JP6323876B2 - Knock-in mouse - Google Patents
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Description
本発明は、生理的な範囲での遺伝子発現のもとでアルツハイマー病を発症するノックインマウスに関する。 The present invention relates to a knock-in mouse that develops Alzheimer's disease under gene expression in a physiological range.
従来、アルツハイマー病は、アミロイドβタンパク質が線維化して蓄積し、老人斑を形成することにより発症すると考えられていた。アミロイドβは、６９５個又は７７０個のアミノ酸残基からなるアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の一部がセクレターゼにより切り出されて生成される約４０アミノ酸残基からなる凝集性の高いペプチドである。しかし、近年では、老人斑の形成がアルツハイマー病の原因ではなく、アミロイドβタンパク質のオリゴマーがアルツハイマーの真の病因であるとする仮説が注目されている（例えば非特許文献１等を参照）。 Conventionally, Alzheimer's disease was thought to develop when amyloid β protein fibrillates and accumulates to form senile plaques. Amyloid β is a highly aggregated peptide consisting of about 40 amino acid residues produced by excising a part of amyloid precursor protein (APP) consisting of 695 or 770 amino acid residues with secretase. In recent years, however, the hypothesis that senile plaque formation is not the cause of Alzheimer's disease, and that the oligomer of amyloid β protein is the true etiology of Alzheimer's (for example, see Non-patent Document 1).
本発明者らは、アミロイドβタンパク質のオリゴマー形成が促進される変異を有するタイプのアルツハイマー病患者発見し、これを大阪変異と名付けた（例えば非特許文献２を参照）。大阪変異はアミノ酸４２残基又は４０残基からなるアミロイドβタンパク質の第２２番のグルタミン酸残基が欠失される変異であり、この変異によってアミロイドβタンパク質の線維化が起こりにくくなり、オリゴマー形成が促進されると考えられている。 The present inventors have discovered a type of Alzheimer's disease patient having a mutation that promotes oligomer formation of amyloid β protein, and named this Osaka mutation (see, for example, Non-Patent Document 2). The Osaka mutation is a mutation in which the No. 22 glutamic acid residue of amyloid β protein consisting of 42 or 40 amino acids is deleted. This mutation makes fibrosis of the amyloid β protein less likely to occur and oligomer formation occurs. It is thought to be promoted.
認知症の主な原因とされているアルツハイマー病患者の増加は、近年、大きな社会的関心事となっており、その治療薬や治療方法の早期の確立が望まれている。特定の疾患の治療薬や治療方法の検討には、その疾患のモデル動物を用いて解析が行われるのが一般的である。そこで本発明者らは、大阪変異を有するヒト型変異ＡＰＰ遺伝子を導入して、大阪変異を有するヒト型アミロイドβタンパク質を過剰に発現するトランスジェニックマウスを作製した。しかし、トランスジェニックマウスにより得られる結果は、導入された遺伝子の過剰発現又は外来遺伝子を導入したことにより生じるアーチファクトである可能性を否定できない。更に、ヒト型のＡＰＰ遺伝子がマウスに導入されているため、マウスにおいてヒト型のアミロイドβタンパク質が発現し、異種間相互作用を否定できず正確に病態が反映されていない可能性があった。 The increase in Alzheimer's disease patients, the main cause of dementia, has become a major social concern in recent years, and early establishment of therapeutic agents and treatment methods is desired. In general, analysis of a therapeutic drug or a treatment method for a specific disease is performed using a model animal of the disease. Accordingly, the present inventors introduced a human mutant APP gene having an Osaka mutation to produce a transgenic mouse that overexpresses the human amyloid β protein having an Osaka mutation. However, it cannot be denied that the result obtained by the transgenic mouse may be an overexpression of the introduced gene or an artifact caused by introducing a foreign gene. Furthermore, since the human-type APP gene has been introduced into the mouse, human-type amyloid β protein is expressed in the mouse, and there is a possibility that the interaction between different species cannot be denied and the disease state is not accurately reflected.
このような異種間相互作用の問題は、マウスにおいてマウス型変異アミロイドβタンパク質を生成するアルツハイマー病モデルを作製することにより回避することができる。しかし、従来、マウス型のアミロイドβタンパク質はヒト型とは異なる挙動を示すと一般的に考えられていた。アミロイドβタンパク質は、ヒト型とマウス型では３アミノ酸残基の相違があり、このアミノ酸残基の違いによりアミロイドβタンパク質の蓄積が生じにくいとする実験結果が報告されている（例えば非特許文献３を参照）。また、通常はヒトに対する治療薬や治療方法を検討するためにトランスジェニック動物を利用することから、ヒトの遺伝子を導入するのが当然と理解されており、敢えてマウスにマウス型の変異アミロイドβタンパク質をコードする遺伝子を導入してアルツハイマー病モデルを作製することは検討されていなかった。従って、ヒト遺伝子由来のタンパク質を持たないマウス型遺伝情報、又はマウス型異常たんぱく質単独でのアルツハイマー病モデルマウスは報告なされていないのが現状であった。 Such a problem of cross-species interaction can be avoided by creating an Alzheimer's disease model that produces mouse-type mutant amyloid β protein in mice. However, conventionally, it was generally considered that mouse-type amyloid β protein behaved differently from human-type. The amyloid β protein has 3 amino acid residue differences between the human type and the mouse type, and experimental results have been reported that accumulation of amyloid β protein is less likely to occur due to this amino acid residue difference (for example, Non-Patent Document 3). See). In addition, it is understood that it is natural to introduce a human gene because transgenic animals are usually used to examine therapeutic agents and treatment methods for humans, and mouse-type mutant amyloid β protein is intentionally introduced into mice. It has not been studied to create an Alzheimer's disease model by introducing a gene encoding. Accordingly, there has been no report of mouse-type genetic information having no human gene-derived protein or an Alzheimer's disease model mouse with a mouse-type abnormal protein alone.
本発明は、生理的な範囲での遺伝子発現のもとで大阪変異を有する変異型アミロイドβタンパク質を生合成するノックインマウスを提供することを主な目的とする。更に、本発明は、当該ノックインマウスを使用したアルツハイマー病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法、ならびにアルツハイマー病の予防及び／又は治療薬の薬効評価方法を提供することを更なる目的とする。 The main object of the present invention is to provide a knock-in mouse that biosynthesizes a mutant amyloid β protein having an Osaka mutation under gene expression in a physiological range. Furthermore, it is a further object of the present invention to provide a method for screening a drug for preventing and / or treating Alzheimer's disease using the knock-in mouse, and a method for evaluating the efficacy of a drug for preventing and / or treating Alzheimer's disease.
上述のように、従来、マウス型アミロイドβタンパク質はヒト型アミロイドβタンパク質とは性質が異なるためにアルツハイマー病の原因となり得ないというのが共通の認識とされていた。しかし、本発明者らが鋭意検討を行った結果、第２２番のグルタミン酸が欠失大阪変異を有するマウス型アミロイドβタンパク質をコードする変異ＡＰＰ遺伝子を用いて作製されたノックインマウスでは、これまでの認識に反してアルツハイマー病を発症することを見出した。更に、病理学的及び行動学的な観点より、このノックインマウスがヒトの大阪変異型のアルツハイマー病の症状が忠実に再現されていることが確認された。本発明は、このような知見に基づいて更に研究を重ねた結果完成されたものである。 As described above, conventionally, it has been commonly recognized that mouse-type amyloid β protein cannot cause Alzheimer's disease because it has different properties from human-type amyloid β protein. However, as a result of intensive studies by the present inventors, the knock-in mouse prepared using the mutant APP gene encoding the mouse amyloid β protein having the Osaka mutation deficient in the 22nd glutamic acid, Contrary to recognition, we found that Alzheimer's disease develops. Furthermore, from a pathological and behavioral viewpoint, it was confirmed that this knock-in mouse faithfully reproduced the symptoms of human Osaka mutant Alzheimer's disease. The present invention has been completed as a result of further research based on such knowledge.
