号１ＣＣＡＡＴＣＴＣ（配列番号６）…ＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡ（配列番号２）…ＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣ（配列番号３）…ＡＡＡＡＡＧ（配列番号４）…ＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣ（配列番号５）
対照配列は、複数のホットスポット、ＣＣＡＡＴＣＴＣ（配列番号６、ホットスポット番号１）…ＡＧＧＡＡＣＴＴＧＡ（配列番号７、ホットスポット番号２）…ＡＡＣＴＣＡＡＴＴＣ（配列番号８、ホットスポット番号３）…ＡＴＡＡＡＧ（配列番号９、ホットスポット番号４）…ＡＴＧＡＡＡＧＴＧＣ（配列番号１０、ホットスポット番号５）を含む。この例示的な対照配列は、それにより、複数のＥＧＦＲ変異形（例えば、ホットスポット番号１、２、３、４、５等）を表す。対照試薬は、複数の対照配列を含んでもよく、それぞれが同じまたは異なる参照配列の１つ以上の変異形を表す。任意の数の変異形が、対照配列によって表され得、任意の数の対照配列が、対照試薬に含まれ得る。対照試薬は、例えば、多くの変異形を含んでもよく、それにより特定の参照配列の全ての可能な変異形が、単一の対照試薬によって表される。例えば、対照試薬は、複数のＳＮＰ、ＭＮＰ、欠失、挿入等を含んでもよく、それぞれが参照配列の異なる変異形を表す。追加の例示的な非限定の変異形を表１Ａ及び１Ｂならびに表６に示す。
対照試薬はまた、複数種の対照配列を表すように設計され得る。例えば、複数種の参照配列及び／またはその変異形（対照配列において単独でまたは組み合わせで見出され得る）を表す対照試薬が設計され得る。本明細書に記載される対照試薬が関連性を有し得る対照配列の例示的なカテゴリーとしては、前述の癌関連領域だけでなく、遺伝性疾患、微生物学（例えば、抗生物質耐性突然変異、免疫逃避関連突然変異に関する）、農業（例えば、植物微生物及び／または薬物耐性関連突然変異）、家畜（例えば、特定の家畜特性に関する突然変異）、食品及び水質検査の分野、ならびに他の領域が挙げられる。特定の対照試薬（またはそれらの組み合わせ）によって表され得る癌関連参照配列の例示的な組み合わせ（例えば、パネル）を表２に示す。
本明細書に記載される対照試薬及びその使用方法は、トレーニング、技能検試験、及び品質制御モニタリングのための一貫した対照材料を提供し得る。例えば、対照試薬を使用して、アッセイにおいて検出されるべき特定数の代表的な配列及び／またはその変異形を含めること、その後、実際に検出された数を算出するによってアッセイが適切に機能していることを確認することができる。これは、表３に提示されるデータによって例証される。
表３に例示されるように、「不良な実行」は、検出された変異形の数が、検出される（例えば、アッセイに含まれる）ことが予想される変異形の数と一致しない場合に特定される。表３の例示的なアッセイに示されるように、アッセイにおいて使用される特定の対照試薬（またはそれらの組み合わせ）は、１５個の代表的な配列及び／またはその変異形を含み、アッセイが適切に実行される場合、１５個全てが検出されるはずである。これらの対照配列のうちの１５個未満が検出されない場合、アッセイは不正確（例えば、「不良な実行」）として特定される。１５個の配列全てが検出される場合、アッセイは正確（例えば、「良好な実行」）として特定される。この概念の変形もまた、当業者によって理解されるように、本明細書において企図される。
ある特定の実施形態では、対照試薬は、変異形ＤＮＡ断片（例えば、プラスミドに組み込まれ得る）を、ゲノムＤＮＡまたは「野生型」（例えば、非変異形）配列を含む合成ＤＮＡと混合することによって調製され得る。そのような配列は、対照細胞（例えば、天然に存在する、または操作／培養された細胞株）から得られるか、またはその中に存在し得る。いくつかの実施形態では、野生型配列は、変異形配列とともにＤＮＡ断片上に含まれ得るか、または変異形配列は、細胞（例えば、対照細胞）にトランスフェクトされ得る、及び／または細胞と混合され得る。ある特定の実施形態では、そのような混合物を使用して、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料（例えば、対照ＦＦＰＥ試料）を調製することができる。例えば、いくつかの実施形態では、対照試薬は、代表的な配列及び／またはその変異形を含む対照配列（例えば、アンプリコン）を設計すること、各アンプリコンを囲むように制限部位を設計すること、そのアンプリコン及び制限部位を含むカセットを含む核酸分子を合成すること、ならびにカセットをプラスミド骨格に組み込むことによって調製し、試験することができる。その後、構成体は、単独でシーケンシングすることによって（例えば、１００％の予想頻度を提供する）、またはそれを、例えばゲノムＤＮＡと特定の予想頻度（例えば、５０％）で混合した後に試験することができる。そのような構成体は、ＦＦＰＥ対照として含む様々な用途のための細胞と混合されてもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される対照試薬を使用して、頻度ラダーを提供することもできる。頻度ラダーは、異なる頻度の多くの変異形で構成される。いくつかの実施形態では、対照試薬を使用して、例えば５％増分の存在度（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％存在度のうちのいずれか）で「ラダー」を提供することができる。例えば、ラダーは、高頻度（例えば、８０％対立遺伝子頻度）で存在する多くの異なる変異形を持つ単一試料を取り、低頻度まで希釈を行うことによって構成され得る。代替として、ラダーは、異なる頻度で変異形を含有する単一試料であり得る。ラダーは、低存在度で体細胞変異形（例えば、腫瘍一塩基多型）または非限定例として約５０％存在度で存在する生殖細胞変異形を含む、多くの試料型の参照として使用され得る。そのようなラダーを使用して、多くの異なる変異形を同時に検出する計器限界を決定することもできる。全ての変異形が多くの試料ではなく単一試料中に存在するため、これは１個〜数個の変異形を含有する材料及び試験のための資源を見出すことにおけるユーザーの時間を節約する。例を表８に提供する。
表８に示されるように、ラダーは、５５５個の変異形を含有する試料を、およそ５０％頻度から約３％頻度まで希釈することによって構成した。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＥＲＳＯＮＡＬ ＧＥＮＯＭＥ ＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）（ＰＧＭ）を使用するＩｏｎ ＡＭＰＬＩＳＥＱ（登録商標）Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２を使用して、ラダーを二重で試験した。変異形のうちの３５個の頻度を、試験した各試料について報告する。斜線のセルは、変異形が検出されなかったことを示す。そのようなデータを使用して、各変異形の検出限界を確立することができる。
ラダーは、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング及び次世代プラットフォームを含む多くのプラットフォームにわたって使用することができ、ＲＵＯ及びＩＶＤの適用はいずれも、この標準の使用から利益を享受し得る。頻度ラダーはまた、シーケンシング反応において内部対照として機能し得、１ｋｂ ＤＮＡラダーがほぼ全てのアガロースゲルにおいて基準として機能するのと非常に似ている。例として、１つの設計は、図２及び３に示されるように、５つの固有配列及び５つの同一配列を提供する。そこに示されるように、１つの配列位置において、これら１０配列のうちの１つのみに存在する変異形がある。第２の位置において、変異形は、１０配列のうちの２つに存在する。第３の位置において、変異形は、配列のうちの３つに存在するなどである。これは、０〜１００％の１０％頻度増分で変異形を産生する。これは、簡略した例であり、ランダム介入配列は、シーケンシングアーチファクトを防ぐために必須であり得る。生成物は、オリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ断片もしくは合成オリゴヌクレオチド）、プラスミド、または同一制限酵素部位によって分離された連結配列を持つ１つのプラスミドなどの任意の好適な形態をとり得る（図３）。１つのプラスミド上に全ての配列変異形を有する利点は、混合物内の１０個の配列全ての相対レベルが、良好に制御されることであり、製造中にプラスミドは、同じ酵素を持つ各配列間で切断され得、１０個の断片を等比で生じる。当業者に理解されるように、そのようなラダーの誘導体は、異なる変異形の種類（例えば、挿入及び／または欠失）を含み得、あらゆるヌクレオチド変化が設計に組み込まれ得（例えば、Ａ→Ｃ、Ａ→Ｔ等）、かつ／またはより小さい増分が、１０％より低い存在度での微調整測定を提供し得る。例えば、他の突然変異を持つ第２のプラスミドを、１：９の比で最初のプラスミドに付加することができ、さらに低い頻度の変異形をもたらす。そのような低頻度シーケンシングラダーは、例えば、１０％未満の存在度で出現する体細胞突然変異を測定するときに必須の対照であり得る。いくつかの実施形態では、そのようなシーケンシングラダーは、複数の核酸種を含み得、各種の核酸配列は、その近接種とは所定の割合だけ異なる（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％、またはそれ以上のうちのいずれか）。各種は、例えば、任意の好適な数のヌクレオチドを含み得る（例えば、約５、１０、２０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００のうちのいずれか）。各種はまた、少なくとも３つのヌクレオチドのホモポリマー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、この種の核酸は、ＤＮＡであり、これらは、プラスミドなどのベクター上で、及び／または細胞によって、及び／または細胞内でコード化され得る。いくつかの実施形態では、各種は、各種に固有であり得る核酸バーコードを含み得る。核酸種をシーケンシングしてシーケンシング計器を較正する、アルゴリズム開発、塩基コール、変異形コールを含むシーケンシング計器の開発業務のためのデータを得る、及び／または計器が適切に機能していること（例えば、ＩＱ／ＯＱ／ＰＱ）を検証することを含む方法も企図される。
