JP2018516895A - がんにおけるマイクロピノサイトーシス - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、(2015年5月13日に出願された)米国仮特許出願第62/161,219号に基づく優先権および利益を主張しており、その全体の内容は本明細書中に参考として援用される。
本発明は、米国国立がん研究所によって授与されたP01 CA104838の下、政府支援でなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
増殖および分裂するために、細胞は、エネルギーの産生と、高分子の合成とを支援する、栄養物質の供給を要求する。哺乳動物細胞は多様なバイオエナジェティックス基質により取り囲まれているが、優先的に、グルコースおよびアミノ酸など、低分子量の栄養物質を代謝する。しかし、タンパク質は、体液のうちで、最も豊富な有機成分であり、それらを合わせたアミノ酸含量は、ヒト血漿中の単量体アミノ酸の量を、何桁か超える。細胞にアクセス可能な場合、細胞外タンパク質は、代替的な栄養物質として機能する潜在的可能性を有する。
本開示は、他の事柄にもまして、ある特定のがん細胞の、それらの局所的微小環境に対する代謝的適応が、それらを毒素療法に対して脆弱にすることについて教示する。
そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される用語は、本開示の理解を容易とするために、当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有し、一部の用語は、本明細書では、以下の定義に従う意味を有するように使用される。
mTORC1およびmTORC1の阻害
キナーゼであるmTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)とは、細胞内の栄養物質レベルを、成長因子によるシグナル伝達からの入力と連携させて、同化的代謝および増殖を刺激する中心的調節因子である(MaおよびBlenis、2009年;ShimobayashiおよびHall、2014年;Zoncuら、2011年b)。mTORC1は、mTOR自体、Raptor(regulatory−associated protein of mTOR)、MLST8(mammalian lethal with SEC13 protein 8)、PRAS40、およびDEPTORから構成される。mTORC1活性は厳密に、mTORC1の、リソソーム膜への動員を誘導する、十分なレベルの細胞内アミノ酸に依存する(Haraら、1998年;Sancakら、2010年)。ここで、mTORC1は、成長因子によるシグナル伝達からのさらなる入力によっても活性化しうる。活性化したmTORC1は、バイオマスの発生を協奏的に増強する、複数の標的をリン酸化させる。例えば、S6キナーゼ(S6K)および4E結合性タンパク質(4E−BP)のリン酸化を介して、mTORC1は、5’キャップ依存的なタンパク質翻訳を増大させる(MaおよびBlenis、2009年)。逆に、Unc51様キナーゼ1/2(Ulk1/2)の阻害を介して、mTORC1は、オートファジーを抑制し、これにより、細胞内物質の分解を防止する(HeおよびKlionsky、2009年;Mizushima、2010年)。これらの手段により、mTORC1は、好適な成長シグナル、ならびに豊富な栄養物質供給をもたらす環境に応答して、細胞成長を促進する。
マクロピノサイトーシスとは、進化において保存された、エンドサイトーシスの非選択的形態であって、Ras GTPアーゼにより誘発されうる非選択的形態である(Bar-SagiおよびFeramisco、1986年;MercerおよびHelenius、2009年)。マクロピノサイトーシスは、単細胞のアメーバ様真核生物が、細胞外高分子により生存することを可能とするが、それが、後生動物細胞の栄養物質獲得において機能するのかどうかは、十分に理解されていない(Amyereら、2002年)。発がん性のK−Rasシグナル伝達が、マクロピノサイトーシスを促進することにより、増殖するがん細胞の、外因性グルタミン供給への依存性を低減しうることが近年になって示された(Commissoら、2013年)。これは、細胞外タンパク質の異化が、哺乳動物細胞がミトコンドリアバイオエナジェティックスを維持しアポトーシスを抑制することを可能とするアナプレロティック基質をもたらしうることを示唆する。
