JP2018506267A - 生体成分のレーザー印刷方法およびその方法を実施する装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つのバイオインクを用いて印刷する方法に関する。この方法は、受容基板（５８）の堆積表面に少なくとも１つのバイオインクの少なくとも１つの液滴を堆積するために少なくとも１つのレーザー型プリントヘッド（１０２）を用いる。この方法は、前記レーザー型プリントヘッド（１０２）で堆積する受容基板と同じ受容基板（５８）の堆積表面に、少なくとも１つのバイオインクの少なくとも１つの液滴（８２）を堆積するために少なくとも１つのノズルプリントヘッド（１０４、１０４’、１０４”）を用いることを特徴とする。【選択図】図８

Description

本発明は生体成分のレーザー印刷方法およびその方法を実施する装置に関する。本発明はまた、この印刷方法を用いて生体組織を生成する方法に関する。

第１の手順では、細胞は、生体組織を得るためにマイクロポーラスマトリックス（または足場）上で、インビトロで増殖させることができる。この第１の手順は、細胞コロニー形成の欠如に起因して、生体組織の増殖がマイクロポーラスマトリックスの深さ内で制限されるために、十分に満足できるものではない。加えて、この手順は、（個別におよび通常は異方性配置に組織された多様な細胞のタイプによって特徴付けられる）組織の複雑さに対処することを困難にする。

これらの欠点を克服するために、生体成分を印刷する方法が自動化可能な方法で生体組織を生成するために開発されている。

種々の文献の記載によれば、このような印刷方法は、生体成分のバイオプリンティング、生体成分のマイクロプリンティング、または単にバイオプリンティングと呼ばれる。

これらの方法によれば、生体組織は、バイオインクの液滴の印刷によって得られる。ある大きさにするために液滴は相互に積み重ねられた層内に配置される。

第１の例によればバイオインクはタンクに蓄えられ、基板上に転写される液滴を形成するためにノズルまたは毛細管を通過する。この第１の例として、いわゆるノズル印刷があり、これはバイオ押出、インクジェット印刷、またはマイクロバルブ印刷を含む。

バイオ押出は、１ミリリットル当たりの細胞数が１億個オーダーのかなり高い細胞密度および１ミリメートルの解像度を得ることを可能にする。

マイクロバルブ印刷は、１ミリリットル当たりの細胞数が数百万個オーダーと細胞密度は低いが、１００μｍオーダーの優れた解像度を得ることができる。

インクジェット印刷は、１ミリリットル当たりの細胞数がマイクロバルブ印刷と同じ細胞密度、または１千万個未満の細胞密度で、１０μｍオーダーのより良い解像度を得ることを可能にする。

バイオ押出の場合には、細胞は第１のノズルから堆積され、ヒドロゲルは第２のノズルから同時に堆積される。バイオ押出の別の例では、細胞とヒドロゲルが押出に先立ってタンクの中で混合されてもよい。他の２つの場合（マイクロバルブ印刷、インクジェット印刷）では、インクは細胞を含む水性媒体である。バイオ押出の別の例によれば、バイオ押出は、繊維状に連続的に、または液滴状に不連続的に、インクを堆積することができる。

このようなノズル印刷モードによれば、印刷の解像度は、特にノズルの選択に関係するので、所定のレオロジー特性を有するバイオインクのみを高解像度用に使用することができる。このような印刷技法はインクのノズル通過時に細胞に損傷を与える恐れがある大きなせん断応力を誘発するので、高い細胞密度を有するバイオインクを高解像度で印刷することが困難である。その上、このタイプのインクでは、主にタンク内の細胞の沈殿のために、細胞によってノズルが塞がれる重大なリスクがある。

広範囲なバイオインクを用いて高解像度を実現するために、生体成分をレーザーによって印刷する方法が開発されている。レーザーバイオプリンティングと呼ばれるこの印刷方法は、また「レーザーアシスト・バイオプリンティング（Laser-Assisted Bio-printing）」（ＬＡＢ）として知られている。本発明は、特にこのタイプの印刷方法に関する。比較すれば、レーザーバイオプリンティングは、１ミリリットル当たりの細胞数が１億個オーダーの高い細胞密度で１０μｍオーダーの解像度を有するインクの印刷を可能にする。

図１に示すように、いわゆる「レーザー誘起前方転写（Laser-lnduced Forward Transfer）」（ＬＩＦＴ）技術に基づいた生体成分のレーザー印刷装置は、レーザービーム１２を照射するパルスレーザー源１０、レーザービーム１２を集束させ方向付けるためのシステム１４、少なくとも１つのバイオインク１８を含むドナー基板１６、およびドナー基板１６から放出された液滴２２を受け取るように配置された受容基板２０を備える。

この印刷技術によれば、レーザービームがパルス化されて、各パルス上に液滴が生成される。

バイオインク１８は、例えば、受容基板２０上に堆積される要素、例えば細胞が存在する例えば水性媒体のようなマトリックスを含む。ドナー基板１６は、レーザービーム１２の波長に対して透明なブレード２４を含み、ブレードは、バイオインク１８がその上にフィルムとして付着された吸収層２６で被覆されている。

吸収層２６は、光エネルギーを運動エネルギーに変換することを可能にする。従って、レーザービーム１２は吸収層２６で時間的に正確に熱を発生する。それ（発熱）は気泡２８を気化により生成させ、気泡は膨張によってバイオインクの液滴３０の放出を引き起こす。

公知の配置によれば、レーザービーム１２は、ほぼ垂直方向にかつ上向きに向けられて、または、重力Ｇと同じ方向に向けられて、ドナー基板１６に衝撃を与える。従って、バイオインク１８は、下方、すなわち、ドナー基板１６の下に配置された受容基板２０の方向に向くようにブレード２４の下に配置される。

この配置であると仮定すれば、バイオインク１８はそのブレードに保持されるように所定のしきい値よりも薄い厚さＥを有するフィルムの形態である。このしきい値は、特にバイオインクの表面張力、粘度および密度によって変わる。

