JP2018526027A - 発酵によるα−イオノン製造の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の態様は、リコペン−ε−シクラーゼをコードする核酸に関する。本発明によるその核酸は、リコペンからε−カロテンへの変換を触媒するリコペン−ε−シクラーゼ(EC)をコードする配列を含むことを特徴とし、リコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、配列番号26による配列を有する参照リコペン−ε−シクラーゼ(AtECmut1)より高いε−カロテン収量をもたらす。
本発明の一部はまた、リコペン、ε−カロテン、および/またはα−イオノン生合成の本発明の構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む種々のプラスミドである。本発明によるこれらのプラスミドの特に好ましい実施形態は図14に列挙されている。
本発明による「Lyc合成」プラスミドは、以下の酵素:ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、およびフィトエンシンターゼ(crtB)をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、そのプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、プラスミドpAC−BETAipi−ΔcrtY(配列番号28)によりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較して、リコペン収量の増加をもたらす。
本発明による「eCaro合成」プラスミドは、以下の酵素:ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、フィトエンシンターゼ(crtB)、およびリコペン−ε−シクラーゼ(EC)をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、そのプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、プラスミドpAC−BETAIPI−ΔcrtY(配列番号28)によりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較して、リコペン収量の増加をもたらす。
本発明による「eCaro開裂」プラスミドは、酵素カロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
本発明による「イオノン合成」プラスミドは、以下の酵素:ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、フィトエンシンターゼ(crtB)、リコペン−ε−シクラーゼ(EC)、およびカロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とし、そのプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、プラスミドpAC−BETAIPI−ΔcrtY(配列番号28)によりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較して、リコペン収量の増加をもたらす。
本発明による「MEP経路」プラスミドは、以下の酵素:1−デスオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ(DXS)をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
本発明のさらなる態様は、本発明による発現カセットに関し、当業者は、それを、図、特に図3、4、7、および9〜14、加えて、配列プロトコールから理解することができる。本発明による発現カセットは、それが本発明による微生物のゲノムに組み込まれている形で、存在することができる。発現カセットは、当業者に知られている方法、特に相同組換えを用いて、微生物のゲノムへ組み込むことができる。好ましい実施形態において、本発明による発現カセットは、大腸菌(E. coli)株、特にXL1−blue、TOP10、XL10 blue、DH5−α、JM109、C41、BL21gold(DE3)、およびW3110に存在することができる。特に、本発明による微生物は、大腸菌(E. coli)株TOP10であり得る。特に好ましいのは、大腸菌(E. coli)株BL21gold(DE3)である。
本発明による微生物は、以下の酵素:ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、フィトエンシンターゼ(crtB)、およびリコペン−ε−シクラーゼ(EC)、またはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、フィトエンシンターゼ(crtB)、リコペン−ε−シクラーゼ(EC)、およびカロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有することを特徴とする。
本発明によるリコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法は、以下の酵素:ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、フィトエンシンターゼ(crtB)、およびリコペン−ε−シクラーゼ(EC)をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物を培養することを含む。
本発明による鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法は、以下の酵素:ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、フィトエンシンターゼ(crtB)、リコペン−ε−シクラーゼ(EC)、およびカロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物の培養を含む。
それに先行する実施形態およびそれに続く実施形態のいずれとも組み合わせられ得る、本発明の以下のさらなる実施形態が記載される。
a.ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
b.イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、
c.フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、および