即ち、本発明は下記に掲げるノックインマウス、当該ノックインマウスを利用したアルツハイマー病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法、アルツハイマー病の予防及び／又は治療薬の薬効評価方法などを提供する。
項１． 下記（ａ）又は（ｂ）に示される変異アミロイド前駆体タンパク質（変異ＡＰＰ）遺伝子がノックインされており、且つ、当該変異ＡＰＰ遺伝子をホモで有するノックインマウス：
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるマウス型変異アミロイドβタンパク質をコードする変異ＡＰＰ遺伝子、又は
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から数えて第５番目のグリシン残基、第１０番目のフェニルアラニン残基、及び第１３番目のアルギニン残基以外の領域の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、マウス体内で発現することによりアルツハイマー病を誘発するポリペプチドをコードする変異ＡＰＰ遺伝子。
項２． アルツハイマー病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法であって、
項１に記載のノックインマウス又はその生体の一部に被検物質を適用する工程、及び前記ノックインマウス又はその生体の一部におけるアルツハイマー病の症状の改善の有無を調べ、アルツハイマー病の症状を改善した被検物質を選択する工程、を含むスクリーニング方法。
項３． アルツハイマー病の症状が、アミロイドβタンパク質の蓄積、アミロイドβオリゴマーの形成、タウタンパク質のリン酸化、シナプス消失、グリア細胞の活性化、神経脱落及び学習記憶障害からなる群より選択される少なくとも１種である、項２に記載のスクリーニング方法。
項４． アルツハイマー病の予防及び／又は治療薬の薬効評価方法であって、
項１に記載のノックインマウス又はその生体の一部に被検物質を適用する工程、及び前記ノックインマウス又はその生体の一部におけるアルツハイマー病の症状の改善効果を調べる工程、を含む薬効評価方法。
項５． アルツハイマー病の症状が、アミロイドβタンパク質の蓄積、アミロイドβオリゴマーの形成、タウタンパク質のリン酸化、シナプス消失、グリア細胞の活性化、神経脱落及び学習記憶障害からなる群より選択される少なくとも１種である、項４に記載の薬効評価方法。
項６． 下記（ａ）又は（ｂ）に示される変異アミロイド前駆体タンパク質（変異ＡＰＰ）遺伝子の、アルツハイマー病のモデル動物の製造のための使用：
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるマウス型変異アミロイドβタンパク質をコードする変異ＡＰＰ遺伝子、又は
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から数えて第５番目のグリシン残基、第１０番目のフェニルアラニン残基、及び第１３番目のアルギニン残基以外の領域の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、マウス体内で発現することによりアルツハイマー病を誘発するポリペプチドをコードする変異ＡＰＰ遺伝子。
項７． アルツハイマー病の症状が、アミロイドβタンパク質の蓄積、アミロイドβオリゴマーの形成、タウタンパク質のリン酸化、シナプス消失、グリア細胞の活性化、神経脱落及び学習記憶障害からなる群より選択される少なくとも１種である、項６に記載の使用。
項８． 項１に記載のノックインマウス又はその生体の一部の、アルツハイマー病の予防及び／又は治療薬のスクリーニングのための使用。
項９． アルツハイマー病の症状が、アミロイドβタンパク質の蓄積、アミロイドβオリゴマーの形成、タウタンパク質のリン酸化、シナプス消失、グリア細胞の活性化、神経脱落及び学習記憶障害からなる群より選択される少なくとも１種である、項８に記載の使用。
項１０． 項１に記載のノックインマウス又はその生体の一部の、アルツハイマー病の予防及び／又は治療薬の薬効評価のための使用。
項１１． アルツハイマー病の症状が、アミロイドβタンパク質の蓄積、アミロイドβオリゴマーの形成、タウタンパク質のリン酸化、シナプス消失、グリア細胞の活性化、神経脱落及び学習記憶障害からなる群より選択される少なくとも１種である、項１０に記載の使用。That is, the present invention provides the following knock-in mice, methods for screening Alzheimer's disease prevention and / or treatment drugs using the knock-in mice, and methods for evaluating the efficacy and efficacy of Alzheimer's disease prevention and / or treatment drugs.
Item 1. The knock-in mouse in which the mutant amyloid precursor protein (mutant APP) gene shown in the following (a) or (b) is knocked in and has the mutant APP gene homozygously:
(A) a mutant APP gene encoding a mouse mutant amyloid β protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) a fifth glycine counted from the N-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It consists of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids other than the residue, the 10th phenylalanine residue, and the 13th arginine residue are substituted, deleted, inserted or added, and is expressed in the mouse body A mutant APP gene encoding a polypeptide that induces Alzheimer's disease.
Item 2. A method for screening a preventive and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease,
The step of applying a test substance to the knock-in mouse according to Item 1 or a part of the living body thereof, and the presence or absence of improvement of Alzheimer's disease symptoms in the knock-in mouse or a part of the living body, to improve the symptoms of Alzheimer's disease A screening method comprising the step of selecting a test substance that has been prepared.
Item 3. Symptoms of Alzheimer's disease are at least one selected from the group consisting of amyloid β protein accumulation, amyloid β oligomer formation, tau protein phosphorylation, synapse loss, glial cell activation, neuronal loss and learning memory impairment Item 3. The screening method according to Item 2.
Item 4. A method for evaluating the efficacy of a preventive and / or therapeutic drug for Alzheimer's disease,
A method for evaluating efficacy, comprising: applying a test substance to the knock-in mouse according to item 1 or a part of the living body thereof; and investigating the effect of improving the symptoms of Alzheimer's disease in the knock-in mouse or a part of the living body thereof.
Item 5. Symptoms of Alzheimer's disease are at least one selected from the group consisting of amyloid β protein accumulation, amyloid β oligomer formation, tau protein phosphorylation, synapse loss, glial cell activation, neuronal loss and learning memory impairment Item 5. A method for evaluating drug efficacy according to Item 4.
Item 6. Use of the mutant amyloid precursor protein (mutant APP) gene shown in the following (a) or (b) for the production of a model animal of Alzheimer's disease:
(A) a mutant APP gene encoding a mouse mutant amyloid β protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) a fifth glycine counted from the N-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It consists of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids other than the residue, the 10th phenylalanine residue, and the 13th arginine residue are substituted, deleted, inserted or added, and is expressed in the mouse body A mutant APP gene encoding a polypeptide that induces Alzheimer's disease.
Item 7. Symptoms of Alzheimer's disease are at least one selected from the group consisting of amyloid β protein accumulation, amyloid β oligomer formation, tau protein phosphorylation, synapse loss, glial cell activation, neuronal loss and learning memory impairment Item 7. The use according to Item 6.
Item 8. Use of the knock-in mouse according to Item 1 or a part of the living body thereof for screening for a preventive and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease.
Item 9. Symptoms of Alzheimer's disease are at least one selected from the group consisting of amyloid β protein accumulation, amyloid β oligomer formation, tau protein phosphorylation, synapse loss, glial cell activation, neuronal loss and learning memory impairment Item 15. Use according to Item 8.
Item 10. Use of the knock-in mouse according to Item 1 or a part of the living body thereof for evaluating the efficacy of a prophylactic and / or therapeutic drug for Alzheimer's disease.
Item 11. Symptoms of Alzheimer's disease are at least one selected from the group consisting of amyloid β protein accumulation, amyloid β oligomer formation, tau protein phosphorylation, synapse loss, glial cell activation, neuronal loss and learning memory impairment Item 15. The use according to Item 10.
本発明のノックインマウスはヒトの大阪変異型アルツハイマー病の症状を忠実に再現しており、大阪変異型アルツハイマー病の疾患モデルマウスとして使用できる。更に、本発明のノックインマウスは、全てマウス由来の分子の作用のもとでアルツハイマー病を発症することから、アルツハイマー病のメカニズムや予防及び／又は治療における検討の際に異種間相互作用の影響を考慮する必要がなく、より正確な評価を行うことができる。 The knock-in mouse of the present invention faithfully reproduces the symptoms of human Osaka mutant Alzheimer's disease and can be used as a disease model mouse for Osaka mutant Alzheimer's disease. Furthermore, since all of the knock-in mice of the present invention develop Alzheimer's disease under the action of a mouse-derived molecule, the effects of cross-species interaction are considered in the study of the mechanism and prevention and / or treatment of Alzheimer's disease. There is no need to consider, and a more accurate evaluation can be performed.
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は、以下に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシンIn the present specification, amino acids, peptides, and proteins are represented using abbreviations adopted by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Committee (CBN) shown below.
A = Ala = alanine, C = Cys = cysteine,
D = Asp = aspartic acid, E = Glu = glutamic acid,
F = Phe = phenylalanine, G = Gly = glycine,
H = His = histidine, I = Ile = isoleucine,
K = Lys = Lysine, L = Leu = Leucine,
M = Met = methionine, N = Asn = asparagine,
P = Pro = proline, Q = Gln = glutamine,
R = Arg = arginine, S = Ser = serine,
T = Thr = threonine, V = Val = valine,
W = Trp = tryptophan, Y = Tyr = tyrosine
また、特に明示しない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表される。 Unless otherwise specified, the amino acid residue sequences of peptides and proteins are expressed from the N-terminus to the C-terminus from the left end to the right end.
［ノックインマウス］
本発明のノックインマウスは、下記（ａ）又は（ｂ）に示される変異アミロイド前駆体タンパク質（変異ＡＰＰ）遺伝子がノックインされており、且つ、当該変異ＡＰＰ遺伝子をホモで有することを特徴とする。
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるマウス型変異アミロイドβタンパク質をコードする変異ＡＰＰ遺伝子、又は
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から数えて第５番目のグリシン残基、第１０番目のフェニルアラニン残基、及び第１３番目のアルギニン残基以外の領域の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、マウス体内で発現することによりアルツハイマー病を誘発するポリペプチドをコードする変異ＡＰＰ遺伝子。[Knock-in mouse]
The knock-in mouse of the present invention is characterized in that the mutant amyloid precursor protein (mutant APP) gene shown in the following (a) or (b) is knocked in and has the mutant APP gene homozygously.