インクフィルムからの液滴３０の形成は、特に、レーザービーム１２（波長、エネルギー、パルス継続時間．．．）、バイオインク１８の性質（表面張力、粘度．．．）および外部条件（温度、湿度．．．）に関連する多くのパラメータに依存する。

レーザープリンティングは、理論上は高い印刷速度を達成することが可能であるとはいえ、これらの液滴は、数十ピコリットルしか存在しないので、１秒間に数万滴を生成しても、生体組織の生産は高速ではない。加えて、ドナー基板は、その夫々が数十マイクロリットル程度の少量の印刷用インクしか含まないので、ドナー基板を頻繁に交換しなければならない。

図２に示す第２の実施形態は、２０１１年１０月１日にwww.elsevier.comのサイトで公開された「フィルムフリーレーザー前方技術による微小液滴堆積（Microdroplet deposition through a film-free laser forward technique）」と題する刊行物に記載されている。このレーザー印刷装置は、レーザービーム３４を照射するレーザー源３２、レーザービーム３４を集束させ方向付けるためのシステム３６、少なくとも１つのバイオインク４０を含むドナー基板３８、およびドナー基板３８から放出された液滴４４を受け取るように配置された受容基板４２を備える。

第１の実施形態とは異なり、ドナー基板３８はバイオインクと異なる吸収層は含んでいない。

この実施形態によれば、ドナー基板３８は、タンクに収容されているバイオインク４０の自由表面４８が受容基板４２に面するように、上壁を持たないタンク４６を含む。整った、実質的に平坦な自由表面４８を得るために、バイオインクは、薄膜状のものではなく、３ｍｍ程度の深さを有する体積を有するものである。従って、タンクの底面はバイオインクの自由表面４８の形状に影響を及ぼさない。さらに、タンクの側壁は、自由表面４８の周辺で表面張力によって限定的な影響を与えるだけである。

バイオインクの体積に深さがあれば、自由表面４８はタンク内で留まって必然的に上方を向き、受容基板４２はバイオインク４０の上方に位置する。

この刊行物によれば、液滴の放出を得るためにレーザービーム３４を自由表面４８の真下で４０〜８０μｍ程度の深さに集束させる。従って、自由表面４８から放出された液滴は、重力Ｇの方向と反対の運動方向で受容基板４２に向かって放出される。

この第２の実施形態は、より大きな体積のバイオインクを含むドナー基板を使用するとしても、バイオインクとしては必ずしも適切ではない。実際、上記に示唆したように、このようなバイオインクは、例えばマトリックスに埋め込まれた細胞のような印刷要素を含んでいるが、これらの要素はタンクの底面に沈下する傾向があるからである。このため、印刷要素の濃度は自由表面付近では低いので、印刷された液滴は事実上、細胞濃度が低く、通常、印刷された生体組織には有害である。その上、この方法によれば、細胞数や堆積される細胞の濃度は、ほとんど制御することができない。

本発明は、先行技術の欠点を解決することを目的とする。

この目的を達成するために、本発明は、少なくとも１つのバイオインクを用いて印刷する印刷方法に関し、前記印刷方法は、受容基板の堆積表面に少なくとも１つのバイオインクの少なくとも１つの液滴を堆積するために少なくとも１つのレーザー型プリントヘッドを使用する。この印刷方法は、レーザー型プリントヘッドで堆積する受容基板と同じ受容基板の堆積表面に少なくとも１つのバイオインクの少なくとも１つの液滴を堆積するために少なくとも１つのノズルプリントヘッドを使用することを特徴とする。

この組み合わせは、生体組織の生産速度を増大すること、およびより複雑な生体組織を得ることを可能にする。

細胞および細胞外マトリックスを同時に備える生体組織の生産のために、細胞外マトリックスが作られる材料はノズルプリントヘッドによって堆積され、細胞はレーザー型プリントヘッドによって堆積される。

本発明はまた、以下のステップを有することを特徴とする生体組織を生成する方法に関する。
−生成すべき生体組織の三次元デジタル表現を生成するステップと、但し、前記表現はそれぞれの色彩またはテクスチャーがバイオインクに対応する複数の着色またはテクスチャー加工されたボリューム領域を有する、
−三次元デジタル表現を連続した積層にスライスするステップと、但し、各層はその表現のボリューム領域に対応する着色またはテクスチャー加工された領域を有する、
−各層に対して、その着色またはテクスチャー加工された領域および各液滴の予想される体積に従って、各バイオインクの液滴の印刷位置を決定するステップと、
−異なる前記液滴を印刷するステップと、を有する。

層は、液滴の大きさに応じた厚さを有する。表現は、好ましくは、それらが属するボリューム領域に依存する異なる色彩またはテクスチャーを有する複数の小さな基本的なボリュームを備える。

一実施形態によれば、各領域が、前記領域において印刷されるバイオインクの液滴の大きさに依存する大きさを有する個別の楕円で満たされる。なお、個別の楕円における各楕円の中心が液滴の中心の位置に対応する。個別の楕円は、大きさの大きい順に領域ごとに配置されるのが好ましい。

本発明は、また、堆積表面を有する少なくとも１つの受容基板と、少なくとも１つのレーザー型のプリントヘッドとを備える印刷装置に関する。印刷装置は、レーザー型の１または複数のプリントヘッドで印刷する受容基板と同じ受容基板に、少なくとも１つのバイオインクを印刷するために少なくとも１つのノズルプリントヘッドを備えることを特徴とする。

別の特徴によれば、印刷装置は、ドナー基板を支持する少なくとも１つのベースを格納するように構成されて、バイオインクに適合する雰囲気で内部を維持することを可能にする封じ込め手段を備えるチャンバーを備える。

チャンバーは、好ましくは複数個のベースを格納するために適した寸法を有する。この場合、印刷装置はチャンバーの内部に格納されるように構成されている少なくとも１つのベースプレートを備え、前記ベースプレートは、各ベースに対して収納部を備える。チャンバーは、好ましくは、ベースを取り出すための第１開口部をプリントヘッドに面する第１面に備え、ベースを取り入れるための第２開口部を他の面に備える。