d.フィトエンシンターゼ(crtB)
をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするプラスミドであって、そのプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、プラスミドpAC−BETAIPI−ΔcrtY(配列番号28)によりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較してリコペン収量の増加をもたらす、プラスミド。
a.ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、フィトエンシンターゼ(crtB)、およびリコペン−ε−シクラーゼ(EC)、または
b.ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、フィトエンシンターゼ(crtB)、リコペン−ε−シクラーゼ(EC)、およびカロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)。
a.ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
b.イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、
c.フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、
d.フィトエンシンターゼ(crtB)、および
e.リコペン−ε−シクラーゼ(EC)。
a.ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
b.イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、
c.フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、
d.フィトエンシンターゼ(crtB)、
e.リコペン−ε−シクラーゼ(EC)、および
f.カロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)。
実施例
発現ベクターを最適化するための出発材料は、E.ヘルビコーラ(E. herbicola)のカロテノイド遺伝子(crtE、IPI、crtB、および20 crtI)を有するプラスミドpAC−BETAipi(Cunningham et al., 2007)であった。とりわけ、プラスミドpAC−BETAipiを、当業者に知られた分子生物学標準方法(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989 (Nolan C, Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)を用いてプラスミドpGT1036(配列番号11)を作製するために以下のように改変した:欠失984〜1394、欠失3432〜5356、および欠失7761〜25 8399。生じたプラスミドpGT1036のプラスミドマップは、図3Aに描かれており、図3Bは、pGT1036の完全な核酸配列を記載する。
発現プラスミドpGJ2720(Jach et al. 2006)から出発して、10bp逆方向反復に隣接される18bpのランダム配列からなる短いDNA配列を、レポーター遺伝子RFP(赤色蛍光タンパク質)の3’末端に導入した。以下のプライマーを、PCR反応に用いた(N=ランダムヌクレオチド):
配列番号1:NNNNNNNNAACGGGATTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCC
配列番号2:NNNNNNNNNNAACGGGCTTTGTTAGCAGCCGG
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)遺伝子At5g57030によりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ(EC)のインシリコ分析を行い、それにより、そのタンパク質配列の(N末端メチオニンを除く)最初の44個のアミノ酸が葉緑体局在化シグナル(輸送ペプチド)を構成することが示された。そのゲノム遺伝子配列は複数のイントロンを含有し、それゆえに、その酵素の微生物発現に適切ではないため、PCRを用いて、シロイヌナズナ(A. thaliana)cDNAからの成熟タンパク質の決定されたコード領域(AtEC−del、配列番号19)を増幅した。その後、それを発現プラスミドpGJ2720においてサブクローニングし、生じたDNA配列を検証した。
分子生物学標準手順を用いて、リコペン−ε−シクラーゼ(EC)発現カセットを作製した。Lacプロモーター(pLac)、AtEC−del(配列番号19)をコードする配列、およびターミネーターaTerm5(実施例2参照)からなる作製されたEC発現カセットを、PCR反応を用いて増幅し、作製されたプラスミドpGT1036(図3A、配列番号11)へ導入した。図4は、例示的に、ECmut3についての遺伝子を含有する発現プラスミド(pGT1066、配列番号17)についてのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列を示す。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標的変異(L404H、A445S、L404H/A445S、A403S/L404H)またはランダム変異を、AtEC−del−アミノ酸配列の位置403/404および/または445へPCR反応を用いて導入した(図5参照)。
配列番号3:GTCTTGCACACATAGTTCAATTCG
配列番号4:CTATGTGTGCAAGACCAAAGAGAAAGAATGCTCTCTG
配列番号5:CTCTTTTCTTTATACATGTTCGTCATTTCACC
配列番号6:GTATAAAGAAAAGAGAACGAGATCTCCTG
配列番号7:GTCTTTCACACATAGTTCAATTCGATACCG
配列番号8:CTATGTGTGAAAGACCAAAGAGAAAGAATGCTC
配列番号9:GCATTCTTTCTCTTTGGTCTTNNKNNKATAGTTCAATTCGATACCGAAGGC
配列番号10:CCAAAGAGAAAGAATGCTCTCTG
単一変異体:
ECmut2(A445S)、ECmut9(L404S)
二重変異体:
ECmut4(A403S/L404H)、ECmut5(A403F/L404W)、ECmut6(A403G/L404G)、
