JP2018186730A - Pulmonary fibrosis model animal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子改変動物の分野に関し、特に、肺線維症モデル動物および当該モデル動物を用いる肺線維症の治療薬のスクリーニング方法等に関する。 The present invention relates to the field of genetically modified animals, and in particular, to a pulmonary fibrosis model animal, a screening method for a therapeutic agent for pulmonary fibrosis using the model animal, and the like.
肺線維症は、肺の線維性病変を特徴とする致死性の疾患である。肺線維症は薬剤や膠原病など様々な原因で起こりうるが、中でも原因の特定できない特発性肺線維症（IPF）は診断後の平均寿命が３−５年である予後不良の難病であり、有効な治療法が存在しない。肺線維症の治療薬開発には適切な疾患モデルが不可欠であるが、現在用いられているブレオマイシン誘発モデルなどの肺線維症モデルは臨床の病態を十分に反映しておらず、より適切なモデルが求められている。IPFに関連する遺伝子変異として、テロメラーゼや、肺サーファクタントタンパク質であるSFTPA1およびSFTPA2の変異が報告されているが、いずれも肺線維症モデルの確立には到っていない。 Pulmonary fibrosis is a fatal disease characterized by pulmonary fibrosis. Pulmonary fibrosis can occur due to various causes such as drugs and collagen disease. Among them, idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), whose cause cannot be identified, is an incurable disease with a poor prognosis with an average life span of 3-5 years after diagnosis. There is no effective treatment. Appropriate disease models are indispensable for the development of therapeutic agents for pulmonary fibrosis, but currently used pulmonary fibrosis models such as bleomycin-induced models do not adequately reflect clinical pathology and are more appropriate models. Is required. As gene mutations related to IPF, mutations of telomerase and pulmonary surfactant proteins SFTPA1 and SFTPA2 have been reported, but none of them has established a pulmonary fibrosis model.
本発明は、肺線維症モデル動物、および当該モデル動物を用いる肺線維症の治療薬のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a pulmonary fibrosis model animal, a screening method for a therapeutic agent for pulmonary fibrosis using the model animal, and the like.
本発明は、ある態様において、SFTPA1（Y208H）を発現する遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。 In one embodiment, the present invention provides a genetically modified non-human mammal that expresses SFTPA1 (Y208H).
本発明は、さらなる態様において、肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物に候補物質を投与すること、および
前記哺乳動物の前記候補物質への応答を評価すること、
を含む方法を提供する。
In a further aspect, the present invention provides a method for screening a therapeutic agent for pulmonary fibrosis comprising:
Administering a candidate substance to a non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H), and evaluating the response of the mammal to the candidate substance,
A method comprising:
本発明は、さらなる態様において、肺線維症モデル動物の作製方法であって、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物を作製することを含む方法を提供する。 In a further aspect, the present invention provides a method for producing a pulmonary fibrosis model animal, comprising producing a non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H).
本発明は、さらなる態様において、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物の、肺線維症モデル動物としての使用を提供する。 In a further aspect, the present invention provides the use of a non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H) as a pulmonary fibrosis model animal.
本発明は、さらなる態様において、肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および
前記細胞のNotchシグナルまたはネクロプトーシスを評価すること
を含む方法を提供する。
In a further aspect, the present invention provides a method for screening a therapeutic agent for pulmonary fibrosis comprising:
There is provided a method comprising contacting a cell with a candidate substance in vitro and assessing Notch signal or necroptosis of said cell.
本発明により、肺線維症モデル動物および肺線維症の治療薬のスクリーニング方法等が提供される。 The present invention provides a pulmonary fibrosis model animal, a screening method for a therapeutic agent for pulmonary fibrosis, and the like.
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。 Unless otherwise specified, the terms used herein have meanings as commonly understood by one of ordinary skill in the fields of organic chemistry, medicine, pharmacy, molecular biology, microbiology, and the like. The following are definitions for some of the terms used in this specification, but these definitions take precedence over the general understanding herein.
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。 As used herein, where a numerical value is accompanied by the term “about,” it is intended to include a range of ± 10% of that value. The numerical range includes all numerical values between the end points and numerical values of the end points. “About” a range applies to the endpoints of the range. Therefore, for example, “about 20-30” includes “20 ± 10% -30 ± 10%”.
SFTPA1（surfactant protein A1）は、主にII型肺胞上皮細胞（AEII細胞）によって産生される肺サーファクタントの成分であり、PSP-A（pulmonary surfactant-associated protein A1）とも呼ばれる。本明細書において、SFTPA1（Y208H）とは、Y208H変異を含むSFTPA1の変異体を意味し、本明細書中、変異型SFTPA1とも称する。本明細書において、Y208H変異とは、配列番号１のヒトSFTPA1のアミノ酸配列と最適に（配列の一致が最大となる状態に）アラインメントしたときに配列番号１の208番目のアミノ酸残基に対応する残基における、Y（チロシン）からH（ヒスチジン）への変異を意味し、208番目のアミノ酸残基における変異に限定されない。SFTPA1は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、またはヒトのSFTPA1である。SFTPA1（Y208H）は、これを発現する哺乳動物または細胞の種と同種のSFTPA1の変異体であっても異種のSFTPA1の変異体であってもよいが、好ましくは同種のSFTPA1の変異体である。ヒトおよびマウスの野生型SFTPA1のアミノ酸配列を配列番号１および２に、変異型SFTPA1のアミノ酸配列を配列番号３および４それぞれ示すが、当業者は公知の情報に基づき適切なSFTPA1のアミノ酸配列を選択することができる。 SFTPA1 (surfactant protein A1) is a component of lung surfactant mainly produced by type II alveolar epithelial cells (AEII cells), and is also called PSP-A (pulmonary surfactant-associated protein A1). In the present specification, SFTPA1 (Y208H) means a mutant of SFTPA1 containing a Y208H mutation, and is also referred to as mutant SFTPA1 in the present specification. In the present specification, the Y208H mutation corresponds to the 208th amino acid residue of SEQ ID NO: 1 when optimally aligned with the amino acid sequence of human SFTPA1 of SEQ ID NO: 1 (in a state where sequence matching is maximized). This means a mutation from Y (tyrosine) to H (histidine) at the residue, and is not limited to the mutation at the 208th amino acid residue. SFTPA1 is, for example, mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, cat, dog, goat, sheep, pig, cow, monkey, or human SFTPA1. SFTPA1 (Y208H) may be a variant of SFTPA1 that is homologous or heterologous to the mammal or cell species that expresses it, but is preferably a variant of SFTPA1 of the same species. . The amino acid sequences of human and mouse wild-type SFTPA1 are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and the amino acid sequences of mutant SFTPA1 are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively, and those skilled in the art will select an appropriate amino acid sequence of SFTPA1 based on known information can do.
ある実施形態において、SFTPA1（Y208H）は、配列番号３または４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、SFTPA1（Y208H）は、配列番号３または４のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、配列番号３または４のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。配列同一性とは、２つの配列間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適に（配列の一致が最大となる状態に）アラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の残基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばBLAST、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。さらなる実施形態において、SFTPA1（Y208H）は、配列番号３または４のアミノ酸配列を含むか、配列番号３または４のアミノ酸配列からなる。 In certain embodiments, SFTPA1 (Y208H) comprises an amino acid sequence having at least 71% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4. In a further embodiment, SFTPA1 (Y208H) comprises an amino acid sequence having 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4, or SEQ ID NO: 3 or 4 And an amino acid sequence having 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity. Sequence identity means the degree of sequence similarity between two sequences, comparing two sequences that are optimally aligned (maximum sequence match) over the region of the sequence being compared. Determined by. The sequence identity number (%) determines the number of matching sites by determining the same residues present in both sequences, and then the number of matching sites is the total number of residues in the sequence region to be compared. It is calculated by dividing by 100 and multiplying the obtained numerical value by 100. Algorithms for obtaining optimal alignment and sequence identity include various algorithms commonly available to those skilled in the art (eg, BLAST algorithm, FASTA algorithm, etc.). The sequence identity is determined using sequence analysis software such as BLAST and FASTA. In a further embodiment, SFTPA1 (Y208H) comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4.
非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サルなどが例示される。ある実施形態において、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類、好ましくはマウスである。 Examples of non-human mammals include mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, goats, sheep, pigs, cows, monkeys, and the like. In certain embodiments, the non-human mammal is a rodent such as a mouse, rat, hamster, guinea pig, preferably a mouse.
本明細書において、遺伝子改変非ヒト哺乳動物とは、遺伝子工学的手法により人為的に改変された遺伝情報を有する非ヒト哺乳動物を意味する。 In the present specification, the genetically modified non-human mammal means a non-human mammal having genetic information artificially modified by a genetic engineering technique.
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物は、公知の遺伝子改変動物の作製方法により、作製することができる。例示的な作製方法を以下に説明する。 A non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H) can be produced by a known method for producing a genetically modified animal. An exemplary manufacturing method is described below.
まず、Y208H変異を生じる点変異を導入した配列を含むターゲティングベクターを作製する。点変異は、部位特異的突然変異誘発などにより導入することができる。YをHに変異させるには、YをコードするTATまたはTACをCATまたはCACに変異させればよく、かかる点変異として、例えば、ヒトまたはマウスSFTPA1をコードする配列（配列番号５または６）の622番目のT（チミン）のC（シトシン）への変異（T622C）が挙げられる。ターゲティングベクターは、所望の組換えが起こった細胞の選別が容易になるよう、前記配列の他、ネオマイシン耐性遺伝子(neo)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-tk)、ジフテリア毒素A遺伝子などの選択マーカー遺伝子をコードする配列を含むことが好ましい。ターゲティングベクターは、選択マーカー遺伝子をCre/loxPシステムなどにより組換え体の選別の後に除去できるよう、構築してもよい。 First, a targeting vector containing a sequence into which a point mutation causing a Y208H mutation has been introduced is prepared. Point mutations can be introduced, such as by site-directed mutagenesis. In order to mutate Y to H, TAT or TAC encoding Y may be mutated to CAT or CAC. As such point mutation, for example, a sequence encoding human or mouse SFTPA1 (SEQ ID NO: 5 or 6) The mutation (T622C) of C (cytosine) of 622th T (thymine) is mentioned. In addition to the sequences described above, the targeting vector facilitates selection of cells in which the desired recombination has occurred, in addition to the neomycin resistance gene (neo), the hygromycin B phosphotransferase gene, the herpesvirus thymidine kinase gene (HSV-tk), It preferably contains a sequence encoding a selectable marker gene such as diphtheria toxin A gene. The targeting vector may be constructed so that the selectable marker gene can be removed after selection of the recombinant by Cre / loxP system or the like.