チャンバーに加えて、印刷装置は、チャンバーとレーザー型のプリントヘッドとの間でベースを移動させる可動クランプを含む。

別の特徴によれば、印刷装置は、少なくとも１つの受容基板を支持するための可動シャーシと、可動シャーシをシャーシに対して３次元にガイドし移動するシステムと、可動シャーシの動きを制御する制御システムとを備え、前記ガイドおよび移動システムと前記制御システムとはマイクロメートルの精度を有する。

他の特徴および利点は、添付図面を参照して述べる本発明の以下の説明から明らかになる。本発明はこれらの説明に限定されるものではない。

先行技術の一例を示すレーザー印刷装置の概略図である。 先行技術の別の例を示すレーザー印刷装置の概略図である。 本発明のレーザー印刷装置の概略図である。 (Ａ)〜(Ｄ)は、液滴が形成されるか否かを異なる状態に対応して説明する側面図である。 (Ａ)〜(Ｃ)は、異なる時点における液滴の形成を示す説明図である。(Ｄ)は、異なる時点における液滴の形成を示し、特に、液滴が受容基板に到達する時点における説明図である。 印刷要素の大きさとバイオインクフィルムの厚さとの関係を説明するドナー基板の断面図である。 (Ａ)(Ｂ)は、レーザービームのエネルギーが異なる場合における同一時点での、液滴の形成に先立ってのバイオインクの自由表面の突起部の形成を示す側面図である。 少なくとも１つのレーザー型プリントヘッドと、少なくとも１つのインクジェット型プリントヘッドとを備える、本発明の一実施形態による印刷装置の概略図である。 レーザー型プリントヘッドと、複数個のインクジェット型プリントヘッドとを備える、本発明の一実施形態による印刷装置の斜視図である。 インクジェット型プリントヘッドで印刷する場合の図９の印刷装置の部分斜視図である。 レーザー型プリントヘッドで印刷する場合の図９の印刷装置の部分断面図である。 複製される生体組織の一部分の３次元表現の斜視図である。 図１２の表現のスライスの斜視図である。 バイオインクの液滴の位置を示す図１３のスライスの上面図である。

図３は、少なくとも１つの生体組織を生成するための印刷装置５０を示す。ここで生体組織は、細胞外マトリックスや種々のモルフォゲンのような種々の成分を所定の配置に従って層状に配置したものである。

従って、印刷装置５０は、少なくとも１つのバイオインク５４の液滴５２を層ごとに堆積表面５６に堆積することを可能にする。ここで堆積表面５６とは、前記受容基板５８上に堆積される第１層、または続いて堆積された最後の層、の表面に対応する。

説明を簡単にするために、堆積表面５６は図３に示す受容基板５８の表面に対応することとする。

図６に示す実施形態によれば、バイオインク５４は例えば水性媒体のようなマトリックス６０を含み、マトリックスの中に堆積表面５６上に印刷される細胞や細胞凝集体のような要素６２が存在することができる。

場合によっては、バイオインク５４は一種類のみの印刷要素６２、または数種類の印刷要素６２をマトリックス６０内に含んでもよい。その代りに、バイオインク５４は単一の成分のみを含んでもよい。

本特許出願に関してバイオインクとは、生物学的材料または生体材料を意味する。例えばバイオインクは、（例えばコラーゲンのような）細胞外マトリックス、細胞外マトリックスおよび細胞や細胞凝集体のような要素、細胞や細胞凝集体のような要素を含む水性媒体、のみを含む。

バイオインク５４は、インクごとに異なるタイプおよび異なるレオロジー特性を有することができるので、これ以上の説明はしない。

この印刷装置は、特にその波長、周波数、エネルギー、直径、パルス持続時間によって特徴付けられるレーザービーム６６を照射するように構成されたレーザー源６４を備える。好ましくはレーザー源６４は、レーザービームの少なくとも一つの特性、特にそのエネルギーを調整するように構成することができる。

相互に分離された液滴を形成するために、レーザー源６４はパルス源であり、毎秒１万個の液滴を放出できる規模である。

例えば、レーザー源６４は波長１，０６４ｎｍのレーザー源である。

レーザー源に加えて、印刷装置５０は、堆積表面５６に垂直なＺ軸に沿って焦点の調整が可能な光学系６８を含む。光学系６８は、好ましくは、衝撃領域上にレーザービーム６６を集束可能なレンズを含む。光学系６８は、好ましくは、衝撃領域の位置を変更するミラーを含む。光学系６８はこのようにしてレーザービームによって衝撃される領域、すなわち、図３の参照符号Ｐiで示す衝撃面を変更することができる。

レーザー源６４および光学系６８に関しては当業者には既知であり、先行技術と同一でもよいのでこれ以上の説明はしない。

印刷装置５０は、また少なくとも１つのドナー基板７０を備える。一実施形態によれば、ドナー基板は少なくとも１つのバイオインクのフィルム７４が付着されたレーザービーム６６の波長用の吸収層７２を含む。

以下の説明部分では、フィルムとは５００μｍ未満の厚さ（衝撃面Ｐiに垂直な方向における寸法）を有して、ある体積を占めるバイオインクを意味する。

タンクとは異なり、バイオインクがフィルムとして包装されているという事実によって沈降現象を回避することが可能になる。

吸収層７２は、光エネルギーを吸収層７２で時間的に正確に熱に変換するようにレーザービーム６６の波長に適合した材料で作られている。

ドナー基板７０は、好ましくは、光学系がレーザービームを吸収層７２に集束するように配置される。

一実施形態によれば、吸収層７２はレーザービーム６６の波長に応じて、金、チタン、または別の成分から作られる。

別の実施形態によれば、ドナー基板７０は吸収層７２を含まない。この場合、レーザービーム６６のエネルギーはインクによって吸収される。

ドナー基板７０は、好ましくはレーザービーム６６の波長に対して透明な材料で作られたブレード７６を備える。ブレードは、その一方の面に吸収層７２に対応するコーティングを含む。ブレード７６の存在は、ドナー基板７０に剛性を与えて、ドナー基板がインクおよび／または吸収層７２を衝撃面Ｐi内で実質的に平坦に扱うことおよび保持することを可能にする。

