JP2018508084A - 逆指向分析（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄａｎａｌｙｓｉｓ）による証拠に基づく植物の有効成分の検出方法 - Google Patents

Abstract

この分野における通例の方法は、細胞と動物を用意する実験室で化合物を同定し、スクリーニングし、そして、その後、候補化合物で臨床試験に移る。これえらの方法で問題を複雑にしているのは、有効化合物は、オリジナルの薬草には存在しないかもしれないし、多数の化合物が結果と関連し、長期間の研究と高額コストをもたらすことである。本発明は、次のような問題を解決した；１）好適で安全な結果を示す試験患者から、候補化合物は同定される。２）一以上の化合物が同定されうる。３）安全で有効な化合物は、代謝物であるかも知れないし、薬草には存在しないかもしれない。本発明の方法は、臨床情報を集めるためにウェブサイトを利用する。候補化合物は、患者からの共通組成を分析することで決定されうる。潜在的な治療化合物のデータは、ヒトから直接得ることができる。 これらの知見は、医薬品の研究開発における時間とコストの削減に貢献する。

Description

本発明は、漢方薬における有効かつ安全な成分を見出すことに関する。

本出願は、2015年3月13日に出願された米国特許出願第62/177.349号の仮特許出願に関連しており、優先権を与えられている。

連邦およびスポンサ研究または開発に関する声明について、該当事項はない。

配列リスト、表またはコンパクトディスクの付録を列挙したコンピュータプログラムへの言及はない。

病気を治療する化合物の開発と応用は、現代医学の特徴である。西洋医学は、研究から市場投入までに平均15年かかる現代化学、研究開発の製品であり、平均で約15億米ドルの費用がかかる。高価なため、その安全性と有効性を証明するために未知の化合物は1つのみ治験することができる。同じ治験で2つ以上の未知の化合物を研究すると、はるかに多くの費用がかかる。
伝統的な漢方薬（TCM）は、中国人の健康に不可欠な貢献をした。TCMは自然薬である。その効果は、単一または複数の化学成分によって達成される固有の物質的基盤を持たなければならない。薬草（ハーブともいう）は非常に複雑な化学組成を持っている。1つの薬草は何百種もの未知化合物で構成されており、TCMは数種または数十種の薬草で構成されている。TCMを研究する古典的な方法は、薬草から単一の化学成分を抽出し、次いで成分の活性をインビボまたはインビトロで1つずつ分析することである。しかし、この方法は、代謝産物の安全性および有効性を検出することができず、TCMの異なる化合物間の相乗効果も検出できない。高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー-質量分析、液体クロマトグラフィー-質量分析、液体クロマトグラフィー-質量-質量分析（LCMS-MS）、指紋など、ハーブの化合物を分析する方法は数多くある。しかしながら、これらの方法は、それらの化学組成物に対応するピークのみを同定することができ、それらを有効性および安全性と関連付けることはできない。したがって、このような材料ベースは、TCM研究において依然としてボトルネックである。

本発明は、漢方薬の成分を同定する方法である。本発明は、ウェブサイトを通じて、プロバイダーが患者の状態、診断及び処置を記録することができるようにするWebサイトが含まれる。患者のデータは、プロバイダーによって集められ、統計解析がされ得る。ハーブの化学組成を分析することができる。本発明により、プロバイダーは、活性成分を決定するために、内部および外部テストの両方を行い、そして、純粋な有効化合物で、または薬草との組み合わせで、患者を処置することができる。
本発明のより完全な理解のために、以下の記載に言及する。

薬草の安全性と有効性に関する情報を提供するTCMをデジタル化する。 有効なコンポーネントを分析して決定する。 好ましい結果を有する患者の共通成分の選択。 有効な抗菌成分の発見 化学分析は、各患者でW、Y、およびZの最高濃度を示す。 患者の反応とバイオマーカーのそれらの種類。 薬草に対する応答に基づいて患者を分類する。

以下の詳細な説明は、本発明の例示的な実施形態を実現する上で、現時点では想定されている最良のモードである。この説明は合理的とはみなされないが、本発明の一般的原理を説明することを唯一の目的のために作られている。

インターネットとウェブサイトは成熟した現代技術である。目標を達成するためには、まず、TCM医師が一般的および臨床的情報を収集するために専門化されたウェブサイトを確立することである。名前、性別、年齢、国籍、出生地、症状および兆候、診断、家族、手術歴、投薬、検査結果、画像および病理学的結果、副作用などの情報も収集される。ウェブサイトの情報は、許可を得てダウンロードする必要がある。各ユーザーはこれらのデータを分析できる。実施実務家は、統計分析を行うためプログラムの使用方法を教えられる。