次いで、ターゲティングベクターを非ヒト哺乳動物のES細胞に導入する。ターゲティングベクターの導入は、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、リポソーム法などにより行うことができる。ターゲティングベクターを細胞に導入すると、相同組み換えにより、前記点変異を含む配列が対応するゲノムの配列と置換され、所望の配列がゲノムに導入される。所望の配列が導入された細胞は、サザンブロットやPCRにより確認することができる。 Next, the targeting vector is introduced into ES cells of a non-human mammal. The targeting vector can be introduced by electroporation method, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, liposome method or the like. When the targeting vector is introduced into the cell, the sequence containing the point mutation is replaced with the corresponding genomic sequence by homologous recombination, and the desired sequence is introduced into the genome. Cells into which a desired sequence has been introduced can be confirmed by Southern blotting or PCR.
相同組換えの結果得られた組換えES細胞を、8細胞期又は胚盤胞の胚内に移植し、このES細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることにより、キメラ動物を作製する。そして、所望の配列が生殖系列に導入されたキメラ動物を野生型動物と交配し、ヘテロ接合体を得て、ヘテロ接合体同士を交配することにより、ホモ接合体を得る。本発明のSFTPA1（Y208H）を発現する遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、ホモ接合体である。ヘテロ接合体またはホモ接合体が得られたことは、サザンブロットやPCRにより確認することができる。 Recombinant ES cells obtained as a result of homologous recombination are transplanted into 8-cell stage or blastocyst embryos, and these ES cell-transplanted embryos are transplanted into the uterus of pseudopregnant foster parents to give birth. Create animals. Then, a chimeric animal having a desired sequence introduced into the germ line is crossed with a wild type animal to obtain a heterozygote, and a heterozygote is mated to obtain a homozygote. The genetically modified non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H) of the present invention is a homozygote. Whether a heterozygote or a homozygote was obtained can be confirmed by Southern blotting or PCR.
SFTPA1（Y208H）を発現する哺乳動物は、肺線維症を自然発症する。本明細書において、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物には、肺線維症の発症前および発症後の動物が含まれる。肺線維症の発症時期は、哺乳動物の種類および実験条件によって異なるが、例えばマウスでは、通常３０〜４０週齢頃である。肺線維症の発症は、肺胞、肺胞壁、および／または肺胞間質への炎症性細胞の浸潤、肺コラーゲン量の増加、AEII細胞死などの肺組織の変化により調べることができる。本明細書において、SFTPA1（Y208H）を発現する遺伝子改変非ヒト哺乳動物には、前記のようにして得られたホモ接合体およびその子孫が含まれる。 Mammals expressing SFTPA1 (Y208H) spontaneously develop pulmonary fibrosis. As used herein, non-human mammals that express SFTPA1 (Y208H) include animals before and after the onset of pulmonary fibrosis. The onset time of pulmonary fibrosis varies depending on the type of mammal and the experimental conditions, but for example, in mice, it is usually around 30 to 40 weeks of age. The onset of pulmonary fibrosis can be examined by changes in lung tissue such as infiltration of inflammatory cells into the alveoli, alveolar walls, and / or alveolar stroma, an increase in lung collagen content, and AEII cell death. In the present specification, the genetically modified non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H) includes the homozygote obtained as described above and its progeny.
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物は、肺線維症モデル動物として、肺線維症の治療薬のスクリーニングに用いることができる。よって、本発明は、前記動物に候補物質を投与することを含む、肺線維症の治療薬のスクリーニング方法を提供する。ある実施形態において、本スクリーニング方法は、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物に候補物質を投与すること、および、前記哺乳動物の前記候補物質への応答を評価することを含む。 A non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H) can be used as a pulmonary fibrosis model animal for screening for a therapeutic agent for pulmonary fibrosis. Therefore, the present invention provides a method for screening a therapeutic agent for pulmonary fibrosis, comprising administering a candidate substance to the animal. In certain embodiments, the screening method comprises administering a candidate substance to a non-human mammal that expresses SFTPA1 (Y208H) and assessing the response of the mammal to the candidate substance.
本明細書において、肺線維症とは、肺の線維性病変を特徴とする疾患を意味する。線維性病変は、線維芽細胞から産生されたコラーゲン等の細胞外タンパク質の過剰蓄積により生じる。肺線維症には、薬剤、膠原病、感染、放射線、または粉塵への暴露などの特定の原因による肺線維症、および原因の特定できない特発性肺線維症（Idiopathic pulmonary fibrosis, 本明細書中、IPFとも称する)が含まれる。好ましい態様において、肺線維症は、特発性肺線維症である。 As used herein, pulmonary fibrosis refers to a disease characterized by pulmonary fibrotic lesions. Fibrotic lesions are caused by excessive accumulation of extracellular proteins such as collagen produced from fibroblasts. Pulmonary fibrosis includes pulmonary fibrosis due to specific causes such as exposure to drugs, collagen disease, infection, radiation, or dust, and idiopathic pulmonary fibrosis, Also referred to as IPF). In a preferred embodiment, the pulmonary fibrosis is idiopathic pulmonary fibrosis.
候補物質は、例えば、低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、または抗体、あるいは微生物、植物または動物の細胞抽出物または培養上清などであるが、これらに限定されない。候補物質は、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー等の、ライブラリーの形態で提供されてもよい。 Candidate substances include, but are not limited to, for example, low molecular weight compounds, nucleic acids, proteins, peptides, or antibodies, or cell extracts or culture supernatants of microorganisms, plants, or animals. Candidate substances may be provided in the form of a library such as a synthetic low molecular weight compound library, a synthetic peptide library, or an antibody library.
候補物質は、経口投与で投与しても、非経口投与（例えば、静脈内投与、経肺投与、皮下投与、筋肉内、腹腔内投与）で投与してもよい。投与回数および投与期間は特に限定されず、１日あたり１回〜数回を、1日〜数日間または数週間、連日または数日おきに行うことが考えられる。候補物質は、哺乳動物が肺線維症を発症する前に投与してもよく、発症した後に投与してもよい。 Candidate substances may be administered orally or parenterally (eg, intravenous, pulmonary, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal). The number of administration and the administration period are not particularly limited, and it may be performed once to several times per day for 1 to several days or weeks, every day or every few days. The candidate substance may be administered before the mammal develops pulmonary fibrosis or may be administered after the onset.
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物をインフルエンザウイルスに感染させると肺線維症の発症が早まることから、候補物質の投与前または投与後に、好ましくは投与前に、哺乳動物をインフルエンザウイルスに感染させてもよい。インフルエンザウイルス感染により、短期間で候補物質への応答を評価することが可能になる。インフルエンザウイルスとしては、A型インフルエンザウイルスが好ましく、特にH3N2型が好ましい。ウイルス量は、哺乳動物に応じて適宜変更されるが、例えば、マウスであれば１個体あたり103〜105PFU、例えば約104PFUを投与すればよく、当業者は使用する哺乳動物に応じて適切なウイルス量を決定することができる。インフルエンザウイルスは、通常の方法により、例えば、鼻腔内に接種することにより、哺乳動物に感染させることができる。 Infection of non-human mammals expressing SFTPA1 (Y208H) with influenza virus accelerates the onset of pulmonary fibrosis, so infection of mammals with influenza virus before or after administration of the candidate substance, preferably before administration You may let them. Influenza virus infection makes it possible to evaluate responses to candidate substances in a short period of time. As the influenza virus, influenza A virus is preferable, and H3N2 is particularly preferable. The amount of virus is appropriately changed depending on the mammal. For example, in the case of a mouse, 10 3 to 10 5 PFU per individual, for example, about 10 4 PFU may be administered. The appropriate amount of virus can be determined accordingly. Influenza viruses can be infected in mammals by conventional methods, for example, inoculating intranasally.
哺乳動物の候補物質への応答の評価は、通常、候補物質を投与した哺乳動物の肺線維症の指標を、対照（通常、候補物質を投与していない、候補物質の投与の有無以外は同一条件の哺乳動物の、肺線維症の指標）と比較することにより行う。対照と比較して肺線維症の指標を改善する候補物質が、肺線維症の治療薬として選択される。肺線維症の指標の改善には、程度の改善および発現の遅延が含まれる。例えば、対照と比較して候補物質を投与した哺乳動物の肺線維症の発症が遅れた場合、または肺線維症症状または生存率が改善した場合、候補物質は肺線維症の治療薬として選択されうる。哺乳動物の候補物質への応答の評価は、哺乳動物の種類および評価する肺線維症の指標等に応じて、適切な時期に実施すればよい。 Evaluation of the response of a mammal to a candidate substance is usually the same as an indicator of pulmonary fibrosis in a mammal to which a candidate substance has been administered, except for the control (usually, the candidate substance is not administered, and the candidate substance is not administered). By comparison with the condition mammals, an index of pulmonary fibrosis). Candidate substances that improve the index of pulmonary fibrosis compared to controls are selected as therapeutic agents for pulmonary fibrosis. Improvements in the indicators of pulmonary fibrosis include improvement in degree and delay in onset. For example, a candidate substance is selected as a treatment for pulmonary fibrosis when the onset of pulmonary fibrosis in a mammal administered the candidate substance compared to the control is delayed or when the pulmonary fibrosis symptoms or survival rate is improved. sell. Evaluation of the response of a mammal to a candidate substance may be performed at an appropriate time according to the type of mammal and an index of pulmonary fibrosis to be evaluated.