当業者であれば、本明細書に記載される対照試薬が、様々なシーケンシングシステム及び／またはプラットフォームにおいて広く有用であることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載される対照試薬は、任意の種類のシーケンシング手順で使用することができ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭＩＳＥＱ（登録商標）、キャピラリー電気泳動、微小球ベースのシステム（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ）、Ｒｏｃｈｅ ４５４システム、ＤＮＡ複製ベースのシステム（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＳＭＲＴ）、ナノボール及び／もしくはプローブ−アンカー結紮ベースのシステム（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ナノポアベースのシステム、ならびに／または任意の他の好適なシステムが挙げられるが、これらに限定されない。
当業者であれば、本明細書に記載される対照試薬が、様々な核酸増幅ベースのシステム及び／またはプラットフォームにおいて広く有用であることも理解するであろう。本明細書に記載される対照試薬は、当業者によって確認され得るように、核酸の標的配列のコピーを増加させるための任意のインビトロシステム内で、及び／またはそれとともに使用され得る。そのようなシステムとしては、例えば、線形、対数、及び／または任意の他の増幅方法（ポリメラーゼ媒介型増幅反応（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、及びローリング鎖増幅（ＲＣＡ）など）、ならびにリガーゼ媒介型増幅反応（リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、及びそれぞれのギャップバージョンなど）の両方、ならびにＬＤＲ及びＰＣＲなどの核酸増幅反応の組み合わせを含む（例えば、米国特許第６，７９７，４７０号を参照されたい））を挙げることができる。したがって、そのようなシステム及び／またはプラットフォームとしては、中でも、例えば、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，９６５，１８８号、及び／もしくは同第５，０３５，９９６号を参照されたい）、等温手順（１つ以上のＲＮＡポリメラーゼを使用する（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８１２２２号）を参照されたい）、鎖置換（例えば、米国特許第ＲＥ３９００７Ｅ号を参照されたい）、プライマー分子の部分破壊（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８７５７４号を参照されたい）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９（１９９０）及び／もしくはＢａｒａｎｙ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３（１９９１）を参照されたい）、Ｑβ ＲＮＡレプリカーゼシステム（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９４／０１６１０８）、ＲＮＡ転写ベースのシステム（例えば、ＴＡＳ、３ＳＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、米国特許第５，８５４，０３３号、米国特許出願公開第２００４／２６５８９７号、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２（１９９８）、及び／もしくはＢａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２６：５０７３−５０７８（１９９８）を参照されたい）、ならびに／または鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｌｉｔｔｌｅ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：７７７−７８４（１９９９）を参照されたい）を挙げることができる。これらのシステムは、熟練者が利用できる多くの他のシステムに加えて、本明細書に記載される対照試薬との併用に好適であり得る。
一実施形態では、対照試薬は、下記ステップのうちの１つ以上を使用して設計され、試験され得る。
●関心対象の特定遺伝子及び／またはその変異形（例えば、ＡＭＰＬＩＳＥＱ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２及び／またはＴＲＵＳＥＱ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌなどの市販のＮＧＳ検査によって標的化されるもの）の代表的な配列を含む対照配列（例えば、アンプリコン）を設計する。
●アンプリコンを包含するゲノム参照源（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ３７（ＧＲＣｈ３７））から配列を特定する。
●ステップｂ）において特定された（例えば、５’及び３’）ゲノム配列によって囲まれたアンプリコンを含む約４００ｂｐ配列を含むカセットを設計する。
●ステップｃ）において調製された各カセットを囲むように制限部位を設計する（例えば、１つのバージョンは、ＤＮＡが一本鎖であるときにヘアピンを作製する配列を付加的に含み得る）。
●共通ベクター（例えば、ｐＵＣ５７）を使用して、ステップｃ）のカセット及びステップｄ）の制限部位を含む核酸分子を合成する（例えば、「プラスミド Ｖ１」）。
●ヘアピン構造及び各領域間に制限部位を持つ関心対象の遺伝子（及び／またはその変異形）の複数の断片を含む第２のプラスミド（例えば、「プラスミド Ｖ２」）を調製する。
●任意に、プラスミド Ｖ１及び／またはＶ２内に含有される変異形配列を、制限酵素で線形化する。
●変異形を、ゲノムＤＮＡ（例えば、野生型ｇＤＮＡ）と特定の予想変異形頻度（例えば、およそ５０％）で混合する。
●任意に、「変異形配列」を単独で試験する（例えば、１００％の予想変異形頻度を提供する）。
●ＮＧＳを使用して変異形検出を行う。
●関心対象の特定遺伝子及び／またはその変異形（例えば、ＡＭＰＬＩＳＥＱ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２及び／またはＴＲＵＳＥＱ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌなどの市販のＮＧＳ検査によって標的化されるもの）の代表的な配列を含む対照配列（例えば、アンプリコン）を設計する。
●アンプリコンを包含するゲノム参照源（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ３７（ＧＲＣｈ３７））から配列を特定する。
●ステップｂ）において特定された（例えば、５’及び３’）ゲノム配列によって囲まれたアンプリコンを含む約４００ｂｐ配列を含むカセットを設計する。
●ステップｃ）において調製された各カセットを囲むように制限部位を設計する（例えば、１つのバージョンは、ＤＮＡが一本鎖であるときにヘアピンを作製する配列を付加的に含み得る）。
●共通ベクター（例えば、ｐＵＣ５７）を使用して、ステップｃ）のカセット及びステップｄ）の制限部位を含む核酸分子を合成する（例えば、「プラスミド Ｖ１」）。
●ヘアピン構造及び各領域間に制限部位を持つ関心対象の遺伝子（及び／またはその変異形）の複数の断片を含む第２のプラスミド（例えば、「プラスミド Ｖ２」）を調製する。
●任意に、プラスミド Ｖ１及び／またはＶ２内に含有される変異形配列を、制限酵素で線形化する。
●変異形を、ゲノムＤＮＡ（例えば、野生型ｇＤＮＡ）と特定の予想変異形頻度（例えば、およそ５０％）で混合する。
●任意に、「変異形配列」を単独で試験する（例えば、１００％の予想変異形頻度を提供する）。