(A) a mutant APP gene encoding a mouse mutant amyloid β protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) a fifth glycine counted from the N-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It consists of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids other than the residue, the 10th phenylalanine residue, and the 13th arginine residue are substituted, deleted, inserted or added, and is expressed in the mouse body A mutant APP gene encoding a polypeptide that induces Alzheimer's disease.
より具体的には、本発明のノックインマウスは、上記特徴を有することにより、マウスアミロイドβタンパク質において第２２番のグルタミン酸残基が欠失されたマウス型変異アミロイドβタンパク質を生合成することができ、大阪変異型アルツハイマー病の疾患モデルマウスとして使用され得る。 More specifically, the knock-in mouse of the present invention can biosynthesize mouse-type mutant amyloid β protein from which the 22nd glutamic acid residue is deleted in mouse amyloid β protein due to the above characteristics. It can be used as a disease model mouse of Osaka mutant Alzheimer's disease.
本発明のノックインマウスは、次のようにして作製される。即ち、前記（ａ）又は（ｂ）の変異ＡＰＰ遺伝子を含むターゲッティングベクターを、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、相同組換えにより内在性ＡＰＰ遺伝子座に（ａ）又は（ｂ）の変異ＡＰＰ遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞クローンを選択する。そして、得られたＥＳ細胞クローンをマウス宿主胚に移植してキメラマウスを得て、更にこれを交配することにより本発明のノックインマウスを得ることができる。 The knock-in mouse of the present invention is produced as follows. That is, the targeting vector containing the mutated APP gene of (a) or (b) is introduced into a mouse embryonic stem cell (ES cell), and the endogenous APP gene locus of (a) or (b) is obtained by homologous recombination. ES cell clones incorporating the mutated APP gene are selected. Then, the obtained ES cell clone is transplanted into a mouse host embryo to obtain a chimeric mouse, which is further mated to obtain the knock-in mouse of the present invention.
また、本発明のノックインマウスは、前記（ａ）又は（ｂ）に示される変異ＡＰＰ遺伝子を発現可能な状態で安定に保持する。ここで、「安定に保持する」とは、本発明のノックインマウスの細胞内に前記ＤＮＡが発現可能な状態に永続的に存在することを指し、前記ＤＮＡが宿主染色体上に組み込まれていてもよく、染色体外ＤＮＡとして安定に存在していてもよいが、好ましくは染色体上に組み込まれた状態で保持されている。更に、本発明のノックインマウスは、前記（ａ）又は（ｂ）に示される変異ＡＰＰ遺伝子に関してホモ接合体である。 The knock-in mouse of the present invention stably holds the mutant APP gene shown in (a) or (b) in a state where it can be expressed. Here, “stablely maintained” means that the DNA is permanently present in the knock-in mouse cell of the present invention in a state where it can be expressed, even if the DNA is integrated on the host chromosome. Although it may exist stably as extrachromosomal DNA, it is preferably retained in an integrated state on the chromosome. Furthermore, the knock-in mouse of the present invention is homozygous for the mutated APP gene shown in (a) or (b) above.
以下、本発明のノックインマウスの作製方法及び特徴について詳述する。
＜ターゲッティングベクターの作製＞
ターゲッティングベクターは、前記（ａ）又は（ｂ）の変異ＡＰＰ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドを調製し、公知のベクターに挿入して得ることができる。Hereinafter, the production method and characteristics of the knock-in mouse of the present invention will be described in detail.
<Preparation of targeting vector>
The targeting vector can be obtained by preparing a polynucleotide having the DNA base sequence of the mutant APP gene of (a) or (b) and inserting it into a known vector.
（変異ＡＰＰ遺伝子の調製）
前記（ａ）又は（ｂ）の変異ＡＰＰ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドは、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりマウスＡＰＰ遺伝子を得て、更に当該ＡＰＰ遺伝子に対して変異を導入することによって調製することができる。マウスＡＰＰ遺伝子（野生型）は公知であり、配列番号２に示される。(Preparation of mutant APP gene)
The polynucleotide having the DNA base sequence of the mutant APP gene of (a) or (b) above is obtained by screening a mouse genomic DNA library, and further introducing a mutation into the APP gene. Can be prepared. The mouse APP gene (wild type) is known and is shown in SEQ ID NO: 2.
マウスのゲノムＤＮＡライブラリーは、ＢＡＣライブラリー等の商業的に入手可能なものを使用することもでき、例えば、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ３Ｈ系統等の純系、ＩＣＲ系統等の交雑系のマウスゲノムＤＮＡライブラリーより従来公知の手法に従って調製することもできる。 A commercially available mouse genomic DNA library such as a BAC library can also be used. For example, 129 strain, C57BL / 6 strain, BALB / c strain, pure strain such as C3H strain, ICR strain, etc. It can also be prepared from a mouse genomic DNA library of a hybrid system such as that according to a conventionally known method.
マウスＡＰＰ遺伝子は公知であることから、ＡＰＰ遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマーを用いて前述のマウスゲノムＤＮＡをスクリーニングして得ることができる。 Since the mouse APP gene is known, it can be obtained by screening the aforementioned mouse genomic DNA using a primer designed based on the base sequence of the APP gene.
アミロイドβタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からβ−又はγ−セクレターゼにより切り出されて生成される。マウスアミロイド前駆体タンパク質遺伝子（ＡＰＰ遺伝子）は、１８のエクソンを含み、アミロイドβタンパク質の第２２番グルタミン酸はエクソン１７によってコードされている。そのため、クローニングの際には、少なくともＡＰＰ遺伝子のエクソン１７を含むＤＮＡ断片がクローニングされるようにプライマーを設計する。また、配列番号２においてエクソン１７をコードする領域は、塩基配列の５'末端から数えて第２１１４４０〜２１１５８６塩基の領域に相当し、アミロイドβタンパク質の第２２番グルタミン酸残基は第２１１４５２〜２１１４５４塩基（ＧＡＡ）によりコードされている。 Amyloid β protein is produced by being cleaved from amyloid precursor protein (APP) by β- or γ-secretase. The mouse amyloid precursor protein gene (APP gene) contains 18 exons, and the 22nd glutamic acid of amyloid β protein is encoded by exon 17. Therefore, in cloning, primers are designed so that a DNA fragment containing at least exon 17 of the APP gene is cloned. In addition, the region encoding exon 17 in SEQ ID NO: 2 corresponds to a region of 211440 to 211586 bases counted from the 5 ′ end of the base sequence, and the 22nd glutamic acid residue of amyloid β protein is 211452 to 21454 bases. Coded by (GAA).
得られたＤＮＡ断片に対して、アミロイドβタンパク質のＮ末端から数えて第２２番のグルタミン酸残基を欠失する変異を導入し、大阪変異を有する変異アミロイドβタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。変異の導入方法は前記第２２番のグルタミン酸が欠失され得る限り特に限定されず、従来公知の方法に従って行うことができるが、具体的には、後述する実施例に記載される方法が例示される。 A polynucleotide encoding a mutant amyloid β protein having an Osaka mutation is obtained by introducing a mutation that deletes the 22nd glutamic acid residue from the N-terminus of the amyloid β protein into the obtained DNA fragment. Can do. The method for introducing the mutation is not particularly limited as long as the 22nd glutamic acid can be deleted, and can be performed according to a conventionally known method. Specific examples include the methods described in the examples described later. The
また、変異ＡＰＰ遺伝子は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において例えば、１個又は複数個、１又は数個、或いは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、マウス体内で発現することによりアルツハイマー病を誘発するポリペプチドをコードするものであってもよい（即ち、前記（ｂ）に示される変異ＡＰＰ遺伝子に相当する）。但し、このような変異の導入は、マウス型のアミロイドβタンパク質に特徴的な配列、即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から数えて第５番目のグリシン残基、第１０番目のフェニルアラニン残基、及び第１３番目のアルギニン残基の領域に対して行う。 Moreover, mutant APP gene, for example, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, one or more, one or several, walk one to five amino acids are substituted, deleted, inserted or added amino acid It may consist of a sequence and may encode a polypeptide that induces Alzheimer's disease when expressed in the mouse (that is, it corresponds to the mutant APP gene shown in (b) above). However, the introduction of such a mutation is the sequence characteristic to the mouse amyloid β protein, ie, the fifth glycine residue and the tenth in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, counting from the N-terminus. In the region of the phenylalanine residue and the 13th arginine residue.
