JP2018510904A - ニーマン・ピック病および他のリソソーム蓄積障害のためのｎｐｃ１のベンゼンスルホンアミド上方制御剤 - Google Patents

Abstract

リソソーム蓄積障害を治療するための方法および組成物が開示される。本方法は、ベンゼンスルホンアミドの属、特にＮ−［３−（アミノスルホニル）フェニル］ベンズアミドおよびヘテロアリールアミドを投与するステップを含む。適した化合物の属を式Ｉに示す。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１５年２月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／１１４５６６号からの優先権を主張し、その内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

政府の権利に関する記載

本発明は、国立衛生研究所から受けたＭＨ０８９５３７の下で政府の支援によってなされた。政府は、本発明にある一定の権利を有する。

本出願は概して、リソソーム蓄積障害を治療するための方法および組成物に関する。本方法は、ベンゼンスルホンアミドの属、特にＮ−［３−（アミノスルホニル）フェニル］ベンズアミドおよびヘテロアリールアミドを投与するステップを含む。

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）としても知られているリソソーム蓄積障害は、特定のリソソームタンパク質の欠乏に起因する、約６０の比較的まれな遺伝性代謝異常のグループである。ほとんどのリソソーム加水分解酵素は連続的に働いて、それらの基質から末端残基を除去するため、１つの酵素の欠乏が異化経路全体の成分を蓄積させる原因となるが、その理由は、経路下流のリソソーム酵素による加水分解のための基質がもはや利用できないからである。未消化物質はリソソームに閉じ込められたままであり、肥大した区画内の沈着物として見える。このグループの障害は、蓄積した基質：ムコ多糖、糖タンパク質、グリコーゲンまたはスフィンゴリピドにしたがって分類される。個別には、ＬＳＤは１：１００，０００未満の発生率で起こる。しかし、グループとしては、発生率は約１：５，０００〜１：１０，０００である。これらの障害のほとんどは、ニーマン・ピック病、Ｃ型（ＮＰＣ）などの常染色体劣性遺伝性であるが、少数はファブリー病およびハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）などのＸ連鎖劣性遺伝性である。

最近の総説［Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ９，５８３（２０１３）］は、現在リソソーム蓄積症と見なされている６０程度の障害について述べている。それらのうちのいくつかを、以下でさらに詳細に説明する。

ニーマン・ピック病は、コレステロール、スフィンゴミエリンおよび他の脂質がリソソーム内に蓄積する遺伝性の重度の代謝障害のグループを指す。重度の形態は、幼児期には致死的である。より軽度の形態の人々は、１０代または青年期まで生存する場合がある。ニーマン・ピックＣ型は、生化学的、遺伝的および臨床的にニーマン・ピックＡ型およびＢ型とは異なる。Ａ型およびＢ型では、酸性スフィンゴミエリナーゼの完全または部分的欠乏が存在する。ニーマン・ピックＣ型では、主要な変異遺伝子ＮＰＣ１のタンパク質産物は酵素ではなく、エンドソーム−リソソーム系の輸送体として機能するようであり、その欠乏は、コレステロール、スフィンゴリピド、ガングリオシドおよび脂肪酸のエンドソーム−リソソーム系内での蓄積につながる。ＮＰＣは常に致命的である。ＮＰＣの小児の大半は２０歳前に死亡する（多くは１０歳前に死亡する）。ＮＰＣの人が４０歳に達することは極めてまれである。進行性の神経疾患は、ニーマン・ピック病Ｃ型の特徴であり、幼児期を超えたすべての症例において能力障害および早死の原因となる。古典的には、ＮＰＣの小児は、認知低下が顕在化する前に、正常な発達マイルストーンスキルへの到達の遅れが最初に生じる場合がある。神経学的徴候および症状には、非協調的な四肢運動、不明瞭発語、嚥下困難、振戦、癲癇、垂直性核上麻痺、ジストニア、下垂、小頭症、精神障害、進行性認知症、進行性難聴、双極性障害、幻覚、妄想、緘黙または昏迷を含み得る精神病性大うつ病が含まれるニーマン・ピック病Ｃ型の末期では、患者は、完全な眼筋麻痺、重度の認知症および随意運動の消失を伴う寝たきりになる。

ファブリー病は、Ｘ連鎖的に遺伝するリソソーム蓄積症である。ファブリー病は広範囲の全身症状を引き起こす可能性がある。α−ガラクトシダーゼＡ活性があったとしてもほとんどない古典的に罹患した男性は、主として心臓、肝臓、腎臓、皮膚および脳の血管内皮細胞のリソソーム内に中性スフィンゴ糖脂質、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）を進行性に蓄積する。古典的な疾患表現型の発症は小児期または青年期に起こり、重度の肢端感覚異常、被角血管腫、角膜および水晶体混濁ならびに発汗低下を特徴とする。加齢と共に、心臓、腎臓および脳の血管疾患は、４０歳代または５０歳代の早死につながる。

ファーバー病（ファーバーの脂肪肉芽腫症、セラミダーゼ欠損、「線維芽細胞性ムコ多糖異常症」および「脂肪肉芽腫症」としても知られる。）は、関節、肝臓、咽頭、組織および中枢神経系の異常につながるセラミドの蓄積の原因となる酸性セラミダーゼの欠乏が顕著な、まれな常染色体劣性障害である。疾患発症は、典型的には早期乳児期に起こるが、後年に起こる場合もある。古典的形態のファーバー病を患う小児は、生後数カ月以内に症状を発症する。これらの症状には、発達遅延ならびに声、関節および皮膚の問題が含まれる場合がある。肝臓、心臓、肺および腎臓にも影響が出る場合がある。呼吸困難の患者には、呼吸管が必要な場合がある。ファーバー病の小児のほとんどは、２歳までに、通常肺疾患で死亡する。この疾患の最も重度の形態のうちの１つでは、肝脾腫を出生直後に診断することができる。この形態の疾患を持って生まれた小児は、通常６カ月以内に死亡する。

ゴーシェ病は、リソソーム蓄積症の最も一般的なものであり、酵素グルコセレブロシダーゼの遺伝的欠損によって引き起こされ、これはグルコシルセラミドの蓄積をもたらし、最も一般的には骨髄および特定の器官のマクロファージ内に蓄積する。Ｉ型（または非神経障害性ゴーシェ）は、この疾患の最も一般的な形態であり、中枢神経系に影響を与えない。これはアシュケナージ系ユダヤ人の遺伝形質の中で最も一般的である。症状の発症はさまざまであり、肝脾腫、骨格虚弱および骨疾患、血小板減少、貧血ならびに疲労を含む場合がある。疾患の発症および重症度に応じて、Ｉ型の患者は成人期まで健康に生きる場合もある。ＩＩ型（または急性乳児神経障害性ゴーシェ病）は、典型的には生後６カ月以内に始まる。Ｉ型疾患に伴う症状に加えて、ＩＩ型の患者は、広範かつ進行性の脳損傷、眼球運動障害、発作、四肢硬直ならびに不十分な吸引および嚥下能力を示すこともある。罹患した小児は、通常２歳までに死亡する。ＩＩＩ型（慢性神経障害性ゴーシェ）は、小児期または成人期においても、いつでも始まり得る。ＩＩＩ型疾患は神経系にも影響を及ぼすが、神経性成分は急性またはＩＩ型のバージョンに比べて、より緩徐進行性であり、患者は１０代前半および成人期まで生存し得る。