バイオインクフィルム７４は、フィルム７４の厚さに対応する距離Ｅだけ吸収層７２から間隔を空けられた自由表面７８を含んでおり、自由表面は堆積表面５６から距離Ｌだけ間隔を空けられている。自由表面７８および堆積表面５６は互いに向かい合っている。

図３に示すように、レーザービーム６６は吸収層とバイオインクフィルム７４との界面で空洞８０を発生するように構成されており、空洞が液滴８２を生成させ、液滴は自由表面７８から離れて堆積表面５６の方に移動する。

以下の説明部分においては、垂直方向とは重力Ｇに平行な方向であり、上下方向は重力Ｇの方向に対応する。

レーザービーム６６の方向および液滴の運動方向は、垂直方向に対して平行である。

上向き印刷

本発明の１つの特徴によれば、レーザービーム６６および従って液滴８２の動きは重力Ｇに対して反対方向に向いている。バイオインクフィルム７４の自由表面７８は従って上向きである。液滴がバイオインクフィルム７４から堆積表面５６へ移動するとき、液滴８２は下から上方向に動く。

この構成には以下の利点がある。
−バイオインクがフィルムの形態であるので、沈降現象の発生を制限する。
−フィルム７４の自由表面７８の形状に対する重力Ｇの影響は自由表面７８が上方を向くことにより制限されるため、バイオインクフィルム７４が実質的に一定の厚さＥを得ることを可能にする。
−バイオインクフィルム７４とは異なる吸収層７２が光エネルギーを熱に時間的に正確に変換するように用いられる場合には、広範囲のバイオインクを使用することができる。

受容基板上に液滴を堆積させる時点でほぼゼロの運動エネルギー

バイオインクフィルムからの液滴８２の形成は多くのパラメータに依存するが、主にバイオインクの特性、レーザービームの特性および実施条件に依存する。

図４（Ａ）から４（Ｄ）は、レーザービーム６６のエネルギーの異なる値に対して、液滴の形成が結果的に生じるか否かに関するバイオインクフィルムの自由表面の変形部の変化状況を時間の経過と共に示す説明図である。ここで、各図のレーザービームのエネルギーは、図４（Ａ）が２１μＪ、図４（Ｂ）は３５μＪ、図４（Ｃ）は４０μＪ、図４（Ｄ）は４３μＪである。

同一のバイオインクを用いた同一の実施条件下で、レーザービームのエネルギーに応じていくつかの状態が存在することに留意されたい。

図４（Ａ）に示すように、レーザービームのエネルギーが下限しきい値未満の場合には、液滴はバイオインクフィルム７４から脱離しない。インクフィルム７４の自由表面７８で生じる変形８４の最大高さがインクフィルム７４と堆積表面５６との間の距離Ｌ未満であるので要素は印刷されない。選択された実例によれば、下限しきい値は２１μＪ〜３５μＪの範囲である。また、図４（Ｄ）に示すようにレーザービームのエネルギーが上限しきい値を上回ると、インクフィルムの内部で生成された気泡８０は自由表面で破壊し、従って微小な液滴の自由な放射を引き起こす。選択された実例によれば、上限しきい値は４０μＪ〜４３μＪの範囲である。

図４（Ｂ）および図４（Ｃ）に示すように、下限しきい値と上限しきい値との間でジェットの形成を可能にする状態がある。フィルム７４と堆積表面５６とを隔てる距離Ｌが十分であれば、この状態は液滴の形成を可能にする。

好ましくは距離Ｌは、フィルムから堆積表面まで延びる連続的なジェットではなく、液滴の形成が可能になる１〜２ｍｍ程度である。この構成は、バイオインクによって得られる生体組織の汚濁のリスクを制限する。

本発明の別の特徴によれば、同一のバイオインクおよび同一の実施形態の条件下で、インクフィルム７４と堆積表面５６とを隔てる距離Ｌ、および／またはレーザービーム６６のエネルギーは、図５（Ｄ）に示すように液滴８２が堆積表面５６に接触するときの液滴の運動エネルギーがほぼゼロに等しくなるように調整される。この構成は、印刷要素、すなわち細胞を損傷するリスクを抑える。

運動エネルギーがほぼゼロに等しく、とは、運動エネルギーがゼロ、または液滴の堆積表面５６への沈降を可能にするために運動エネルギーがわずかに正であることを意味する。

この状況は液滴８２が重力Ｇに対して反対方向に移動するために可能になる。

バイオインクフィルム７４と堆積表面５６とを隔てる距離Ｌは、固定されていることが好ましい。従って、レーザービーム６６のエネルギーは、液滴８２が堆積表面５６に接触するときに液滴の運動エネルギーがほぼゼロに等しくなるように調整される。

較正技術

上記に示唆したように、液滴の形成は、レーザービームのエネルギーのみには関係しない。それはまた、バイオインクの性質、特に粘度、表面張力、その実施条件に関係する。

図５（Ａ）から５（Ｄ）、７（Ａ）、７（Ｂ）は、特に所定の距離Ｌで速度ゼロでの堆積に導く液滴の形成や堆積のために最適な速度を得るために、レーザービームのエネルギーを決定する較正方法を図示する。

図５（Ａ）から５（Ｄ）は、図５（Ａ）に示すレーザービームの衝撃の時点と、図５（Ｄ）に示す堆積表面５６に液滴８２が堆積する時点との間で、液滴８２を形成するステップのいくつかを示す。

本発明の１つの特徴によれば、レーザーエネルギーを調節する較正方法は、レーザービーム６６の衝撃後の設定時点Ｔ１でバイオインクのフィルム７４の自由表面７８の変形部８６の夾角θを測定するステップと、夾角θの測定値に応じてレーザービーム６６のエネルギーを調整するステップとを有する。

図５（Ｂ）、７（Ａ）および７（Ｂ）に示すように、変形部８６は、垂直方向に対して平行な中央軸Ａｍに対して対称形状を有する。この変形部８６は、中央軸Ａｍ上に中心のある頂点Ｓを含む。頂点Ｓは、フィルム７４の自由表面７８の残りの部分から最も遠い変形領域８６に対応する。