後生生物の細胞は、外部の鍵因子により、栄養物質の取込みに関与するように命令を受ける。成長因子によるシグナル伝達経路は、細胞周期の進行を刺激するだけでなく、栄養物質の取込みも促進し、同化的代謝も誘発し、これにより、細胞の塊を増大させるのに十分な、高分子の合成のための構成単位の利用可能性を確保する(Thompson、2011年)。この原理は、形質転換細胞に特徴的な、同化的代謝の調節異常を支援するように、構成的に活性化させた成長因子によるシグナル伝達に依拠するがん細胞により利用されている(Vander Heidenら、2009年)。いくつかの成長因子により方向づけられるシグナル伝達経路は、代謝物トランスポーターの発現または表面への提示を増大させることにより、低分子量の栄養物質の、細胞による取込みを増強する。例えば、PI3キナーゼ/Aktシグナル伝達経路およびRasシグナル伝達経路のいずれも、グルコースの取込みを増強する(ManningおよびCantley、2007年;Pylayeva-Guptaら、2011年;Yunら、2009年)。
本開示は特に、Rasの発がん性の活性化を特徴とするがんの処置に関する。一部の実施形態では、Rasの発がん性の活性化を特徴とするがんの処置は、対象へと、mTORC阻害療法と、毒素療法とを含む治療レジメンを投与するステップを含む。一部の実施形態では、mTORC阻害療法を、毒素療法の前に投与する。一部の実施形態では、mTORC阻害療法は、mTORC1阻害剤を含む。
本開示は、栄養物質および/または他の物質を、細胞外空間から取り込む、マクロピノサイトーシスを利用するがん細胞を識別することに関する。本開示はまた、がんの検出に適する組成物にも関する。一部の実施形態では、がんの検出に適する組成物は、がん細胞によるマクロピノサイトーシスのための基質へとコンジュゲートさせたイメージング剤を含む。一部の実施形態では、本発明に適する組成物はさらに、mTORC1阻害剤も含む。一部の実施形態では、がんを、in vivoの対象において検出する。一部の実施形態では、イメージング剤は、金属性である。一部の実施形態では、イメージング剤は、放射性標識されている。
(試薬)
抗体は、Abcam製(ab13524 LAMP2);Cell Signaling製(型番:2215 phospho−S240/244 S6、型番:2217 S6、型番:2280 Raptor、型番:2708 S6K1、型番:2855 phospho−T37/46 4E−BP1、型番:2920 Akt、型番:2983 mTOR、型番:4060 phospho−S473 Akt、型番:4377 phospho−T389 S6K1、型番:4856 phospho−S235/236 S6、型番:6888 phospho−S757 Ulk1、型番:9101 phospho−T202/Y204 Erk1/2、型番:9107 Erk1/2、型番:9476 Rictor、型番:9552 PTEN、型番:11817 phospho−S476 Grb10)、Dianova製(DIA−−−310 CD31)、Santa Cruz製(sc−1026 Grb10)、Vector Laboratories製(VP−K451 Ki−67)であった。二次抗体は、Life Technologies製(Alexa Fluor 488 anti−rabbit、Alexa Fluor 555 anti−rat)、GE Healthcare製(HRP−linked anti−rabbit、HRP−linked anti−mouse)、Vector Labs製(VectaStain ABC Kit)であった。Alexa Fluor 647−BSA、Alexa Fluor 488、10kDa Dextran、DQ Green BSA、Hoechst 33342、LysoTracker Red and Prolong Antifade+DAPIは、Life Technologies製であった。
アデノウイルス5−サイトメガロウイルス−Cre(Iowa Gene Transfer Core)の感染により、Creを、SV40ラージT不死化Lox−Stop−Lox−K−RasG12D MEFおよび野生型対照MEF(Tuvesonら、2004年)へと導入した。2mlの培養培地中の細胞200,000個に、懸濁液中で、細胞1個当たり1,000pfuのアデノウイルスCreを感染させ、6ウェルプレートに播種した。6時間後に感染を繰り返し、12時間後に、培地を、ウイルス非含有培地で置きかえた。K−RasG12Dの発現をもたらす、転写終結配列の切出しの成功は、PCRにより確認した。