肺線維症の指標としては、肺胞、肺胞壁、および／または肺胞間質への炎症性細胞の浸潤、肺コラーゲン量の増加、AEII細胞死などの肺線維症症状、および生存率の低下などが挙げられる。SFTPA1（Y208H）を発現する哺乳動物における肺線維症の発症にNotchシグナルおよびネクロプトーシスが関与することが確認されたことから、Notchシグナルの活性化またはネクロプトーシスの亢進を肺線維症の指標とすることもできる。Notchシグナルの活性化は、AEII細胞におけるNotch標的遺伝子であるDtx1またはHes1の発現、BAL液中のNotchリガンドであるDll1のレベル、AEII細胞におけるDll1生成に関与するプロテアーゼであるAdam10および／またはAdam12の発現などにより、調べることができる。ネクロプトーシスの亢進は、AEII細胞におけるネクロプトーシス関連酵素であるRIPK3の発現、BAL液中の損傷関連分子パターン（damage-associated molecular pattern; DAMP）（例えばIL-33）のレベルなどにより、調べることができる。 Indices of pulmonary fibrosis include inflammatory cell infiltration into the alveoli, alveolar walls, and / or alveolar stroma, increased lung collagen content, AEII cell death and other pulmonary fibrosis symptoms, and survival rate Decrease. It was confirmed that Notch signal and necroptosis are involved in the development of pulmonary fibrosis in mammals expressing SFTPA1 (Y208H), indicating activation of Notch signal or increased necroptosis as an indicator of pulmonary fibrosis It can also be. The activation of Notch signal is caused by the expression of Dtx1 or Hes1 which is a Notch target gene in AEII cells, the level of Dll1 which is a Notch ligand in BAL fluid, and Adam10 and / or Adam12 which are proteases involved in Dll1 production in AEII cells. It can be examined by expression or the like. Increased necroptosis is examined by the expression of RIPK3, a necroptosis-related enzyme in AEII cells, and the level of damage-associated molecular pattern (DAMP) (eg IL-33) in BAL fluid. be able to.
Notchシグナルおよびネクロプトーシスが肺線維症に関与することが確認されたことから、インビトロでNotchシグナルまたはネクロプトーシスを評価することによっても、肺線維症の治療薬をスクリーニングすることができる。ある実施形態において、本スクリーニング方法は、細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および、当該細胞のNotchシグナルまたはネクロプトーシスを評価することを含む。ある実施形態において、細胞は、SFTPA1（Y208H）を発現する。Notchシグナルを阻害する候補物質、およびネクロプトーシスを抑制する候補物質は、肺線維症の治療薬として選択されうる。 Since it was confirmed that Notch signal and necroptosis are involved in pulmonary fibrosis, therapeutic agents for pulmonary fibrosis can also be screened by evaluating Notch signal or necroptosis in vitro. In certain embodiments, the screening method comprises contacting a cell with a candidate substance in vitro and evaluating the cell for Notch signal or necroptosis. In certain embodiments, the cell expresses SFTPA1 (Y208H). Candidate substances that inhibit Notch signal and candidate substances that suppress necroptosis can be selected as therapeutic agents for pulmonary fibrosis.
Notchシグナルの評価は、公知の方法により行うことができる。膜貫通型受容体であるNotchは、リガンドの結合により活性化されると細胞内ドメインが切断され、切断された細胞内ドメインが転写因子であるRBPJに結合して、Hes1やDtx1などの標的遺伝子の転写を活性化する。それゆえ、Notchシグナル伝達は、例えば、Notchの下流分子の制御下にレポータータンパク質を発現するレポーターシステムにより、またはNotchの細胞内ドメインの切断に基づき、評価することができる。前記レポーターシステムは、例えば、RBPJ結合配列またはNotch標的遺伝子のプロモーターの下流に、レポータータンパク質を発現する遺伝子（本明細書中、レポーター遺伝子とも称する）を含むポリヌクレオチドを用いる。レポータータンパク質としては、GFP、eGFP、BFP、YFP、EYFP、CFP、RFP、dsRed、およびmCherry等の蛍光タンパク質が挙げられる。Notchの細胞内ドメインの切断は、例えば、切断された細胞内ドメインを特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロッティングなどにより、調べることができる。 The Notch signal can be evaluated by a known method. When activated by ligand binding, Notch, a transmembrane receptor, cleaves the intracellular domain, and the cleaved intracellular domain binds to RBPJ, a transcription factor, to target genes such as Hes1 and Dtx1. Activates transcription. Thus, Notch signaling can be assessed, for example, by a reporter system that expresses a reporter protein under the control of a downstream molecule of Notch, or based on cleavage of the intracellular domain of Notch. The reporter system uses, for example, a polynucleotide containing a gene that expresses a reporter protein (also referred to herein as a reporter gene) downstream of an RBPJ binding sequence or a promoter of a Notch target gene. Reporter proteins include fluorescent proteins such as GFP, eGFP, BFP, YFP, EYFP, CFP, RFP, dsRed, and mCherry. The cleavage of Notch intracellular domain can be examined, for example, by Western blotting using an antibody that specifically recognizes the cleaved intracellular domain.
ある実施形態において、細胞は、Notchおよびその下流分子を発現し、かつ当該下流分子の制御下にレポータータンパク質を発現するポリヌクレオチドを有する。下流分子としては、限定はされないが、RBPJが挙げられ、当該下流分子の制御下にレポータータンパク質を発現するポリヌクレオチドとしては、RBPJ結合配列またはNotch標的遺伝子のプロモーター（例えば、Hes-1プロモーター）の下流にレポーター遺伝子を含むポリヌクレオチドが挙げられる。NotchリガンドによるNotchシグナルの活性化を阻害する候補物質が、肺線維症の治療薬として選択されうる。Notchリガンドとしては、Delta-like 1（Dll1）が例示される。 In certain embodiments, the cell has a polynucleotide that expresses Notch and its downstream molecule and expresses a reporter protein under the control of the downstream molecule. Examples of downstream molecules include, but are not limited to, RBPJ. Polynucleotides that express reporter proteins under the control of the downstream molecules include RBPJ binding sequences or Notch target gene promoters (eg, Hes-1 promoter). Examples include a polynucleotide containing a reporter gene downstream. Candidate substances that inhibit Notch signal activation by Notch ligands can be selected as therapeutic agents for pulmonary fibrosis. An example of the Notch ligand is Delta-like 1 (Dll1).
ネクロプトーシスの評価は、公知の方法により行うことができる。ネクロプトーシスでは、活性化されたRIPK3（Receptor-interacting protein kinase 3）によりMLKL（Mixed lineage kinase domain-like）がリン酸化され、リン酸化MLKLの働きにより細胞膜が破壊され、DAMPが放出される。それゆえ、ネクロプトーシスは、ネクロプトーシス性刺激による細胞膜の破壊（例えば、細胞膜の破壊により放出されるIL-33などのDAMPのレベル）に基づき、評価することができる。 Evaluation of necroptosis can be performed by a known method. In necroptosis, MLIP (Mixed lineage kinase domain-like) is phosphorylated by activated RIPK3 (Receptor-interacting protein kinase 3), the cell membrane is destroyed by the action of phosphorylated MLKL, and DAMP is released. Therefore, necroptosis can be evaluated on the basis of cell membrane disruption (eg, the level of DAMP such as IL-33 released by cell membrane disruption) by necroptotic stimulation.
ある実施形態において、細胞は、RIPK3およびMLKLを発現する。ネクロプトーシス性刺激としては、TNF-αが挙げられる。 In certain embodiments, the cells express RIPK3 and MLKL. Necroptotic stimuli include TNF-α.
インビトロでのスクリーニングに使用可能な細胞としては、HEK293細胞、293T細胞、A549細胞、Jurkat細胞などが例示される。スクリーニングに必要なタンパク質およびポリヌクレオチド等の分子は、細胞に内在するものであってもよく、人為的に細胞に導入したもの、または細胞で発現させたものであってもよい。細胞への人為的導入および細胞での人為的発現は、公知の遺伝子工学的手法により行うことができる。 Examples of cells that can be used for in vitro screening include HEK293 cells, 293T cells, A549 cells, and Jurkat cells. Molecules such as proteins and polynucleotides necessary for screening may be endogenous to the cell, artificially introduced into the cell, or expressed in the cell. Artificial introduction into cells and artificial expression in cells can be performed by known genetic engineering techniques.
本発明の例示的実施形態を以下に記載する。
１．SFTPA1（Y208H）を発現する、遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
２．非ヒト哺乳動物がマウスである、前記１に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
３．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記１または２に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
４．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記３に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
５．肺線維症モデル動物である、前記１〜４のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
６．肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物に候補物質を投与すること、および
前記哺乳動物の前記候補物質への応答を評価すること、
を含む方法。
７．非ヒト哺乳動物がマウスである、前記６に記載の方法。
８．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記６または７に記載の方法。
９．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記８に記載の方法。
１０．候補物質への応答の評価が、候補物質を投与した前記哺乳動物の肺線維症の指標を対照と比較することすることを含む、前記６〜９のいずれかに記載の方法。
１１．肺線維症の指標が、肺線維症症状である、前記１０に記載の方法。
１２．肺線維症の指標が、生存率の低下である、前記１０に記載の方法。
１３．候補物質の投与前に、前記哺乳動物をインフルエンザウイルスに感染させることを含む、前記６〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．インフルエンザウイルスが、A型インフルエンザウイルスである、前記１３に記載の方法。
１５．A型インフルエンザウイルスが、H3N2型である、前記１４に記載の方法。
１６．肺線維症モデル動物の作製方法であって、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物を作製することを含む方法。
１７．非ヒト哺乳動物がマウスである、前記１６に記載の方法。
１８．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記１６または１７に記載の方法。
１９．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記１８に記載の方法。
２０．SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物の、肺線維症モデル動物としての使用。
２１．非ヒト哺乳動物がマウスである、前記２０に記載の使用。
２２．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記２０または２１に記載の使用。
２３．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記２２に記載の使用。
２４．肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および
前記細胞のNotchシグナルを評価すること
を含む方法。
２５．細胞が、SFTPA1（Y208H）を発現する、前記２４に記載の方法。
２６．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記２４または２５に記載の方法。
２７．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記２６に記載の方法。
２８．細胞が、Notchおよびその下流分子を発現し、かつ前記下流分子の制御下にレポータータンパク質を発現するポリヌクレオチドを有する、前記２４〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．候補物質の投与前もしくは投与後、または候補物質の投与と同時に、Notchリガンドで細胞を刺激することを含む、前記２４〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および
前記細胞のネクロプトーシスを評価すること
を含む方法。
３１．細胞が、SFTPA1（Y208H）を発現する、前記３０に記載の方法。
３２．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記３０または３１に記載の方法。
３３．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記３２に記載の方法。
３４．細胞が、RIPK3およびMLKLを発現する、前記３０〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．候補物質の投与前もしくは投与後、または候補物質の投与と同時に、ネクロプトーシス性刺激で細胞を刺激することを含む、前記３０〜３４のいずれかに記載の方法。
Exemplary embodiments of the invention are described below.