クラッベ病（グロボイド細胞白質ジストロフィーまたはガラクトシルセラミドリピドーシスとしても知られている。）は、神経系のミエリン鞘に影響を及ぼす、まれな、しばしば致命的な変性障害である。これはガラクトシルセラミダーゼの欠乏をもたらすＧＡＬＣ遺伝子の突然変異によって引き起こされるスフィンゴリピドーシスの一形態である。この状態は、常染色体劣性様式で遺伝する。クラッベ病を患う乳児は出生時は正常である。症状は月齢３〜６カ月の間に始まり、この疾患は一般に２歳までには致命的になる。遅発性のクラッベ病患者は、疾患の進行がより遅い傾向がある。米国住民では、クラッベ病は出生１０万件に約１件発生する。しかし、１，０００件に約６件のさらに高い発生率がイスラエルの特定の地域で報告されており、スカンジナビア諸国では比較的疾患率が高く、出生５０，０００件に１件と報告されている。

ＬＳＤは、遺伝性代謝疾患のための治療様式の開発のモデルとして長い間役立ってきた。非常に低い正常な酵素レベルでも、さまざまなＬＳＤに罹患した患者由来の培養線維芽細胞の代謝欠損を矯正し得るという観察は、とりわけ、ゴーシェ病１型およびファブリー病の酵素補充療法の開発を成功に導いた。しかし、現在、タンパク質または遺伝子を有する中枢神経系にアクセスすることに伴う重大な問題のために、ＮＰＣ１または神経病理を呈する他の蓄積障害の患者には治療選択肢がない。

本発明は、ＮＰＣ１プロモーターを上方制御し、それによってリソソーム蓄積障害を治療するための医薬組成物および方法を対象とする。

本発明は、第１の態様において、式Ｉ

（式中、
Ｒ^１は、水素原子および（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基から選択され、
Ｒ^２は、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、場合により置換されることがあるベンジル基、メタ置換フェニル基およびパラ置換フェニル基から選択され、ここで、ベンジル基またはフェニル基上の置換基は、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、ハロゲン基、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基およびシアノ基から選択され、または
Ｒ^１およびＲ^２は、これらが結合している窒素原子と共に、場合により置換および／または縮合置換されることがある複素環を形成し、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、水素原子、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基、およびアミン基または飽和窒素複素環で置換された（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基から選択され、
Ｃｙは、アダマンチル基、場合により置換されることがある単環式アリール基および場合により置換されることがある単環式ヘテロアリール基から選択され、ただし、Ｒ^２が（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基であるとき、Ｃｙは、非置換のアリール基またはヘテロアリール基ではない。）の化合物を投与するステップを含む、リソソーム蓄積障害を治療する方法を提供する。

本発明は、第２の態様において、以下で説明する式Ｉの化合物の医薬製剤を提供する。

本発明は、第３の態様において、以下で説明する属Ｉ内の特定の化合物を提供する。

発明の詳細な説明

式Ｉ

の化合物がリソソーム蓄積障害の治療に有用であることが明らかになっている。

式Ｉのいくつかの実施形態において、Ｃｙは、場合により置換されることがあるピラゾール基、ピロール基、チアゾール基、イミダゾール基、オキサゾール基、ピリジン基、ピリダジン基、ピリミジン基、チオフェン基、フラン基またはフェニル基である。いくつかの実施形態において、Ｃｙは、場合により置換されることがあるピロール基、オルト置換フェニル基、メタ置換フェニル基、または場合により置換されることがあるピリジン基であり、ここで、ピロール基、フェニル基またはピリジン環上の置換基は、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_６）アシル基、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_１０）オキサアルキル基およびハロゲン基から選択される。オルト置換、メタ置換および（他の文脈では）パラ置換の記載は、置換基が示した位置に見出されることを意味すると理解されるべきである。さらに明示的に限定されない限り（例えば、「オルト位で一置換された」）、環上の他の場所に他の置換基が見出されないことを意味するものではない。

式Ｉのいくつかの実施形態において、一緒になったＲ^１およびＲ^２は環を形成しない。これらの実施形態において、Ｒ^１は、水素原子および（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基から選択から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ^２は、メタまたはパラ置換フェニル基であってもよく、メタおよびパラ置換基は、ブロモ基、シアノ基およびアセチル基から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基であり、Ｒ^２は（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基である。

式Ｉのいくつかの実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２は、これらが結合している窒素原子と共に、場合により置換および／または縮合されることがある複素環を形成する。これらの実施形態において、環は、飽和窒素複素環、例えば、ピロリジン、ピペリジン、アゼピン、モルホリンまたはピペラジンでもよく、あるいは環は、テトラヒドロベンゾアゼピン、テトラヒドロキノリン、テトラヒドロイソキノリン、インドリンまたはイソインドリンなどの縮合複素環でもよい。

式Ｉのいくつかの実施形態において、Ｒ^３は、水素原子、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基、およびアミン基または飽和窒素複素環で置換された（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基から選択され、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、水素原子およびフッ素原子から選択される。アミン基または飽和窒素複素環で置換された（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基の例は、ジメチルアミノプロポキシ基および２−（ピロリジン−１−イル）エトキシであろう。通常、（Ｃ_１−Ｃ_１０）オキサアルキル基、およびアミン基または飽和窒素複素環で置換された（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基のアルキル部分は直鎖状になるであろう。いくつかの実施形態において、Ｒ^３は、水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基およびヒドロキシ基から選択され、Ｒ^４およびＲ^６は水素原子であり、かつＲ^５は水素原子またはフッ素原子である。

本明細書において用いられるとき、用語「場合により置換されることがある」は、「非置換または置換された」と同義で用いられてもよい。用語「置換された」は、指定された基による、指定された基内の１つまたは複数の水素原子の交換を指す。例えば、置換されたアリール基、ヘテロシクリル基などは、各残基内の１つまたは複数の水素原子が、ハロゲン基、ハロアルキル基、アルキル基、アシル基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシ低級アルキル基、カルボニル基、フェニル基、ヘテロアリール基、ベンゼンスルホニル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、ハロアルコキシ基、オキサアルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基［−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル基］、カルボキサミド基［−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２］、アルキルアミノカルボニル基［−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル基］、シアノ基、アセトキシ基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルコキシ基、ヘテロシクリルアルコキシ基、メルカプト基、アルキルチオ基、スルホキシド基、スルホン基、スルホニルアミノ基、アルキルスルフィニル基、アルキルスルホニル基、ベンジル基、ヘテロシクリル基、フェノキシ基、ベンジルオキシ基、ヘテロアリールオキシ基、アミノスルホニル基、アミジノ基、グアニジノ基およびウレイド基で置き換えられているアリール基またはヘテロシクリル基を指す。