細胞を、氷冷PBSですすぎ、氷冷トリプシン(0.05%)を伴うインキュベーションにより、培養プレートから引き剥がした。トリプシンを、氷冷血清で不活化させ、細胞をペレット化させ、氷冷PBSですすいだ。細胞を、氷冷溶解緩衝液[50mMのHEPES、pH7.4、40mMのNaCl2、2mMのEDTA、1mMのオルトバナジン酸Na、50mMのNaF、10mMのピロリン酸Na、10mMのグリセロリン酸Na、1%Triton X−100、1倍濃度のHaltプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル(Thermo Scientific)]中で、15分間にわたり溶解させ、可溶性の溶解物画分を、16,000gで10分間にわたる遠心分離により単離した。タンパク質濃度を、Pierce BCA Protein Assay(Thermo Scientific)により決定し、等量のタンパク質を、標準的なプロトコールに従いSDSゲル電気泳動およびウェスタンブロット法により解析した。
免疫染色のために、細胞を、氷冷PBSですすぎ、PBS中に4%のホルムアルデヒドで、15分間にわたり固定し、PBS中に0.05%のTriton X−100で透過化させた。PBSによるすすぎの後、細胞を、PBG(PBS中に0.5%のBSA、0.2%の冷水用魚類ゼラチン)で、30分間にわたりブロッキングし、PBG中の一次抗体と共に、1.5時間にわたりインキュベートし、PBG+4%の通常のヤギ血清で、2回にわたり洗浄し、次いで、PBG+4%のNGS中の二次抗体と共に、45分間にわたりインキュベートした。PBSで3回にわたる洗浄の後、細胞を、Prolong Antifade+DAPIと共に、顕微鏡スライド上にマウントし、Leica TCS SP5−IIを使用してイメージングした。
組織は、10%の中性緩衝ホルマリン中で、24時間にわたり固定し、70%のエタノールへと移した。標準的なプロトコールを使用して、パラフィン包埋組織を切片化し、免疫組織化学のために加工した。Perkin Elmer Panoramic Scannerを使用して、画像を収集した。増殖指数は、各試料について、6つのランダムに選び出された視野であって、外部および内部/CD−31陰性の各腫瘍領域の視野内の、Ki−67陽性腫瘍細胞の画分を定量化することにより決定した。
細胞を、0.5μCi(0.4%)のL−[14C(U)]−ロイシン(Perkin Elmer)を含有する完全培地中で、24時間にわたり培養した。ブライト−ダイヤー法(BlighおよびDyer、1959年)に本質的に従い、全脂質画分および全タンパク質画分を単離した。タンパク質ペレットを、6Mのグアニジン塩酸塩中に再可溶化させ、次いで、シンチレーション液へと移した。有機相に溶存させた脂質を、シンチレーションバイアルへと移し、溶媒を蒸発させた後で、シンチレーション液中に再懸濁させた。タンパク質および脂質の14C−ロイシン含量は、シンチレーションカウンティングにより定量化した。
細胞培養実験は、10%の透析FBS(分子量カットオフ10,000;Gemini Biosystems)、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、5mMのグルコース、および2mMのグルタミンを伴うDMEM/F12中、37℃および5%のCO2で実施した。増殖アッセイのために、MEFを、完全培地中に播種し、5時間後、短時間にわたりすすぎ、次いで、表示の飢餓培地中で培養した。EAA滴定実験のために、1倍濃度のMEMアミノ酸溶液(M5550、Sigma)を、表示の百分率として、EAAを補充した。がん細胞株を、飢餓の前に、完全培地中で、1日間にわたり培養した。Trypan Blue除外法により評価される通り、生細胞が>95%である接着細胞の数は、Multisizer 4 Coulter Counter(Beckman)を使用して決定した。mTOR活性化/局在化実験のために、細胞をすすぎ、次いで、EAA飢餓培地(グルタミンを除く全てのアミノ酸を欠くDMEM/F12)中、1時間にわたりインキュベートし、その後、EAA(1倍濃度のMEMアミノ酸溶液)、アルブミン(そうでないことが陳述されない限り、3%)、または新鮮EAA非含有飢餓培地を補充した培地中で、表示の期間にわたり静置した。
KPCマウスモデル(LSL−K−RasG12D/+;LSL−Trp53R172H/+;Pdx−1−Cre)については、既に記載されている(Hingoraniら、2005年)。KPCマウスは、100%の浸透率で、進行性および転移性のPDAを発症し、ヒトPDAの組織病理学的特徴および臨床的特徴を再現している。マウスは、12時間の明期/12時間の暗期で飼育した。全ての手順は、Institutional Animal Care and Use Committee at CSHLに従い行った。超音波(Vevo software、Visualsonics)により決定される通り、同等なサイズ(直径7〜9mm、n=5)の腫瘍が確立されたKPCマウスを、5mg/kgのRapamune(Pfizer)または生理食塩液(媒体対照)を伴う経口強制投与により、毎日8日間にわたり処置した。最終回のRapamune投与は、終了時点の4時間前に施した。腫瘍容量は、処置の4日目および7日目に撮影した3d超音波画像から測定した。