中央軸Ａｍを含む平面内で、頂点Ｓは、中央軸Ａｍの一方側の第１側面８８および中央軸Ａｍの他方側の第２側面８８’によって延長されており、双方の側面８８、８８’は中央軸Ａｍに対して対称である。

各面８８、８８’は、変曲点を含む。

第１側面８８はその変曲点で第１接線Ｔｇ１を含み、第２側面８８’はその変曲点で第２接線Ｔｇ２を含み、２つの接線Ｔｇ１およびＴｇ２は中央軸Ａｍ上の点で交差している。

夾角θは、接線Ｔｇ１およびＴｇ２によって形成された角に対応し、フィルム７４に（または下方に）面している。

液滴を形成させるためには、夾角θは第１のしきい値θ₁以下でなければならない。

図７（Ａ）に示すように、夾角θが第１のしきい値θ₁を超えていれば、レーザービームのエネルギーは液滴を生成するためには不十分である。他方、図７（Ｂ）に示すように、夾角θが第１のしきい値θ₁を下回る場合には、レーザービームのエネルギーは液滴を生成するために十分である。

形成された液滴がフィルム７４の自由表面７８からの距離Ｌで堆積表面５６に到達するときにゼロに近い運動エネルギーを得るためには、夾角θは第２のしきい値θ₂以上でなければならない。

夾角θの値は、好ましくは、Ｔ１の時点で獲得された変形部８６の像を用いて決定される。一実施形態においては、この像は視軸が垂直方向に対して直角を向くカメラを用いて撮られる。

この時点Ｔ１は、フィルムの厚さに依存し、インクごとにはほとんど変わらない。この時点Ｔ１は、４０〜５０μｍ程度の厚さＥを有するフィルムに対するレーザービームの衝撃から好ましくは４〜５μｓ程度である。この時点Ｔ１に対応する図が、図５（Ｂ）である。

第１のしきい値θ₁は、ほぼ１０５度に等しい。従って、時点Ｔ１で夾角θが１０５度以下であれば、レーザービームのエネルギーは液滴８２を生成させるためには十分である。

第２のしきい値θ₂は、堆積表面５６とインクフィルム７４の自由表面７８との間の距離Ｌに依存する。第２のしきい値θ₂は距離Ｌに反比例する。

第２のしきい値θ₂は１ｍｍオーダーの小さな距離Ｌに対して大きく、約８０度に等しい。比較的小さい距離Ｌは堆積表面に液滴が接触する時点におけるジェット内のストレスを低減させるために好ましい。第２のしきい値θ₂は１０ｍｍオーダーのかなりな距離Ｌに対して小さく、約５０度に等しい。リモート印刷が望まれる場合、例えばドナー基板７０が、堆積表面５６が位置する底部のウェルの寸法より大きな寸法を有する場合には、かなり長い距離Ｌが好ましい。

レーザービームのエネルギーを較正するこの技術は、特に堆積表面５６上に堆積される時点でのインクに含まれる要素の損傷リスクを抑制するようにジェットの速度を低下させることによって、ジェットの速度の最適化を可能にする。

インクフィルムの厚さ

バイオインクの組成物は、好ましくは、細胞中に高濃度の生体組織を得るために高濃度の印刷要素６２を含む。この場合には、図３に示すように、液滴８２は印刷要素６２内に高濃度の体積分率成分を含む。

フィルム７４の厚さＥは、高濃度のバイオインク用には４０〜６０μｍ程度である。

印刷要素の堆積の正確さを向上させるために、バイオインクのフィルム７４は、好ましくは、１．５Ｄ〜２Ｄの範囲の厚さＥを有する。ここでＤは、ほぼ球状である印刷要素６２の直径であり、印刷要素６２が内接する球の直径である。

一実施形態によれば、バイオインクのフィルム７４は、直径が１０〜１５μｍ程度のより小さな印刷要素用に２０μｍ以上の厚さＥを有する。フィルムの厚さＥは印刷要素６２が細胞の凝集体の場合には、４００μｍ程度であってもよい。

印刷要素６２が単位細胞である場合には、通常、フィルムの厚さＥは１００μｍ未満である。

好ましくはフィルム７４は、（（自由表面７８の寸法）／（フィルム７４の厚さ））が１０以上であるように特徴付けられており、より好ましくはこの比が２０以上である。自由表面７８の寸法は、衝撃面Ｐiに平行な平面におけるフィルム７４の自由表面７８の最大寸法に対応する。

レーザー型プリントヘッドおよびノズルプリントヘッドを組み合わせた印刷技術

本発明の別な特徴によれば、印刷方法は、少なくとも第１のバイオインク用の少なくとも１つのレーザー型プリントヘッド、および少なくとも第２のバイオインク用の少なくとも１つのノズルプリントヘッドを用いる。

この組み合わせによって、生産速度を向上させることができる。

ノズルプリントヘッドとは、第２のバイオインクが通過するオリフェスを備えるプリントヘッドを意味する。従って、ノズルプリントヘッドは、インクジェット型のプリントヘッド、マイクロバルブプリントヘッド、および、バイオ押出型のプリントヘッドであってもよい。

レーザー型の各プリントヘッドは、好ましくは図３に示したプリントヘッドと同じである。しかしながら、本発明はこのタイプのレーザープリントヘッドに限定されない。図１および図２に記載されているようなレーザー型プリントヘッド、または他のプリントヘッドを使用することも考えられる。

ノズルプリントヘッドは先行技術のプリントヘッドと同じであることが好ましいので、これ以上は説明しない。

細胞外物質によって分離された分離細胞を含む生体組織の場合には、細胞外物質は好ましくは、１または複数のノズルプリントヘッドによって堆積され、細胞は、好ましくは１または複数のレーザー型プリントヘッドによって堆積される。