1. A genetically modified non-human mammal that expresses SFTPA1 (Y208H).
2. 2. The genetically modified non-human mammal according to 1 above, wherein the non-human mammal is a mouse.
3. 3. The genetically modified non-human mammal according to 1 or 2 above, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises an amino acid sequence having 71% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
4). 4. The genetically modified non-human mammal according to 3 above, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
5. 5. The genetically modified non-human mammal according to any one of 1 to 4 above, which is a pulmonary fibrosis model animal.
6). A screening method for a therapeutic agent for pulmonary fibrosis, comprising:
Administering a candidate substance to a non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H), and evaluating the response of the mammal to the candidate substance,
Including methods.
7). 7. The method according to 6 above, wherein the non-human mammal is a mouse.
8). 8. The method according to 6 or 7 above, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises an amino acid sequence having 71% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
9. 9. The method according to 8 above, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
10. 10. The method according to any of 6 to 9, wherein the evaluation of the response to the candidate substance comprises comparing the indicator of pulmonary fibrosis of the mammal administered the candidate substance with a control.
11. 11. The method according to 10, wherein the pulmonary fibrosis index is a pulmonary fibrosis symptom.
12 11. The method according to 10 above, wherein the indicator of pulmonary fibrosis is a decrease in survival rate.
13. The method according to any one of 6 to 12, comprising infecting the mammal with influenza virus before administration of the candidate substance.
14 14. The method according to 13, wherein the influenza virus is an influenza A virus.
15. 15. The method according to 14 above, wherein the influenza A virus is H3N2.
16. A method for producing a pulmonary fibrosis model animal, comprising producing a non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H).
17. 17. The method according to 16 above, wherein the non-human mammal is a mouse.
18. 18. The method according to 16 or 17 above, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises an amino acid sequence having 71% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
19. 19. The method according to 18 above, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
20. Use of a non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H) as a pulmonary fibrosis model animal.
21. 21. The use according to 20 above, wherein the non-human mammal is a mouse.
22. The use according to the above 20 or 21, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises an amino acid sequence having 71% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
23. The use according to 22 above, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
24. A screening method for a therapeutic agent for pulmonary fibrosis, comprising:
Contacting the cell with a candidate substance in vitro, and assessing the Notch signal of the cell.
25. 25. The method according to 24 above, wherein the cell expresses SFTPA1 (Y208H).
26. 26. The method according to 24 or 25, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises an amino acid sequence having 71% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
27. 27. The method according to 26, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
28. 28. The method according to any of 24 to 27, wherein the cell has a polynucleotide that expresses Notch and its downstream molecule and expresses a reporter protein under the control of the downstream molecule.
29. 29. The method according to any one of 24 to 28, comprising stimulating cells with Notch ligand before or after administration of a candidate substance, or simultaneously with administration of a candidate substance.
30. A screening method for a therapeutic agent for pulmonary fibrosis, comprising:
Contacting the cell with a candidate substance in vitro, and assessing necroptosis of the cell.
31. The method according to 30 above, wherein the cell expresses SFTPA1 (Y208H).
32. 32. The method according to 30 or 31, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises an amino acid sequence having 71% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
33. The method according to 32, wherein SFTPA1 (Y208H) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
34. 34. The method according to any one of 30 to 33 above, wherein the cell expresses RIPK3 and MLKL.
35. 35. The method according to any of 30 to 34, comprising stimulating cells with necroptotic stimulation before or after administration of the candidate substance, or simultaneously with administration of the candidate substance.
以下、実施例により本発明を説明するが、如何なる意味においても本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to these Examples in any meaning.
１．方法
エキソームリシーケンスおよびDNAシーケンス
エキソームシーケンスおよびデータ解析は、既報のとおり行った（Kitamura, A. et al., J Clin Invest 121, 4150-4160 (2011).; Kitamura, A. et al., J Exp Med 211, 2385-2396 (2014).）。簡潔に言うと、ゲノムDNAからペアードエンドライブラリーを作製し、SureSelect Human All Exon Kit（Agilent Technologies）由来のビオチン化cRNAオリゴヌクレオチドベイトにハイブリダイズさせた。ライブラリーは、Illumina Hiseq2000シークエンシングシステムの1レーンに対し、ペアードエンド、75bpの読み取りデータで、配列決定した。当該読み取りデータを、UCSC Genome Browserのヒト参照配列（hg19）に対してアライメントした。標的エキソーム全体の90％が、10を超える読み取りデータで網羅されていた。候補領域に存在するDNA変異は、dbSNP build 134、1000人ゲノムプロジェクト、およびNHLBI エキソームシーケンスプロジェクトに対して、選別した。ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、およびスプライス部位対立遺伝子を評価した。SFTPA1における変異は、ABI Prism 3100 遺伝子解析装置（PE Applied Biosystems）を用いて配列決定した。
1. Methods Exome resequencing and DNA sequencing Exome sequencing and data analysis were performed as previously reported (Kitamura, A. et al., J Clin Invest 121, 4150-4160 (2011) .; Kitamura, A. et al. , J Exp Med 211, 2385-2396 (2014).). Briefly, a paired end library was generated from genomic DNA and hybridized to a biotinylated cRNA oligonucleotide bait from the SureSelect Human All Exon Kit (Agilent Technologies). The library was sequenced with a paired end, 75 bp read data for one lane of the Illumina Hiseq2000 sequencing system. The read data was aligned with the UCSC Genome Browser human reference sequence (hg19). 90% of all target exomes were covered by more than 10 readings. DNA mutations present in the candidate region were screened against dbSNP build 134, 1000 Genome Project, and NHLBI Exome Sequencing Project. Missense, nonsense, frameshift, and splice site alleles were evaluated. Mutations in SFTPA1 were sequenced using an ABI Prism 3100 gene analyzer (PE Applied Biosystems).
SNPホモ接合性マッピングおよび連鎖解析
1つの血縁家族由来の、肺線維症を発症した同胞、および発症していない同胞を、Illumina Human 610 Quad（San Diego, CA, USA）で調べた。サンプルの処理およびラベリングは、製造業者の指示に従い行った。99％を超える平均コールレートが得られた。ホモ接合領域は、HomozygosityMapperを用いて同定した。異なる家族由来の3人の患者間で共通するホモ接合領域の簡単な比較を可能にする図形インターフェイスは、本発明者らが開発した。連鎖解析については、Merlin softwareを用いて多点ロッドスコアを得た。
SNP homozygosity mapping and linkage analysis
Siblings with and without pulmonary fibrosis from one family were examined with the Illumina Human 610 Quad (San Diego, CA, USA). Sample processing and labeling were performed according to the manufacturer's instructions. An average call rate exceeding 99% was obtained. Homozygous regions were identified using HomozygosityMapper. The inventors have developed a graphical interface that allows a simple comparison of homozygous regions common between three patients from different families. For linkage analysis, multipoint rod scores were obtained using Merlin software.
マウス
C57BL/6は、Japan SLC（Hamamatsu, Japan）から購入した。Sftpa1-KIマウスは、Sftpa1に変異を有するターゲティングベクターを作成することにより構築した。
mouse
C57BL / 6 was purchased from Japan SLC (Hamamatsu, Japan). Sftpa1-KI mice were constructed by creating a targeting vector having a mutation in Sftpa1.
気管支肺胞上皮の洗浄
マウスを安楽死させ、肺組織およびBAL液を0.8ml量のPBSを用いて回収した。Notchリガンドを測定するために、無細胞BAL液を−80℃のフリーザーで保管した。
Bronchoalveolar epithelial lavage Mice were euthanized and lung tissue and BAL fluid were collected using 0.8 ml volume of PBS. In order to measure Notch ligand, the cell-free BAL solution was stored in a freezer at −80 ° C.
フローサイトメトリー
細胞を染色バッファーに懸濁し、抗FcγRII/IIIモノクローナル抗体（mAb）（2.4G2）とインキュベートし、その後抗体で染色した。抗F4/80（BM8）抗体、抗CD11b（M1/70）抗体、抗CD11c（N418）抗体、抗Gr-1（RB6-8C5）抗体、抗CD4（GK1.5）抗体、および抗CD8（53-6.7）抗体は、BioLegend（San Diego, CA）より入手した。7−AADに陽性である細胞を除いた後、105個の細胞の蛍光強度をFACSCanto IIフローサイトメーター（BD Biosciences, CA）で測定し、FACSDiva（BD Biosciences）ソフトウエアで解析した。
Flow cytometry Cells were suspended in staining buffer, incubated with anti-FcγRII / III monoclonal antibody (mAb) (2.4G2), and then stained with antibody. Anti-F4 / 80 (BM8) antibody, anti-CD11b (M1 / 70) antibody, anti-CD11c (N418) antibody, anti-Gr-1 (RB6-8C5) antibody, anti-CD4 (GK1.5) antibody, and anti-CD8 (53 -6.7) The antibody was obtained from BioLegend (San Diego, CA). After removing cells positive for 7-AAD, the fluorescence intensity of 10 5 cells was measured with a FACSCanto II flow cytometer (BD Biosciences, CA) and analyzed with FACSDiva (BD Biosciences) software.