同じ調合物は、調合物が安全かつ効果的であるか、または安全であるが有効ではない等、様々な患者において異なる結果を有し得る。医師は結果を分析し、組成を調整し、結果を改善するために患者を再治療することができる。医師である実施実務家は、異なる治療法を処置される患者を比較して、薬草の副作用を検出することができる。好ましい結果が通知されるか刊行され、他の医師が同じ方法でこれらの結果を繰り返すことができ、TCMを測定可能で再現性があるものとし、経験から科学にその内容を変換することができる。好適な結果が見出された場合、次のステップは活性成分の分析および発見であり、処理工程は、図1に示されている。

HPLC、LC-MS（液体クロマトグラフィー質量分析）、LC-MS-MS、TCMフィンガープリントなど、化学組成を分析する方法は数多くある。個々の血液検体分析を用いて各個人に多くの化学組成が存在する場合、好適な反応（応答）を有する患者の共通成分は、図3に記載のコンピュータ支援プログラムを用いて検出されるべきである。図3を参照すると、図1の好ましい応答を有する10人の患者（P1からP10）を仮定すると、各患者は化学分析において異なる成分を有する。例えば、P1は255個がある、P2は302個などがある。図3で説明したロジックを用いて共通コンポーネントを見つけることができる。図3で説明したことに関して、R²が小さすぎる場合、これは、いくつかの重要なコンポーネントが失われたことを意味し、図2のステップ1に戻り、紛失したコンポーネントを発見しようとする。同じ成分の患者が、近い濃度にあるので、それらを試験に付す理由はない。

統計分析を適用し、統計的に有意でない化合物を除去することができる。R²は、図2で説明したような有効性について、どれくらいの残りの化合物で説明するかを決定するのに使用することができる。図2で説明したことに関して、一部の患者において薬草と共に成分が安全かつ有効である場合、その濃度をそのような患者で見出すことができた。6aにおいて、図1の応答の不良な患者は、薬草と共に成分で処理される。一方、6bにおいて、図1の応答の悪い患者は、成分のみで処置されているが、目的は非必須成分を除去することである。

ロジスティック回帰を適用して、バイナリデータを従属変数とする有意でない組成物を除去することができる。ANCOVAは線形従属変数に適用することができ、生存分析は長期的な研究に使用される。臨床的改善は従属変数であり、化学組成は従属変数となる。有意でない独立変数は、p値≧05の場合は除去される。

分析後に統計的に有意な化合物が依然として存在する。これらの化合物について、化学的データベースを用いて同定する努力がなされる。これらの化合物の構造が既知であり、利用可能である場合、それらはインビトロおよびインビボ研究のための次の工程で使用することができる。そうでなければ、これらの化合物はさらなる研究のために精製することができる。

これらの化合物の安全性は、治療中の臨床応用においても利用可能であり、100年の経験では、異なる時点からの血液試料を検討することによってその範囲を見出すことができる。これらの精製された若しくは合成化合物は、動物研究において使用することができた。それらが安全であれば、それらは患者の処置に単独でまたは元の調合剤と混合して使用することができる。結果は、図2で説明したように、これらの化合物が安全かつ有効であることをさらに証明することができる。

ハーブの無駄な成分を排除するために、合成された化合物を単独で使用して患者を処置することができる。いくつかの患者が好ましい結果を有する場合、これらの化合物は有効であることが証明され、臨床的に単独で使用することができる。

各オリジナルの薬草およびこれら薬草の混合物の成分の分析を行うことができ、その結果を他の化合物化学データベースと比較して、それらが構造的に既知であるかどうかを見ることができる。活性化合物は、オリジナルハーブ、または混合ハーブ中に存在するかもしれない。これらがこれらの薬草に存在しない場合、インビボの代謝産物である可能性がある。

実施例１:薬草から高血圧症を治療する効果的なコンポーネントを見つける

TCMの医師は、A、B、C、D、Eの薬草で構成された調合剤で高血圧を治療し、20人の患者が治療された。当初、すべての患者は高血圧を有し、他の疾患はない。これらの患者は処置され、3日に1回、診療所に戻ってくる。2週間後、10人の患者の血圧は正常になる。他の10人の患者の血圧に変化はない。採血は、処置の0、0.5、1、2、4、8、12、24時間の時点で行いうる。

ロジスティックな段階的回帰は、A、B、C、Eが統計的に有意な薬草であり、これらの薬草のR²=0.81であり、医師はD薬草を混合物から除去し、患者を治療し続けた。この結果は、他の医師の患者の治療において確認される。