●ＮＧＳを使用して変異形検出を行う。
ある特定の実施形態では、関心対象の全ての遺伝子に対して個々のカセットを合成し、野生型と組み合わせることができる。ある特定の実施形態では、カセットは、それに近接または隣接した変異形の検出を干渉しない複数の変異形で設計され得る。
いくつかの実施形態では、ＮＧＳは、Ｉｏｎ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）を使用し、最初にＩｏｎ ＡＭＰＬＩＳＥＱ（登録商標）ライブラリー調製マニュアルのユーザーマニュアルに従い、ＡＭＰＬＩＳＥＱ（登録商標）Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２試薬でライブラリーを構成すること、テンプレート−正イオン球粒子（ＩＳＰ）を調製し、Ｉｏｎ ＰＧＭテンプレートＯＴ２ ２００キットマニュアルに従い、Ｉｏｎ ＯｎｅＴｏｕｃｈ２計器を使用してそれを富化すること、Ｉｏｎ ＰＧＭシーケンシング２００キットｖ２マニュアルを使用してシーケンシングすること、またはＴＲＵＳＥＱ（登録商標）Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＰａｎｅｌユーザーマニュアルもしくはＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（登録商標）ユーザーマニュアルに従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭＩＳＥＱ（登録商標）上でシーケンシングすること、及びＰＧＭにはＴｏｒｒｅｎｔ Ｖａｒｉａｎｔ Ｃａｌｌｅｒ ｖ３．４及びｖ３．６を使用し、ＭＩＳＥＱ（登録商標）にはＭＩＳＥＱ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｖ２．３を使用してデータ分析を行うことによって行われ得る。
本明細書に記載される試薬及び方法は、様々な試料とともに様々な設定において使用され得る。例えば、これらの試薬及び方法を使用して、患者から得られた血清、全血、唾液、組織、尿、濾紙上の乾燥血（例えば、新生児スクリーニング用）、鼻試料、便試料等の生体試料及び／またはそれらの調製物（例えば、ＦＦＰＥ調製物）を分析することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される対照試薬を含む対照調製物が提供されてもよい。
本開示は、さらに、本明細書に記載される１つ以上の対照試薬を含むキットに関する。これらのキットを使用して、本明細書に記載される方法または当業者が利用できる他の方法を、任意に使用説明書に従って実行することができる。例えば、キットは、例えば１つ以上のプラスミドの形態の複数の参照配列及び／またはそれらの変型を含む対照配列（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の参照配列の多くの変型に対する対照を提供するように組織化された対照配列の組み合わせを含有し得る。いくつかの実施形態では、変型は、特定の癌を診断する発癌遺伝子に関し得る。いくつかの実施形態では、例えば、キットは、特定の癌に対して知られている突然変異の範囲を網羅することが知られている対照試薬及び／または対照試料（例えば、組織試料）を含み得る。いくつかの実施形態では、マーカーの変型は、薬物による治療の有用性を予知する遺伝子内の突然変異の変型である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のマーカーは、特定の疾患及び／または様々な疾患（例えば、癌、感染性疾患）に対するものである。いくつかの実施形態では、対照試薬（複数可）は、疾患の存在及び／またはその進行の試験における薬物の効能を確認するために試験に含まれ得る。いくつかの実施形態では、キットは、共通の特徴及び／または症状を有する一連の疾患（例えば、関連疾患）を試験するための対照試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、マーカーは、未知の重要性を有し得るが、そうでなければユーザーにとって（例えば、基礎研究目的のために）興味深い場合がある。このキットはまた、容器（例えば、バイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他の包装システム（例えば、射出成形もしくは吹込成形プラスチック容器を含む）を含んでもよく、その中に１つ以上の対照試薬が配置／収容され、またいくつかの実施形態では、分割され得る）。複数の構成成分がキットに含まれる場合、一般に、少なくとも１つの第２、第３、または他の追加の容器を含むことになり、その中に追加の構成成分が別個に配置され得る。構成成分の様々な組み合わせが、単一容器に包装されてもよい。キットは、市販用の厳重に密閉した試薬容器も含み得る。キットの構成要素が１つ及び／または複数の液体溶液で提供される場合、この液体溶液は、無菌水溶液であり得る水溶液を含む。上述されるように、キットはまた、キットの構成要素を用いるため、ならびにキットに含まれない任意の他の試薬の使用の説明書を含み得る。説明書は、任意に実装され得る変型を含み得る。説明書は、キットの別個の部分として（例えば、紙もしくはプラスチックの挿入物もしくは添付文書）またはインターネットベースのアプリケーションとして提供されてもよい。いくつかの実施形態では、キットは、単独でまたは互いに組み合わせて（例えば、複数のアッセイ）検出され得る、任意の数の参照配列及び／またはその変異形間に関連する対照試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、定義された量の対照試薬を含有する少なくとも１つの他の試料、及びそれがユーザーに基準点を提供し得るように混和された「対照」試験細胞を含み得る。キットは、ポリメラーゼ及び／または１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの１つ以上をさらに含み得る。本開示のキットに対する他の変型及び配置は、当業者によって理解されるように企図される。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、参照配列の複数の変異形を含む核酸分子または核酸分子の混合物を提供し、各変異形配列は、任意に、核酸分子から放出可能であり得る。ある特定の実施形態では、核酸分子または核酸分子の混合物は、制限酵素を使用して核酸分子から放出可能な変異形を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子または核酸分子の混合物は、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、多塩基多型（ＭＮＰ）、挿入、欠失、コピー数変異、遺伝子融合、重複、変換、反復多型、参照配列のホモポリマー、及び／または非ヒト配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子または核酸分子の混合物は、少なくとも５個の変異形を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１５、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００、７００、１０００個の変異形が存在する。さらに他の実施形態では、１０００個を超える変異形が存在する。いくつかの実施形態では、各変異形は、（例えば、試験される試料中に）高頻度または低頻度で存在する。例えば、ある特定の実施形態では、各変異形は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％、またはそれ以上の頻度で存在し得る。他の実施形態では、各変異形は、５０％未満、４０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、及びその間の任意の整数の頻度で存在し得る。
開示される対照材料の利点は、試料の「真理」が分かることである。現在、絶対頻度（すなわち、真理）が知られている参照材料はなく、すなわち、存在する所与の変異形または変異形の組み合わせの実際の頻度は不明である。対照的に、開示される対照材料において、変異形の実際の頻度は知られている。
本開示の教示に従い、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）アッセイのための標準化対照材料が生成され得る。部位間の変異形コールの差、計器間の試薬の変動性、多様な生物情報学パイプライン及びフィルターにより導入された変型、実行間及び研究所間の変動性などの問題は、対照材料を利用して特定され、解決及び／または除去され得る。
さらなる利点は、本明細書に開示される対照材料は、異なる長さの挿入及び欠失、多数のＳＮＰ等を含む、任意の数及び種類の変異形を含み得る。そのような多様性を提供する他の対照材料は存在しない。
変異形は、関心対象のいずれかであり得る。本開示において利用され得る変異形の種類及び数に関して、本明細書で提供される制限はない。
ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドが変異形として利用され得る。ある特定の実施形態では、メチル化が検出され得る。例えば、ＣｐＧメチル化は、バイオマーカー変異形として利用され得る。