ウェスタンブロッティングおよびブルーネイティブゲル電気泳動法（Blue Native PAGE）
細胞ペレットを、冷却したRIPAバッファー（Wako Pure Chemical Industries）およびプロテアーゼ阻害薬（Roche）中で溶解し、溶解物をSDSローディングダイ中で加熱した。サンプルをSDS-PAGEにより分離して、ブロットを抗Flag抗体（F1804; Sigma-Aldrich）、抗myc抗体（9E10; Santa Cruz）、または抗Ripk3抗体（ウサギポリクローナル抗体; Novus Biologicals, NBP1-77299）とインキュベートした。次いで、それらをペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体（31430; Pierce Biotechnology）またはヤギ抗ウサギIgG抗体（170-6515; BioRad）とインキュベートした。対照として、メンブレンをポリクローナル抗アクチン抗体（A2066; Sigma-Aldrich）およびHRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（170-6515; BioRad）でプローブした。一部の実験では、メンブレンを抗Flag抗体および抗アクチン抗体でブロットした後に、HRP結合抗マウスIgG抗体および抗ウサギIgG抗体でブロットした。バンドはECL Prime Chemiluminescent Substrate（GE Healthcare）およびImageQuant LAS-4000ミニシステム（GE Healthcare）で検出した。ブルーネイティブゲル電気泳動法を、Novex Native PAGE Bis-Tris Gel System（Invitrogen）を用いて、製造業者のプロトコールに従い行った。簡潔に言うと、細胞を1%ジギトニンおよびプロテアーゼ阻害薬（Roche）を含む1x Native PAGEサンプルバッファー（Invitrogen）中で懸濁し、その後氷上で10分間インキュベートした。遠心分離後、25μgの上清を、1.0μLの5% G250サンプル添加剤および10μLの1x Native PAGEサンプルバッファー（Invitrogen）で懸濁した。サンプルを3％〜12％のBis-Tris Native PAGEゲル上にロードし、その後1x Native PAGE Running buffer system（Invitrogen）で電気泳動した。NativeMarkタンパク質スタンダード（Invitrogen）を分子量マーカーとして用いた。ECL prime Chemiluminescent Substrate（GE Healthcare）をメンブレンに添加し、その後Lumino Image Analyzer（GE Healthcare）でメンブレンを解析した。
Western blotting and Blue Native PAGE
The cell pellet was lysed in chilled RIPA buffer (Wako Pure Chemical Industries) and protease inhibitor (Roche) and the lysate was heated in an SDS loading die. Samples were separated by SDS-PAGE and blots with anti-Flag antibody (F1804; Sigma-Aldrich), anti-myc antibody (9E10; Santa Cruz), or anti-Ripk3 antibody (rabbit polyclonal antibody; Novus Biologicals, NBP1-77299) Incubated. They were then incubated with peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (31430; Pierce Biotechnology) or goat anti-rabbit IgG antibody (170-6515; BioRad). As a control, the membrane was probed with a polyclonal anti-actin antibody (A2066; Sigma-Aldrich) and an HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (170-6515; BioRad). In some experiments, membranes were blotted with anti-Flag antibody and anti-actin antibody followed by HRP-conjugated anti-mouse IgG antibody and anti-rabbit IgG antibody. Bands were detected with ECL Prime Chemiluminescent Substrate (GE Healthcare) and ImageQuant LAS-4000 mini system (GE Healthcare). Blue native gel electrophoresis was performed using the Novex Native PAGE Bis-Tris Gel System (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. Briefly, cells were suspended in 1x Native PAGE sample buffer (Invitrogen) containing 1% digitonin and protease inhibitor (Roche) and then incubated on ice for 10 minutes. After centrifugation, 25 μg of supernatant was suspended in 1.0 μL of 5% G250 sample additive and 10 μL of 1x Native PAGE sample buffer (Invitrogen). Samples were loaded on a 3-12% Bis-Tris Native PAGE gel and then electrophoresed on a 1x Native PAGE Running buffer system (Invitrogen). NativeMark protein standard (Invitrogen) was used as a molecular weight marker. ECL prime Chemiluminescent Substrate (GE Healthcare) was added to the membrane, and then the membrane was analyzed with Lumino Image Analyzer (GE Healthcare).
リアルタイムPCR
全RNAを単離し（ReliaPrep RNA Cell Miniprep System, Promega）、cDNAを合成した（0.1μgのRNA）。相対的発現は、サイクル閾値の比較試験を用いて計算した。PCR解析は、プライマーを用いたStepOnePlus（Applied Biosystems）を使用して行った。CypAのmRNAレベルを、内部標準として用いた。
Real-time PCR
Total RNA was isolated (ReliaPrep RNA Cell Miniprep System, Promega) and cDNA was synthesized (0.1 μg RNA). Relative expression was calculated using a cycle threshold comparison test. PCR analysis was performed using StepOnePlus (Applied Biosystems) using primers. CypA mRNA levels were used as an internal standard.
AEIIの精製
肺を、肺動脈を通じて右心室を介して、5mlのPBSで灌流した。1ミリリットルのブタエラスターゼ（4.5U; Roche Diagnostics）を、気管カニューレを通じて注入した。肺葉を静かに気管支から分離し、20%FBSおよび100 U/ml DNAse I（Qiagen）を含むRPMI 1640培地中ですりつぶした。続いて、懸濁液中の細胞を、100-、70-、および40-μｍナイロンメッシュで濾過した。混入している白血球、内皮細胞およびI型肺胞上皮細胞を、ビオチン化抗CD45抗体、抗CD11b抗体、抗CD11c抗体、抗CD31抗体、および抗ポドプラニン抗体（Biolegends）、並びに、ストレプトアビジン常磁性マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて消失させた。
Purification of AEII The lungs were perfused with 5 ml PBS through the pulmonary artery through the right ventricle. One milliliter of porcine elastase (4.5U; Roche Diagnostics) was infused through the tracheal cannula. Lung lobes were gently separated from bronchi and ground in RPMI 1640 medium containing 20% FBS and 100 U / ml DNAse I (Qiagen). Subsequently, the cells in suspension were filtered through 100-, 70-, and 40-μm nylon mesh. Contaminating leukocytes, endothelial cells, and type I alveolar epithelial cells are treated with biotinylated anti-CD45 antibody, anti-CD11b antibody, anti-CD11c antibody, anti-CD31 antibody, and anti-podopranin antibody (Biolegends), and streptavidin paramagnetic micro Disappeared using beads (Miltenyi Biotec).
ヒドロキシプロリンの測定
肺組織中のヒドロキシプロリンは、ヒドロキシプロリンアッセイキット（QuickZyme Hydroxyproline Assay, QuickZyme Biosciences, Leiden）により測定した。ヒドロキシプロリン含量は、他に特に規定がない限り、「肺当たりのμg」で表す。
Measurement of hydroxyproline Hydroxyproline in lung tissue was measured with a hydroxyproline assay kit (QuickZyme Hydroxyproline Assay, QuickZyme Biosciences, Leiden). Hydroxyproline content is expressed in “μg per lung” unless otherwise specified.
共焦点レーザー走査顕微鏡法
GFPタグ付き野生型または変異型SFTPA1で遺伝子導入した293T細胞をスライド上に置き、PBSで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定して、0.3% Triton X-100および3% BSAを含有するPBSで透過処理した。細胞を、抗カルネキシン抗体、抗Rab5抗体、抗RCAS1抗体、または抗COX IV抗体（Cell Signaling Technology）で染色した。PBSで洗浄後、細胞を、Alexa594結合抗ウサギIgG抗体と、1時間、室温で反応させた。サンプルを、DAPIを含むProlong Gold退色防止剤と共に包埋し、共焦点レーザー走査顕微鏡（NIKON, A1R+）により解析した。
Confocal laser scanning microscopy
293T cells transfected with GFP-tagged wild-type or mutant SFTPA1 are placed on a slide, washed twice with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde, and contain 0.3% Triton X-100 and 3% BSA Permeabilized with PBS. Cells were stained with anti-calnexin antibody, anti-Rab5 antibody, anti-RCAS1 antibody, or anti-COX IV antibody (Cell Signaling Technology). After washing with PBS, the cells were reacted with Alexa594-conjugated anti-rabbit IgG antibody for 1 hour at room temperature. Samples were embedded with Prolong Gold antifade containing DAPI and analyzed with a confocal laser scanning microscope (NIKON, A1R +).
ChIPアッセイ
細胞（1×106細胞）を、1％ホルムアルデヒドで、37℃で10分間インキュベートし、その後、架橋されたクロマチンを超音波処理して剪断クロマチンフラグメント（200-1000 bp）にした。超音波処理したクロマチンを抗Rbpj抗体で免疫沈降し、陰性対照を対照抗体で免疫沈降した。免疫複合体を、Protein Aアガロースビーズで回収した。プロテイナーゼKで処理した後、DNAをフェノール/クロロホルム抽出により精製した。リアルタイムPCRを行い、Rbpjの結合するRipk3プロモーターフラグメントを定量した。
ChIP assay Cells (1 × 10 6 cells) were incubated with 1% formaldehyde for 10 minutes at 37 ° C., after which the crosslinked chromatin was sonicated into sheared chromatin fragments (200-1000 bp). Sonicated chromatin was immunoprecipitated with anti-Rbpj antibody and the negative control was immunoprecipitated with control antibody. Immune complexes were recovered with Protein A agarose beads. After treatment with proteinase K, the DNA was purified by phenol / chloroform extraction. Real-time PCR was performed to quantify the Ripk3 promoter fragment to which Rbpj binds.
ELISA
BAL液を、プレート上に4℃で一晩コーティングした。まずビオチン結合抗Dll1抗体、抗Dll4抗体、抗Jagged1抗体、または抗Jagged2抗体を、次いでストレプトアビジン-HRP（eBiosciences）を、当該液と共にインキュベートした。TMB（eBiosciences）の添加後、各ウェルの吸光度を415nmで測定した。
ELISA
BAL fluid was coated on the plate overnight at 4 ° C. First, biotin-conjugated anti-Dll1 antibody, anti-Dll4 antibody, anti-Jagged1 antibody, or anti-Jagged2 antibody was then incubated with the solution, followed by streptavidin-HRP (eBiosciences). After the addition of TMB (eBiosciences), the absorbance of each well was measured at 415 nm.