アミノ酸置換を行う場合は、側鎖官能基の性質に基づく保存的置換であることが好ましい。天然アミノ酸は、側鎖官能基によって非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の各カテゴリーに分類される。保存的置換とは、もとのアミノ酸残基と置換後のアミノ酸残基が同一のカテゴリーに分類されるアミノ酸残基であることを指す。ここで、「非極性アミノ酸」として具体的には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファン；「非電荷アミノ酸」として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン；「酸性アミノ酸」として、アスパラギン酸及びグルタミン酸；「塩基性アミノ酸」として、リジン、アルギニン、及びヒスチジンがそれぞれ挙げられる。 When amino acid substitution is performed, conservative substitution based on the nature of the side chain functional group is preferred. Natural amino acids are classified into nonpolar amino acids, uncharged amino acids, acidic amino acids and basic amino acids according to side chain functional groups. A conservative substitution refers to an amino acid residue in which the original amino acid residue and the amino acid residue after substitution are classified into the same category. Here, specific examples of “nonpolar amino acids” include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan; “uncharged amino acids” include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, And “amine amino acid” include aspartic acid and glutamic acid; “basic amino acid” includes lysine, arginine, and histidine, respectively.
アミノ酸を欠失する場合は、発現されるポリペプチドがマウス体内で発現することによりアルツハイマー病を誘発することが可能である限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列の例えばＮ末端又はＣ末端から例えば１〜５個のアミノ酸を欠失させてもよい。 When the amino acid is deleted, as long as it is possible to induce Alzheimer's disease by expressing the expressed polypeptide in the mouse body, for example, from the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 For example, 1 to 5 amino acids may be deleted.
アミノ酸を挿入する場合は、発現されるポリペプチドがマウス体内で発現することによりアルツハイマー病を誘発することが可能である限り挿入されるアミノ酸の数や位置は特に限定されないが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の任意の場所に例えば、１若しくは数個、或いは１〜５個のアミノ酸残基を挿入してもよい。また、アミノ酸を挿入する場合、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、第２１番のアラニン残基と第２２番のアスパラギン酸残基の間を避けて行う。 In the case of inserting an amino acid, the number and position of the inserted amino acid are not particularly limited as long as the expressed polypeptide can be induced in the mouse body to induce Alzheimer's disease. for example anywhere in the amino acid sequence, one or several, walk may be inserted 1-5 amino acid residues. In addition, when an amino acid is inserted, it is carried out while avoiding the position between the 21st alanine residue and the 22nd aspartic acid residue in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
アミノ酸を付加する場合、発現されるポリペプチドがマウス体内で発現することによりアルツハイマー病を誘発することが可能である限り、付加されるアミノ酸の数は限定されないが、例えば１〜５個が挙げられる。 When adding an amino acid, as long as the polypeptide expressed is capable of inducing Alzheimer's disease by expressing a mouse body, the number of amino acids to be added is not limited, 1-5 pieces are exemplified For example It is done.
これらの変異の導入については従来公知の方法を採用することができ、例えば部位特異的変異導入法等が挙げられる。部位特異的変異導入法は、例えば、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲに基づく手法や、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の市販キットを利用することにより実施することができる。また、２個所以上に変異を導入する場合には上記方法に準じた方法を繰り返すことにより、目的とするポリペプチドをコードする変異ＡＰＰ遺伝子を得ることができる。 For the introduction of these mutations, conventionally known methods can be employed, and examples include site-specific mutagenesis. The site-directed mutagenesis method can be carried out, for example, by using a technique based on Inverse PCR or a commercial kit of QuikChange II Kit (manufactured by Stratagene). When introducing mutations at two or more sites, a mutated APP gene encoding the target polypeptide can be obtained by repeating the method according to the above method.
このような変異を有するアミノ酸配列からなる変異アミロイドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が２５％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは９０％以上のものが挙げられる。 Examples of the mutant amyloid comprising an amino acid sequence having such a mutation include those having a sequence identity of 25% or more, preferably 50% or more, more preferably 90% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
ポリペプチドの配列同一性については、対比される２つのポリペプチドを最適に整列させ、アミノ酸が両方の配列で一致した位置の数を比較アミノ酸総数で除し、この結果に１００を乗じた数値で表わされる。具体的には、ポリペプチドの配列同一性は、「ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１０」（ゼネティックス社）のＭａｘｉｍｕｍ ｍａｔｃｈｉｎｇプログラムをデフォルトのパラメーターで用いることで決定することができる。 For polypeptide sequence identity, the two polypeptides to be compared are optimally aligned, the number of positions where the amino acid matches in both sequences is divided by the total number of comparison amino acids, and the result multiplied by 100. Represented. Specifically, the sequence identity of polypeptides can be determined by using the Maximum matching program of “GENETYX Ver.10” (Genetics) with default parameters.
また、前記（ｂ）に示される変異ＡＰＰ遺伝子は、前述の変異（アミロイドβタンパク質の第２２番グルタミン酸の欠損）を有している限り、前記（ａ）に示される変異ＡＰＰ遺伝子の相補配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものであり、且つマウスにおいてアルツハイマー病を発症し得るものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーションの後、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む緩衝液により４２℃で洗浄処理が挙げられる。より高ストリンジェントな条件としては、例えば、６５℃でのハイブリダイゼーションの後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理が挙げられる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、上記の塩濃度、温度条件等以外の要素により影響を受け、当業者であれば種々の要素に基づいて上記される具体的条件によるストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーが実現され得る条件を設定することができる。 In addition, the mutant APP gene shown in (b) has a complementary sequence to the mutant APP gene shown in (a) as long as it has the mutation described above (deletion of glutamic acid No. 22 in amyloid β protein). On the other hand, it may hybridize under stringent conditions and may develop Alzheimer's disease in mice. Here, stringent conditions include, for example, washing at 42 ° C. with a buffer containing 1 × SSC and 0.1% SDS after hybridization at 42 ° C. Higher stringent conditions include, for example, a washing treatment at 65 ° C. with a buffer containing 0.1 × SSC and 0.1% SDS after hybridization at 65 ° C. The stringency of hybridization is affected by factors other than the above-mentioned salt concentration, temperature conditions, etc., and those skilled in the art will realize stringency equivalent to the stringency under the specific conditions described above based on various factors The conditions that can be done can be set.
（変異アミロイド遺伝子を含むターゲッティングベクターの調製）
上記のようにして得られる変異ＡＰＰ遺伝子をベクターに挿入してターゲッティングベクターを作製する。ターゲッティングベクターは、該ターゲッティングベクターとゲノム中のＡＰＰ遺伝子との間の相同組換えにより、第２２番目のグルタミン酸が欠失させるように設計される。また、ターゲッティングベクターは相同組換えを可能とするために、マウスの内在性ＡＰＰ遺伝子と相同な領域を、導入されるＤＮＡ断片（変異ＡＰＰ遺伝子）の両端（５'側及び３'側）に含んでいてもよい。即ち、ターゲッティングベクターとしては、例えばアミロイド遺伝子の上流の配列、前記変異アミロイド配列、ポジティブ選択マーカー遺伝子、及びアミロイド遺伝子の下流の配列を含むものが挙げられる。(Preparation of targeting vector containing mutant amyloid gene)
A mutated APP gene obtained as described above is inserted into a vector to prepare a targeting vector. The targeting vector is designed so that the 22nd glutamic acid is deleted by homologous recombination between the targeting vector and the APP gene in the genome. Moreover, in order to enable homologous recombination, the targeting vector contains regions homologous to the endogenous mouse APP gene at both ends (5 ′ side and 3 ′ side) of the introduced DNA fragment (mutated APP gene). You may go out. That is, examples of the targeting vector include those containing a sequence upstream of the amyloid gene, the mutant amyloid sequence, the positive selection marker gene, and a sequence downstream of the amyloid gene.
目的の変異ＡＰＰ遺伝子が組み込まれていることを確認するためにターゲッティングベクターに挿入されるポジティブ選択マーカーとしては、従来公知の遺伝子薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、等が挙げられる。また、レポーター遺伝子としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、ＧＦＰ遺伝子等が挙げられる。これらのポジティブ選択マーカー遺伝子は、ＥＳ細胞中で発現可能なように、プロモーター配列を含む発現カセットとして組み込まれていることが望ましい。 Conventionally known gene drug resistance genes, reporter genes, and the like can be used as positive selection markers inserted into the targeting vector to confirm that the target mutant APP gene has been incorporated. Examples of drug resistance genes include neomycin resistance genes, hygromycin resistance genes, puromycin resistance genes, and the like. Examples of the reporter gene include β-galactosidase (lacZ) gene and GFP gene. These positive selectable marker genes are preferably incorporated as an expression cassette containing a promoter sequence so that they can be expressed in ES cells.