本開示はまた、既知数の代表的な配列及び／またはその変異形を、試験核酸配列を潜在的に含む試験試料を含む混合物に含め、混合物中の核酸をシーケンシングすることによって、シーケンシング反応の有効性を確認するための試薬及び方法を提供し、混合物中の代表的な配列及び／または変異形の全ての検出は、シーケンシング反応が正確であったことを示す。代表的な配列及び／または変異形は、本明細書に記載される種類のものであり得る。それを含む組成物も提供される。所定の割合は、例えば、約１、５、または１０％であり得る。また各種は、例えば、２０〜５００個のヌクレオチドであり得る。各種は、少なくとも３つのヌクレオチドのホモポリマー配列を含み得る。核酸は、ＤＮＡであり得る。各種は、各種に固有であり得る核酸バーコードを有し得る。例えば、本明細書に記載される核酸種を使用して、シーケンシング計器を較正することができる。任意に、１つ以上のポリメラーゼ及び／または１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、そのような種を含むキットも提供される。複数の核酸種を含むプラスミド及び／または細胞も提供される（各種の核酸配列は、その近接種とは所定の割合だけ異なる）。
本開示の説明は、単に例示的かつ説明的であり、本教示の範囲を限定することを意図しないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、特に具体的に明記されない限り、複数形を含む。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、またはそのような基語の修飾、例えば限定されないが、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含有した（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」もまた、限定することが意図されない。「または」の使用は、特に明記されない限り「及び／または」を意味する。「及び／または」という用語は、その前後の用語が一緒にまたは別個にとられ得ることを意味する。例証目的のために、限定としてではないが、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ」または「Ｙ」または「Ｘ及びＹ」を意味し得る。値の範囲が本明細書で提供される場合はいつも、その範囲が、特に具体的に明記されない限り、開始値及び終了値、ならびにその間の任意の値または値の範囲を含むことを意味する。例えば、「０．２〜０．５」は、０．２、０．３、０．４、及び０．５、その間の範囲（０．２〜０．３、０．３〜０．４、０．２〜０．４など）；その間の増分（０．２５、０．３５、０．２２５、０．３３５、０．４９など）；その間の増分範囲（０．２６〜０．３９など）等を示す。「約」または「およそ」という用語は、その用語の通常の意味を指し得るが、列挙される値の約１〜１０パーセントのうちのいずれかに含まれる１つまたは複数の値も示し得る。
本明細書で使用される節の見出しは、単なる組織化目的のためであり、記載される主題をいかようにも限定するものとみなされてはならない。特許、特許出願、論文、書籍、専門書、及びインターネットウェブページを含むが、これらに限定されない本出願において引用される全ての文献及び同様の資料は、そのような文献及び同様の資料の形式にかかわらず、任意の目的のためにそれら全体が参照により明示的に組み込まれる。組み込まれる文献及び同様の資料のうちの１つ以上が、本出願における用語の定義と矛盾するようにその用語を定義または使用する場合、本出願が優先する。本教示は、様々な実施形態と併せて記載されるが、本教示は、そのような実施形態に限定されることを意図しない。反対に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替例、修飾、及び同等物を包含する。ある特定の実施形態は、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施形態は、単なる実施例であり、特許請求の範囲をいかようにも限定することを意図されない。
本開示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解され得、本開示の範囲をいかようにも限定するものとしてみなされるべきではない。
実施例１
例示的な対照試薬は、下記のように調製し、試験した。
ａ）表１〜３に示される断片を含むアンプリコンを設計した。
ｂ）ゲノム配列を選択して各アンプリコンを包含した（選択されたゲノム配列は、各アンプリコンの順方向及び逆方向プライマーの５’ヌクレオチドに対応する参照ゲノム、ならびにこれら２つのヌクレオチド間の全ての配列の染色体及びヌクレオチド位置である）。
ｃ）ステップｂ）において特定された（例えば、５’及び３’）ゲノム配列によって囲まれたアンプリコンを含む約４００ｂｐ ＥＧＦＲ配列を含むカセットを設計した（参照配列は、約４００ｂｐ領域を含むように、ステップｂ）において定義された領域の各末端にほぼ等しい量で付加される）。
ｄ）下に示されるように、ステップｃ）において調製された各カセットに対して制限酵素及び他の部位を設計した（例えば、１つのバージョンは、ＤＮＡが一本鎖であるときにヘアピンを作製する配列を付加的に含み得、制限酵素は、関心対象の配列が消化されないが、単に対照試薬から放出されるように選ばれる）。
ＥＧＦＲ Ｖ１＊＊
ＥＧＦＲ＿１−ＣｌａＩ−ＥＧＦＲ＿２−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥＧＦＲ＿３−ＳｍａＩ−ＥＧＦＲ＿４−ＸｈｏＩ−ＥＧＦＲ＿５−ＮｏｔＩ−ＥＧＦＲ＿６／７−ＥＧＦＲ＿８
＊＊ＥＧＦＲ＿１等は、ＥＧＦＲ変異形を表す。ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、及びＮｏｔ Ｉ酵素の制限酵素部位は、変異形間に位置付けられた。
ＥＧＦＲ Ｖ２＊＊＊
ＥＧＦＲ＿４−ＨＰ（７）−ＣｌａＩ−ＥＧＦＲ＿５−ＨＰ（７）−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥＧＦＲ＿６／７−ＨＰ（９）−Ｓｍａ１−ＥＧＦＲ＿８
＊＊＊ヘアピン７（ＨＰ（７））：ＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１１）、ＨｉｎｄＩＩＩ＝ＨｉｎｄＩＩＩ ＲＥ部位、ヘアピン９（ＨＰ（９））：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１２）、ＳｍａＩ＝ＳｍａＩ ＲＥ部位
ｅ）ステップｄ）のカセットは、固相合成器上のオリゴククレオチドの自動合成に続いて、重複するオリゴヌクレオチドの結紮によって共通ベクター（ｐＵＣ５７）（例えば、プラスミドＶ１）に組み込まれた。
ｆ）ヘアピン構造及び各領域間に制限部位を持つ（例えば、上記及び表４の例示的な構成体ＥＧＦＲ Ｖ２と同様に）関心対象の遺伝子（及び／またはその変異形）の複数の断片を含む第２のプラスミド（例えば、「プラスミド Ｖ２」）もまた、固相合成器上のオリゴヌクレオチドの自動合成に続いて、重複するオリゴヌクレオチドの結紮によって調製された。
ｇ）その後、プラスミド Ｖ１及び／またはＶ２内に含有される変異形配列（表４〜６）を、ＨｉｎｄＩＩＩで線形化した。
ｈ）その後、変異形をゲノムＤＮＡ（例えば、野生型ｇＤＮＡ）と特定の予想変異形頻度（例えば、およそ５０％）で混合した（プラスミドＤＮＡ及びヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ−２９３）ゲノムＤＮＡを、蛍光光度計（ＱＵＢＩＴ（登録商標））を使用して定量化して濃度を決定した。その後、プラスミド及びゲノムＤＮＡを一緒に混合して、１：１のモル比（５０％変異形頻度）を得た）。
ｉ）その後、「変異形配列」を単独で試験して、シーケンシングを確認するために１００％）の予想変異形頻度を提供した。
ｊ）ステップｈ）の変異形は、Ｉｏｎ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用し、ＮＧＳによって検出された（結果を表７に提示する）。
例示的な対照試薬は、下記のように調製し、試験した。
ａ）表１〜３に示される断片を含むアンプリコンを設計した。
ｂ）ゲノム配列を選択して各アンプリコンを包含した（選択されたゲノム配列は、各アンプリコンの順方向及び逆方向プライマーの５’ヌクレオチドに対応する参照ゲノム、ならびにこれら２つのヌクレオチド間の全ての配列の染色体及びヌクレオチド位置である）。
ｃ）ステップｂ）において特定された（例えば、５’及び３’）ゲノム配列によって囲まれたアンプリコンを含む約４００ｂｐ ＥＧＦＲ配列を含むカセットを設計した（参照配列は、約４００ｂｐ領域を含むように、ステップｂ）において定義された領域の各末端にほぼ等しい量で付加される）。
ｄ）下に示されるように、ステップｃ）において調製された各カセットに対して制限酵素及び他の部位を設計した（例えば、１つのバージョンは、ＤＮＡが一本鎖であるときにヘアピンを作製する配列を付加的に含み得、制限酵素は、関心対象の配列が消化されないが、単に対照試薬から放出されるように選ばれる）。
ＥＧＦＲ Ｖ１＊＊