ルシフェラーゼアッセイ
BAL液の存在下または非存在下に、FuGENE6トランスフェクション試薬（Roche Diagnostics）を用いて、293T細胞にNotch1全長マウスcDNAおよびTP-1レポーター遺伝子を遺伝子導入した。遺伝子導入の24時間後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega, Madison, USA）により、製造業者のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性を、pRL-TKのウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。値は全て、3連で行い、かつ、少なくとも4回繰り返した実験から得た。
Luciferase assay
In the presence or absence of BAL fluid, Notch1 full-length mouse cDNA and TP-1 reporter gene were transfected into 293T cells using FuGENE6 transfection reagent (Roche Diagnostics). Twenty-four hours after gene transfer, luciferase activity was measured by a dual luciferase assay system (Promega, Madison, USA) according to the manufacturer's protocol. Firefly luciferase activity was normalized to the Renilla luciferase activity of pRL-TK. All values were obtained from experiments performed in triplicate and repeated at least four times.
組織診断
パラフィン包埋切片を、Massonのトリクローム染色に用いた。
Histological diagnosis Paraffin-embedded sections were used for Masson's trichrome staining.
インフルエンザ感染
マウスに麻酔をかけ、20μlの滅菌PBS中のインフルエンザウイルスを鼻腔内に接種した（１個体あたり104PFU）。ウイルス力価は、既報のとおり測定した（Kashima, Y. et al., Vaccine 27, 7402-7408 (2009).）。感染したマウスの生存は、毎日観察した。一部の実験では、マウスに対し、気管内にSP-A（25 μg/50 μl/投与）を処理した。処理は、IAV感染の1日前に始め、その後2日間の間隔で行った（0日目：感染、−1、1、3、5、7日目）。他の実験では、マウスに対し、静脈内に抗ST2抗体（R&D Systems）（100μg/マウス）を、同じスケジュールで処理した（0日目：感染、−1、1、3、5、7日目）。
Influenza-infected mice were anesthetized and inoculated intranasally with influenza virus in 20 μl of sterile PBS (10 4 PFU per animal). Virus titer was measured as previously reported (Kashima, Y. et al., Vaccine 27, 7402-7408 (2009).). Survival of infected mice was observed daily. In some experiments, mice were treated with SP-A (25 μg / 50 μl / dose) intratracheally. Treatment was started 1 day before IAV infection and then at 2-day intervals (Day 0: infection, -1, 1, 3, 5, 7 days). In other experiments, mice were treated with anti-ST2 antibody (R & D Systems) (100 μg / mouse) intravenously on the same schedule (Day 0: infection, days -1, 1, 3, 5, 7). ).
アデノウイルス感染
サイトメガロウイルスプロモーター下にマウスRipk3を有する、E1欠失組換えアデノウイルスベクターを作成して精製した。対照ウイルスとしては、Ripk3を含まないウイルスを用いた。IAV感染の1日後に、組換えアデノウイルスを気管内に109 pfu/マウスで注入し、マウスに感染させた。
Adenovirus infection An E1-deleted recombinant adenovirus vector carrying mouse Ripk3 under the cytomegalovirus promoter was constructed and purified. As a control virus, a virus not containing Ripk3 was used. One day after IAV infection, recombinant adenovirus was injected intratracheally at 10 9 pfu / mouse to infect mice.
統計
群間差の統計学的有意性を、独立、両側t検定、パラメトリックダネット検定、またはログランク検定により評価した。p値<0.05を、有意であると判断した。
Statistics Statistical significance of differences between groups was assessed by independent, two-tailed t test, parametric Dunnett test, or log rank test. A p value <0.05 was considered significant.
２．結果
患者病歴および遺伝子解析
近親婚をした1つの日本人家族において、2人の息子が24歳と27歳の年齢でIPF（特発性肺線維症）と診断され、それぞれ32歳と34歳で死亡した（図１ａ）。末の弟もまた、40歳の年齢で呼吸困難を発症し始めた。胸部Ｘ線は両側の網状陰影を示し、上の兄達のコンピュータ断層撮影解析は、末梢領域および胸膜下領域において、引性気管支拡張および蜂巣嚢胞（honeycomb cyst）を伴う異常な網目を示した（図１ｂ）。当該家族の血縁関係と、彼らの両親に肺線維症の臨床徴候がなかったことを考えると、常染色体劣性遺伝疾患発症性の変異が疑われた。ホモ接合性マッピング、連鎖解析、およびエキソームリシーケンス法を行い、2人の上の兄の間で共通する15のまれな変異を発見し、このうち、2人に共通するホモ接合領域に位置するSFTPA1のホモ接合型ミスセンス変異（T622C）を発見した（図１ｃ）。この変異は、1000人ゲノムプロジェクトおよびExome Aggregation Consortiumを含むいくつかのヒト遺伝子変異データベースには存在しなかった。両親が共に検出された変異に対しヘテロ接合性であるため、当該変異は、常染色体劣性遺伝との仮定のもと、当該疾病と同時分離を示した。この変異は、208番目のアミノ酸をチロシンからヒスチジンに変化させており（図１ｃ）、糖鎖認識部位中に存在した（図１ｃ）。この領域は、8つの種で保存されている（図１ｄ）。
2. Results Patient History and Genetic Analysis In a Japanese family with a close relative, two sons were diagnosed with idiopathic pulmonary fibrosis at the age of 24 and 27 and died at 32 and 34, respectively. (FIG. 1a). The youngest brother also began to develop dyspnea at the age of 40. Chest X-rays showed bilateral reticular shadows, and the computed tomographic analysis of the older brothers showed abnormal meshes with pulling bronchodilation and honeycomb cysts in the peripheral and subpleural regions ( FIG. 1b). Given the relatives of the family and the absence of clinical signs of pulmonary fibrosis in their parents, an autosomal recessive inherited mutation was suspected. Homozygous mapping, linkage analysis, and exome resequencing were performed to find 15 rare mutations common between the two older brothers, of which they were located in the homozygous region common to the two SFTPA1 homozygous missense mutation (T622C) was discovered (FIG. 1c). This mutation was not present in several human genetic mutation databases including the 1000 Genome Project and the Exome Aggregation Consortium. Because both parents were heterozygous for the detected mutation, the mutation showed simultaneous segregation with the disease under the assumption of autosomal recessive inheritance. This mutation changed the 208th amino acid from tyrosine to histidine (FIG. 1c) and was present in the sugar chain recognition site (FIG. 1c). This region is conserved in 8 species (FIG. 1d).
SFTPA1の変異はSFTPA1の分泌を妨げる
SFTPA1タンパク質の発現および分泌における、SFTPA1の当該変異の影響を評価するために、mycタグ付きの野生型または変異型SFTPA1をA549細胞に形質導入して、細胞ペレットおよび上清中のSFTPA1の発現を調べた（図２ａ）。細胞ペレット中の変異型SFTPA1の発現は、野生型SFTPA1と同等であった。しかしながら、野生型SFTPA1は上清中に検出されたが、変異型SFTPA1は検出されず、このことは、SFTPA1の変異がSFTPA1の分泌を妨げることを示している。次に、ブルーネイティブゲル電気泳動法により、野生型および変異型SFTPA1タンパク質を調べた（図２ｂ）。変異型SFTPA1タンパク質は細胞内で凝集体を作り、一方、野生型SFTPA1の大半はモノマーとして存在していた。野生型および変異型SFTPA1の局在性を評価するために、GFPタグ付き野生型または変異型SFTPA1を遺伝子導入したA549細胞を、オルガネラマーカーで染色した（データ不掲載）。野生型SFTPA1は斑点模様を示したが、変異型SFTPA1を遺伝子導入した細胞では、斑点模様は検出されなかった。野生型SFTPA1はERおよびゴルジ体に局在し、ミトコンドリアおよびエンドソームには存在しなかった。対照的に、変異型SFTPA1はERに局在し、ゴルジ体、ミトコンドリア、およびエンドソームには存在しなかった。これらのデータは、ERからゴルジ体への変異型SFTPA1の輸送が障害されていることを示唆している。
Mutations in SFTPA1 prevent SFTPA1 secretion
To assess the effect of the SFTPA1 mutation on SFTPA1 protein expression and secretion, transfect wild-type or mutant SFTPA1 with a myc tag into A549 cells and express SFTPA1 expression in cell pellets and supernatants. Investigated (Figure 2a). The expression of mutant SFTPA1 in the cell pellet was equivalent to wild type SFTPA1. However, wild-type SFTPA1 was detected in the supernatant, but mutant SFTPA1 was not detected, indicating that mutations in SFTPA1 prevent SFTPA1 secretion. Next, wild type and mutant SFTPA1 proteins were examined by blue native gel electrophoresis (FIG. 2b). Mutant SFTPA1 protein formed aggregates in the cell, while most of wild-type SFTPA1 was present as a monomer. In order to evaluate the localization of wild-type and mutant SFTPA1, A549 cells transfected with wild-type or mutant SFTPA1 with GFP tag were stained with an organelle marker (data not shown). Wild-type SFTPA1 showed a speckled pattern, but no speckled pattern was detected in cells transfected with mutant SFTPA1. Wild-type SFTPA1 was localized in the ER and Golgi, but not in mitochondria and endosomes. In contrast, mutant SFTPA1 was localized to the ER and absent from the Golgi apparatus, mitochondria, and endosomes. These data suggest that the transport of mutant SFTPA1 from the ER to the Golgi apparatus is impaired.