細胞外物質はせん断効果に対して敏感ではないので、ノズルプリントヘッドを用いて堆積させることができる。ノズルプリントヘッド用のバイオインクカートリッジは、レーザー型プリントヘッド用のドナー基板７０によって支持されるインク（４０μｍ程度）の体積よりもはるかに大きな体積を有するので、細胞外マトリックスの物質を高流量で堆積させることができる。ノズルプリントヘッドは高流量でインクを堆積することができるが、レーザー型プリントヘッド用の各ドナー基板は非常に少量のインクしか支持しないので、これらを頻繁に交換する必要があり、ノズルプリントヘッドと比較して除去時間が増加する傾向がある。

別の特徴によれば、１または複数のレーザー型プリントヘッド、および１または複数のノズルプリントヘッドは、同一の装置に一体化されて同一の座標系で動く。この構成は、種々のプリントヘッドの相対的な位置決めを簡単にし、除去の精度を向上させ、印刷要素の完全性を保障することができる。

ドナー基板保管チャンバーを備える印刷装置

本発明の一実施形態による印刷装置を図８から図１１に示す。

印刷装置は、レーザー型のプリントヘッド１０２およびインクジェット型の数個のプリントヘッド１０４、１０４’、１０４”を支持するシャーシ１００を含む。シャーシ１００は、座標系Ｘ、Ｙ、Ｚを含み、Ｚ軸は垂直方向に方向付けられており、Ｘ、Ｙ平面は水平面に対応する。

プリントヘッド１０２、１０４、１０４’、１０４”は、シャーシ１００に対して固定されており、液滴が垂直上方に放出されるように配置されている。

プリントヘッド１０２、１０４、１０４’、１０４”は、Ｙ軸に平行な第１の方向にずれている。一実施形態においては、インクジェット型のプリントヘッド１０４、１０４’、および１０４”は連結されている。レーザー型のプリントヘッド１０２は、インクジェット型のプリントヘッド１０４、１０４’、１０４”から間隔が空いている。

印刷装置は、また、可動シャーシ１０６と、可動シャーシ１０６をシャーシ１００に対してＸ、Ｙ、Ｚ軸に平行な３方向にガイドし、移動するシステムと、可動シャーシ１０６の移動を制御する制御システムと、を備える。ガイドおよび移動システムと制御システムは、シャーシ１００に対する可動シャーシ１０６の動きに関してマイクロメートルの精度を達成するように選択されている。

図１０に示すように、可動シャーシ１０６は、少なくとも１つの受容基板５８を解放可能に取り付けるためのフレーム１０８を含む。受容基板が可動シャーシに固定された場合には、受容基板５８の動きはマイクロメートルの精度で制御される。

レーザー型のプリントヘッド１０２は、シャーシ１００に固定されて光学系の一部を収容する中空の円筒体１１０と、その上に配置されて水平面内に開口する上端部１１４を含む管状部１１２とを備える。これらの要素は、光学系によってガイドされるレーザービームが上端部１１４の部分をスキャンするように構成されている。

各ドナー基板７０は、ベース１１６上に配置されたディスクの形状を有する。

図１１に示す一実施形態によれば、各ベース１１６は、ドナー基板７０の直径と同じ直径を有してドナー基板を保持するために十分な高さを有する凹部１１８をその上端部に備える管の形状を有する。この凹部１１８は、従って、ドナー基板を支持するベースに対してドナー基板７０を位置決めすることができる。

上端部１１４およびベース１１６が相互に協働する形状を有することにより、ベースが１１６が上端部１１４に対して、従ってシャーシのＸ、Ｙ、Ｚ系に対して、所定の位置に固定される。一実施形態によれば、ベース１１６は、上端部１１４を支えてベースがＺ軸に沿って位置することを可能にする外側のフランジ１２０を含む。このフランジ１２０の下に、ベース１１６は管状部１１２の内側に備えられたテーパー部と協働する円錐台状の表面部１２２を含む。これらの形状は、管状部１１２に対してベース１１６を中心合わせすること、およびＸＹ平面にベースを位置決めすることを可能にする。管状部１１２に対するベース１１６の位置決めを改善するために磁気材料を用いることが好ましい。

印刷装置は、好ましくは、少なくとも１つのベース１１６を格納するように構成されたチャンバー１２４を備える。チャンバー１２４は、格納されるベースを入れたり出したりする少なくとも１つの開口１２５を備える。一実施形態によれば、チャンバー１２４は、平行６面体の形状を有する。

チャンバー１２４は、好ましくは数個のベースを格納するのに適した寸法を有する。従って、印刷装置はレーザー型の同じプリントヘッド１０２を用いて数個のバイオインクを連続的に印刷することができる。

ベース１１６は、例えば各ベース１１６に対して１つの収納部が対応する、複数個の収納部１２８を有するベースプレート１２６に格納される。ベースプレート１２６は細長い形状を有しており、その全長にＵ字状のノッチ１２８を含む。図８に示す第１の例によれば、ベースプレート１２６の長さはＹ軸に沿って方向付けられている。

第２の好ましい実施形態によれば、ベースプレート１２６の長さはＸ軸に沿って方向付けられており、ノッチ１２８はプリントヘッドに向かって開いている。

チャンバー１２４には、好ましくは、ベース１１６を取り出すことが可能な第１開口部１２５がプリントヘッドに面する第１面上にあり、ベース１１６を取り入れるための第２開口部１２５’が他の面上にある。

一実施形態によれば、チャンバー１２４には、ベースプレート１２６を位置決めするためのガイドシステムがある。ガイドシステムは、例えば、ベースプレート１２６の下部に備わる溝の断面と係合するレールである。このレールは、第２の開口部１２５’で開口する。これは、好ましくはＸ軸に沿った方向を向く。

チャンバー１２４は、特に温度および／または湿度に関してバイオインクに適合する雰囲気（特に温度および／または湿度）で保存するための封じ込め手段をチャンバーの内側に備える。このような封じ込め手段は、特に各開口部１２５、１２５’に備えられる。それらは、障壁またはエアカーテンの形状を取ってもよい。

チャンバーに加えて、印刷装置にはチャンバー１２４とレーザー型のプリントヘッド１０２との間でベースを移動させる可動クランプ１３０がある。第１の例では、可動クランプ１３０は、可動シャーシ１０６に依存せずにＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動するように構成された可動キャリッジ１３２に固定される。