ＥＧＦＲ＿１−ＣｌａＩ−ＥＧＦＲ＿２−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥＧＦＲ＿３−ＳｍａＩ−ＥＧＦＲ＿４−ＸｈｏＩ−ＥＧＦＲ＿５−ＮｏｔＩ−ＥＧＦＲ＿６／７−ＥＧＦＲ＿８
＊＊ＥＧＦＲ＿１等は、ＥＧＦＲ変異形を表す。ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、及びＮｏｔ Ｉ酵素の制限酵素部位は、変異形間に位置付けられた。
ＥＧＦＲ Ｖ２＊＊＊
ＥＧＦＲ＿４−ＨＰ（７）−ＣｌａＩ−ＥＧＦＲ＿５−ＨＰ（７）−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥＧＦＲ＿６／７−ＨＰ（９）−Ｓｍａ１−ＥＧＦＲ＿８
＊＊＊ヘアピン７（ＨＰ（７））：ＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１１）、ＨｉｎｄＩＩＩ＝ＨｉｎｄＩＩＩ ＲＥ部位、ヘアピン９（ＨＰ（９））：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１２）、ＳｍａＩ＝ＳｍａＩ ＲＥ部位
ｅ）ステップｄ）のカセットは、固相合成器上のオリゴククレオチドの自動合成に続いて、重複するオリゴヌクレオチドの結紮によって共通ベクター（ｐＵＣ５７）（例えば、プラスミドＶ１）に組み込まれた。
ｆ）ヘアピン構造及び各領域間に制限部位を持つ（例えば、上記及び表４の例示的な構成体ＥＧＦＲ Ｖ２と同様に）関心対象の遺伝子（及び／またはその変異形）の複数の断片を含む第２のプラスミド（例えば、「プラスミド Ｖ２」）もまた、固相合成器上のオリゴヌクレオチドの自動合成に続いて、重複するオリゴヌクレオチドの結紮によって調製された。
ｇ）その後、プラスミド Ｖ１及び／またはＶ２内に含有される変異形配列（表４〜６）を、ＨｉｎｄＩＩＩで線形化した。
ｈ）その後、変異形をゲノムＤＮＡ（例えば、野生型ｇＤＮＡ）と特定の予想変異形頻度（例えば、およそ５０％）で混合した（プラスミドＤＮＡ及びヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ−２９３）ゲノムＤＮＡを、蛍光光度計（ＱＵＢＩＴ（登録商標））を使用して定量化して濃度を決定した。その後、プラスミド及びゲノムＤＮＡを一緒に混合して、１：１のモル比（５０％変異形頻度）を得た）。
ｉ）その後、「変異形配列」を単独で試験して、シーケンシングを確認するために１００％）の予想変異形頻度を提供した。
ｊ）ステップｈ）の変異形は、Ｉｏｎ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用し、ＮＧＳによって検出された（結果を表７に提示する）。
実施例２
ＦＦＰＥ包埋対照
ＦＦＰＥ包埋対照を使用してアッセイをモニタリングした結果を図４〜７に提示する。そこに示されるように、ＦＦＰＥ包埋対照試薬を使用して、低頻度変異形（例えば、図面において「Ｃ」で示されるＲＢ１）を含む、変異形検出をモニタリングすることができる。変異形は、アンプリコン自体、ＧＣ含有量、配列コンテキスト、及び／または変異形の種類によって、当業者によって所望のとおり追跡され得る。
ＦＦＰＥ包埋対照
ＦＦＰＥ包埋対照を使用してアッセイをモニタリングした結果を図４〜７に提示する。そこに示されるように、ＦＦＰＥ包埋対照試薬を使用して、低頻度変異形（例えば、図面において「Ｃ」で示されるＲＢ１）を含む、変異形検出をモニタリングすることができる。変異形は、アンプリコン自体、ＧＣ含有量、配列コンテキスト、及び／または変異形の種類によって、当業者によって所望のとおり追跡され得る。
本明細書に開示される各実施形態は、開示される他の実施形態のうちのいずれかとともに使用され得るか、またはそうでなければ組み合わされ得る。任意の実施形態の任意の要素は、任意の実施形態において使用され得る。本発明は、特定の実施形態に関して説明されたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、同等物がその要素に置き換えられ得ることは、当業者によって理解されるであろう。加えて、本発明の本質的な教示から逸脱することなく、修正を行うことができる。
実施例３
複数の試験部位にわたる５５５個の変異形対照の性能
５３個の異なる遺伝子からの５５５個の変異形を含有する対照試料を構成し、Ｉｏｎ ＡＭＰＬＩＳＥＱ（登録商標）Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２（ＣＨＰｖ２）、ＴＲＵＳＥＱ（登録商標）Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ（ＴＳＡＣＰ）、及びＴＲＵＳＩＧＨＴ（登録商標）Ｔｕｍｏｒ Ｐａｎｅｌで試験した。各パネルについて、２ロットのＡｃｒｏＭｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｃｏｎｔｒｏｌを、少なくとも２つの部位において二重で試験した。追加の部位に限り、ロットのうちの１つを少なくとも２回、または両方のロットを１回試験した。部位間の変動の原因としては、異なる計器、操作者、及び一般的なワークフローが挙げられ得る。また、生物情報学パイプラインの変動が、性能結果の変動に著しく寄与した可能性がある。
複数の試験部位にわたる５５５個の変異形対照の性能
５３個の異なる遺伝子からの５５５個の変異形を含有する対照試料を構成し、Ｉｏｎ ＡＭＰＬＩＳＥＱ（登録商標）Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２（ＣＨＰｖ２）、ＴＲＵＳＥＱ（登録商標）Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ（ＴＳＡＣＰ）、及びＴＲＵＳＩＧＨＴ（登録商標）Ｔｕｍｏｒ Ｐａｎｅｌで試験した。各パネルについて、２ロットのＡｃｒｏＭｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｃｏｎｔｒｏｌを、少なくとも２つの部位において二重で試験した。追加の部位に限り、ロットのうちの１つを少なくとも２回、または両方のロットを１回試験した。部位間の変動の原因としては、異なる計器、操作者、及び一般的なワークフローが挙げられ得る。また、生物情報学パイプラインの変動が、性能結果の変動に著しく寄与した可能性がある。
図８は、異なる部位及びパネルにわたる性能を示す。ＡＣＲＯＭＥＴＲＩＸ（登録商標）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｃｏｎｔｒｏｌにおいて検出された異なる種類の変異形の平均数が、部位別に報告され、パネル別にグループ化される。注記：各種類の変異形の総数は、各パネルについて異なる。図８〜１１を参照されたい。
異なるパネルにわたって特定の変異形の検出を評価するために、３つのパネルによって標的化された２２個の臨床関連変異形を選択した。図９は、パネルにわたる２２個の選択された変異形の検出を示す。２ロットの対照を少なくとも１回、または１ロットを少なくとも２回試験した部位からのデータを用いて分析を行った。検出は、黒い四角で示され、不在は、白い四角で示される。部位間の差は、同じライブラリー調製方法を用いるものの間でも明らかであり、生物情報学パイプラインが性能に影響を及ぼす可能性を示す。
実施例４
５５５個の変異形を含む対照材料の性能を表９に示す。ここでは、ＣＨＰｖ２（ＡＭＰＬＩＳＥＱ（登録商標）Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２）、ＴＳＡＣＰ（ＴＲＵＳＥＱ（登録商標）Ａｍｐｌｉｃｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）、及びＴＳＴＰ（ＴＲＵＳＩＧＨＴ（登録商標）ｔｕｍｏｒ ｐａｎｅｌ）に対するＳＮＶ（一塩基変異形）、ＭＮＶ（多塩基変異形）、ＤＥＬ（欠失）、ＩＮＳ（挿入）が示される。変異形が上流プライマーと下流プライマーとの間に位置付けられた場合、その変異形は、試験方法によって網羅されるとみなした。変異形が、対照の少なくとも１回の実行において検出された場合、その変異形は検出されたとみなした。ゲノムＤＮＡで希釈する前に、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを合成ＤＮＡに関して行った。ゲノムＤＮＡにおいて検出された変異形は、公的に入手可能なＧＭ２４３８５についての全ゲノムシーケンシング情報を使用して確認された。
５５５個の変異形を含む対照材料の性能を表９に示す。ここでは、ＣＨＰｖ２（ＡＭＰＬＩＳＥＱ（登録商標）Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２）、ＴＳＡＣＰ（ＴＲＵＳＥＱ（登録商標）Ａｍｐｌｉｃｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｎｅｌ）、及びＴＳＴＰ（ＴＲＵＳＩＧＨＴ（登録商標）ｔｕｍｏｒ ｐａｎｅｌ）に対するＳＮＶ（一塩基変異形）、ＭＮＶ（多塩基変異形）、ＤＥＬ（欠失）、ＩＮＳ（挿入）が示される。変異形が上流プライマーと下流プライマーとの間に位置付けられた場合、その変異形は、試験方法によって網羅されるとみなした。変異形が、対照の少なくとも１回の実行において検出された場合、その変異形は検出されたとみなした。ゲノムＤＮＡで希釈する前に、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを合成ＤＮＡに関して行った。ゲノムＤＮＡにおいて検出された変異形は、公的に入手可能なＧＭ２４３８５についての全ゲノムシーケンシング情報を使用して確認された。