ポジティブ選択マーカー遺伝子は変異ＡＰＰ遺伝子の発現を妨げる場合あるため、従来公知の遺伝子工学的手法を用いて、相同組換え体の選択後にポジティブ選択マーカーを除去することが好ましい。このような手法としては、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系やＦｌｐ−ｆｒｔ系、バクテリオファージａｔｔ系を利用する方法が挙げられる。例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を利用する場合、ポジティブ選択マーカー遺伝子の両端にｌｏｘＰ配列を配し、Ｃｒｅリコンビナーゼを作用させることにより除去することができる。また、Ｆｌｐ−ｆｒｔ系を利用する場合には、ポジティブ選択マーカーの両端にｆｒｔ配列を配し、Ｆｌｐリコンビナーゼにより除去することができる。 Since the positive selection marker gene may interfere with the expression of the mutated APP gene, it is preferable to remove the positive selection marker after selection of homologous recombinants using a conventionally known genetic engineering technique. Examples of such a method include a method using a Cre-loxP system, a Flp-frt system, or a bacteriophage att system. For example, when the Cre-loxP system is used, it can be removed by placing a loxP sequence at both ends of the positive selection marker gene and allowing Cre recombinase to act. In addition, when the Flp-frt system is used, frt sequences can be arranged at both ends of the positive selection marker and removed by Flp recombinase.
ターゲッティングベクターにおいて、内在性ＡＰＰ遺伝子に相同な領域の外側に、ネガティブ選択用マーカー遺伝子を挿入することにより相同組換えにより標的となる内在性ＡＰＰ遺伝子にターゲティングされたクローンのみを効率よく選択することができる。ネガティブ選択マーカー遺伝子としては、例えばジフテリア毒素（ＤＴ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子等が挙げられる。 In a targeting vector, by inserting a marker gene for negative selection outside a region homologous to the endogenous APP gene, only clones targeted to the endogenous APP gene targeted by homologous recombination can be efficiently selected. it can. Examples of the negative selection marker gene include diphtheria toxin (DT) gene and thymidine kinase (TK) gene.
ターゲッティングベクターは、前記変異ＡＰＰ遺伝子、標的配列に相同な５'側腕及び３'側腕、選択マーカー遺伝子等を、制限酵素、ＤＮＡリガーゼ等を用いた通常の遺伝子工学的手法により従来公知のベクター中に挿入して調製され得る。 The targeting vector is a conventionally known vector obtained by subjecting the mutated APP gene, the 5 ′ side arm and 3 ′ side arm homologous to the target sequence, a selection marker gene, etc., to a conventional genetic engineering technique using a restriction enzyme, DNA ligase or the like. It can be prepared by inserting into it.
ベクターとしては、マウスＥＳ細胞において発現可能であり、且つ形質転換可能なものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌由来のプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルスなどが用いられる。なかでも、好ましいベクターとして大腸菌由来のプラスミド等が挙げられる。 The vector is not particularly limited as long as it can be expressed in mouse ES cells and can be transformed. For example, plasmids derived from E. coli, retroviruses, lentiviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses, baculoviruses, etc. Viruses are used. Among these, plasmids derived from Escherichia coli and the like are preferable vectors.
＜ＥＳ細胞への導入及びノックインマウスの選択＞
前記ターゲッティングベクターをマウスＥＳ細胞に導入することにより、所望の変異アミロイドβタンパク質を発現し得るキメラマウスを得ることができ、得られたキメラマウスを交配することにより前記変異アミロイドβタンパク質をコードする遺伝子についてホモ接合体であるノックインマウスを得ることができる。<Introduction into ES cells and selection of knock-in mice>
By introducing the targeting vector into mouse ES cells, a chimeric mouse capable of expressing the desired mutant amyloid β protein can be obtained, and the gene encoding the mutant amyloid β protein can be obtained by mating the obtained chimeric mice Knock-in mice that are homozygous for can be obtained.
ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞である。本発明のノックインマウスを作製するために使用されるマウスＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、公知の方法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）ｖｏｌ．２９２，ｐ．１５４を参照）に従って新たに樹立されたものを用いてもよい。既に樹立されたマウスＥＳ細胞株としては、ＲＦ８細胞（Ｍｅｉｎｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４０４１−１４０４６（１９９６））、ＣＧＲ８細胞（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１０：１３４１−１３４８（１９９０））、ＭＧ１．１９細胞（Ｇａｓｓｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：１２９２−１２９６（１９９５））等が挙げられる。また、例えば、大日本製薬（株）より市販されているマウスＥＳ細胞１２９ＳＶ（Ｎｏ．Ｒ−ＣＭＴＩ−１−１５、Ｎｏ．Ｒ−ＣＭＴＩ−１Ａ）、Ｃ５７／ＢＬ６（Ｎｏ．Ｒ−ＣＭＴＩ−２Ａ）、ＤＢＡ−１（Ｎｏ．Ｒ−ＣＭＴＩ−３Ａ）等を用いることができる。また、マウスｉＰＳ細胞を使用してノックインマウスを作製することも可能である。マウスｉＰＳ細胞を利用する場合であっても後述するＥＳ細胞を用いた場合の方法に準じてノックインマウスの作製を行うことができる。 ES cells are derived from the inner cell mass (ICM) of a fertilized egg at the blastocyst stage, and can be cultured and maintained in an undifferentiated state in vitro. As a mouse ES cell used for producing the knock-in mouse of the present invention, an established cell line may be used, and known methods (for example, see Nature (1981) vol. 292, p. 154). You may use what was newly established according to). As mouse ES cell lines already established, RF8 cells (Meiner, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14041-14046 (1996)), CGR8 cells (Nichols, J. et. al., Development, 110: 1341-1348 (1990)), MG 1.19 cells (Gassmann, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: 1292-1296 (1995)). Can be mentioned. Further, for example, mouse ES cells 129SV (No. R-CMTI-1-15, No. R-CMTI-1A), C57 / BL6 (No. R-CMTI-2A) commercially available from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. ), DBA-1 (No. R-CMTI-3A), etc. can be used. It is also possible to produce knock-in mice using mouse iPS cells. Even when mouse iPS cells are used, knock-in mice can be prepared according to the method using ES cells described later.
ＥＳ細胞株の培養条件については、ＥＳ細胞の未分化幹細胞としての性質を維持することが可能な限り従来公知の条件から適宜選択して設定することができる。例えば、分化抑制因子として知られるＬＩＦ（例えば１０3Ｕ／ｍｌの濃度）の存在下において、５％ＣＯ2、約３７℃の条件下で培養するなどの方法が挙げられる。また、細胞の継代を通常１日２回行い、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．１２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに播種する方法等を採用することができる。ＥＳ細胞の培養は、必要に応じてフィーダー細胞上で行ってもよく、フィーダー細胞としては線維芽細胞等が例示される。The culture conditions for the ES cell line can be appropriately selected and set from conventionally known conditions as long as the properties of ES cells as undifferentiated stem cells can be maintained. Examples thereof include a method of culturing under conditions of 5% CO 2 and about 37 ° C. in the presence of LIF known as a differentiation inhibitor (for example, a concentration of 10 3 U / ml). In addition, cell passage is usually performed twice a day and, for example, a method of singly cellizing by trypsin / EDTA solution (usually 0.125% trypsin / 0.01% EDTA) treatment and newly seeding is employed. it can. ES cell culture may be performed on feeder cells as necessary, and examples of the feeder cells include fibroblasts.
ＥＳ細胞への前記ターゲッティングベクターの導入は、従来公知の方法を利用することができ、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が挙げられるが、操作が比較的簡便であり、比較的長いＤＮＡ断片を導入できるという観点からエレクトロポレーション法が好ましい方法として挙げられる。 For introduction of the targeting vector into ES cells, a conventionally known method can be used. For example, calcium phosphate coprecipitation method, electroporation method, lipofection method, aggregation method, microinjection (microinjection) Method, gene gun (particle gun) method, DEAE-dextran method, and the like, but electroporation is a preferable method from the viewpoint that the operation is relatively simple and relatively long DNA fragments can be introduced.
ターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞について、導入されたＤＮＡが組み込まれたかどうかは、前述の薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等のポジティブ選択マーカー遺伝子を利用して、細胞の段階で形質転換体を確認、選択することができる。また、相同組換えによる組込みの確認は、ネガティブ選択マーカー遺伝子を利用して行うことができる。より具体的には、例えばポジティブ選択マーカー遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子を含み、ネガティブ選択マーカー遺伝子としてジフテリア毒素（ＤＴ）遺伝子を含むベクターを用いた場合であれば、遺伝子導入後のＥＳ細胞をＧ４１８等のネオマイシン系抗生物質を添加した培地で培養し、耐性を有する（生存した）ＥＳ細胞を選択することにより確認できる。或いは、ターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞の単一細胞を培養してコロニーを得、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法等を利用してこれらのコロニーから抽出されたＤＮＡを確認してもよい。 Regarding the ES cells into which the targeting vector has been introduced, whether or not the introduced DNA has been incorporated is confirmed by using the above-mentioned drug selection gene, reporter gene or other positive selection marker gene, and confirming the transformant at the cell stage, You can choose. Also, confirmation of integration by homologous recombination can be performed using a negative selection marker gene. More specifically, for example, when a vector containing a neomycin resistance gene as a positive selectable marker gene and a diphtheria toxin (DT) gene as a negative selectable marker gene is used, the ES cell after gene introduction is expressed as G418 or the like. This can be confirmed by culturing in a medium supplemented with neomycin antibiotics and selecting resistant (surviving) ES cells. Alternatively, colonies may be obtained by culturing single cells of ES cells introduced with a targeting vector, and DNA extracted from these colonies may be confirmed using Southern hybridization, PCR method or the like.