別の例によれば、可動クランプ１３０は可動シャーシ１０６に固定される。

一実施形態によれば、印刷装置は（図示しない）撮影装置を含む。撮影装置はその視線が垂直方向に対して直角であり、ドナー基板の上側表面に面している。撮影装置は、レーザー型のプリントヘッド１０２のレーザービームのエネルギーを較正するために使用することができる。

バイオプリンティングを用いて生体組織を作製する方法

前記方法の第１ステップは、印刷すべき生体組織の３次元デジタル表現を生成することからなる。

図１２には、そのような表現の一部が、第３ボリューム領域１４６内に第２ボリューム領域１４４が位置し、第２ボリューム領域１４４内に第１ボリューム領域１４２が位置する立方体として図示されている（１４０）。この説明の目的は、表現１４０を大幅に単純化することである。

各ボリューム領域１４２、１４４、１４６は異なる色彩の着色または異なるテクスチャー加工がなされており、色彩またはテクスチャーのそれぞれは、（限定はされないが）次に述べるものの中の、すなわち、材料、製造手段、軌跡．．．の、特性のセットに対応する。色彩またはテクスチャーのそれぞれは、好ましくはバイオインクに対応する。

全てのボリューム領域１４２、１４４、および１４６は、閉じられている。

表現は、好ましくは、複数の小さな基本ボリュームを有し、基本ボリュームは、それらが属しているボリューム領域に依存する異なる色彩またはテクスチャーを有する。一実施形態によれば、表現１４０はＰＬＹタイプのコンピュータファイルから生じる。

本方法の第２ステップは、表現１４０をＺ軸に沿って連続した積層にスライスすることからなる。図１３では、その表現１４０の層１４８が分離されている。

表現１４０をスライスする場合、ボリューム領域の変化に従って、各層が新しい領域に対応するエッジを含む。

図１３に示すように、層１４８は、第１ボリューム領域１４２に対応する第１領域１４２’、第２ボリューム領域１４４に対応する第２領域１４４’、および第３ボリューム領域１４６に対応する第３領域１４６’を含む。各層に対して、領域１４２’、１４４’、１４６’はボリューム領域１４２、１４４、１４６の色彩またはテクスチャーに従って着色またはテクスチャー加工される。

各層は、印刷された液滴の高さに従って決定される厚さεを有する。

印刷される１つの材料のみを層が含む場合には、その層は液滴の高さに実質的に等しい厚さを有する。

印刷されるいくつかの材料を層が含む場合には、第１の例においては、層は、各材料に関連する液滴の高さの最小公倍数に等しい厚さを有する。この例は、印刷されるオブジェクトに関してあらゆる場所で高さ方向のズレを最小限にして高速印刷を達成するという利点を有する。

第２の例によれば、層は各材料に関連する液滴の高さの最大公約数に等しい厚さを有する。この例は、解像度および層の数を増やすという利点がある。

例えば、第１の材料がレーザーバイオプリンティングを用いて印刷される場合、印刷された液滴は１０μｍオーダーの高さを有する。第２の材料がマイクロバルブバイオプリンティングを用いて印刷される場合、印刷された液滴は１００μｍオーダーの高さを有する。第１の例においては、層は１００μｍオーダーの厚さを有する。第２の例においては、層は１０μｍオーダーの厚さを有する。

好ましくは各層が、例えばそれらが属する領域に応じて異なる色彩を有する複数の小さな基本的なポリゴン、例えば三角形ポリゴン、を含む。

印刷されるオブジェクトは、従って、それぞれが関連する色彩やテクスチャーを有する１組のポリゴンをそれぞれ含む層のセットに対応する。

本方法の第３ステップは、着色またはテクスチャー加工された領域１４２’、１４４’、１４６’、および各液滴の予想される体積に従って、各バイオインクの液滴の印刷位置を各層に対して決定することからなる。この目的のために、各層の各領域１４２’、１４４’、１４６’は、図１４に示すように、前記領域において印刷されるバイオインクの液滴の大きさに依存する大きさの楕円１４２”、１４４”、１４６”で満たされる。

各領域において、楕円は同じ寸法を有する。全ての楕円が平行な焦点軸を有する。

楕円形状は、（第１の方向は焦点軸に平行であり、第２の方向は第１の方向に垂直である）２つの方向における液滴の間の距離を調整することを可能にする。

各楕円の中心は、液滴の中心の位置に対応する。

楕円は、大きさの大きい順に領域ごとに配置されているので、領域１４６’に配置されるより大きな楕円が最初に配置され、領域１４２’に配置されるより小さい楕円が最後に配置される。

好ましくは、領域変更で、位置決めは次の２つの基準に従って最適化される。
− −１つの楕円内に正しい色彩またはテクスチャーを有する基本ポリゴンの最大比、例えば７５％程度。
− −１つの楕円内に間違った色彩またはテクスチャーを有する基本ポリゴンの最小比、例えば５％程度。

重なり合う楕円は容認できる。

本方法の第４ステップは、バイオインクの液滴が印刷される堆積表面５６と種々のプリントヘッドとの動きを同期させることからなる。

バイオレーザープリンティングの場合、レーザー集束領域は、各レーザー印刷される楕円の中心であり、各楕円はレーザーパルスの対象である。この場合、堆積表面は静止しており、レーザーは堆積表面の全体をスキャンする。堆積表面がドナー基板よりも大きい場合には、（その上に堆積表面が形成される）受容基板もレーザースキャンと同期化されて移動できる。

ノズルバイオプリンティングの場合には、各楕円の中心は堆積表面５６の液滴の衝撃箇所に対応する。この場合には、印刷ノズルは静止しており、受容基板が動く。しかしながら、印刷ノズルは可動であってもよい。

用途

本発明によるバイオプリンティングは、以下のものを作製するために用いることができる。
−再生医療のための移植可能な組織、
−インビトロでの治療の選択を可能にし、個人差を考慮した治療溶液の開発を可能にする、患者の細胞から作られた個別化された組織、
−分子、成分および薬物候補の有効性または毒性の予測的な試験のために、健全なヒトの組織または病理に冒された組織の生理機能を再現する予測モデル。