治療に対する良好な応答を有する患者からの血液サンプルのLC-MS-MS分析により、各患者は数百の化学成分しか存在せず、W、X、Y、Zの4つの同一成分のみが検出される。統計的に有意な化合物であるこれらの4つの成分についてのR²=0.84で、ロジスティック的な段階的回帰を適用した。

データベースが検索され、Yは既知の化合物であり合成することができ、Zは未知の化合物である。WはA、B、C、Eの混合物中に存在しないので、Zは代謝物でなければならないAまたはB、またはCまたはEのいずれかであり、インビボで生体内代謝物である。

Zの構造は後に研究で確認され、合成することができる。化学分析は、図5の表で説明されているように、各患者におけるW、Y、およびZの最高濃度で、この表中の全ての数字は仮説的なものである。

さらなる分析は、W、Y、Z化合物が存在するかどうかをチェックする良好な応答を示さなかった10人の患者において同じ方法で行われる。2人の患者（P1、P2）は、顕著な効果を示すこれらの患者に近い濃度のW、Yを含み、Z化合物は存在しない。3人の患者（P3、P4、P5）にW、Y、Zがなく、患者（P6、P7）の血液サンプルはW、Y、Zを有する。しかし、その濃度は非常に低く、他の3人の患者（P8、P9、P10）は血液中にW、Y、Zを有し、濃度は良好な応答の患者に近い。

化合物W、Y、Zは合成され、毎日7人の患者（P1〜P7）を治療するために使用され、その血圧は2週間後にチェックされる。

バイオマーカー分析によってP1〜P10の5種類のバイオマーカーが示されている。AAA、BBB、CCC、DDD、EEEタイプのAAA患者は、治療にZ化合物のみを必要とし、タイプCCCは、治療のために全てのW、Y、Z化合物を必要とする。タイプBBB、DDD、EEE患者は、これらの化合物のいずれかまたはすべてで治療することはできない。結果を図7の表に示す。

良好な応答を有する10人の患者のバイオマーカーはHHHである。将来の治療では、これらのバイオマーカーを最初にチェックする必要がある。バイオマーカーがAAAまたはCCCまたはHHHである場合、化合物W、Y、Zを治療に適用することができ、バイオマーカーBBB、DDD、EEEを有する患者は、図3に説明されているように、図6および図7の表に示されている。

実施例２：大腸菌敗血症の患者を治療するために薬草を使用し、初回調合薬で治療した10人の患者がいる。患者が調合を受けた後、0時間、0.5時間、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間および24時間の時点で採血を行う。インビトロでの採取試験が行われ、結果は以下の通りである：

0時間で、コロニーの平均は52で標準偏差（S.D.）11であり;24時間の処理後、コロニー数は222で、S.D.35。 これは効果的でない最初の調合である。この結果は、配合が効果的でないことを示している。

その後、医師は同じ患者を治療するために2回目の混合物を使用する。採血は同じ時点で行われた。インビトロでの採取試験が行われ、結果は以下の通りである：

0時間で、平均は、522でS.D41であり、24時間の治療後、平均は15でS.D.3である。2回目の配合が効果的である。

これらの結果に基づいて、第2の処方が有効であることが証明された。好ましい効果を有する患者の血液試料の分析では、各患者は多くの化学成分を有し、全ての患者にC1-C4成分のみが存在する。

コンコックシオン１で治療されていた血液のサンプルを分析した結果は、C1-C2が見つかり、科学的なデータベースはC3-C4は構造的に既知であり、合成でき、商業的に入手可能であることを表す。

C3-C4は、体外ペトリ皿で検証され、有意な除菌効果が分かる。ピーク濃度は、これら患者から別の時に集めた血液サンプルを計ることで決定でき、最高濃度は、別の時に血液サンプルを計ることでえられ、C3-C4の適当な投与量が決められる。これらの患者には副作用が見つからず、百年間この薬草でその利用に副作用が報告されていない。

ことなる別の時に、これらの患者における濃度にもとづき、ビトロ毒性のテストがC3−C4でおこなわれた。合格した後、安全のためのテストがボランディアで行われる。このトライアルで好適な反応が見られ、副作用が出ないなら、これらは患者を治療するために使用できる。

C3-C4は非有効あるいは重大な副作用があり、そして科学的なデータベースを調べ直す。C1-C2の構造は、既知であり、商業的に入手可能である。
最高濃度は別の時に血液のサンプルを計ることで得られ、C1-C4の適当な投与量が決められる。