SFTPA1はSFTPA2と複合体を形成するため、変異型SFTPA1とSFTPA2との相互作用を評価した。Flagタグ付きの野生型SFTPA1またはSFTPA2を、mycタグ付きの野生型または変異型SFTPA1と共に導入し、細胞ペレットまたは上清中のこれらの会合を、抗Flag抗体による免疫沈降および抗myc抗体によるブロッティングによって評価した（図２ｃ）。既報の通り、野生型SFTPA1タンパク質は細胞ペレットおよび上清中においてSFTPA2と複合体を形成した。変異型SFTPA1タンパク質は細胞ペレット中で、野生型SFTPA1よりも低効率でSFTPA2と複合体を形成し、変異型SFTPA1-SFTPA2複合体は上清中には検出されなかった（図２ｃ）。 Since SFTPA1 forms a complex with SFTPA2, the interaction between mutant SFTPA1 and SFTPA2 was evaluated. Wild-type SFTPA1 or SFTPA2 with Flag tag is introduced together with wild-type or mutant SFTPA1 with myc tag, and their association in cell pellets or supernatants by immunoprecipitation with anti-Flag antibody and blotting with anti-myc antibody Evaluation was made (FIG. 2c). As previously reported, wild-type SFTPA1 protein formed a complex with SFTPA2 in the cell pellet and supernatant. The mutant SFTPA1 protein formed a complex with SFTPA2 in the cell pellet at a lower efficiency than the wild type SFTPA1, and the mutant SFTPA1-SFTPA2 complex was not detected in the supernatant (FIG. 2c).
SFTPA1に変異を有するマウスは自発的に肺線維症を発症する
当該家族のSFTPA1の変異が実際にIPF発症の一因であったのかを調べるため、マウス遺伝子Sftpa1に同じ変異（Y208H）を有するマウス（Sftpa1-KI）を作製した（図８ａ）。変異型SFTPA1を含むコンストラクトの相同組換えを、サザンブロッティングにより確認した（図８ｂ）。
Mice with mutation in SFTPA1 spontaneously develop pulmonary fibrosis Mice with the same mutation (Y208H) in mouse gene Sftpa1 to investigate whether the SFTPA1 mutation in the family actually contributed to the development of IPF (Sftpa1-KI) was produced (FIG. 8a). Homologous recombination of the construct containing mutant SFTPA1 was confirmed by Southern blotting (FIG. 8b).
最初に、Sftpa1-KIマウスにおけるSftpa1の分泌を評価した。Sftpa1-KIマウス由来の肺組織は、対照マウスと同等レベルでSftpa1を発現した（図３ａ）。一方、Sftpa1-KIマウスのBAL液はSftpa1を含んでいなかったが、野生型マウスのBALではSftpa1の高生産がみられた（図３ａ）。これらの知見は、遺伝子導入A459細胞において変異ヒトSFTPA1の分泌が障害されたことと一致している。 First, Sftpa1 secretion in Sftpa1-KI mice was evaluated. Lung tissue from Sftpa1-KI mice expressed Sftpa1 at the same level as control mice (FIG. 3a). On the other hand, the BAL solution of Sftpa1-KI mice did not contain Sftpa1, but high production of Sftpa1 was observed in BAL of wild-type mice (FIG. 3a). These findings are consistent with impaired secretion of mutant human SFTPA1 in transgenic A459 cells.
Sftpa1-KIマウスは、8〜30週齢では健常であるが、およそ40週齢で死亡し始める（図３ｂ）。Sftpa1-KIマウスの肺切片は、30週齢において細胞浸潤および線維性領域の増加を示す（図３ｃ）。当該週齢において、Sftpa1-KIマウスの肺のコラーゲン量は対照マウスより多かった（図３ｄ）。これらのデータは、マウスSftpa1における当該変異が自発的に肺線維症を引き起こすことを示している。これは、当該家族で見られたヒトSFTPA1における対応する変異がIPFの原因となる変異であることを、強く示唆している。 Sftpa1-KI mice are healthy at 8-30 weeks of age, but begin to die at approximately 40 weeks of age (FIG. 3b). Lung sections of Sftpa1-KI mice show cell infiltration and increased fibrotic area at 30 weeks of age (FIG. 3c). At the age of the week, the amount of collagen in the lungs of Sftpa1-KI mice was higher than that in control mice (FIG. 3d). These data indicate that the mutation in mouse Sftpa1 spontaneously causes pulmonary fibrosis. This strongly suggests that the corresponding mutation in human SFTPA1 found in the family is a mutation responsible for IPF.
インフルエンザウイルス感染がSftpa1-KIマウスにおける肺線維症の進行を早める
肺感染症がIPF患者の臨床症状を悪化させることが知られているため、Sftpa1-KIマウスにおける肺線維症の分子メカニズムを評価する目的で、当該マウスにインフルエンザウイルスA（IAV）を感染させた。対照マウスおよびSftpa1-KIマウスはいずれも、IAV感染の3〜12日後に肺において同様のウイルス力価を示し（図９ａ）、最終的に感染後12日目に当該ウイルスを根絶させた（図９ａ）。このことは、Sftpa1変異がIAV感染に対する易感染性に影響しないことを示している。しかしながら、Sftpa1-KIマウスは感染後13日目から死亡し始め、感染後28日目までに当該マウスの70%が死亡した（図４ａ）。対照マウスおよびSftpa1-KIマウスは、感染後3日目および7日目に、同様の総細胞数を有し（図４ｂ）、感染後7日目にT細胞、B細胞および好中球について同様の出現頻度（frequency）を有した（図９ｂ）。IAV感染Sftpa1-KIマウスの肺病理組織診断では、感染後10日目に細胞浸潤を伴う肺線維症を示し、一方対照の肺は肺線維症の徴候をほとんど示さなかった（図４ｃ）。肺コラーゲン量は、対照マウスよりもSftpa1-KIマウスにおいて多かった（図４ｄ）。
Influenza virus infection accelerates the progression of pulmonary fibrosis in Sftpa1-KI mice Evaluate the molecular mechanism of pulmonary fibrosis in Sftpa1-KI mice because pulmonary infection is known to exacerbate clinical symptoms in IPF patients For the purpose, the mice were infected with influenza virus A (IAV). Both control and Sftpa1-KI mice showed similar virus titers in the lungs 3-12 days after IAV infection (FIG. 9a) and eventually eradicated the virus 12 days after infection (FIG. 9). 9a). This indicates that the Sftpa1 mutation does not affect the susceptibility to IAV infection. However, Sftpa1-KI mice began to die on day 13 after infection, and 70% of the mice died by day 28 after infection (FIG. 4a). Control mice and Sftpa1-KI mice had similar total cell numbers on days 3 and 7 after infection (FIG. 4b), and similar for T cells, B cells and neutrophils on day 7 after infection. Frequency (Figure 9b). Lung histopathology of IAV infected Sftpa1-KI mice showed pulmonary fibrosis with cell infiltration 10 days after infection, whereas the control lung showed little signs of pulmonary fibrosis (FIG. 4c). Lung collagen levels were higher in Sftpa1-KI mice than in control mice (FIG. 4d).
Sftpa1の当該変異はSftpa1の分泌を障害するため、細胞外Sftpa1の欠如が肺線維症の原因である可能性がある。そこで、IAVに感染したSftpa1-KIマウスに対し、ヒトSP-Aを気管内投与した。しかしながら、SP-Aによる処理によって肺線維症は回復せず（図１０）、このことは、Sftpa1-KIマウスの肺線維症は細胞外SP-Aの欠如に起因しないことを示唆している。 Since the mutation in Sftpa1 impairs Sftpa1 secretion, lack of extracellular Sftpa1 may be responsible for pulmonary fibrosis. Therefore, human SP-A was intratracheally administered to Sftpa1-KI mice infected with IAV. However, treatment with SP-A did not restore pulmonary fibrosis (FIG. 10), suggesting that pulmonary fibrosis in Sftpa1-KI mice is not due to lack of extracellular SP-A.
インフルエンザウイルス感染がSftpa1-KIマウスにおける肺線維症の進行を早める
上皮細胞死が肺線維症に関連するため、Sftpa1-KIマウスのAEII細胞死を調べた。Sftpa1-KIマウスにおいて、IAVによる感染後、より多くのAEII細胞が7AADに陽性であった（図５ａ）。Sftpa1-KIマウスのAEII細胞における活性型カスパーゼ3の発現は、野生型と同等であり（図５ｂ）、このことは、アポトーシスがSftpa1-KIマウスにおける細胞死の増加に関連しないことを示唆した。次に、当該細胞死へのネクロプトーシスの寄与を調べることを試みた。Sftpa1-KIマウスをRipk3欠損マウスと交配し（Sftpa1-KI;Ripk3-/-）、Sftpa1-KI;Ripk3-/-マウスにIAVを感染させた。60%を超える対照Sftpa1-KIマウスがIAV感染後に死亡したが、Sftpa1-KI;Ripk3-/-マウスは約90%がIAV感染後も生存した（図５ｃ）。Sftpa1-KI;Ripk3-/-マウスにおいて、IAV感染後の7AAD陽性のAEII細胞数は、野生型と同等であった（図５ｄ）。その上、Sftpa1-KI;Ripk3-/-マウスは、少なくとも48週齢までは、自発的に肺線維症を発症しなかった（図５ｅ）。これらのデータは、ネクロプトーシスの増加がSftpa1-KIマウスの死の原因であることを示唆している。ネクロプトーシスを起こした細胞から放出される損傷関連分子パターン（DAMP）の1つがIL-33であることから、IAVに感染した野生型またはSftpa1-KIマウスを抗ST2抗体で処理した。抗ST2抗体による処理は、Sftpa1-KIマウスの生存を部分的に助け（図１１）、このことは、IL-33が、ネクロプトーシスを起こしたAEII細胞から放出されたDAMPの1つであり、肺線維症に関係していることを示唆している。
Influenza virus infection accelerates the progression of pulmonary fibrosis in Sftpa1-KI mice Because epithelial cell death is associated with pulmonary fibrosis, AEII cell death in Sftpa1-KI mice was examined. In Sftpa1-KI mice, more AEII cells were positive for 7AAD after infection with IAV (FIG. 5a). Expression of active caspase 3 in AEII cells of Sftpa1-KI mice is comparable to wild type (FIG. 5b), suggesting that apoptosis is not associated with increased cell death in Sftpa1-KI mice. Next, an attempt was made to examine the contribution of necroptosis to the cell death. Sftpa1-KI mice were mated with Ripk3-deficient mice (Sftpa1-KI; Ripk3-/-), and Sftpa1-KI; Ripk3-/-mice were infected with IAV. More than 60% of control Sftpa1-KI mice died after IAV infection, while about 90% of Sftpa1-KI; Ripk3-/-mice survived IAV infection (FIG. 5c). In Sftpa1-KI; Ripk3-/-mice, the number of 7AAD-positive AEII cells after IAV infection was equivalent to that of the wild type (FIG. 5d). Moreover, Sftpa1-KI; Ripk3-/ − mice did not spontaneously develop pulmonary fibrosis until at least 48 weeks of age (FIG. 5e). These data suggest that increased necroptosis is responsible for the death of Sftpa1-KI mice. Since one of the damage-related molecular patterns (DAMP) released from necroptotic cells is IL-33, wild type or Sftpa1-KI mice infected with IAV were treated with anti-ST2 antibody. Treatment with anti-ST2 antibody partially helped Sftpa1-KI mice survive (Figure 11), which is one of the DAMPs that IL-33 was released from necroptotic AEII cells. , Suggesting that it is related to pulmonary fibrosis.