目的のＤＮＡの組み込みが確認されたＥＳ細胞を、マウス由来の胚に戻してキメラ胚を作製し、これを仮親に移植して更に発生を続けさせることによって、変異型アミロイド遺伝子についてヘテロ接合体であるノックインマウスを得ることができる。ヘテロ接合体の選択は、例えばマウスの尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法等の従来公知の方法により検定することができる。 The ES cell in which the integration of the target DNA has been confirmed is returned to the mouse-derived embryo to produce a chimeric embryo, which is transplanted into a foster parent and further developed, thereby allowing the mutant amyloid gene to be heterozygous. A knock-in mouse can be obtained. The selection of the heterozygote can be performed by, for example, a conventionally known method such as Southern hybridization or PCR method on chromosomal DNA separated and extracted from the tail of a mouse.
このようにして得られたヘテロ接合体同士を交雑することにより、通常４／１の確率でホモ接合体のノックインマウスを得ることができる。キメラマウスの中でＥＳ細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラマウスが得られることとなり、これを交配することにより導入されたＤＮＡが遺伝的に固定されたノックインマウスを作製することができる。 By crossing the heterozygotes thus obtained, a homozygous knock-in mouse can be usually obtained with a probability of 4/1. If ES cells contributed to the formation of primordial germ cells that will differentiate into eggs or sperm in the future, germline chimeric mice will be obtained, and the DNA introduced by mating will be genetically transferred. Knock-in mice fixed to can be prepared.
更に、本発明は上記ノックインマウスから得られる、生体の一部、好ましくは単離された組織、細胞等を提供する。単離された組織としては、例えばアルツハイマーの病変部に相当する脳、脳の各部位（例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳等）の組織片等が挙げられる。また、単離された細胞としては、例えば神経細胞等が挙げられる。 Furthermore, the present invention provides a part of a living body, preferably an isolated tissue, cell, etc., obtained from the knock-in mouse. The isolated tissues include, for example, brain and brain parts corresponding to Alzheimer's lesions (eg, olfactory bulb, amygdaloid nucleus, basal sphere, hippocampus, hypothalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, etc.) Examples include tissue pieces. Moreover, as an isolated cell, a nerve cell etc. are mentioned, for example.
＜ノックインマウスの特徴＞
このようにして得られる本発明のノックインマウスは、通常８カ月齢以降、好ましくは１２カ月齢以降、更に好ましくは１８カ月齢以降に、以下の少なくともいずれかの特徴を示す。<Features of knock-in mouse>
The knock-in mouse of the present invention thus obtained usually exhibits at least one of the following characteristics after 8 months, preferably after 12 months, and more preferably after 18 months.
（ｉ）本発明のノックインマウスにおいては、海馬の神経細胞内にアミロイドβタンパク質がオリゴマーの形態で蓄積する。アミロイドβタンパク質は、例えば抗１４Ｆ１抗体、β００１抗体（Ｌｉｐｐａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ，１９９９）等の抗アミロイドβ抗体を用いて免疫染色を行うことにより検出される。また、蓄積されたアミロイドβタンパク質がオリゴマーを形成していることの確認は、例えば抗Ａｌ１抗体等を用いて免疫染色を行うことにより実施できる。 (I) In the knock-in mouse of the present invention, amyloid β protein accumulates in the form of oligomers in the hippocampal neurons. The amyloid β protein is detected by immunostaining using an anti-amyloid β antibody such as anti-14F1 antibody, β001 antibody (Lippa C et al., Arch. Neurol, 1999). Moreover, confirmation that the accumulated amyloid β protein forms an oligomer can be carried out, for example, by performing immunostaining using an anti-Al1 antibody or the like.
（ｉｉ）本発明のノックインマウスの脳内においては、野生型マウスに比べ６０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の異常リン酸化タウタンパク質の上昇が生じる。異常リン酸化タウタンパク質については、抗ＰＨＦ１抗体等を用いた免疫染色により検出することができる。 (Ii) In the brain of the knock-in mouse of the present invention, abnormal phosphorylated tau protein is increased by 60% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more, compared to the wild-type mouse. Abnormally phosphorylated tau protein can be detected by immunostaining using an anti-PHF1 antibody or the like.
（ｉｉｉ）本発明のノックインマウスの脳内においては、野生型マウスに比べ２０％以上、好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上の脳内シナプスの消失が見られる。シナプス消失については、抗シナプトフィジン抗体を用いた免疫染色により検出することができる。 (Iii) In the brain of the knock-in mouse of the present invention, the disappearance of synapses in the brain is 20% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, compared to the wild-type mouse. Synapse disappearance can be detected by immunostaining using an anti-synaptophysin antibody.
（ｉｖ）本発明のノックインマウスの海馬において、野生型マウスに比べ６０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性化ミクログリア及び活性化アストロサイトの上昇が見られる。活性化ミクログリア及び活性化アストロサイトは、ミクログリアに対して抗Ｉｂａ１抗体、アストロサイトに対して抗ＧＦＡＰ抗体をそれぞれ用いて免疫染色を行うことにより検出できる。 (Iv) In the hippocampus of the knock-in mouse of the present invention, activation microglia and activated astrocytes are increased by 60% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more, compared to the wild type mouse. Activated microglia and activated astrocytes can be detected by immunostaining using anti-Iba1 antibody against microglia and anti-GFAP antibody against astrocytes, respectively.
（ｖ）本発明のノックインマウスは、脳の海馬において、野生型マウスに比べて２０％以上、好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上の神経脱落が認められる。神経脱落の評価は、例えば、抗ＮｅｕＮ抗体を用いて脳切片を染色し、海馬における神経細胞の数を計測することにより実施され得る。 (V) The knock-in mouse of the present invention has 20% or more, preferably 40% or more, and more preferably 50% or more neuronal loss in the hippocampus of the brain compared to the wild-type mouse. Evaluation of neuronal loss can be performed, for example, by staining a brain section with an anti-NeuN antibody and counting the number of neurons in the hippocampus.
（ｖｉ）本発明のノックインマウスは、野生型マウスと比較して学習記憶障害を呈する。学習記憶障害の評価、公知の試験系を利用することができ、具体的にはモリス水迷路試験等が例示される。例えば、モリス水迷路試験において、野生型マウスは試験を繰り返す毎に逃避潜時間が短縮され、５日間で逃避潜時間が６０〜７０％程度短縮されるのに対し、本発明のノックインマウスは、試験を繰り返しても、逃避潜時間の短縮が１０〜５０％程度、好ましくは１０〜３０％程度にとどまり、学習記憶障害の症状を呈する。 (Vi) The knock-in mouse of the present invention exhibits learning memory impairment as compared to the wild-type mouse. Evaluation of learning memory impairment, a known test system can be used, and specific examples include the Morris water maze test. For example, in the Morris water maze test, the wild-type mouse is shortened every time the test is repeated, and the escape latency is shortened by about 60 to 70% in 5 days, whereas the knock-in mouse of the present invention is Even if the test is repeated, the escape latency is shortened to about 10 to 50%, preferably about 10 to 30%, and exhibits symptoms of learning memory impairment.
［アルツハイマー病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法］
本発明は、前記ノックインマウス又はその生体の一部を用いたアルツハイマー病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法は、ノックインマウス又はその生体の一部に被検物質を適用する工程、及び前記ノックインマウス又はその生体の一部におけるアルツハイマー病の症状の改善の有無を調べ、アルツハイマー病の症状を改善した被検物質を選択する工程を含むことを特徴とする。[Screening method of preventive and / or therapeutic drug for Alzheimer's disease]
The present invention provides a method for screening a preventive and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease using the knock-in mouse or a part of the living body thereof. The screening method comprises a step of applying a test substance to a knock-in mouse or a part of the living body thereof, and examining whether the knock-in mouse or a part of the living body has an improvement in the symptoms of Alzheimer's disease, thereby improving the symptoms of Alzheimer's disease And a step of selecting the test substance.
本発明のスクリーニング方法において、被検物質としてはアルツハイマー病の予防及び／又は治療に有効である可能性のあるものであれば特に限定されず、例えば、合成化合物、核酸（例えば、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物、細胞抽出物、細胞培養上清、植物抽出物、培養産物等が挙げられ、これらの混合物の形態であってもよい。 In the screening method of the present invention, the test substance is not particularly limited as long as it may be effective for the prevention and / or treatment of Alzheimer's disease. For example, synthetic compounds, nucleic acids (for example, antisense nucleic acids, cDNA, siRNA, etc.), peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, culture products and the like, and may be in the form of a mixture thereof.