本明細書に記載の化合物の多くは文献において既知であり、商業的供給元から購入されてもよい。市販されていない化合物は、以下の経路で合成されてもよい：

上に示した試薬は例示であり、同じ変換を達成するために当技術分野において周知の類似の試薬で置き換えることができることを当業者は理解されよう。例えば、ＣｙＣＯＯＨは、アミドおよびペプチド合成において使用される一般的な試薬のいずれかによってアニリンと縮合させることができる。同様に、ニトロ基は、水素原子および触媒または別の金属／酸の組み合わせを用いて還元することができる。例示的な合成は以下の通りである。
Ｎ−（３−（Ｎ−（４−ブロモフェニル）スルファモイル）−４−メトキシフェニル）−４−メチルニコチンアミドの調製：
ステップ１ ＣｌＣＨ_２ＣＨ_２Ｃｌ（５ｍＬ）中の１−メトキシ−４−ニトロベンゼンＡ（６．２ｇ、４１ｍｍｏｌ）の溶液を０℃まで冷却し、クロロスルホン酸（４ｍＬ、６ｍｍｏｌ）を滴加して処理した。反応物を室温まで加温し、２時間還流し、次いで冷却した。水を注意深く加えて過剰のクロロスルホン酸を失活させた。固体の沈殿が観察され、これは、クロロホルムを加えて混合物を撹拌すると再び溶解した。有機層を分離して乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、濾過して濃縮し、２−メトキシ−５−ニトロベンゼン−１−スルホニルクロリドＢ（１．７８ｇ、７．０７ｍｍｏｌ、収率１７．５％）を得た。
ステップ２ Ｂ（１．７ｇ、６．８ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍＬ）中の４−ブロモアニリン（１．７ｇ、１０ｍｍｏｌ）で処理した。反応物に還流冷却器を取り付け、９０℃で１６時間撹拌した。ピリジンの大部分を回転蒸発により除去した。残留物をＥｔＯＡｃで希釈して、水、次いで塩水で洗った。有機層を分離して（ＭｇＳＯ_４）で乾燥させ、濾過して濃縮し、精製して１．７ｇ（６５％）のＣを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔシステム）保持時間ｔ_１（ショート）＝３．５０ｍｉｎ、Ｃ_２６Ｈ_２２Ｂｒ_２Ｎ_４Ｎａ０_１０Ｓ_２［２Ｍ＋Ｎａ］^＋のＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値７９６．９、測定値７９６．８。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）８ｐｐｍ １０．５４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），８．４９（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３８−７．４３（ｍ，３Ｈ），７．０９−７．０２（ｍ，２Ｈ），４．０１（ｓ，３Ｈ）。
ステップ３ Ｃ（０．９０ｇ、２．３０ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（２４ｍＬ）に溶解し、塩化スズ（ＩＩ）二水和物（２．１ｇ、９．３ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を１時間還流して冷却し、約ｐＨ６まで１Ｎ ＮａＯＨで処理した。おそらくスズ塩からなる白色懸濁液が観察された。ＥｔＯＡｃを加え、混合物を一晩激しく撹拌した。水層は依然として白色懸濁液であった。混合物をセライトに通して濾過し、有機層を分離して乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、濾過して濃縮した。アイソクラティック３５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン溶媒系を用いたフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーによる精製により、接近して溶出する非極性化合物を分離し、純粋なアニリンＤ（０．５６ｇ、１．５７ｍｍｏｌ、収率６７％）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔシステム）保持時間ｔ_１（ショート）＝２．７８ｍｉｎ、Ｃ_１３Ｈ_１４ＢｒＮ_２０_３Ｓ［Ｍ＋Ｈ］^＋のＭＳ（ＥＳ１）ｍ／ｚ計算値３５７．０、測定値 ３５６．９。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）６ ９．９６（ｓ，４Ｈ），７．４４−７．３３（ｍ，８Ｈ），７．０９−６．９７（ｍ，１２Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ），６．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．８Ｈｚ，４Ｈ），５．０２（ｓ，１０Ｈ），４．０３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｓ，１２Ｈ），１．９９（ｓ，１Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）６ ９．９６（ｓ，１Ｈ），７．４２−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．０７−６．９８（ｍ，３Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．８Ｈｚ，１Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３１１）。
ステップ４ ５−アミノ−Ｎ−（４−ブロモフェニル）−２−メトキシベンゼンスルホンアミドＤ（７０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、４−メチルニコチン酸（８１ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）、２，４，６−トリプロピル−１，３，５，２，４，６−トリオキサトリホスフィナン２，４，６−トリオキシド（０．３７ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）（Ｔ３Ｐ（登録商標））およびトリエチルアミン（０．１１ｍＬ、０．７８ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を６０℃で４８時間撹拌した。冷却後、混合物（これはゲルになっていた。）を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離して濃縮し、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーにより精製して、Ｎ−（３−（Ｎ−（４−ブロモフェニルスルファモイル）−４−メトキシフェニル）−４−メチルニコチンアミド：３２ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ、３４％）を得た：ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔシステム）保持時間ｔ_１（ロング）＝４．１３ｍｉｎ、Ｃ_２０Ｈ_１９ＢｒＮ_３０_４Ｓ［Ｍ＋Ｈｌ］^＋のＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値４７６．０ 測定値４７６．０；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１０．５８（ｓ，１Ｈ），１０．１７（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４３−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１０−７．０３（ｍ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），２．４４（ｓ，３１１）；Ｃ_２０Ｈ_１９ＢｒＮ_３０_４Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値４７６．０２７４ 測定値４７６．０２８４。

本明細書において用いられるとき、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「を治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、あるいは「を緩和する（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」または「を寛解する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」は、同義で用いられる。これらの用語は、治療上の利益を含むがこれに限定されない有益な結果または所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、根底にある障害の寛解を意味する。また、患者が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにも関わらず、患者に改善が観察されるように、基礎疾患に関連する１つまたは複数の生理的症状の寛解により治療上の利益が達成される。例えば、「ＮＰＣを治療する」とは、ＮＰＣに関連する少なくとも１つの症状を軽減することを意味する。患者がもはやＮＰＣの何らかの症状を示さないこと、またはリソソーム機能が正常な状態にされることは必要ではない。組成物は、特定の疾患を発症するリスクのある患者に、あるいはこの疾患の診断がなされていなくても、疾患の１つまたは複数の生理系を報告する患者に投与されてもよい。

本明細書において用いられるとき、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」またはこれらの文法上の変形は、記載の特徴、整数、ステップまたは構成要素を特定するが、１つまたは複数の別の特徴、整数、ステップ、構成要素あるいはこれらの群の追加を除外しないと見なされるべきである。この用語は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含する。語句「実質的に〜からなる」またはこの文法上の変形は、本明細書において用いられるとき、記載の特徴、整数、ステップまたは構成要素を特定するが、別の特徴、整数、ステップ、構成要素またはこれらの群が記載の組成物または方法の基本かつ新規の特性を実質的に変えない場合にのみ、１つまたは複数の別の特徴、整数、ステップ、構成要素あるいはこれらの群の追加を除外しないと見なされるべきである。本明細書において用いられるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により特に明確に示されていない限り、複数形も含むことを意図している。用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのｃｏｍｐｒｉｓｅの任意の形態）、「を有する（ｈａｖｅ）」（ならびに「ｈａｓ」および「ｈａｖｉｎｇ」などのｈａｖｅの任意の形態）、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などのｉｎｃｌｕｄｅの任意の形態）および「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」などの任意の形態のｃｏｎｔａｉｎ）は制約のない連結動詞であることがさらに理解されるであろう。結果として、１つまたは複数のステップあるいは要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」方法は、それら１つまたは複数のステップあるいは要素を持つが、それら１つまたは複数のステップあるいは要素のみを持つことに限定されない。