ECmut7(A403K/L404D)、ECmut8(A403W/L404R)、ECmut10(A403S/L404T)、ECmut11(A403F/L404S)、ECmut12(A403C/L404S)、ECmut13(A403I/L404T)、ECmut14(A403T/L404R)、ECmut15(A403F/L404R)、ECmut16(A403W/L404G)、
ECmut17(A403C/A404C)、ECmut18(A403L/L404V)、ECmut19(A403K/L404R)、ECmut20(A403Y/L404K)、ECmut21(A403Q/L404K)、ECmut22(A403G/L404Q)
三重変異体:
ECmut3.1(A403S/L404H/A445S)、ECmut3.2(A403C/L404C/A445S)、
ECmut3.3(A403E/L404A/A445S)、ECmut3.4(A403W/L404R/A445S)、
ECmut3.5(A403M/L404A/A445S)、ECmut3.6(A403N/L404T/A445S)、
ECmut3.7(A403N/L404A/A445S)、ECmut3.8(A403H/L404S/A445S)、
ECmut3.9(A403E/L404G/A445S)、ECmut3.11(A403K/L404G/A445S)、
ECmut3.13(A403R/L404S/A445S)、ECmut3.14(A403G/L404R/A445S)、
ECmut3.15(A403F/L404V/A445S)、ECmut3.16(A403G/L404G/A445S)。
全ての発現プラスミドを、形質転換を用いて、大腸菌(E. coli)TOP10細胞へ導入した。宿主細胞の形質転換を、標準方法(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989 (Nolan C, Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)に従って、行った。
組換え株を、それらの合成されたカロテノイドに関して、HPLCを用いて、分析した。
振盪フラスコ培養におけるα−イオノンの製造について、最初、本発明による発現プラスミド(例えば、ECmut3をコードするpGT1066およびCCD1発現プラスミドpGT1069またはpGT1070)を一緒に、標準形質転換プロトコールを用いて大腸菌(E. coli)TOP10へ導入し、その後、LB培地を含む寒天プレート上で選択条件(クロラムフェニコール(25mg/L)およびアンピシリン(100mg/L)での選択)下、培養した(28〜30℃で24時間のインキュベーション)。基質ε−カロテンの産生について、液体培地(dYT+クロラムフェニコール(25mg/L)およびアンピシリン(100mg/L))に、得られたプレートからの単一コロニーを接種し、その培養物を、振盪(200rpm)下、28〜30℃で24時間、培養した。その後、カロテノイド酸化開裂酵素(CCD)の発現、および形成されたε−カロテンからα−イオノンへの変換を、誘導培地(dYT+0.5%アラビノース+クロラムフェニコール(25mg/L)およびアンピシリン(100mg/L))の添加によって開始した。最初の体積の1/5を加えた。その後、その培養物を、28℃でさらに4時間、インキュベートした。形成されたα−イオノンの抽出について、細菌細胞を、遠心分離(10分間;5000rpm)により分離し、続いて、溶解させ、その可溶化液をジエチルエーテルと共に振盪した。
産生されたε−カロテンを定量的に変換し、そのことは、すでに、細胞の変色に基づいて巨視的に目に見えた。形成されたα−イオノンの抽出について、実施例7にすでに記載されているように、細菌細胞を、遠心分離(10分間;5000g)により分離し、続いて、溶解させ、その可溶化液をジエチルエーテルと共に振盪した。生じた調製物を、HPLCおよびLC−MSにより分析した(図8)。細菌カロテノイド抽出物のHPLC分析を、3ポンプシステムおよびダイオードアレイ検出器を有するHPシリーズII 1090液体クロマトグラフ(Agilent Technologies、Boblingen)を用いて行った。分離について、Zorbax SB−C18分離カラム(3.5μm、4.6×150mm、Agilent Technologies、Boblingen)を40℃のカラム温度で用いた。カロテノイドの分離は、最初、2分間、アセトニトリル(AcN)中20%酢酸エチル(EtAc)での均一濃度で、続いて、AcN中20%EtAc〜AcN中50%EtAcの勾配で10分間、その後、AcN中50%EtAcでの均一濃度で3分間、1分間あたり1mlの流速で行われた。分析を、LC用HP ChemStationバージョンA.05.02を用いて行い、α−、β−、δ−、およびε−カロテンについて450nmの波長、ならびにα−およびβ−イオノンについて280nmで行った。
発酵的に製造されたα−イオノンの鏡像異性体分布/純度に関する分析をGC−質量分析法により行った。調製について、ジエチルエーテル抽出物(実施例8参照)を蒸発乾固して、ジエチルエーテルを除去し、得られた乾燥物質をアセトニトリル中に溶解した。その後、この試料を、希釈せずにGC−質量分析法に用いた。
この目的を達成するために、鏡像異性体選択ガスクロマトグラフィ/質量分析法(GC/MS)を以下のように行った:質量スペクトルを、質量分析計Saturn 2000(Varian、Darmstadt)に連結されたガスクロマトグラフVarian 3800(Varian、Darmstadt)で作成した。α−イオノンの鏡像異性体分布の決定について、質量スペクトルを、70eVのイオン化エネルギーでのCI様式において記録した。以下のキャピラリーカラムを用いた:BGB174、30m×0.25mm内径(ID)、0.25μmフィルム厚さ、Phenomenex。GC/MSについての以下の条件を用いた:
・試料注入:カラム上、40℃、1μl注入体積
・キャリアガス:ヘリウム、流速35cm/秒
・質量分析計:イオントラップSaturn 2000−2000 R、Varian、Darmstadt
・温度プログラム:70℃で0分間、1分あたり4℃の増加、220℃で5分間である、温度勾配70〜220℃。
この目的を達成するために、半定量的ガスクロマトグラフィ/質量分析法(GC/MS)を、質量分析計Saturn 2000(Varian、Darmstadt)に連結されたガスクロマトグラフVarian 3800(Varian、Darmstadt)を用いて実施した。β−イオノン質量スペクトルの半定量的決定について、70eVのイオン化エネルギーでのEI様式で記録された。以下のキャピラリーカラムを用いた:FFAP、30m×0.25mm内径(ID)、0.25μmフィルム厚さ、Phenomenex。