本発明のスクリーニング方法において被検物質の適用方法は、評価対象がノックインマウスであるか、ノックインマウスの生体の一部であるかによって適宜変更され得る。例えば、ノックインマウスに被検物質を投与することにより実施する場合、被検物質の投与方法は被検物質がマウスの脳に影響を与え得るものであれば特に制限されないが、例えば、静脈投与、脳室内投与、経口投与、腹腔内投与等が挙げられる。或いは、ノックインマウスの生体の一部を用いる場合であれば被検物質を組織培養、細胞培養等の培地等に添加することにより実施できる。 In the screening method of the present invention, the method for applying the test substance can be appropriately changed depending on whether the evaluation object is a knock-in mouse or a part of the living body of the knock-in mouse. For example, when performed by administering a test substance to a knock-in mouse, the administration method of the test substance is not particularly limited as long as the test substance can affect the mouse brain, for example, intravenous administration, Examples include intraventricular administration, oral administration, and intraperitoneal administration. Alternatively, in the case of using a part of the living body of the knock-in mouse, the test substance can be added by adding it to a medium such as tissue culture or cell culture.
アルツハイマー病の症状としては、具体的には、アミロイドβタンパク質の蓄積、アミロイドβオリゴマーの形成、タウタンパク質のリン酸化、シナプス消失、グリア細胞の活性化、神経脱落、学習記憶障害、脳画像検査や脳波測定等を含む電気生理学的変化が例示される。これらの症状のいずれか１種について評価を行ってもよいが、２種以上の症状について評価を行うことにより、アルツハイマー病の予防及び／又は治療薬としてより有効性の高い被検物質を選択することができる。 Symptoms of Alzheimer's disease include amyloid β protein accumulation, amyloid β oligomer formation, tau protein phosphorylation, synapse loss, glial cell activation, neuronal loss, learning memory impairment, brain imaging and Examples include electrophysiological changes including electroencephalogram measurements. Any one of these symptoms may be evaluated, but a test substance that is more effective as a preventive and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease is selected by evaluating two or more symptoms. be able to.
これらの症状の検出方法又は評価方法は特に限定されず、対象となる症状に応じて従来公知の方法から適宜選択して実施することができる。例えば、ノックインマウスに被検物質を投与して行われるインビボスクリーニングの場合、被検物質が投与されたノックインマウスの脳を摘出して、常法に従って脳の凍結切片又はパラフィン包埋切片を調製し、所望の検出標的タンパク質に結合する抗体を用いて免疫染色を行うことにより検出される。免疫染色による評価方法等については、上記＜ノックインマウスの特徴＞において記載される抗体を用いて従来公知の染色方法に従い行うことができる。或いは、摘出された脳をホモジナイズし、イムノアッセイ等を行うことにより含有されるアミロイドβの量を測定してアミロイドβタンパク質の蓄積を検出することもできる。これらの方法により得た結果を被検物質投与群と非投与群間で比較することにより、被検物質の有効性を評価することができる。そして、非投与群に比べて被検物質投与群でアルツハイマー病の症状の改善が認められた場合、当該被検物質をアルツハイマー病の予防及び／又は治療薬として選択する。 The detection method or evaluation method of these symptoms is not particularly limited, and can be carried out by appropriately selecting from conventionally known methods according to the target symptoms. For example, in the case of in vivo screening performed by administering a test substance to a knock-in mouse, the brain of the knock-in mouse to which the test substance is administered is removed, and a frozen section of the brain or a paraffin-embedded section is prepared according to a conventional method. Detection is performed by immunostaining with an antibody that binds to the desired target protein for detection. About the evaluation method by immuno-staining, etc., it can carry out according to a conventionally well-known staining method using the antibody described in the above-mentioned <Characteristics of a knock-in mouse>. Alternatively, the accumulation of amyloid β protein can be detected by measuring the amount of amyloid β contained by homogenizing the removed brain and performing an immunoassay or the like. By comparing the results obtained by these methods between the test substance administration group and the non-administration group, the effectiveness of the test substance can be evaluated. When improvement in the symptoms of Alzheimer's disease is observed in the test substance administration group compared to the non-administration group, the test substance is selected as a prophylactic and / or therapeutic drug for Alzheimer's disease.
また、動物の行動解析などにより、学習・記憶能力の差違を投与群と非投与群との間で比較してもよい。被験物質投与群において、非投与群と比較して、有意な学習・記憶障害の改善が認められれば、該被験物質をアルツハイマー病の予防及び／又は治療薬として選択する。学習・記憶障害の評価方法については、上記＜ノックインマウスの特徴＞において記載される方法を採用することができる。 Further, the difference in learning / memory ability may be compared between the administration group and the non-administration group by animal behavior analysis or the like. If a significant improvement in learning / memory impairment is observed in the test substance administration group compared to the non-administration group, the test substance is selected as a prophylactic and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease. As a method for evaluating learning / memory impairment, the method described in <Characteristics of Knock-in Mouse> can be employed.
また、前記ノックインマウス由来の生体の一部、好ましくはアルツハイマーの病変部に相当する脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳等）の組織片または細胞（例、神経細胞等）を各組織又は細胞の種類に応じた条件下で培養し、これに被験物質を添加して一定時間（例えば、１〜７２時間）インキュベートした後、組織片もしくは細胞を、上記インビボスクリーニングにおける脳と同様に処理し、被験物質投与群と非投与群との間で比較することによっても、アルツハイマー病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングすることができる。 In addition, a part of the living body derived from the knock-in mouse, preferably each part of the brain and brain corresponding to the lesion of Alzheimer (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla oblongata) , Cerebellum, etc.) tissue pieces or cells (eg, nerve cells, etc.) are cultured under conditions according to the type of each tissue or cell, and a test substance is added thereto for a certain time (for example, 1 to 72 hours). After the incubation, the tissue pieces or cells are treated in the same manner as the brain in the in vivo screening, and the preventive and / or therapeutic drug for Alzheimer's disease is screened by comparing between the test substance administration group and the non-administration group. can do.
［アルツハイマー病治療薬の薬効評価方法］
また、本発明は、前記ノックインマウス又はその生体の一部を用いたアルツハイマー病の予防及び／又は治療薬の薬効評価方法を提供する。該薬効評価方法は、ノックインマウス又はその生体の一部に被検物質を適用する工程、及び前記ノックインマウス又はその生体の一部におけるアルツハイマー病の症状の改善効果を調べる工程を含むことを特徴とする。[Method for evaluating the efficacy of Alzheimer's disease drugs]
The present invention also provides a method for evaluating the efficacy of a prophylactic and / or therapeutic drug for Alzheimer's disease using the knock-in mouse or a part of the living body thereof. The method for evaluating drug efficacy includes a step of applying a test substance to a knock-in mouse or a part of the living body thereof, and a step of examining the effect of improving the symptoms of Alzheimer's disease in the knock-in mouse or a part of the living body thereof. To do.
被検物質としては、アルツハイマー病の予防及び／又は治療薬の効果が確認されていない新規化合物を使用することができ、また既にアルツハイマー病の予防及び／又は治療薬としての有効性が示唆されている候補化合物を使用することもできる。薬効の評価は、前記候補化合物が実際にアルツハイマー病の予防及び／又は治療に有効であるか否かを、アルツハイマーの症状の改善について、被検物質の投与群と非投与群を比較することにより行うことができる。ここで、アルツハイマー病の症状の改善効果を調べる方法等については上記スクリーニング方法の場合と同様に行うことができる。 As a test substance, a novel compound for which the effect of a preventive and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease has not been confirmed can be used, and its effectiveness as a preventive and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease has already been suggested. Candidate compounds can also be used. Evaluation of drug efficacy is carried out by comparing whether the candidate compound is actually effective for the prevention and / or treatment of Alzheimer's disease, comparing the administration group of the test substance with the non-administration group for improvement of Alzheimer's symptoms. It can be carried out. Here, the method for examining the effect of improving the symptoms of Alzheimer's disease can be performed in the same manner as in the case of the above screening method.
以下の実施例において本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。 The present invention will be described more specifically in the following examples, but the present invention is not limited thereto.
（１）ノックインマウスの作製
大阪変異を有するアミロイドβタンパク質を生成するノックインマウスは、以下の方法により作製された。
［遺伝子ターゲッティングベクターの作製］
図１（ａ）に示されるように、マウスＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）遺伝子のゲノムは、１８個のエクソンで構成される（図１中、数字１〜１８は各エクソンの番号を表す）。大阪変異は、アミロイドβタンパク質においてＮ末端から数えて第２２番のグルタミン酸残基が欠失される変異であり、アミロイドβタンパク質の第２２番アミノ酸はエクソン１７によりコードされる。そこでこのような変異をノックインするためのターゲッティングベクターを作製した。具体的な方法を以下に記載する。 (1) Production of knock-in mouse A knock-in mouse that produces amyloid β protein having an Osaka mutation was produced by the following method.