本発明に関連する製剤には、経口、非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内および関節内を含む。）、直腸および局所（皮膚、頬側、舌下および眼内を含む。）投与に適した製剤が含まれる。最も適した経路は、レシピエントの状態および障害に依存し得る。製剤は、単位投薬形態で好都合に提供されてもよく、薬学の技術分野で周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが所定量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤または錠剤などの別個のユニットとして、粉末または顆粒として、水性液または非水性液中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体乳剤または油中水型液体乳剤として提供されてもよい。活性成分はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして提供されてもよい。好ましい単位投与製剤は、有効量またはその適切な割合の活性成分を含む経口の単位投与形態である。

非経口投与のための製剤には、水性および非水性滅菌注射液が含まれ、これらには、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を所期のレシピエントの血液と等張にする溶質が含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、水性および非水性滅菌懸濁液も含まれ、これらには、懸濁剤および粘稠化剤が含まれてもよい。製剤は、複数用量容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルの単位用量で提供されてもよく、滅菌液体担体、例えば食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの添加のみを使用直前に必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保管されてもよい。即時注射液および懸濁液は、先述した種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。

特に前述の成分に加えて、本発明に関連する製剤は、当該技術分野において通常の他の薬剤を含んでもよいと理解されるべきである。例えば、経口投与に適したものには、他の治療成分、固結防止剤、保存料、甘味料、着色料、香料、乾燥剤、可塑剤、色素、崩壊剤、潤滑剤などが含まれてもよい。

リソソーム蓄積障害には以下が含まれる：（１）スフィンゴリピドーシス、例えば、ファブリー病；ファーバー脂肪肉芽腫症；ゴーシェ病Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型；ニーマン・ピック病Ａ型およびＢ型；ＧＭ１ガングリオシドーシス；ＧＭ２−ガングリオシドーシス（サンドホフ）；ＧＭ２−ガングリオシドーシス（テイ・サックス）；ＧＭ２−ガングリオシドーシス（ＧＭ２活性化因子欠損）；ＧＭ３−ガングリオシドーシス；異染性白質ジストロフィー；およびスフィンゴリピド活性化因子欠損；（２）ムコ多糖症、例えば、ＭＰＳ Ｉ（シーリー（Ｓｃｈｅｌｅ）、ハーラー−シーリーおよびハーラー病）；ＭＰＳ ＩＩ（ハンター）；ＭＰＳ ＩＩＩＡ（サンフィリポＡ）；ＭＰＳ ＩＩＩＢ（サンフィリポＢ）；ＭＰＳ ＩＩＩＣ（サンフィリポＣ）；ＭＰＳ ＩＩＩＤ（サンフィリポＤ）；ＭＰＳ ＩＶＡ（モルキオ症候群Ａ）；ＭＰＳ ＩＶＢ（モルキオ症候群Ｂ）；ＭＰＳ ＶＩ（マロトー・ラミー）；ＭＰＳ ＶＩＩ（スライ病）；およびＭＰＳ ＩＸ；（３）オリゴ糖代謝異常、例えば、α−マンノシドーシス；β−マンノシドーシス；フコシドーシス；アスパルチルグルコサミン尿症；シンドラー病；シアリドーシス；ガラクトシアリドーシス；ムコリピドーシスＩＩ型（Ｉ細胞病）；およびムコリピドーシスＩＩＩ型；（４）糖原病、例えば、ポンペ病；ならびに（５）膜内在性タンパク質障害、例えば、シスチン症；ダノン病；動作性ミオクローヌス−腎不全症候群；サイリア（Ｓａｉｌｉａ）病；ニーマン・ピック病Ｃ１型；ならびにムコリピドーシスＩＶ型。また、しばしばリソソーム蓄積障害のクラスに含まれるのは、Ｈａｉｔｉａ−Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ；ヤンスキー・ビールショースキー；シュピールマイヤー−シェーグレン；パリー；ヘルマンスキー・パドラック病１〜８型；Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ １、２および３；ならびにチェディアック・東病である。

特に興味深いリソソーム蓄積障害は、ニーマン・ピックＣ、ファブリー病、ファーバー病、ゴーシェ病、サンフィリポおよび他のムコ多糖症である。

ニーマン・ピックＣを見ると、患者の９５％がＮＰＣ１遺伝子内に突然変異を有しており、これは、大部分がＲａｂ９−ＧＴＰアーゼ陽性である後期エンドソーム小胞の膜内に存在する大きな膜貫通糖タンパク質をコードしている。ＮＰＣ１タンパク質は、「多剤」膜貫通流出ポンプ機能を有する原核生物のパーミアーゼの耐性−結節形成−分裂（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＲＮＤ）ファミリーの類似の真核生物メンバーとして確立されている。１３の膜貫通ドメイン、３つの大きな重度にグリコシル化されたエンドソームループ、いくつかのより小さい細胞質ループおよびＣ末端の細胞質尾部と共に、このタンパク質は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧ−Ｒ）のステロール感知ドメイン（ＳＳＤ）に形態上よく似たドメイン、およびタンパク質切断−活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）を結合するステロール調節エレメントも有し、これらはいずれもコレステロール恒常性において重要な役割を果たす。この構造的相同性は、ＮＰＣ疾患の生化学的特徴および診断マーカー：後期エンドソームから放出される異常な（ｉｍｐａｉｒｅｄ）コレステロールと一致しており、これは、遊離の非エステル化コレステロールを結合する蛍光プローブフィリピンを用いて評価することができる。（本発明者らが束縛されることを望まない）可能性のある機構の提案は、ＬＤＬに関連する、または形質膜からのエステル化または遊離コレステロールが、受容体介在性エンドサイトーシスによって細胞に入るというものである。続いて、リソソーム酸リパーゼがエステル化コレステロールを加水分解して遊離コレステロールを放出する後期エンドソーム／リソソームオルガネラ内に送達される。遊離コレステロールのサイトゾル内への放出は、まず、リソソームタンパク質ＨＥ１（ＮＰＣ疾患の突然変異の５％を占めるＮＰＣ２遺伝子によってコードされる可溶性タンパク質）と結合し、続いて、そのコレステロールカーゴを後期エンドソーム膜内のＮＰＣ１タンパク質に輸送する二段階機構によって行われる。

ＮＰＣ疾患を引き起こす約２００の突然変異のうち、その大部分は、ＮＰＣ１タンパク質の全長にわたって分布するミスセンス突然変異である。最も一般的な突然変異の１つはＩ１０６１Ｔ対立遺伝子であり、これは、機能タンパク質をコードするが、それ自体が小胞体関連分解の標的にされることになるミスフォールディングの傾向を有する。