実施例５
本明細書に提供される対照材料は、プラスミド及び／またはＲＮＡを細胞に一時的にトランスフェクトすること、及びそのような細胞を、対照として使用するためのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックに組み込むことによって急速細胞株生成に使用され得る。ＦＦＰＥ対照の生成方法は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０３３５５３３号に提供される。したがって、ＦＦＰＥ材料は、細胞成長後に核酸を細胞に直接導入することによって生成され、ＦＦＰＥ材料に加工された。これは、変異細胞材料の生成時間を７ヶ月から１日に減少させ、著しい時間と費用の節約を表す。また、細胞成長後に核酸を導入することによって、細胞成長を阻害し得るか、または細胞死につながり得る多くの有毒な組み合わせを回避することができる。これはまた、１つの細胞株が、同数の突然変異に必要とされる１０＋の操作された細胞株に対して数百の突然変異を収容することができるため、細胞を成長させ、保管するプロセスを簡略化する。本明細書に記載される試薬及び方法は、例えば、１つ以上の所定の突然変異を含有する１つ以上の所定の核酸配列を含有する単一細胞の生成を可能にする。本明細書に提供される試薬及び方法は、無制限数のプラスミドまたはＲＮＡ転写物を含有する任意の細胞株の生成を可能にする。さらに、本明細書に提供される試薬及び方法は、非天然の核酸を操作された細胞株のゲノムに統合する必要がない。
本明細書に提供される対照材料は、プラスミド及び／またはＲＮＡを細胞に一時的にトランスフェクトすること、及びそのような細胞を、対照として使用するためのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックに組み込むことによって急速細胞株生成に使用され得る。ＦＦＰＥ対照の生成方法は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０３３５５３３号に提供される。したがって、ＦＦＰＥ材料は、細胞成長後に核酸を細胞に直接導入することによって生成され、ＦＦＰＥ材料に加工された。これは、変異細胞材料の生成時間を７ヶ月から１日に減少させ、著しい時間と費用の節約を表す。また、細胞成長後に核酸を導入することによって、細胞成長を阻害し得るか、または細胞死につながり得る多くの有毒な組み合わせを回避することができる。これはまた、１つの細胞株が、同数の突然変異に必要とされる１０＋の操作された細胞株に対して数百の突然変異を収容することができるため、細胞を成長させ、保管するプロセスを簡略化する。本明細書に記載される試薬及び方法は、例えば、１つ以上の所定の突然変異を含有する１つ以上の所定の核酸配列を含有する単一細胞の生成を可能にする。本明細書に提供される試薬及び方法は、無制限数のプラスミドまたはＲＮＡ転写物を含有する任意の細胞株の生成を可能にする。さらに、本明細書に提供される試薬及び方法は、非天然の核酸を操作された細胞株のゲノムに統合する必要がない。
この方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞にトランスフェクトすることによって実行可能であることが明示された。ＤＮＡ研究の場合、非成長ＨＥＫ２９３細胞は、８個の異なるＤＮＡ断片で同時にトランスフェクトされ、それぞれが約６〜１４ｋｂの長さであり、それぞれがおよそ５０個の異なる突然変異を含有する。リポフェクタミン２０００をトランスフェクションに使用した。続いて、細胞をポリマーと混合し、ＦＦＰＥ材料に加工する。ＦＦＰＥ材料からのＤＮＡを抽出し、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２を使用して検査した。３００を超えるホットスポット変異形が、シーケンシングから検出された。表１０及び表１１は、ＤＮＡトランスフェクション方法の結果を示すデータを提供する。本明細書に提供される方法は、核酸を細胞中に導入するために好適な任意の技法と併用され得ることが理解される。一般に、トランスフェクション試薬は、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドに結合するか、またはそれらと複合して、それらの細胞への進入を媒介する、１つまたは複数の化合物である。トランスフェクション試薬はまた、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの、細胞への結合及び内在化を媒介する。トランスフェクション試薬の例としては、カチオン性リポソーム及び脂質、ポリアミン、リン酸カルシウム沈殿物、ヒストンタンパク質、ポリエチレンイミン、及びポリリジン複合体が挙げられる。ヒストン及びプロタミンのようなカチオン性タンパク質、またはポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレン、及びポリエチレンイミンのような合成ポリマーは、有効な細胞内送達剤であり得るが、スペルミンのような小ポリカチオンは、有効でないことが示された。典型的に、トランスフェクション試薬は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの負電荷に結合する正味の正電荷を有する。トランスフェクション試薬は、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの、細胞への結合を媒介するか、または細胞において受容体に結合するリガンドを経由する。例えば、カチオン性リポソームまたはポリリジン複合体は、正味の正電荷を有し、それがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することを可能にする。追加の処理なしに遺伝子導入を促進するポリエチレンイミンは、恐らくエンドソーム機能自体を崩壊させる。他のビヒクルもまた、先行技術において、遺伝子を細胞に導入するために使用される。これらは、核酸を粒子上で複合することを含み、その後、細胞中へと加速される。これは、「微粒子銃」または「銃」技法と呼ばれる。他の方法としては、電気穿孔、微量注入、リポソーム融合、プロトプラスト融合、ウイルス感染、及びイオン泳動が挙げられる。
加えて、高速ＦＦＰＥ方法が、典型的なＦＦＰＥ材料について予想されるように断片化ＤＮＡを生成したかどうかを評価するために、異なる長さのＤＮＡを増幅させるｑＰＣＲアッセイを使用して、ＦＦＰＥ ＤＮＡを無傷のプラスミドＤＮＡと比較した。この研究は、ＦＦＰＥ ＤＮＡが、プラスミドよりも多く断片化されたことを明示した。
ＲＮＡ研究の場合、２つの異なるＥＭＬ４−ＡＬＫインビトロ融合遺伝子ＲＮＡ転写物を生成し、リポフェクタミン２０００を使用して非成長ＨＥＫ ２９３にトランスフェクトした。続いて、細胞をＦＦＰＥ材料に加工した。ＦＦＰＥ材料からのＲＮＡを抽出し、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を特異的に増幅する２つのｑＰＣＲアッセイを使用して試験した。ＦＦＰＥ材料は、両方の転写物について陽性であった。表１２は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合のＲＮＡ転写物がトランスフェクション後に検出可能であることを示すデータを提供する。
本明細書に提供されるこれらの試薬及び方法は、数百の異なるＤＮＡまたはＲＮＡ突然変異を含有するＦＦＰＥ材料が、単一トランスフェクションによって作製され得ること、及びそのような材料から抽出された核酸が、真のＦＦＰＥ材料の態様を示すことを明示する。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されたが、そのような実施形態が単なる例として提供されることは当業者には明らかであろう。ここで当業者であれば、本発明から逸脱することなく多数の変型、変更、及び置換を想到するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替例が、本発明の実施において用いられ得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法と構造、及びそれらの同等物が、それにより網羅されることが意図される。