限定することなく例示すれば、生体組織は骨組織である。

Claims (16)

1. 少なくとも１つのバイオインクを用いて印刷する印刷方法であって、
   前記印刷方法は、
   受容基板（５８）の堆積表面（５６）に少なくとも１つのバイオインクの少なくとも１つの液滴（８２）を堆積するために少なくとも１つのレーザー型プリントヘッド（１０２）を使用し、
   前記印刷方法は、前記レーザー型プリントヘッド（１０２）で堆積する受容基板と同じ受容基板（５８）の堆積表面（５６）に、少なくとも１つのバイオインクの少なくとも１つの液滴（８２）を堆積するために少なくとも１つのノズルプリントヘッド（１０４、１０４’、１０４”）を使用することを特徴とする印刷方法。
2. 前記印刷方法は、細胞および細胞外マトリックスを含む生体組織を得るために用いられており、
   前記細胞外マトリックスが作られる材料は前記ノズルプリントヘッド（１０４、１０４’、１０４”）によって堆積され、細胞は前記レーザー型プリントヘッド（１０２）によって堆積されることを特徴とする請求項１に記載の印刷方法。
3. 請求項１または２に記載の印刷方法を用いて生体組織を生成する方法であって、
   前記方法は、
   −生成すべき生体組織の三次元デジタル表現（１４０）を生成するステップと、但し、前記表現はそれぞれの色彩またはテクスチャーがバイオインクに対応する複数の着色またはテクスチャー加工されたボリューム領域（１４２、１４４、１４６）を有する、
   −前記三次元デジタル表現（１４０）を連続した積層（１４８）にスライスするステップと、但し、各層（１４８）は前記表現（１４０）の前記ボリューム領域（１４２、１４４、１４６）に対応する着色またはテクスチャー加工された領域（１４２’、１４４’、１４６’）を有する、
   −各層に対して、前記着色またはテクスチャー加工された領域（１４２’、１４４’、１４６’）および各液滴の予想される体積に従って、各バイオインクの液滴の印刷位置を決定するステップと、
   −異なる前記液滴を印刷するステップと、
   を有することを特徴とする生体組織を生成する方法。
4. 請求項１または２に記載の印刷方法が異なる前記液滴を印刷するように用いられることを特徴とする請求項３に記載の生体組織を生成する方法。
5. 前記層（１４８）は、前記液滴の大きさに応じた厚さを有することを特徴とする請求項３または４に記載の生体組織を生成する方法。
6. それぞれの層が、それらが属する領域に応じて異なる色彩またはテクスチャーを有する小さな基本的な一組のポリゴンを含むことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の生体組織を生成する方法。
7. 各液滴の前記印刷位置を決定するステップにおいては、各領域（１４２’、１４４’、１４６’）が、前記領域において印刷されるバイオインクの液滴の大きさに依存する大きさを有する個別の楕円（１４２”、１４４”、１４６”）で満たされ、個別の楕円における各楕円の中心が液滴の中心の位置に対応することを特徴とする請求項３〜６のいずれかに記載の生体組織を生成する方法。
8. 前記個別の楕円は、大きさの大きい順に領域ごとに配置されていることを特徴とする請求項７に記載の生体組織を生成する方法。
9. 堆積表面（５６）を有する少なくとも1つの受容基板（５８）と、
   レーザー型の少なくとも1つのプリントヘッド（１０２）と、を備える印刷装置であって、
   レーザービーム（６６）を照射するように構成された少なくとも1つのパルスレーザー源（６４）と、
   前記レーザービーム（６６）を集束させ方向付けるための光学系（６８）と、
   少なくとも１つのバイオインクを含む少なくとも１つのドナー基板（７０）と、を備え、
   前記印刷装置は、前記レーザー型の１または複数のプリントヘッド（１０２）で印刷する受容基板と同じ受容基板（５８）に少なくとも１つのバイオインクを印刷する少なくとも１つのノズルプリントヘッド（１０４、１０４’、１０４”）を備えることを特徴とする印刷装置。
10. 前記印刷装置は、ドナー基板（７０）を支持する少なくとも１つのベース（１１６）を格納するように構成されると共に、バイオインクに適合する雰囲気で内部を維持することを可能にする封じ込め手段を備えるチャンバー（１２４）を備えることを特徴とする請求項９に記載の印刷装置。
11. 前記チャンバー（１２４）は複数個のベース（１１６）を格納するために適した寸法を有し、前記印刷装置は複数個の収納部（１２８）を有して前記チャンバーの内部に格納されるように構成されている少なくとも１つのベースプレート（１２６）を備える、但し、前記複数の収納部は各ベース（１１６）に対して１つの収納部が対応するように構成されている、ことを特徴とする請求項１０に記載の印刷装置。
12. 前記ベースプレート（１２６）は、前記チャンバー（１２４）内に前記ベースプレートを位置決めするためのガイドシステムを備えることを特徴とする請求項１１に記載の印刷装置。
13. 前記チャンバー（１２４）は、ベース（１１６）を取り出すための第１開口部（１２５）をプリントヘッドに面する第１面に備え、ベースを取り入れるための第２開口部（１２５’）を他の面に備えることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載の印刷装置。
14. 前記印刷装置は、前記チャンバー（１２４）と前記レーザプリントヘッド（１０２）との間で、ベースを移動させるための可動クランプ（１３０）を備えることを特徴とする請求項９〜１３のいずれかに記載の印刷装置。
15. 前記印刷装置は、少なくとも１つの受容基板（５８）を支持する可動シャーシ（１０６）と、前記可動シャーシ（１０６）をシャーシ（１００）に対して３次元にガイドし移動するシステムと、前記可動シャーシ（１０６）の動きを制御する制御システムとを備え、前記ガイドおよび移動システムと前記制御システムとはマイクロメートルの精度を有することを特徴とする請求項９〜１４のいずれかに記載の印刷装置。
16. 前記可動クランプ（１３０）は、前記可動シヤーシ（１０６）に固定されていることを特徴とする請求項１４または１５に記載の印刷装置。

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