P値は、培養細胞の増殖実験および蛍光顕微鏡法実験のためには、対応のない両側t検定を使用して計算し、マウスの腫瘍を解析するためには、マン−ホイットニーノンパラメトリックt検定を使用して計算した。
K−Rasシグナル伝達の活性化が、細胞外タンパク質を代謝する細胞の能力を変更するのかどうかについて探索するため、本発明者らは、野生型K−Ras対立遺伝子または構成的に活性なK−RasG12D対立遺伝子を有する不死化マウス胚性線維芽細胞(MEF)を比較した。アルブミンは、血漿中および間質液中の主要なタンパク質であり、そのレベルは、2〜5%の範囲にわたる。したがって、細胞外液の、タンパク質に富む組成を模倣するために、培養培地に、10%の透析ウシ胎仔血清±3%のアルブミンを補充した。グルコース非含有培地中に入れたところ、野生型MEFおよびK−RasG12D MEFのいずれも、3%のアルブミンの存在に関わらず、増殖を停止させた(図1A)。細胞を、非必須アミノ酸(NEAA)飢餓にかけたところ、アルブミンの補充は、生存率をわずかに改善した。細胞を、単一のNEAAであるグルタミンを欠く培地に入れたところ、アルブミンの補充は、わずかな程度ではあるが、K−RasG12D MEFの細胞数の増大を可能とした。
細胞は、アミノ酸レベルを、成長因子によるシグナル伝達からの入力と統合して、細胞増殖を促進する、mTORC1経路を介して、EAAを感知しうる(MaおよびBlenis、2009年;ShimobayashiおよびHall、2014年)。細胞を、EAA非含有培地中に入れると、mTORC1が、下流の標的をリン酸化する能力が抑制される。細胞外にもたらされるタンパク質の異化が、EAAの非存在下で、mTORC1活性を回復させるのかどうかについて調べるため、MEFを、1時間にわたるEAA飢餓下に置くことにより、mTORC1を不活化させた。次いで、EAAまたは異なる濃度のアルブミンを含有する新鮮培地を添加し、mTORC1の再活性化を、リン酸化S6K1に対するウェスタンブロット法により評価した。EAA非含有培地に、1〜3%のアルブミンを補充したところ、野生型MEFおよびK−RasG12D MEFのいずれにおいても、S6K1リン酸化の、濃度依存的な増大が引き起こされたが、これは、mTOR阻害剤であるトリン1により完全に抑制された(図6A)。したがって、生理学的レベルのアルブミンは、mTORC1経路を活性化させうる。野生型MEFおよびK−RasG12D MEFは、EAAに応答して、同等なmTORC1の活性化を呈したが、3%のアルブミンを添加したところ、高mTORC1活性を示したのは、K−RasG12D MEFであった(図5A)。同様に、H−RasG12Vの発現も、アルブミンに応答して、mTORC1活性を増大させた(図6B)。逆に、sh−RNAにより媒介されるPTENの枯渇を介するPI3キナーゼ/Aktシグナル伝達の上昇は、EAAによるmTORC1の活性化を増大させたが、アルブミンによるmTORC1の活性化は増大させなかった(図6C)。これらのデータは、Rasシグナル伝達が、経路の成長因子に調節される分枝ではなく、アミノ酸を感知する分枝を介し、アルブミン刺激に応答して、mTORC1の活性化を増強することを示唆する。
細胞外タンパク質をアミノ酸供給源として利用する細胞の能力に寄与する、Rasの下流のシグナル伝達経路について検討するため、MEK1/2、PI3キナーゼ、チロシンキナーゼに対する阻害剤およびmTOR阻害剤の、3%のアルブミンを加えたロイシン非含有培地中でのK−RasG12D MEFの増殖に対する効果を決定した。驚くべきことに、mTORの阻害は、アルブミンを補充したロイシン非含有培地中の細胞増殖を遅延させなかった。それどころか、mTOR/PI3キナーゼ二重阻害剤を含む、mTOR阻害剤の各々は、これらの条件下で増殖を増強した(図9A、左パネル、図10A)が、mTORシグナル伝達活性は、効果的に遮断した(図9B)。これに対し、MAPキナーゼ、PI3キナーゼ、またはチロシンキナーゼによるシグナル伝達に対する阻害は、ロイシン非含有培地中の細胞増殖を、わずかに減少させた(図9A、左パネル)。これらのキナーゼ阻害剤の効果は、ロイシン含有培地中では異なり、この場合、mTORの阻害は、細胞増殖の抑制として特に効果的であった(図9A、右パネル)。次に、mTOR阻害剤の、細胞増殖に対する濃度依存的な効果について検討した。トリン1の濃度を、50から300nMへと上昇させることにより、ロイシン非含有培地+3%のアルブミン中の細胞増殖が徐々に改善されたことから、細胞が、アルブミンを、ロイシンの供給源として使用する場合、増殖は、mTORシグナル伝達活性と逆相関することが示唆される(図9C)。