＊ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ、ポリープ症における欠失２．５（ＤＰ２．５）；染色体５：１１２．０４〜１１２．１８Ｍｂ；参照配列ＮＭ＿００００３８及びＮＰ＿００００２９）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体（Ｍ−ＣＳＦＲ）、ＣＤ１１５；染色体５、１４９．４３〜１４９．４９Ｍｂ；参照配列ＮＭ＿００５２１１及びＮＭ＿００５２０２）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体；染色体７：５５．０９〜５５．３２Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００５２２８及びＮＰ＿００５２２１９）、ＦＢＸＷ７（Ｆ−ボックス／ＷＤ反復含有タンパク質７；染色体４：１５３．２４〜１５３．４６Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００１０１３４１５及びＮＰ＿００１０１３４３３）、ＦＧＦＲ１（線維芽細胞成長因子受容体１、基本線維芽細胞成長因子受容体１、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ−２／ファイファー症候群、ＣＤ３３１；染色体８：３８．２７〜３８．３３Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００１１７４０６３及びＮＰ＿００１１６７５３４）、ＦＧＦＲ３（線維芽細胞成長因子受容体３、ＣＤ３３３；染色体４：１．８〜１．８１Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿０００１４２及びＮＰ＿０００１３３）、ＦＬＴ３（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３、ＣＤ１３５、胎児肝臓キナーゼ−２（Ｆｌｋ２）；染色体１３：２８．５８〜２８．６７Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００４１１９及びＮＰ＿００４１１０）、ＧＮＡ１１（グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットα−１１；染色体１９：３．０９〜３．１２Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００２０６７及びＮＰ＿００２０５８）、ＨＮＦ１Ａ（肝細胞核因子１ホメオボックスＡ；染色体１２：１２１．４２〜１２１．４４Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿０００５４５及びＮＰ＿０００５３６）、ＨＲＡＳ（ＧＴＰａｓｅ ＨＲａｓ、形質転換タンパク質ｐ２１；染色体１１：０．５３〜０．５４Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００１１３０４４２及びＮＰ＿００１１２３９１４）、ＩＤＨ１（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＮＡＤＰ＋）、可溶性；染色体２：２０９．１〜２０９．１３Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００５８９６及びＮＰ＿００５８８７）、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体、血管内皮成長因子受容体２、ＣＤ３０９；染色体４：５５．９４〜５５．９９Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００２２５３及びＮＰ＿００２２４４）、ＫＩＴ（マスト／幹細胞成長因子受容体（ＳＣＦＲ）、プロト発癌遺伝子ｃ−Ｋｉｔ、チロシン−タンパク質キナーゼＫｉｔ、ＣＤ１１７；染色体４：５５．５２〜５５．６１Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿０００２２２及びＮＰ＿０００２１３）、ＫＲＡＳ（ＧＴＰａｓｅ ＫＲａｓ、Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス発癌遺伝子ホモログ；染色体１２：２５．３６〜２５．４Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００４９８５−ＮＰ＿００４９７６）、ＭＥＴ（ｃ−Ｍｅｔ、ＭＮＮＧ ＨＯＳ形質転換遺伝子、肝細胞成長因子受容体；染色体７：１１６．３１〜１１６．４４Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿０００２４５及びＮＰ＿０００２３６）、ＮＯＴＣＨ１（ノッチホモログ１、転位関連（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）；染色体９：１３９．３９〜１３９．４４；参照配列番号ＮＭ＿０１７６１７及びＮＰ＿０６００８７）、ＰＤＧＦＲＡ（α型血小板由来成長因子受容体；染色体４：５５．１〜５５．１６Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００６２０６及びＮＰ＿００６１９７）、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０αタンパク質；染色体３：１７８．８７〜１７８．９６Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００６２１８及びＮＰ＿００６２０９）、ＲＥＴ（受容体チロシンキナーゼ；染色体１０：４３．５７〜４３．６４；参照配列番号ＮＭ＿０００３２３及びＮＰ＿０６５６８１）、ＳＭＡＤ４（染色体１８：４８．４９〜４８．６１Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００５３５９及びＮＰ＿００５３５０）、ＳＭＡＲＣＢ１（クロマチンサブファミリーＢメンバー１のＳＷＩ／ＳＮＦ関連マトリックス関連アクチン依存調節因子；染色体２２：２４．１３〜２４．１８Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００１００７４６８及びＮＰ＿００１００７４６９）、ＳＭＯ（平滑化；染色体７：１２８．８３〜１２８．８５Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿００５６３１及びＮＰ＿００５６２２）、ＳＴＫ１１（セリン／トレオニンキナーゼ１１、肝臓キナーゼＢ１（ＬＫＢ１）、腎癌抗原ＮＹ−ＲＥＮ−１９；染色体１９：１．１９〜１．２３Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿０００４５５及びＮＰ＿０００４４６）、ＴＰ５３（タンパク質５３、腫瘍タンパク質５３；染色体１７：７．５７〜７．５９Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿０００５４６及びＮＰ＿０００５３７）、ＶＨＬ（フォン・ヒッペル−リンダウ腫瘍抑制因子；染色体３：１０．１８〜１０．１９Ｍｂ；参照配列番号ＮＭ＿０００５５１及びＮＰ＿０００５４２）。
これらの参照配列のそれぞれの１つ以上の変異形は、各対照配列及び／または対照試薬においても表され得る。いくつかの実施形態では、例えば、各参照配列に対して複数の変異形が含まれ得る。参照配列のパネルは、特定の代謝、遺伝子情報処理、環境情報処理、細胞プロセス、有機体系、疾患、薬物開発、または他の経路（例えば、ＫＥＧＧ経路（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ．ｈｔｍｌ、２０１３年１１月８日））を表すように設計されてもよい。これらのような対照試薬は、別個にアッセイされ得るか、または単一アッセイに組み合わされ得る。対照試薬は、様々な量の各参照配列及び／またはその変異形を含むように設計されてもよい。
Claims (5)
- ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）対照を調製するための方法であって、前記方法が、
ａ）定義された濃度の細胞材料を得ることと、
ｂ）前記細胞材料に、参照配列の複数の変異形または前記参照配列との変異形の混合物を含む核酸分子または核酸分子の混合物を導入することと、
ｃ）ｂ）の前記細胞材料をゲル化ポリマーと混合し、ゲル／細胞材料を作製することと、
ｄ）前記ゲル化ポリマーが凝固するまで、前記ゲル／細胞材料を定義された形状を有する型に添加することと、を含む、方法。 - 前記変異形が、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、多塩基多型（ＭＮＰ）、挿入、欠失、コピー数変異、遺伝子融合、重複、反転、反復多型、参照配列のホモポリマー、及び／または非ヒト配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 複数の変異形を含む前記核酸分子または前記核酸分子の混合物が、少なくとも３０個の変異形を含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記核酸分子または前記核酸分子の混合物が、癌、遺伝性疾患、感染性疾患に関連する変異形を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜５に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生されるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）対照を含むキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562232261P | 2015-09-24 | 2015-09-24 | |
| US62/232,261 | 2015-09-24 | ||