ビトロでの有効性テストが、問題なく、C1-C4でなされた。安全のためのテストがボランディアで行われ、これら患者で副作用がなく、百年間この薬草の利用で副作用も報告されていない。

安全性と有効性の検討が、C1-C4についてボランティアで行われた。好ましい反応が観察され、重大な副作用が見付からず、C1-C4薬は、疾患を治療できる。この全手順は図４に示された。

注：C1-C4の構造が不明で、あるいは合成できないなら、それらは精製され若しくはテストされる。もし、有効なら、その組成は分析され、そして後に合成できる。

上記実施例は、この特許の適用を表示するための限定的な実例であり、網羅的ではない。本発明の範囲内には、他の制限されない実施態様がありうる。

図6によれば、これは患者の反応とバイオマーカーのそれらのタイプを示す表である。
1.これら患者は、第一の調合で好適な反応をもたない仮説的な対象である。
2.これらのバイオマーカーは、仮説的なものである。
3.BP：血圧。
4. W、Y、Z成分は、正常範囲内でこれら患者に存在するので、これらの成分を投与する理由はない。

ある患者が、薬草治療に対して好ましい反応を示す場合、その反応のためにある成分が存在するにちがいない。それらは、薬草に存在する異なる成分、または異なる薬草からの反応成分、または人体内の代謝化合物であり得る。好ましい応答を有する患者は、受容体、連鎖反応、酵素サブタイプなどの反応機構を有するにちがいない。患者の薬草への反応に応じて、A、B、Cの3つのカテゴリーに分類することができる。

図7を参照すると、これは、薬草に対する応答に基づいて患者の分類を示すための表である。A型およびB型の患者は、これらの薬草で治療することができるが、C型の患者はこれら薬草のために必要な反応連鎖がないため、治療することができない。これらのタイプの患者は、科学的方法によって同定することができる。すべての情報は仮説である。

Claims (10)

1. 伝統的な漢方薬に存在する活性成分を同定する方法であって、
   患者の状態、診断及び処置を含む患者データの記録の実施をウェブサイトを通じてプロバイダーに可能にするためにウェブサイトをセットアップする工程を含み、ここで該プロバイダーは該患者のデータをダウンロードすることができ；
   有効な薬草の組み合わせ見出し、そして意味のない薬草を排除するために、ANOVA、ANCOVA、ロジスティック回帰、時系列、R-スクエアから選ばれる手段によって、該データの統計分析を実行し；
   当該組成物内の化合物を合成若しくは分離することで、これら薬草の組成を分析し；
   活性成分を決定するために、内部及び外部の両方のテストを行い、そして、純粋な有効化合物で若しくはその薬草との組み合わせで、規制当局の認可若しくは認可なしに、その医学的状態について、患者を処置し；
   患者において有効化合物が同定される
2. 該ウェブサイトは、全ての医学的実務家に、実務情報を入力すること及び該ウェブサイトからダウンロードされた該データをもとに統計分析行うことを許容するようにセットアップされ、そして、該実務家は、繰り返し、診断及び処置の継続的改良をおこなうことが可能であり、そしてどの薬草が患者に有効な効果をもち安全か及びどの薬草が患者に安全だが効果がないかを決定することが可能である、請求項１に記載の方法。
3. さらに、化学的分析装置で患者の血液検体を分析し、そして、コンピュータプログラムを経て、肯定的な結果をもつ、これら患者の共通の組成物をみいだすことを含む、請求項１に記載の方法。
4. さらに、ANOVA、ANCOVA、ロジスティック回帰、時系列、R-スクエアから選ばれる一つを含む、統計解析法により該化合物の重要でない組成を分析し、排除することを含む、請求項１に記載の方法。
5. さらに、これら有効でない患者の血液検体を分析し、これら共通の組成をもつ者を見出すことを含む、請求項１の方法。
6. さらに、これら共通の化合物が、肯定的および否定的結果を有する患者に存在する様々な化合物間の差異によって、内部及び外部の両方のテストで効果があるどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
7. さらに、患者の生物学的特性に応じて精製された化合物を用いて内部および外部テストを行うことを含む、請求項１に記載の方法。
8. さらに、その異なる生物学的特性に従って見出された活性化合物で患者を処置することを含む、請求項１に記載の方法。
9. さらに、該精製された活性化合物のみを使用することによって、またはオリジナルの薬草と精製した物質との組み合わせで患者を処置することを含む、請求項１の方法。
10. ここで、有効な化合物は、規制当局によって承認された後、又は承認なしで特許物質として、又はトレードシークレットとして、関連医学的状態について患者を処置するために使用されうる、請求項1に記載の方法。