これに対し、遊離ロイシンが細胞外にもたらされた場合、細胞の増殖は、顕著に高度となったが、用量を増大させるトリン1により低下した(図10B)。同様に、トリン1による処理は、活性化Ras突然変異を有するいくつかの癌細胞株を、ロイシン非含有培地+3%のアルブミン中で増殖するように誘導する一方で、ロイシン含有培地中のそれらの増殖は、大幅に減少させた(図10C)。アルブミンは、全てのタンパク質原性アミノ酸の混合物をもたらすので、アルブミンが、他の単一のEAA(イソロイシン、リジン、またはアルギニン)を欠く培地中の細胞の生存/増殖を支援するのかどうかについてもまた検討した。実際、生理学的レベルのアルブミンは、細胞の生存率をレスキューし、mTORシグナル伝達の、トリン1による阻害は、細胞が、これらのEAAを欠く培地中で頑健に増殖するように誘導した(図10D)。
細胞外タンパク質からのロイシンの回収は、ロイシン非含有培地中の細胞増殖についての律速段階を構成すると考えられた。これは、mTORC1が、細胞外タンパク質のアミノ酸内容物への細胞の接近を制限し、考えられるところでは、それらのエンドサイトーシスまたはリソソームにおける分解を遮断することにより、細胞外タンパク質に依存する増殖を抑制することを示唆した。これらの可能性を識別するため、まず、mTORC1の阻害が、細胞外高分子の内在化を増大させるのかどうかについて調べた。しかし、トリン1のノックダウンも、Raptorのノックダウンも、蛍光標識されたデキストランまたはアルブミンの、細胞への取込みを上昇させなかったことから、mTORC1シグナル伝達は、細胞外高分子のバルクの内在化を阻害しないことが指し示される(図12A〜C)。次に、mTORC1の阻害が、リソソームにおける内在化タンパク質の分解に影響を及ぼすのかどうかについて検討した。K−RasG12D MEFを、DQ−BSAとリソソームをマーキングするためのLysoTracker±トリン1とを含有する培地中に入れ、リソソームにおけるDQ−BSAのタンパク質分解により発生する蛍光シグナルを、時間経過と共に追跡した。mTORの阻害は、DQ−BSAの分解の増強を示す、DQ−BSAの蛍光の消光解除の劇的な増大を引き起こした(図11A、B)。同様に、Raptorのノックダウンによる、mTORC1の阻害も、細胞内のDQ−BSA蛍光を増大させた(図12D)。リソソームにおけるタンパク質分解の、クロロキンまたはリソソームプロテアーゼ阻害剤による遮断は、トリン1処理細胞内のDQ−BSA分解を無効化させた(図12E)。したがって、mTORC1は、環境から取り込まれたタンパク質の、リソソームにおける分解を、負に調節する。
多くの異なる系において、アミノ酸が、細胞外において豊富である場合、mTORC1は、増殖を促進することが示されてきたが、上記のデータは、mTORC1が、細胞外タンパク質の異化に依拠する細胞増殖を抑制しうることを指し示した。このため、量を減少させたEAAを含有するが、代替的なEAA供給源としての、3%のアルブミンで補充された培地中の、K−RasG12D MEFの増殖に対する、mTORC1の阻害の影響の探索を行うことになった。EAAが、細胞外において豊富である場合、トリン1処理またはRaptorノックダウンは、細胞増殖を大幅に減少させた(図13A、B)。しかし、対照細胞の増殖が、EAAレベルの低下と共に急速に降下したのに対し、トリン1で処理した細胞またはRaptor shRNAを発現する細胞は、EAA濃度の10倍の範囲にわたり、増殖のわずかな低減を示すに過ぎなかった。EAA濃度を低度としたときも、トリン1処理またはRaptorノックダウンは、細胞増殖を顕著に改善した。これらの結果は、mTORC1シグナル伝達が、アミノ酸に富む培地中のK−RasG12D MEFの増殖は刺激するが、細胞外タンパク質が必須アミノ酸の供給源として要求される条件下では、K−RasG12D MEFの増殖を制限することを示唆する。
mTORC1の阻害が、in vivoにおいて、K−Ras突然変異細胞の増殖を促進しうるのかどうかを決定するため、膵臓特異的な突然変異体K−Rasおよびp53(KPC)の内因性対立遺伝子を発現する遺伝子操作マウスモデルを使用して、mTORC1の阻害の、膵菅腺癌(PDA)の発症に対する効果について検討した(Hingoraniら、2005年)。ヒトでは、K−Rasは、膵臓がんの大部分において突然変異するが、KPCマウスの腫瘍細胞が、マクロピノサイトーシスを介して、高分子量のデキストランを内在化することが示されたことから、KPCマウスの腫瘍細胞は、細胞外タンパク質に接近する潜在的可能性を有することが指し示されることは、これと符合する(Commissoら、2013年)。さらに、膵臓がんの腫瘍微小環境は、乏血管性であり、かつ、高度に栄養物質枯渇性であり(Kamphorstら、2015年)、これは、この文脈では、細胞外タンパク質が、重要な代替的栄養物質供給源として機能しうる可能性を高める。