ここで、本発明者らは、内因性変異ＮＰＣ１および／または後期エンドソーム輸送タンパク質Ｒａｂ９の全体的な細胞レベルを上方制御して、ＮＰＣ疾患表現型を改善することができる小分子の属を見出した。観察された結果の合理的な説明は、内因性変異ＮＰＣ１タンパク質の上方制御が、小胞体から逃れることができ、かつ後期エンドソーム／リソソーム系を標的とすることができる適切に折りたたまれたＮＰＣ１タンパク質の割合を増加させるというものである。これは、分解のためにタグ付けされた全変異タンパク質の割合を減少させる。後期エンドソームへのＮＰＣ１タンパク質の輸送増加は、その区画からの遮断された脂質の放出を改善し、疾患表現型を正常化する。低分子量ＧＴＰアーゼＲａｂ９は、ＮＰＣ１疾患の欠陥経路である後期エンドソームからＴＧＮへの逆行輸送のモジュレーターである。ＮＰＣ１疾患線維芽細胞におけるＲａｂ９の過剰発現は、ＮＰＣ１タンパク質機能の必要性を回避し、後期エンドソームからＴＧＮへの輸送を回復させ、ＮＰＣ１脂質輸送遮断表現型を実際上「抑制」する。

Ｒａｂ９プロモーターまたはＮＰＣ１レポーターコンストラクトのいずれも安定して発現させるＨｕｈ７ヒト肝癌細胞株を用いて、本発明者らは、式Ｉの化合物が、ＮＰＣ１患者の線維芽細胞株からのコレステロールおよびスフィンゴ糖脂質グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）の除去において優れた活性を示すことを見出した。ＮＰＣ１またはＲａｂ９の上方制御は、ニーマン・ピック病Ｃ型ならびに以下で述べる他のリソソーム蓄積症を治療するためのアプローチを提供する。

使用した試薬および溶媒は無水の市販グレードであり、さらに精製することなく使用した。シリカゲル（１００〜２００メッシュ）上でカラムクロマトグラフィーを実施した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ ４００ＭＨｚ分光装置を用いて、ＣＤＣｌ_３およびＤＭＳＯ−ｄ_６中の溶液から記録した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルの化学シフトは、内部として溶媒ピークを用いて百万分率（ｐｐｍ、δ）で報告される。分子量の確認は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２２４飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州サンタクララ））を使用して行った。水中の５〜１００％アセトニトリル（０．０３％ギ酸）の３分間の勾配を運転時間５．１分、流量０．４ｍＬ／ｍｉｎで使用した。Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３ Ｃ１８カラム（１．８ミクロン、２．１×５０ｍｍ）を２５℃の温度で使用した。分子式の確認は、正モードでエレクトロスプレーイオン化を利用し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓｈｕｎｔｅｒソフトウェア（バージョンＢ．０２）を使用して確認した。

アッセイ

Ｒａｂ９プロモーター−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイのｑＨＴＳ。一次スクリーニングの目的で、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現させるために約１．５ｋｂのＲａｂ９プロモーターを用いてベクターを操作することによりプロモーターアッセイを開発した。したがって、Ｒａｂ９プロモーターの活性化は、ルシフェラーゼ発現をもたらす。このベクターを用いて、Ｒａｂ９ルシフェラーゼベクターを安定して発現させるＨｕｈ７細胞株を作製した。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０ｕｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ−１６４０を含む培地内で増殖させ、維持した。１０％ ＦＢＳを追加したＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ還元血清培地中のアッセイのために、ＤＭＳＯ溶液中の２３ｎＬ／ウェルの試験化合物を含む１，５３６ウェル白色不透明プレートに、５μＬ中１，５００細胞／ウェルで細胞を播種した。アッセイプレートを３７℃で２４時間インキュベートし、その後、３μＬ／ウェルのＢｒｉｔｅＬｉｔｅおよびルシフェラーゼ検出試薬混合物（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を加えた。室温で１０分間インキュベートした後、ＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光シグナルを測定した。

ＮＰＣ１プロモーター−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイのｑＨＴＳ。第２の一次スクリーニングの目的で、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現させるために約１．５ｋｂのＮＰＣ１プロモーターを用いてベクターを操作することによりプロモーターアッセイを開発した。したがって、ＮＰＣ１プロモーターの活性化は、ルシフェラーゼ発現をもたらす。このベクターを用いて、ＮＰＣ１−ルシフェラーゼベクターを安定して発現させるＨｕｈ７細胞株を作製した。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳ、２ ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ−１６４０を含む培地内で維持した。１０％ ＦＢＳを追加したＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ還元血清培地中のアッセイのために、ＤＭＳＯ溶液中の２３ｎＬ／ウェルの試験化合物を含む１，５３６ウェル白色不透明プレートに、５μＬ中１，５００細胞／ウェルで細胞を播種した。アッセイプレートを３７℃で２４時間インキュベートし、その後、３μＬ／ウェルのＢｒｉｔｅＬｉｔｅおよびルシフェラーゼ検出試薬混合物（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を加えた。室温で１０分間インキュベートした後、ＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光シグナルを測定した。

Ｒａｂ９プロモーター活性化因子の確認アッセイ：ウミシイタケルシフェラーゼ。確認アッセイは、一次スクリーニングで使用したものとは異なるルシフェラーゼタンパク質をＲａｂ９プロモーターが発現させるアッセイを用いて行った。Ｒａｂ９プロモーターはウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子の前にクローン化されており、したがって、Ｒａｂ９プロモーター活性化はウミシイタケルシフェラーゼ発現をもたらす。このベクターを用いて、Ｒａｂ９ウミシイタケルシフェラーゼベクターを安定して発現させるＨｕｈ７細胞株を作製した。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ−１６４０を含む培地内で増殖させ、維持した。１０％ ＦＢＳを追加したＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ還元血清培地中のアッセイのために、１，５３６ウェル不透明プレートに、５μＬ中１，５００細胞／ウェルで細胞を播種し、次いで、ＤＭＳＯ溶液中の２３ｎＬ／ウェルの化合物をピン転写により加えた。アッセイプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。Ａｍｐｌｉｔｅルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキットをＡＢＤ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから購入し、メーカーの推奨にしたがって調製／保管した。室温で１０分間インキュベートした後、ＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光シグナルを測定した。

ＮＰＣ１プロモーター活性化因子の確認アッセイ：ウミシイタケルシフェラーゼ。確認アッセイは、一次スクリーニングで使用したものとは異なるルシフェラーゼタンパク質をＮＰＣ１プロモーターが発現させるアッセイを用いて行った。ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子の前にＮＰＣ１プロモーターをクローン化した。ＮＰＣ１プロモーター活性化はウミシイタケルシフェラーゼ発現をもたらす。このベクターを用いて、ＮＰＣ１ウミシイタケルシフェラーゼベクターを安定して発現させるＨｕｈ７細胞株を作製した。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ−１６４０を含む培地内で増殖させ、維持した。１０％ ＦＢＳを追加したＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ還元血清培地中のアッセイのために、１，５３６ウェル不透明プレートに、５μＬ中１，５００細胞／ウェルで細胞を播種し、次いで、ＤＭＳＯ溶液中の２３ｎＬ／ウェルの化合物をピン転写により加えた。アッセイプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。Ａｍｐｌｉｔｅルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキットをＡＢＤ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから購入し、メーカーの推奨にしたがって調製／保管した。室温で１０分間インキュベートした後、ＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光シグナルを測定した。