・試料注入:カラム上、40℃、1μl注入体積
・キャリアガス:ヘリウム、流速35cm/秒
・質量分析計:イオントラップSaturn 2000−2000 R、Varian、Darmstadt
・温度プログラム:40℃で1分間、1分あたり60℃の増加、240℃で5分間である、温度勾配40〜240℃。
α−イオノン試料について、100%[R]0%[S]の鏡像異性体分布が決定された。その試料は、鏡像異性的に純粋な(R)−α−イオノンを含有する。
プロモーターの選択で、中間体(リコペン、ε−カロテン)および最終産物(α−イオノン)の合成は、微調整することができる。この目的を達成するために、誘導性または構成的プロモーターを用いることができる。多数の遊離プラスミドを有する微生物の構築、または微生物ゲノムにおける1つの発現カセット、それぞれの組込みに依存して、異なるプロモーター強度が望ましい。
・pTet:大腸菌(E. coli)プラスミドpBR332()由来のテトラサイクリンプロモーター、構成的
・pLac:Lacプロモーター、ゲノム大腸菌(E. coli)Lac−オペロンのプロモーター領域
・pBAD:アラビノース誘導性プロモーター;ゲノム大腸菌(E. coli)アラビノース−オペロンのプロモーター領域
・pXylプロモーター:キシロース誘導性プロモーター;ポリシストロニックオペロンxylA/xylBおよびxylF/xylG/xylH/xylRを調節する双方向性プロモーター領域(シス−制御配列)からなる、大腸菌(E. coli)キシロース−オペロン由来の制御配列、それの活性は、xylFGHRオペロンのxylR遺伝子産物を通して制御される
・pTet−m1:Lycオペロンの前のプロモーターにおける12bp−欠失、プロモーター活性は2.8倍、増加している
・pXyl0:合成キシロース誘導性プロモーター。(xylF−、xylG−、およびxylH−遺伝子配列の欠失を用いることによる)xylR遺伝子のシス−制御配列との直接的カップリングにより作製される。基本的構築物。誘導能:25×;相対的発現強度(最大):参照プロモーター(pLac)の2.5%
・pXyl1:標的遺伝子の効率的翻訳のためのpXyl0の最適化リボソーム結合部位(シャイン・ダルガノ配列)との組合せ。プロモーターは、pXyl0より3〜4倍、活性が高い(pLac活性の最大10%)。
・pXyl2:pXyl1に基づいて、下流指向性プロモーターエレメントの−10領域(RNAポリメラーゼの結合部位)の配列が改変された。プロモーターは、pXyl0より3〜4倍、活性が高い(pLac活性の最大36%)。
用いられたプロモーターは、PCRに基づいたアプローチによって作製された構成的発現プロモーターのコレクションに由来した。プロモーターを含まないRFPレポーター構築物(pGJ2720del)は、この関連において鋳型としての機能を果たした。逆PCRアプローチを用いて、全プラスミド配列は、プルーフリーディングポリメラーゼで増幅され、そのDNA断片は、オリゴヌクレオチドプライマーに含有される追加の配列によって伸長される。プライマー1(−10プライマー)は、レポーター遺伝子の前のリボソーム結合部位の領域における鋳型DNAと結合する。それの伸長は、9個のランダム塩基、続いて、配列TATAATおよび6個の追加のランダム塩基からなる。プライマー2は、プライマー1の結合部位の前に直接、(逆配向で)結合する。プライマー2伸長(−35プライマー)は、9個のランダム塩基、続いて、配列TGTCAAおよび6個のさらなるランダム塩基からなる。プライマー1および2は60℃のアニーリング温度を有する。プライマーを、酵素ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)で製造会社の使用説明書に従ってリン酸化し、その後、以下のPCRプログラムで、鋳型の増幅に用いた:98℃で2分間、続いて98℃で45秒間、60℃で30秒間、および72℃で2分間の30サイクル。生じたPCR断片を、アガロースゲル上で電気泳動的に分離させ、DNAバンドをゲルから単離した(PCRおよびゲル抽出キット、Machery & Nagel)。酵素T4−DNAリガーゼを用いて、単離されたDNA断片の自己ライゲーションを実施した。ライゲーション生成物を、標準形質転換方法を用いて大腸菌(E. coli)XL1細胞へ形質転換し、組換え細胞を選択培地上で培養した。生じた機能性プロモーターの選択を、RFPレポーター遺伝子発現(赤色呈色)に基づいて、最大に誘導されたpLacプロモーターの調節下でRFPレポーター遺伝子を発現する対応する微生物と比較して、巨視的に行った。種々の発現レベルを有するクローンを選択し、プラスミドDNAを単離し、それぞれ得られたプロモーター配列を、DNAシーケンシングにより同定した。命名は、クローン選択によるスキームaPxxに従って行った。プロモーター番号は発現強度と相関しない。
・aP12:活性:(誘導された)pLacプロモーターの35%
・aP15:活性:(誘導された)pLacプロモーターの39%
・pP32:活性:(誘導された)pLacプロモーターの51%
・aP47.2:活性:(誘導された)pLacプロモーターの180%
カロテノイド産生性大腸菌(E. coli)株を、液体dYT培地中、28℃で18〜48時間、培養する。生じた培養物の細胞密度(=OD600)を、光度計において600nmでの吸収を測定することにより決定する。必要に応じて、培養物を、0.1〜0.8の範囲に吸光度値を示すようにdYT培地で適切に希釈する(通常1:10)。結果に基づいて、培養物を、OD600/ml=4に調整する(新鮮な培地での希釈)。これらの培養物の1mLからの細胞を、遠心分離(1分間、13,000rpm)によりペレット化し、上清を移す。ペレットがまだカロテノイドを含有する(呈色がまだ目に見える)場合には、抽出を繰り返し、抽出物の上清を混ぜ合わせる。抽出物のカロテノイド濃度を、吸収スペクトルを記録し、474nm(リコペン)または442nm(e−カロテン)における測定された吸光度を特定の吸光係数(リコペン:3450(L/g・cm);e−カロテン:2900(L/g・cm))に基づいて変換することにより測光的に(g/Lで)決定する。抽出された細胞質量の乾燥重量を、測定された細胞密度から以下の実験的に決定された式を用いて計算する:TGw(g/L)=0.35×OD600。カロテノイド合成能力の評価について、バイオマスあたりのカロテノイド量(mgカロテノイド/g TGw)を決定する。
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Claims (39)
- 以下の酵素をコードする異種性ヌクレオチド配列を含む微生物を培養することを含む、鏡像異性的に純粋なα−イオノンを製造する方法:
a.ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
b.イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(ipi)、
c.フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、
d.フィトエンシンターゼ(crtB)、
e.リコペン−ε−シクラーゼ(EC)、および
f.カロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)。 - 前記ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼがゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼcrtEまたはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼidsAである、請求項1に記載の方法。
- 前記リコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、配列番号19による配列と少なくとも80%配列同一性を有し、かつ前記配列番号19による配列から位置403、404、および445の少なくとも1つにおいて逸脱している、請求項1または2に記載の方法。
- 前記リコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、以下の変異または変異組合せ:ECmut9(L404S)、ECmut10(A403S/L404T)、ECmut3.3(A403E/L404A/A445S)、およびECmut3.2(A403C/L404C/A445S)の1つを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)がシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)またはウスキモクセイ(Osmanthus fragrans)由来のカロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が1つまたは複数のプラスミド上にコードされている、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のプラスミドが前記微生物において個々の構造として存在し、または前記微生物のゲノムへ組み込まれている、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- コードされた酵素が共発現する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、配列番号30、31、32、33、34、35、または36による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、配列番号21、24、37、38、39、40、41、または42による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、配列番号43または44による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、配列番号45、46、または47による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、配列番号33による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミド、および配列番号37による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミドを含有し、あるいは
前記微生物が、配列番号33による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミド、および配列番号41による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミドを含有し、あるいは
前記微生物が、配列番号44による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミド、および配列番号45による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミドを含有する、
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。 - リコペンからε−カロテンへの変換を触媒するリコペン−ε−シクラーゼ(EC)をコードする配列を含むことを特徴とする核酸であって、コードされたリコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、配列番号26による配列を有する参照リコペン−ε−シクラーゼ(EC)より高いε−カロテン収量をもたらす、核酸。
- 前記コードされたリコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、配列番号19による配列と少なくとも80%配列同一性を有する配列を有する、請求項14に記載の核酸。
- 前記コードされたリコペン−ε−シクラーゼ(EC)の配列が、配列番号19による配列から位置403、404、および445の少なくとも1つにおいて逸脱している、請求項15に記載の核酸。
- 前記コードされたリコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、以下の変異または変異組合せ:ECmut9(L404S)、ECmut10(A403S/L404T)、ECmut3.3(A403E/L404A/A445S)、およびECmut3.2(A403C/L404C/A445S)の1つを含む、請求項15または16に記載の核酸。
- 前記コードされたリコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、以下の変異または変異組合せ:ECmut9(L404S)、ECmut10(A403S/L404T)、ECmut3.3(A403E/L404A/A445S)、およびECmut3.2(A403C/L404C/A445S)の1つを有する、配列番号19による配列からなる、請求項15から17のいずれか一項に記載の核酸。
- 請求項14から18のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ(EC)。
- 以下の酵素:
a.ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