最後に、細胞外タンパク質の、アミノ酸供給源としての利用であって、細胞増殖を支援する利用の抑制における、mTORC1の役割が、Ras形質転換細胞に制限されるのかどうかを決定するため、野生型Ras対立遺伝子を有する細胞内の、mTORC1の阻害の帰結について探索した。Raptor shRNAを発現する野生型MEF、またはmTOR阻害剤で処理した野生型MEFは、3%のアルブミンを補充したロイシン非含有培地中で頑健に増殖することができた(図14B〜D)。mTORシグナル伝達を、より厳密に遮断するため、RaptorまたはRictorを、条件付け対立遺伝子を有するMEFから遺伝子除去した(図14E)(Cybulskiら、2012年)。Raptorノックアウト細胞は、野生型対照と比較して、栄養物質が豊富な培地中の細胞増殖の大幅な減少を示す一方で、ロイシン非含有培地+3%のアルブミン中の増殖は維持することができた(図13F)。これに対し、Rictorの欠失は、ロイシン含有培地中の細胞増殖をわずかに減少させるに過ぎず、アルブミン補充培地中のロイシン欠乏細胞の増殖を結果としてもたらさなかった(図14F)。また、量を減少させたEAAのほか、代替的なEAA供給源としての3%のアルブミンを含有する培地中の、対照またはRaptor shRNAを発現する野生型MEFの増殖についても検討した。Raptorノックダウンは、EAAが豊富な条件下における細胞増殖を損った(図13G)。しかし、EAAレベルを低減したところ、対照細胞と、Raptorノックダウン細胞との細胞増殖の差違は減殺され、EAAレベルを低度としたところ、Raptorノックダウンは、増殖を増強した。
上記の結果は、哺乳動物細胞内では、mTORC1シグナル伝達が、環境から取り込まれたタンパク質のリソソームにおける異化を抑制することを裏付ける。当然の帰結として、mTORC1の阻害は、例えば、EAAを欠乏された培養細胞内、または乏血管性腫瘍領域内にある膵臓がん細胞内の栄養物質としての細胞外タンパク質に依拠する細胞増殖を増強する。mTORC1経路は、栄養物質に富む条件下において、翻訳の増強を部分的に介する、細胞増殖の強力な刺激因子であることが公知である(MaおよびBlenis、2009年;ShimobayashiおよびHall、2014年)。しかし、mTORC1が、正味のタンパク質合成を促進する能力は、アミノ酸の外因性供給源を厳密に要求する。本研究は、細胞外タンパク質からのアミノ酸の回収を制限することにより、mTORC1は、細胞増殖を、細胞外における遊離アミノ酸の利用可能性とカップリングさせることを指し示す。これは、タンパク質の生合成が、翻訳の効率ではなく、アミノ酸の獲得により制約される条件下における増殖を、mTORC1の阻害が促進しうることを示唆する。したがって、mTORC1が、細胞増殖を刺激するのか、抑制するのかは、細胞のアミノ酸供給源に依存しうる。
本結果はまた、mTOR阻害剤の、がん治療剤としての有効性の不可解な欠如にも光を投げかけうる。最近の数年間にわたり、がん処置において、mTORC1経路をターゲティングしようと、多大な努力がなされている。これらの研究は、ヒト腫瘍は、一般に、その上流の活性化因子であるPI3キナーゼ経路内の突然変異のために、mTORC1活性の上昇を示すことが多いという観察により動機付けられている(ManningおよびCantley、2007年)。しかし、近年の臨床試験は、様々な固形腫瘍における、ラパマイシン類似体(ラパログ)の有効性が、限定的に過ぎないことを示した。本研究は、mTOR阻害剤の、がん処置における、内因性の弱点を明らかにする。細胞外に由来するタンパク質の異化を増強することにより、mTOR阻害剤は、代替的な栄養物質としての細胞外タンパク質の使用を増加させて、生存を支援し、増殖を維持する。これは、栄養物質枯渇腫瘍の微小環境内、または腫瘍細胞が新規の代謝的ニッチに適応しなければならない転移時において特に重要でありうる。これらの知見は、mTOR阻害剤の増殖促進効果が、Rasにより方向づけられるマクロピノサイトーシスなどのエンドサイトーシス経路を介して、がん細胞が十分な細胞外タンパク質を取り込む能力と相関することを予測する。一貫して、KPCマウスの、ラパマイシンによる処理は、乏血管性腫瘍領域内に棲息する膵臓がん細胞の増殖を増大させ、正味の腫瘍増殖を加速化させる。これは、K−Rasが主要な駆動性がん遺伝子である膵臓がん(Javleら、2010年)、またはRas抑制因子であるNF1内の突然変異により引き起こされる神経線維腫症など、Rasシグナル伝達における活性化突然変異を伴う様々な腫瘍型の処置における、mTOR阻害剤の不奏効を説明しうる。