細胞毒性アッセイ。ＮＰＣ１−ホタルルシフェラーゼの細胞に対して毒性を示した化合物を区別するために、細胞毒性アッセイを行った。細胞を、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ−１６４０を含む培地内で増殖させ、維持した。１０％ ＦＢＳを追加したＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ還元血清培地中のアッセイのために細胞を播種した。１，５３６ウェル白色不透明プレートに３μＬを加えて細胞を４，０００細胞／ウェルで播種し、次いで、ＤＭＳＯ溶液中の２３ｎＬ／ウェルの試験化合物をピン転写により加えた。アッセイプレートを３７℃で４８時間インキュベートし、その後、３μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を加えた。室温で５分間インキュベートした後、ＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光シグナルを測定した。

生化学的ウミシイタケルシフェラーゼカウンターアッセイ。ウミシイタケのタンパク質を安定化することによってウミシイタケルシフェラーゼのシグナルを促進する任意の化合物を排除するために直交分析を行った。簡潔には、３μＬの０．０１ｍＭ Ｄ−ルシフェリンおよび０．０１ｍＭ ＡＴＰを１５３６ウェルの白色の固いボトムプレートに分注した。ピンニングにより、２３ｎＬの化合物を加えた。ＰＴＣ１２４（３−［５−（２−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル］安息香酸）が対照として役目を果たした。室温で１０分間インキュベートした後、１μＬのルシフェラーゼを加え、その後、ＶｉｅｗＬｕｘでプレートの発光読み取り値を直ちに読み取った。すべての成分の最終濃度は以下の通りであった：０．０１ｍＭ Ｄ−ルシフェリン、０．０１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｎＭ Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ、１Ｍ Ｍｇアセテート、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および０．０５％ ＢＳＡ。

ＶＴＢ−ＧＬ−３アッセイ。リソソーム中の中性スフィンゴ糖脂質グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）の蓄積はファブリー病の特徴であるが、ＮＰＣ疾患を含む他のリソソーム蓄積障害においても観察されている。腎臓および肝臓などの器官からのＧＬ−３の除去は、ファブリー病の予後の改善に対応する。脂質は大腸菌ベロ毒素（ＶＴＢ）のＢサブユニットを用いて検出することができて、これは、ＧＬ−３のオリゴ糖部分およびセラミド部分の両方に対して高い特異性および結合活性を有する。精製した組換えＶＴＢを細菌から産生させ、細胞検出検査のために蛍光色素Ａｌｅｘａ５９４に結合させた。試験化合物で４８〜７２時間処理した後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗い、リン酸緩衝ホルマリンを用いて４℃で３０分間固定し、食塩水で２回×５分間洗浄して、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬ Ａｌｅｘａ５９４−ＶＴＢと共に４５分間インキュベートした。次いで、細胞を食塩水２回×５分間で洗い、ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔでマウントし、Ｍｅｔａｖｕｅプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に内蔵された形態計測機能を使用して４０倍フィルターで採点した。

一例として、ＶＴＢを使用して、本明細書に記載のさまざまな化合物で処理した後のＮＰＣ細胞における脂質蓄積の矯正のレベルを評価することができる。野生型（Ｗｔ）およびＮＰＣ３細胞を２つの化合物で３日間処理し、次いで、上述の通りＶＴＢ染色のために処理した。未処理のＮＰＣ３細胞は強い染色を示すが、Ｗｔ細胞は、予想される通り物質の最小限の蓄積を示す。実施例１および実施例３６の化合物で処理すると、ＮＰＣ３細胞における脂質物質の蓄積は、Ｗｔ細胞に影響を与えることなく大幅に減少する。ＶＴＢ染色の蛍光強度の定量化は、２つの化合物がＮＰＣ３細胞における脂質蓄積を９０％を超えて減少させることができることを示す。

式Ｉの化合物を上述のスクリーニングで試験し、以下の結果を得た：

ＮＰＣ細胞における遊離コレステロール蓄積を検出するフィリピン染色アッセイ。遊離の非エステル化コレステロールを認識するフィリピンで処理したＮＰＣ１患者の細胞の線維芽細胞を染色することにより、化合物をＮＰＣ１細胞表現型に対するそれらの効果について評価した。ＮＰＣ１プロモーターを上方制御する化合物は、未処理のＮＰＣ１線維芽細胞と比べて、処理されたＮＰＣ１線維芽細胞におけるフィリピン染色を減少させると予想された。これは、非エステル化コレステロールの除去を示す。反対に、ＮＰＣ１プロモーターの阻害剤は、野生型線維芽細胞におけるフィリピン染色を増加させると予想された。これは、したがって、ＮＰＣ様表現型の出現を示す。簡潔には、細胞をリポタンパク質欠乏培地で３〜４日間増殖させ、次いで培地を交換し、試験化合物および５０μｇ／ｍＬの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を追加した。２４〜４８時間後、細胞をフィリピンで染色し、Ｍｅｔａｖｕｅプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に内蔵された形態計測機能を使用して４０倍フィルターで採点した。フィリピン蛍光の強度を未処理の細胞の５０％未満に減少させた試験化合物が特に重要であると考えられる。

上記の表には記載されていないが、表５に示した追加の化合物は以下の通り：

ＮＰＣ細胞内のスフィンゴリピド輸送をモニターするためのラクトシルセラミド染色。蛍光プローブＢＯＤＩＰＹ−ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）を用いて、化合物で４８〜７２時間処理した細胞において、ＮＰＣ１線維芽細胞に見られるスフィンゴリピド輸送欠陥に対する各化合物の影響を評価した。この糖脂質は、１時間後にＷｔ細胞のゴルジ装置に完全に局在するが、ＮＰＣ１細胞ではエンドソーム染色のみを示す。この誤った局在は修正することができ、Ｗｔ ＮＰＣ１タンパク質またはＲａｂ９の発現によってゴルジ局在が回復するため、エンドサイトーシス輸送経路の動的観察が実現する。細胞を、１％ ＦＢＳを含む培養培地で５μＭ ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒ／ＢＳＡを用いて３７℃で４５分間インキュベートし、洗浄して、さらに１％ ＦＢＳを含む培地内で３７℃で１時間インキュベートした。形質膜に存在する蛍光脂質を、脂肪酸を含まない５％ ＢＳＡを用いた逆交換により除去した。細胞を３％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２０分間固定し、次いで、電荷結合素子カメラを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡で可視化した。ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアで画像を取得し、次いで、ＡｕｔｏＤｅｂｌｕｒソフトウェアを使用してデコンボリューションした。

脂質蓄積の静的レベルを検出する上述のＶＴＢアッセイとは異なり、Ｂｏｄｉｐｙ ＬａｃＣｅｒプローブは、形質膜からゴルジ装置への脂質輸送の回復／矯正の検出を可能にする。この動的アッセイは、さまざまな化合物がＮＰＣ輸送遮断に対して有する矯正のレベルを決定するために使用することができる。実施例１および３６の化合物で処理したＮＰＣ３細胞は、未処理のＮＰＣ３細胞と比べた、プローブのゴルジへの蓄積によって示されるそれらの遮断の矯正を示す。１μＭの実施例１の化合物は、ゴルジの位置のパーセントを統計的に有意な量だけ減少させる。１０または１００ｎＭの実施例３６の化合物は、ゴルジの位置のパーセントを統計的に有意な量だけ減少させる。