b.イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPI)、
c.フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、および
d.フィトエンシンターゼ(crtB)
をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするプラスミドであって、前記プラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現が、pAC−BETAipi−ΔcrtYプラスミドによりコードされるリコペン生合成経路の異種性発現と比較してリコペン収量の増加をもたらす、プラスミド。 - 参照配列と少なくとも80%配列同一性を有する配列を含み、前記参照配列が配列番号11による配列である、請求項20に記載のプラスミド。
- 請求項14から18のいずれか一項に記載の核酸配列をさらに含む、請求項20または21に記載のプラスミド。
- 参照配列と少なくとも80%配列同一性を有する配列を含み、前記参照配列が配列番号18による配列である、請求項20から22のいずれか一項に記載のプラスミド。
- 参照配列と少なくとも80%配列同一性を有する配列を含む、プラスミドであって、前記参照配列が配列番号29による配列であり、前記プラスミドによりコードされるリコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、以下の変異または変異組合せ:ECmut9(L404S)、ECmut10(A403S/L404T)、ECmut3.3(A403E/L404A/A445S)、およびECmut3.2(A403C/L404C/A445S)の1つを有する、請求項20から23のいずれか一項に記載のプラスミド。
- 配列番号31、32、33、34、35、または36による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有する、請求項20から24のいずれか一項に記載のプラスミド。
- シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)またはウスキモクセイ(Osmanthus fragrans)由来のカロテノイド酸化開裂酵素(CCD1)をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項20から25のいずれか一項に記載のプラスミド。
- 配列番号43または44による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有する、請求項20から26のいずれか一項に記載のプラスミド。
- 以下の酵素をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、プラスミド:
a.1−デスオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ(DXS)、および
b.イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ(CwIPI)。 - 配列番号45による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有する、請求項28に記載のプラスミド。
- 以下の酵素をコードする異種性ヌクレオチド配列を含有する微生物を培養することを含む、リコペンから高純度のε−カロテンを製造する方法:
a.ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、
b.イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(ipi)、
c.フィトエンデサチュラーゼ/デヒドロゲナーゼ(crtI)、
d.フィトエンシンターゼ(crtB)、および
e.リコペン−ε−シクラーゼ(EC)。 - 前記ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼがゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼcrtEまたはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼidsAである、請求項30に記載の方法。
- 前記リコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、配列番号19による配列と少なくとも80%配列同一性を有し、かつ前記配列番号19による配列から位置403、404、および445の少なくとも1つにおいて逸脱している、請求項30または31に記載の方法。
- 前記リコペン−ε−シクラーゼ(EC)が、以下の変異または変異組合せ:ECmut9(L404S)、ECmut10(A403S/L404T)、ECmut3.3(A403E/L404A/A445S)、およびECmut3.2(A403C/L404C/A445S)の1つを含む、請求項30から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が1つまたは複数のプラスミド上にコードされている、請求項30から33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のプラスミドが前記微生物において個々の構造として存在し、または前記微生物のゲノムへ組み込まれている、請求項30から34のいずれか一項に記載の方法。
- コードされた酵素が共発現する、請求項30から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、配列番号30、31、32、33、34、35、または36による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項30から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、配列番号45、46、または47による配列と少なくとも80%、または少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一性を有するプラスミドを含有する、請求項30から37のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から13または30から38のいずれか一項に記載の方法において培養される前記微生物による微生物。
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