本研究は、哺乳動物細胞が、EAAの供給源としての細胞外タンパク質を採取して、生存および増殖を維持しうることを裏付ける。これらのデータは、Rasにより方向づけられたタンパク質のマクロピノサイトーシスが、形質転換細胞の、細胞外グルタミン供給への依存性を緩和しうることを示す近年の研究(Commissoら、2013年)を裏打ちし、拡張する。Rasにより誘導される、細胞外タンパク質のマクロピノサイトーシスは、Dictyostelium discoideumなど、単細胞のアメーバ様真核生物の増殖を維持することが既に認識されている(Amyereら、2002年)。まとめると、これらの知見は、マイクロピノサイトーシスが、真核細胞内の栄養物質獲得の、進化的に古形の戦略を構成することを指し示す。興味深いことに、後生動物細胞内のマクロピノサイトーシスは、成長因子によるシグナル伝達の制御下にあり、マイクロピノサイトーシスの誘導は、血清による刺激に対する、多様な哺乳動物細胞型の即時的な応答である(Amyereら、2002年;MercerおよびHelenius、2009年)。これは、成長因子が、細胞に、グルコースおよびアミノ酸など、低分子量の栄養物質だけでなく、細胞外高分子もまた取り込むように命令しうることを示唆する。しかし、成長因子によるシグナル伝達と、アミノ酸とからの協奏的入力は、mTORC1の活性化を結果としてもたらすが、これは、環境から内在化させたタンパク質の異化を制限する。したがって、mTORC1は、細胞外に由来するタンパク質の分解を防止しながら、遊離アミノ酸を利用する同化的細胞内代謝を誘発する。考えられるところでは、この機構は、単量体アミノ酸が利用可能である限りにおいて、体液中に含有されるタンパク質の無用な代謝回転を防止する。
参考文献
当業者は、規定の実験だけを使用して、本明細書で記載される本発明の具体的な実施形態の多くの同等物を認識または確認することが可能であろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲で明示される通りである。
Claims (35)
- Rasタンパク質の発がん性の活性化を特徴とするがんを患う対象へと、
(i)mTORC阻害療法と、
(ii)毒素療法と
を含む治療レジメンを投与するステップを含む方法。 - mTORC阻害療法を、前記毒素療法の前に投与する、請求項1に記載の方法。
- 前記mTORC阻害療法が、mTORC1阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記がんが、線維形成性および/または乏血管性である微小環境内に棲息する、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記がんが、転移性細胞を含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 前記がんが、膵臓がんである、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記Rasタンパク質が、K−Ras、H−Ras、N−Ras、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 前記mTORC1阻害剤が、ラパマイシン/シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、デフォロリムス、ウォルトマンニン、TOP−216、TAFA93、CCI−779、ABT578、SAR543、アスコマイシン、FK506、AP23573、AP23464、AP23841、KU−0063794、INK−128、EX2044、EX3855、EX7518、AZD−8055、AZD−2014、Palomid 529、Pp−242、OSI−027、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項2から8のいずれかに記載の方法。
- 前記毒素療法が、シクロホスファミド、クロランブシル、シスプラチン、ブスルファン、メルファラン、カルムスチン、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン、マイトマイシンC、メトトレキサート、エトポシド、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシル、ダカルバジン、アクチノマイシンD、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、細胞増殖抑制剤、デキサメタゾン、プレドニゾン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ロイコボリン、アミホスチン、ダクチノマイシン、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン、リポソーマルドキソルビシン、ゲムシタビン、リポソーマルダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT11(イリノテカン)、10−ヒドロキシ7−エチル−カンプトテシン(SN38)、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 前記毒素療法を、低用量で投与する、請求項10に記載の方法。