ファブリー病の治療における化合物の有効性は、Ｉｏａｎｎｏｕら［Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６８，１４−２５（２００１）］によって記述されているように、ファブリー病マウスの肝臓および脾臓におけるＧＬ３の蓄積の減少を測定することによって決定した。年齢および性別を一致させたＮＰＣ１マウス２０匹を、それぞれ１０匹のマウスの２つの群に分けた。各マウスに、合計２００μＬのＤＭＡ／ｓｏｌｕｔｏｌ／食塩溶液を与えた。実施例５０の化合物をＤＭＡ／ｓｏｌｕｔｏｌ／食塩水に溶解し、３０ｍｇ／Ｋｇ＝７５０μｇ／マウスで与えた。各マウスに、１週間に３回の腹腔内注射を３週間行った。３週間の最後にマウスを屠殺し、臓器を採取した。ファブリー糖脂質ＧＬ−３を各組織から抽出し、ＧＬ−３ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて定量した［Ｚｅｉｄｎｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７，１０４−１１３（１９９９）］。処置したマウスの肝臓、心臓および腎臓は、ＧＬ−３レベルの５０％超の減少を示した。血漿レベルも低下したが、それほど多くはなかった（３０％）。

異なるリソソーム蓄積症におけるリソソームの蓄積量を定量化するために、本発明者らは、特定のタイプの脂質に結合するいくつかの毒素を開発した。その受容体、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ３）の検出および定量化のための組換え大腸菌ベロ毒素サブユニットＢ（ＶＴＢ）の使用は上述した。本発明者らは、Ｃ末端にステップタグＩＩ配列を含むようにＶＴＢを再設計し、したがって、これは、さまざまなストレプトアビジン標識プローブと共に使用できる。本発明者らは、異なるレポーター；ＧＦＰ、ＲＦＰ、ルシフェラーゼ、ＳｔｒｅｐＴａｇに融合したオステロリシン（ｏｓｔｅｒｏｌｙｓｉｎ）Ａ（ＯｌｙＡ）の４つの異なるバージョンを設計した。さらに、本発明者らは、ガングリオシドＧＴ１ｂに結合する破傷風毒素断片Ｃ（ＴＴＣ）と、コレステロールを認識するｐｅｒｆｉｎｇｏｌｙｓｉｎ Ｏ（ＰＦＯ）とに基づくプローブを構築した。上述の毒素プローブのそれぞれを大腸菌で発現させ、均一になるまで精製した。各リソソーム蓄積症に適切なプローブの組み合わせを決定するために、本発明者らは、異なるリソソーム蓄積障害の患者の細胞株をいくつか用いて、これらのプローブの評価を実施した。いくつかのリソソーム蓄積症は、特定の染色パターンを共有し、それらのエンドソーム／リソソーム内に類似の脂質が蓄積していることを示唆した。リソソーム蓄積症の大部分について最も強いシグナルを有する毒素は、ＯｌｙＡプローブおよびＶＴＢプローブである。したがって、それらをほとんどの検討で使用した。

示したさまざまなリソソーム蓄積障害を伴う患者の線維芽細胞株は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。細胞を、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を含む提案された細胞培養培地内で維持した。完全増殖培地内の６ウェルディッシュ中のガラスカバースリップ上で細胞を増殖させた。毎日、３日間、細胞には、１μＭの試験化合物またはＤＭＳＯ（対照）を含む新鮮な培地が与えられるであろう。続いて、細胞単層をＰＢＳですすぎ、リン酸緩衝ホルマリンを用いて４℃で３０分間固定し、ＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理した。細胞をＯｌｙＡ−ＧＦＰと共にインキュベートし、洗浄して、蛍光顕微鏡用に処理した。電荷結合素子カメラ（Ｎｉｋｏｎ（ニューヨーク州メルビル））を備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡で、すべてのサンプルについて同じ露光時間を使用して画像を取得した。ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアの積分強度機能を使用して蛍光強度を決定した。それぞれについて少なくとも１００個の細胞を定量化した。

染色およびスフィンゴ糖脂質ＧＬ−３レベルの定量化：細胞および処置は、細胞をＶＴＢ−ｓｔｒｅｐタグでインキュベートし、続いてＳｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ ｃｈｒｏｍｅｏ ４８８（Ｉｂａ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）でインキュベートし、その後、蛍光顕微鏡観察が続いたことを除いて上述の通りであった。画像化および蛍光定量は上述の通りであった。

あるいは、各リソソーム蓄積症について適切な脂質を定量化するために、毒素ＥＬＩＳＡを使用した。細胞を９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルで播種した。１μＭの試験化合物で４８〜７２時間処理した後、細胞を固定して透過処理し、適切な毒素プローブでプローブ検査した。結合した毒素の量を、抗毒素アルカリホスファターゼを用いて定量化した。現像したプレートを、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ Ｐｒｏマシンを用いてＯＤ ６００で読み取った。

実施例５０の化合物で処理した後、リソソーム蓄積物質は以下の通り減少した：ファブリー、５１％；ニーマン・ピックＡ型、５０％；ファーバー、４８％；バッテン、５９％；ゴーシェ、５０％；ポンペ、４２％；ウォルマン、７５％；ＭＰＳ ＶＩＩ、２７％。

リソソーム蓄積症酵素アッセイ：適切な患者の細胞株を１２ウェルディッシュに播種した。細胞の三つ組のウェルを、１μＭの試験化合物で７２時間処理した。毎日培地を除去し、試験化合物を含む新鮮な培地と交換した。続いて、細胞を緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ ６．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む１％ Ｉｇｅｐａｌ）に溶解し、氷上で３０分間インキュベートした後、１４ｋ ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。可溶化物を、疾患特異的な酵素活性について以下の通り３７℃で１時間アッセイした：

ウォルマン：細胞可溶化物をクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．４）中の１ｍＭ ４−メチルウンベリフェリルオレアートと共にインキュベートすることにより、リボソーム酸リパーゼ活性を測定した。０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を用いて反応を停止させた。

クラッベ：細胞可溶化物をクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．６）中の０．４ｍＭ ６−ヘキサデカノイルアミノ−４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドおよび１ｍｇ／ｍＬ タウロコール酸ナトリウムと共にインキュベートすることにより、β−ガラクトセレブロシダーゼ活性を測定した。０．４Ｍグリシン（ｐＨ１０．８）を用いて反応を停止させた。

バッテン：細胞可溶化物をクエン酸塩−リン酸緩衝液（ｐＨ４．４）中の２５０ｍＭ Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−７−アミド−４−メチルクマリンと共にインキュベートすることにより、トリペプチジルペプチダーゼＩＩ活性を測定した。０．３％トリフルオロ酢酸を用いて反応を停止させた。

ファブリー：可溶化物をＰＢＳ／０．２Ｍ酢酸（ｐＨ４．２）（１：１）中の等容量の４ｍＭ ４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシドと混合することにより、ガラクトシダーゼＡ活性を測定した。１Ｍグリシン／１Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ１０）を用いて反応を停止させた。