| PCT/US2016/053280 WO2017053683A1 (en) | 2015-09-24 | 2016-09-23 | Formalin fixed paraffin embedded (ffpe) control reagents |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018534914A true JP2018534914A (ja) | 2018-11-29 |
Family
ID=57124130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018514429A Pending JP2018534914A (ja) | 2015-09-24 | 2016-09-23 | ホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｆｐｅ）対照試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20170088892A1 (ja) |
| EP (1) | EP3353521A1 (ja) |
| JP (1) | JP2018534914A (ja) |
| GB (1) | GB2559898B (ja) |
| WO (1) | WO2017053683A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7054133B2 (ja) | 2017-11-09 | 2022-04-13 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | 配列解析方法、配列解析装置、参照配列の生成方法、参照配列生成装置、プログラム、および記録媒体 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2627984B1 (en) * | 2010-10-12 | 2017-08-16 | Life Technologies Corporation | Method of preparing quality control material for ffpe |
| WO2015069791A1 (en) * | 2013-11-05 | 2015-05-14 | Life Technologies Corporation | Method for preparing ffpe quality control material with bulking agent |
| WO2015073080A1 (en) * | 2013-11-12 | 2015-05-21 | Life Technologies Corporation | Reagents and methods for sequencing |
-
2016
- 2016-09-23 JP JP2018514429A patent/JP2018534914A/ja active Pending
- 2016-09-23 WO PCT/US2016/053280 patent/WO2017053683A1/en active Application Filing
- 2016-09-23 EP EP16779246.4A patent/EP3353521A1/en not_active Withdrawn
- 2016-09-23 US US15/274,053 patent/US20170088892A1/en not_active Abandoned
- 2016-09-23 GB GB1805509.5A patent/GB2559898B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2559898A (en) | 2018-08-22 |
| US20170088892A1 (en) | 2017-03-30 |
| GB201805509D0 (en) | 2018-05-16 |
| GB2559898B (en) | 2019-12-11 |
| EP3353521A1 (en) | 2018-08-01 |
| WO2017053683A1 (en) | 2017-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Laffleur et al. | Noncoding RNA processing by DIS3 regulates chromosomal architecture and somatic hypermutation in B cells | |
| US10913981B2 (en) | Reagents and methods for sequencing | |
| JP6998404B2 (ja) | 標的ヌクレオチド配列の富化及び決定方法 | |
| JP7229923B2 (ja) | ヌクレアーゼ切断を評価する方法 | |
| Del Vecchio et al. | Next-generation sequencing: recent applications to the analysis of colorectal cancer | |
| US20150126376A1 (en) | Compositions and methods for sensitive mutation detection in nucleic acid molecules | |
| CN110392739B (zh) | 检测dna突变的测序方法 | |
| JP2019503182A (ja) | 腫瘍のディープシークエンシングプロファイリング | |
| JP2020501554A (ja) | 短いｄｎａ断片を連結することによる一分子シーケンスのスループットを増加する方法 | |
| CN110799643B (zh) | 用于细胞谱系的多重定量分析的组合物和方法 | |
| US20220090204A1 (en) | Dna reference standard and use thereof | |
| Moens et al. | HaloPlex targeted resequencing for mutation detection in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded tumor samples | |
| JP2018534914A (ja) | ホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｆｐｅ）対照試薬 | |
| Chardon et al. | A multiplex, prime editing framework for identifying drug resistance variants at scale | |
| US10610521B2 (en) | Biomarkers for response to rapamycin analogs | |
| EP3604521A1 (en) | Method for evaluating multiple different genes of interest | |
| US20190115105A1 (en) | Tandem duplicator phenotype (tdp) as a distinct genomic configuration in cancer and use thereof | |
| US20220127601A1 (en) | Method of determining the origin of nucleic acids in a mixed sample | |
| WO2012049279A1 (en) | MEANS AND METHODS APPLYING SINGLE NUCLEOTIDE PRIMER EXTENSION WITH ION PAIR-, REVERSED-PHASE HPLC (SIRPH) FOR THE DIAGNOSIS OF SNPs | |
| Dunwell et al. | Adaptor template oligo-mediated sequencing (ATOM-Seq): a versatile and ultra-sensitive UMI-based NGS library preparation technology, for use with cfDNA and cfRNA | |
| CA3216028A1 (en) | Synthetic polynucleotides and method of use thereof in genetic analysis | |
| EP4158053A1 (en) | Oligonucleotide adapters and method | |
| Hosseinabadi | Genomics of lung cancer: tumor evolution, heterogeneity and drug resistance | |
| Kaufman et al. | Single-Step qPCR and dPCR Detection of Diverse CRISPR-Cas9 Gene Editing Events In Vivo. | |
| CN115698328A (zh) | 参考梯状物和衔接子 |