- 毒素を、可溶性タンパク質へとコンジュゲートさせる、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 前記可溶性タンパク質が、アルブミンである、請求項12に記載の方法。
- 前記治療レジメンが、リソソーム阻害療法を含まない、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- 前記治療レジメンが、Ras阻害療法を含まない、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
- 単剤療法としてのmTORC1阻害剤による処置に好適に応答する可能性が高いがんを識別するための方法であって、前記がんに由来する試料を、Rasの発がん性の活性化についてアッセイするステップを含み、前記試料が、低度の発がん性のRas活性を有するか、または発がん性のRas活性を有さないと決定される方法。
- 単剤療法としてのmTORC1阻害剤による処置に好適に応答しない可能性が高いがんを識別するための方法であって、前記がんに由来する試料を、Rasの発がん性の活性化についてアッセイするステップを含み、前記試料が、発がん性のRas活性を有すると決定される方法。
- Rasの発がん性の活性化が、遺伝子突然変異により引き起こされる、構成的に活性なRasを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記遺伝子突然変異が、突然変異したRasタンパク質を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記遺伝子突然変異が、Ras抑制性タンパク質の発現または活性の低下を結果としてもたらす、請求項18に記載の方法。
- Rasの発がん性の活性化を、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、PCRおよびサンガージデオキシシークエンシング、PCRおよびパイロシークエンシング、PCRおよび質量分析(MS)、PCRおよび一塩基伸長、マルチプレックスライゲーション依存型プローブ増幅(MLPA)、または蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により検出する、請求項17から20のいずれかに記載の方法。
- がんを検出するための組成物であって、がん細胞によるマクロピノサイトーシスのための基質へとコンジュゲートさせたイメージング剤を含む組成物。
- mTORC1阻害剤をさらに含む、請求項22に記載の組成物。
- 前記がんを、in vivoの対象において検出する、請求項22から23のいずれかに記載の組成物。
- 前記イメージング剤が、金属性である、請求項22から24のいずれかに記載の組成物。
- 前記イメージング剤が、放射性標識されている、請求項22から24のいずれかに記載の組成物。
- マクロピノサイトーシスのための前記基質が、可溶性タンパク質を含む、請求項22から26のいずれかに記載の組成物。
- 前記可溶性タンパク質が、アルブミンである、請求項27に記載の組成物。
- 前記がんが、発がん性のRas活性を呈する、請求項22に記載の組成物。
- 対象におけるがんを検出するための方法であって、
(i)前記対象へと、mTORC1阻害剤を投与するステップと;
(ii)前記対象へと、検出用シグナルを誘発することが可能なイメージング剤を投与するステップと;
(iii)前記イメージング剤により誘発された前記シグナルを検出するステップと
を含む方法。 - 前記イメージング剤を、がん細胞によるマクロピノサイトーシスのための基質へとコンジュゲートさせる、請求項30に記載の方法。
- 前記イメージング剤を、可溶性タンパク質へとコンジュゲートさせる、請求項31に記載の方法。
- 前記可溶性タンパク質が、アルブミンである、請求項32に記載の方法。
- 前記mTORC1阻害剤を、前記イメージング剤の前に投与する、請求項30から33のいずれかに記載の方法。
- 前記mTORC1阻害剤を、前記対象へと、前記イメージング剤の少なくとも1、3、5、12、または24時間前に投与する、請求項30に記載の方法。
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