それぞれの場合で、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ Ｐｒｏにおいて、３６０／４６０ｎｍ励起／発光対で蛍光シグナルを読み取った。ファブリー病（突然変異Ｐ２５０Ｔ、Ｎ３４Ｓ、Ｎ２１５Ｓ）の３人の異なる患者由来の細胞において、実施例５０の化合物で処理した細胞におけるリソソームａ−ガラクトシダーゼＡはそれぞれ、対照の１２２％、１８０％および１２９％であった。ウォルマン病患者由来の細胞では、実施例５０の化合物で処理した細胞におけるリソソーム酸リパーゼ活性は、対照の１８０％であった。クラッベ病患者由来の細胞では、実施例５０の化合物で処理した細胞におけるβ−ガラクトセレブロシダーゼ活性は、対照の１１４％であった。バッテン病患者由来の細胞では、実施例５０の化合物で処理した細胞におけるペプチダーゼＩＩ活性は、対照の１８５％であった。

本発明の化合物が血液脳関門（ＢＢＢ）を透過する能力は、以下のプロトコルによって評価することができる：Ｃ５７ＢＬ６マウスに３０ｍｇ／ｋｇの試験化合物を皮下注射した。注射の２時間後、マウスを屠殺し、組織を単離して冷食塩水ですすぎ、濾紙上で乾燥して秤量し、ドライアイスに入れて急速凍結した。サンプルを４８ウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ（商標）７７０１−５５００ ＵＮＩＰＬＡＴＥ（商標）４８ウェル×５ｍＬ Ａｓｓａｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ Ｗｅｌｌ ＆ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ）内で−８０℃で、分析するまで保存した。アッセイのために、３倍の容量の水を各脳サンプルに加え、ＳＰＥＸ Ｇｅｎｏ／Ｇｒｉｎｄｅｒを用いてサンプルをホモジナイズした。１０種類の較正標準（１．０〜１０００ｎｇ／ｍＬ）を、対照ブランクの脳ホモジネート中で調製した。２００μＬのＩＳ／アセトニトリル／ＭｅＯＨを２ｍＬ ９６ウェルプレートの各ウェルに加え、４０μＬのホモジネートした組織サンプルを２ｍＬ ９６ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。プレートに蓋をして、パルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）ボルテックスミキサーを用いて５分間ボルテックスし、次いで、４℃および３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。１５０μＬの上清をＴｅｃａｎを用いて３５０μＬ Ｗａｔｅｒｓ ９６ウェルプレートに移し、１．０μＬの上清をＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入した。この試験において、実施例５０の化合物は、１．０５８×１０^−４ｃｍ／ｓの透過率を示すことが明らかになった。したがって、実施例５０の３０ｍｇ／ｋｇの注射により、１時間で約３μｇ／ｍＬの血漿濃度および１時間で約２００ｎｇ／ｍＬの脳濃度が得られた。したがって、この化合物は、中心成分を有するリソソーム蓄積症、例えば、ニーマン・ピック、バッテン、ゴーシェＩＩ型、クラッベおよびムコ多糖症ＶＩＩ（ＭＰＳ ＶＩＩ）の治療に有用であると予想される。

Claims (19)

1. 式Ｉ
   

   

   （式中、
   Ｒ^１は、水素原子および（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基から選択され、
   Ｒ^２は、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、場合により置換されることがあるベンジル基、メタ置換フェニル基およびパラ置換フェニル基から選択され、ここで、前記ベンジル基またはフェニル基上の置換基は、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、ハロゲン基、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基およびシアノ基から選択され、または
   Ｒ^１およびＲ^２は、これらが結合している窒素原子と共に、場合により置換および／または縮合されることがある複素環を形成し、
   Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、水素原子、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基、および、アミン基または飽和窒素複素環で置換された（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基から選択され、
   Ｃｙは、アダマンチル基、場合により置換されることがある単環式アリール基、および場合により置換されることがある単環式ヘテロアリール基から選択され、ただし、Ｒ^２が（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基であるとき、Ｃｙは、非置換のアリール基またはヘテロアリール基ではない。）の化合物を投与するステップを含む、リソソーム蓄積障害を治療する方法。
2. 前記障害が、スフィンゴリピドーシスおよびムコ多糖症から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記障害が、ニーマン・ピックＣ、ニーマン・ピックＡ／Ｂ、ファブリー病、ファーバー病、ウォルマン病、ゴーシェ病、クラッベ病、ＭＰＳ ＶＩＩ（ムコ多糖症ＶＩＩ）、神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ ２）および糖原病ＩＩ型（ポンペ病）から選択される、請求項１に記載の方法。
4. Ｃｙが、場合により置換されることがあるピラゾール基、ピロール基、チアゾール基、イミダゾール基、オキサゾール基、ピリジン基、ピリダジン基、ピリミジン基、チオフェン基、フラン基およびフェニル基から選択される、場合により置換されることがある環である、請求項１に記載の方法。
5. Ｃｙが、置換ピロール基、オルト置換フェニル基、メタ置換フェニル基、および場合により置換されることがあるピリジン基またはイミダゾール基から選択される環であり、ここで、前記環上の前記置換基が、（Ｃ_１−Ｃ_７）炭化水素基、（Ｃ_１−Ｃ_６）アシル基、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_１０）オキサアルキル基およびハロゲン基から選択される、請求項４に記載の方法。
6. Ｒ^１が、水素原子および（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基から選択される、請求項１に記載の方法。
7. Ｒ^２が、メタおよびパラ置換フェニル基から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記メタおよびパラ置換基が、ブロモ基、クロロ基、シアノ基およびアセチル基から選択される、請求項７に記載の方法。
9. Ｒ^１が（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基であり、かつＲ^２が（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基である、請求項１に記載の方法。
10. Ｒ^１およびＲ^２が、これらが結合している窒素原子と共に、場合により置換されることがある単環式複素環を形成する、請求項１に記載の方法。
11. 前記場合により置換されることがある複素環が、ピロリジン、ピペリジン、アゼピン、モルホリンおよびピペラジンから選択される、請求項１０に記載の方法。
12. Ｒ^１およびＲ^２が、これらが結合している窒素原子と共に、場合により置換されることがある縮合複素環を形成する、請求項１に記載の方法。
13. 前記場合により置換されることがある縮合複素環が、テトラヒドロベンゾアゼピン、テトラヒドロキノリン、テトラヒドロイソキノリン、インドリンおよびイソインドリンから選択される、請求項１２に記載の方法。
14. Ｒ^３が、水素原子、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、ハロゲン基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基、およびアミン基または飽和窒素複素環で置換された（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ基から選択され、かつＲ^４、Ｒ^５およびＲ^６が、独立して、水素原子およびフッ素原子から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. Ｒ^３が、水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基、ジメチルアミノプロポキシ基およびヒドロキシ基から選択され、Ｒ^４およびＲ^６が水素原子であり、かつＲ^５が水素原子またはフッ素原子である、請求項１４に記載の方法。
16. 式：
    

    

    （式中、Ｃｙはメチル置換ピリジン環である。）の化合物。
17. Ｃｙが、４−メチルピリジン−３−イル、イミダゾール−４−イルおよび２−フェニルイミダゾール−４−イルから選択される、請求項１６に記載の化合物。
18. 医薬として許容される担体、および式：
    

    

    （式中、Ｃｙは、メチル置換ピリジン環、イミダゾール基または置換イミダゾール基である。）の化合物を含む医薬組成物。
19. Ｃｙが、４−メチルピリジン−３−イル、イミダゾール−４−イルおよび２−フェニルイミダゾール−４−イルから選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。