AEII由来の可溶性Dll1が、IAV感染後のSftpa1-KIマウスの肺線維症の原因である
DNAマイクロアレイを用いて、野生型のAEII細胞と変異型Sftpa1を有するAEII細胞との間で示差的に発現される遺伝子を同定した（データ不掲載）。インフルエンザウイルスに感染したSftpa1-KIマウス由来のAEII細胞において、Dtx1およびHes1の発現の増加が見られ、このことは、Notchシグナル伝達がSftpa1-KIマウスのAEII細胞で活性化していることを示唆している。Sftpa1-KIマウスにおいて、AEII細胞での標準的Notch標的遺伝子であるDtx1およびHes1の発現が野生型マウスより高いことを、リアルタイムPCRにより確認した（図６ａ）。Notchシグナル伝達の影響を評価するために、Rbpjf/f-SPC-Creマウスと交配したSftpa1-KIマウス（Sftpa1-KI;Rbpj-/-）を構築し、Sftpa1-KI;Rbpj-/-マウスおよびSftpa1-KIマウスにおける、IAV感染後のマウスの生存を比較した。Sftpa1-KI;Rbpj-/-マウスは、Sftpa1-KIマウスと比較して、IAV感染後の生存が改善されており、このことは、Notchシグナル伝達の増強が、Sftpa1変異が引き起こす肺線維症の進行の原因であることを示唆している（図６ｂ）。
Soluble Dll1 from AEII is responsible for pulmonary fibrosis in Sftpa1-KI mice after IAV infection
A DNA microarray was used to identify genes that are differentially expressed between wild-type AEII cells and AEII cells with mutant Sftpa1 (data not shown). Increased expression of Dtx1 and Hes1 was observed in AEII cells from Sftpa1-KI mice infected with influenza virus, suggesting that Notch signaling was activated in AEII cells in Sftpa1-KI mice. ing. In Sftpa1-KI mice, it was confirmed by real-time PCR that the expression of Dtx1 and Hes1, which are standard Notch target genes, in AEII cells was higher than in wild-type mice (FIG. 6a). To evaluate the effects of Notch signaling, we constructed Sftpa1-KI mice (Sftpa1-KI; Rbpj-/-) mated with Rbpjf / f-SPC-Cre mice, Sftpa1-KI; Rbpj-/-mice and The survival of mice after IAV infection in Sftpa1-KI mice was compared. Sftpa1-KI; Rbpj-/-mice have improved survival after IAV infection compared to Sftpa1-KI mice, indicating that enhanced Notch signaling is associated with pulmonary fibrosis caused by Sftpa1 mutations. This suggests that it is the cause of progression (Fig. 6b).
Notchシグナル伝達は、NotchとNotchリガンドとの相互作用により開始されるため、IAV感染したSftpa1-KIマウスおよび野生型マウスのBAL液中の、可溶性Notchリガンドのレベルを評価した。Sftpa1-KI;Rbpj-/-マウスにおいて、BAL液中の可溶性Dll1のレベルは、対照マウスと比較して高かった（図６ｃ）。Sftpa1-KIマウスの可溶性Dll4のレベルは、野生型マウスと同等であり、BAL液中の可溶性Jagged1およびJagged2は、IAVに感染したSftpa1-KIまたは対照マウスのいずれにおいても検出されなかった（図６ｃ）。可溶性 Dll1はADAM10またはADAM12により生じることから、IAVに感染した野生型およびSftpa1-KIマウスにおけるAEII細胞でのAdam10およびAdam12の発現を調べた。AEII細胞において、Adam10およびAdam12の発現はいずれも、野生型マウスと比較してSftpa1-KIマウスにおいて増加していた（図１２）。さらに、Notchレポーターアッセイは、Sftpa1-KIマウスのBAL液が野生型マウスよりも強いNotch刺激活性を有することを示した（図６ｄ）。 Since Notch signaling is initiated by the interaction of Notch and Notch ligand, the level of soluble Notch ligand in BAL fluid of IAV infected Sftpa1-KI mice and wild type mice was evaluated. In Sftpa1-KI; Rbpj − / − mice, the level of soluble Dll1 in BAL fluid was higher compared to control mice (FIG. 6c). The level of soluble Dll4 in Sftpa1-KI mice was comparable to wild type mice, and soluble Jagged1 and Jagged2 in BAL fluid were not detected in either Sftpa1-KI or control mice infected with IAV (FIG. 6c). ). Since soluble Dll1 is produced by ADAM10 or ADAM12, the expression of Adam10 and Adam12 in AEII cells in wild type and Sftpa1-KI mice infected with IAV was examined. In AEII cells, both Adam10 and Adam12 expression was increased in Sftpa1-KI mice compared to wild type mice (FIG. 12). Furthermore, Notch reporter assay showed that the BAL fluid of Sftpa1-KI mice has stronger Notch stimulating activity than wild type mice (FIG. 6d).
AEII細胞においてDll1を欠失しているSftpa1-KIマウス（Sftpa1-KI;Dll1-/-）を用いて、肺線維症の進行に対するBAL液中のDll1の寄与を確認した。Sftpa1-KI;Dll1-/-マウスは、IAV感染後に死亡率の低下を示した（図６ｅ）。これらのデータは、Notchシグナル伝達増強後の、AEII細胞におけるDll1の発現の増加が、Sftpa1-KIマウスの肺線維症の原因であることを示唆している。 Sftpa1-KI mice lacking Dll1 in AEII cells (Sftpa1-KI; Dll1-/-) were used to confirm the contribution of Dll1 in BAL fluid to the progression of pulmonary fibrosis. Sftpa1-KI; Dll1-/-mice showed reduced mortality after IAV infection (FIG. 6e). These data suggest that increased Dll1 expression in AEII cells after enhanced Notch signaling is responsible for pulmonary fibrosis in Sftpa1-KI mice.
Ripk3は、Notchシグナル伝達により制御される
Notchとネクロプトーシスとの関連を解析するために、IAV感染後のAEII細胞におけるRipk3の発現を評価した。Ripk3の発現は、IAVに感染したSftpa1-KIマウス由来のAEII細胞において、IAVに感染した野生型マウス由来の細胞よりもはるかに高く、AEII細胞におけるRbpjの欠失は、Sftpa1欠損が引き起こすRipk3の高発現を低下させた（図７ａ）。Ripk3遺伝子のプロモーター領域に4つの推定Rbpj結合部位が存在することから、Rbpjが直接Ripk3の発現を制御するかどうかを、ChIPアッセイを用いて調べた。ChIPアッセイにより、Ripk3のプロモーター領域（−1344から−1333）にRbpjが直接結合していることが示された（図７ｂ）。
Ripk3 is regulated by Notch signaling
To analyze the association between Notch and necroptosis, the expression of Ripk3 in AEII cells after IAV infection was evaluated. Ripk3 expression is much higher in AEII cells from Sftpa1-KI mice infected with IAV than in wild-type mice infected with IAV, and the deletion of Rbpj in AEII cells is caused by Sftpa1 deficiency High expression was reduced (FIG. 7a). Since there are four putative Rbpj binding sites in the promoter region of Ripk3 gene, whether or not Rbpj directly regulates Ripk3 expression was examined using a ChIP assay. ChIP assay showed that Rbpj was directly bound to the promoter region of Ripk3 (-1344 to -1333) (Fig. 7b).
最後に、Rbpj仲介Ripk3発現が、Sftpa1-KIマウスの肺線維症の原因であるかどうかを解析した。Ripk3をコードするアデノウイルスベクターを構築し、IAVに感染したSftpa1-KI;Rbpj-/-マウスの気管内にRipk3−アデノウイルスを感染させた。Ripk3−アデノウイルスの感染は、対照ウイルスを感染させたマウスと比較して、Sftpa1-KI;Rbpj-/-マウスの生存を悪化させ（図７ｃ）、このことは、Notch仲介Ripk3発現がSftpa1-KIマウスの肺線維症の原因であることを示している。 Finally, we analyzed whether Rbpj-mediated Ripk3 expression is responsible for pulmonary fibrosis in Sftpa1-KI mice. An adenovirus vector encoding Ripk3 was constructed, and Ripk3-adenovirus was infected into the trachea of Sftpa1-KI; Rbpj − / − mice infected with IAV. Ripk3-Adenovirus infection exacerbated the survival of Sftpa1-KI; Rbpj − / − mice compared to mice infected with control virus (FIG. 7c), indicating that Notch-mediated Ripk3 expression was Sftpa1- It shows that it is the cause of pulmonary fibrosis in KI mice.
Claims (15)
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物に候補物質を投与すること、および
前記哺乳動物の前記候補物質への応答を評価すること、
を含む方法。 A screening method for a therapeutic agent for pulmonary fibrosis, comprising:
Administering a candidate substance to a non-human mammal expressing SFTPA1 (Y208H), and evaluating the response of the mammal to the candidate substance,
Including methods.
SFTPA1（Y208H）を発現する細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および
前記細胞のNotchシグナルまたはネクロプトーシスを評価すること
を含む方法。 A screening method for a therapeutic agent for pulmonary fibrosis, comprising:
Contacting a cell expressing SFTPA1 (Y208H) with a candidate substance in vitro, and assessing Notch signal or necroptosis of said cell.
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