[Generation of gene targeting vector]
As shown in FIG. 1 (a), the genome of the mouse APP (amyloid precursor protein) gene is composed of 18 exons (in FIG. 1, numbers 1 to 18 represent the number of each exon). The Osaka mutation is a mutation in which the 22nd glutamic acid residue counted from the N-terminus of amyloid β protein is deleted, and the 22nd amino acid of amyloid β protein is encoded by exon 17. Therefore, a targeting vector for knocking in such a mutation was prepared. A specific method is described below.
マウス１２９系統のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、エクソン１６の５'側イントロンを含む領域の末端にＮｏｔＩ、エクソン１７の３'側イントロンを含む領域の末端にＡｓｃＩの制限酵素サイトが付加されるようにエクソン１６及び１７を含むＤＮＡ断片を得た。即ち、TV-A-F5'(NotI)（配列番号３）及びTV-A-F3'(NarI)（配列番号４）のプライマーセット、ならびにTV-Am-M5'（配列番号５）及びTV-Am-M3'(AscI)（配列番号６）のプライマーセットを用いたＰＣＲ法により当該ＤＮＡ断片を得た。ここで、配列番号４に示されるプライマーを使用することにより、エクソン１７内にコードされるアミロイドβタンパク質の第２２番目のグルタミン酸に対応する核酸配列ＧＡＡを欠失させた。 A genomic DNA library of mouse 129 strain was screened, and a restriction enzyme site of AscI was added to the end of the region containing the 5 ′ intron of exon 16 and the end of the region containing the 3 ′ intron of exon 17 A DNA fragment containing exons 16 and 17 was obtained. That is, a primer set of TV-A-F5 ′ (SEQ ID NO: 3) and TV-A-F3 ′ (NarI) (SEQ ID NO: 4), and TV-Am-M5 ′ (SEQ ID NO: 5) and TV- The DNA fragment was obtained by PCR using a primer set of Am-M3 ′ (AscI) (SEQ ID NO: 6). Here, the nucleic acid sequence GAA corresponding to the 22nd glutamic acid of the amyloid β protein encoded in exon 17 was deleted by using the primer shown in SEQ ID NO: 4.
一方、TV-AM-R5'(PmeI)（配列番号７）及びTV-Am-R3'(AatII)（配列番号８）のプライマーを用いてエクソン１７の３'側イントロンを含む領域の末端にＰｍｅＩ及びＡａｔＩＩ制限酵素サイトが付加されるようにクローニングし、ｐＴＶベクターの３'側腕として用いた。 On the other hand, using the TV-AM-R5 ′ (PmeI) (SEQ ID NO: 7) and TV-Am-R3 ′ (AatII) (SEQ ID NO: 8) primers, PmeI is located at the end of the region containing the 3 ′ intron of exon 17. And the AatII restriction enzyme site was added and used as the 3 ′ arm of the pTV vector.
更に、エクソン１７の３'側イントロン中にｌｏｘ Ｐ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰカセット（ｎｅｏカセット）を挿入した。ｎｅｏ耐性遺伝子は、Ｃｒｅマウスとの交配によってゲノムＤＮＡから排除されるように、ＬｏｘＰ（図１（ｂ）中、三角で表わされる）の間にデザインされている。また、得られたターゲッティングベクターが染色体上にランダムに挿入された場合に、得られた組換えＥＳ細胞が死滅するように、ジフテリア毒素の遺伝子（ＤＴ）の配列を、３'末端に付加した。 Further, a lox P-neo-loxP cassette (neo cassette) was inserted into the 3 ′ intron of exon 17. The neo resistance gene is designed during LoxP (represented by triangles in FIG. 1 (b)) so that it is excluded from genomic DNA by mating with Cre mice. Further, a diphtheria toxin gene (DT) sequence was added to the 3 ′ end so that the obtained recombinant ES cells would be killed when the obtained targeting vector was randomly inserted on the chromosome.
このように構築したターゲッティングベクター配列を、制限酵素サイトを利用したライゲーション（前腕のライゲーションにはＮｏｔＩ、Ｎａｒ１及びＡｓｃ１を使用し、後腕のライゲーションにはＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ及びＡａｔＩＩを使用）によりｐＴＶベクターに組み込み、ｎｅｏカセットとエクソン１６の間に、変異型エクソン１７のＤＮＡ断片が挿入されたターゲッティングベクターコンストラクトプラスミド（ｐＴＶベクターを、ｐＴＶＦｌｏｘＰＧＫｎｅｏｍｐＡ／Ａ４と表すことがある）を構築した。作製されたプラスミドを大腸菌に形質転換し、培養した後にプラスミドを抽出し、制限酵素ＮｏｔＩで切断した直鎖状のターゲッティングベクターを精製した。 The targeting vector sequence thus constructed was ligated to the pTV vector by ligation using restriction enzyme sites (using NotI, Nar1 and Asc1 for ligation of the forearm and AscI, PmeI and AatII for ligation of the rear arm). Incorporation, a targeting vector construct plasmid in which a DNA fragment of mutant exon 17 was inserted between the neo cassette and exon 16 (the pTV vector may be represented as pTVFloxPGKneompA / A4) was constructed. The prepared plasmid was transformed into Escherichia coli and cultured, and then the plasmid was extracted, and a linear targeting vector cut with the restriction enzyme NotI was purified.
ターゲッティングベクターに使用した各プライマーの配列は、以下の通りである。下記配列中、下線部は制限酵素サイトを示す。またTV-A-F3'(Nar1)の配列（配列番号４）において、太字下線で示されたＣとＡの間のグルタミン酸残基をコードする塩基配列ＧＡＡが欠失されていることを示す。 The sequence of each primer used in the targeting vector is as follows. In the following sequences, the underlined portion indicates a restriction enzyme site. In addition, in the TV-A-F3 ′ (Nar1) sequence (SEQ ID NO: 4), it is shown that the base sequence GAA encoding the glutamic acid residue between C and A indicated by bold underline is deleted.
TV-A-F5'(NotI)（配列番号３）:
5'-ATAAGAATGCGGCCGCGTAGGAAGGCCCAGCTAGAAGGAAATGGG-3'
TV-A-F3'(NarI)（配列番号４）:
5'-CCGATGATGGCGCCTTTGTTCGAACCCACATCAGCAAAGAACACCTTCGAAAGGAAGCCG-3'
TV-Am-M5'（配列番号５）：
5'-CGGCTTCCTTTCGAAGGTGTTCTTTGCT-3'
TV-Am-M3'(AscI)（配列番号６）：
5'-TTGGCGCGCCAGTTAACTAGGCCTAATGTTCCTCCATGGTAACCACGCA-3'
TV-AM-R5'(PmeI)（配列番号７）：
5'-AGCTTTGTTTAAACAGGCTGTTGCCCTGAACTTCCACCTGAG-3'
TV-Am-R3'(AatII)（配列番号８）：
5'-GGGGTTAGACGTCCCATTGGGTGTGACCCCACTTCAGAG-3'TV-A-F5 ′ (NotI) (SEQ ID NO: 3):
5'-ATAAGAAT GCGGCCGC GTAGGAAGGCCCAGCTAGAAGGAAATGGG-3 '
TV-A-F3 '(NarI) (SEQ ID NO: 4):
5'-CCGATGAT GGCGCC TTTGTTCGAACCCACAT CA GCAAAGAACACCTTCGAAAGGAAGCCG-3 '
TV-Am-M5 ′ (SEQ ID NO: 5):
5'-CGGCTTCCTTTCGAAGGTGTTCTTTGCT-3 '
TV-Am-M3 ′ (AscI) (SEQ ID NO: 6):
5'-T TGGCGCGCC AGTTAACTAGGCCTAATGTTCCTCCATGGTAACCACGCA-3 '
TV-AM-R5 ′ (PmeI) (SEQ ID NO: 7):
5'-AGCTTT GTTTAAAC AGGCTGTTGCCCTGAACTTCCACCTGAG-3 '
TV-Am-R3 ′ (AatII) (SEQ ID NO: 8):
5'-GGGGTTA GACGTC CCATTGGGTGTGACCCCACTTCAGAG-3 '
［ターゲッティングコンストラクトのＥＳ細胞への導入］
電気穿孔法により、ＮｏｔＩで切断された直鎖状のターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入した。具体的には以下の通りである。[Introduction of targeting construct into ES cells]
A linear targeting vector cleaved with NotI was introduced into ES cells by electroporation. Specifically, it is as follows.
ＥＳ細胞（Ｒ１細胞：Ｄｒ．Ｎａｇｙ，Ａ（Ｃａｎａｄａ）より供与）を、２０％牛胎児血清を含む高ブドウ糖ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、必須アミノ酸、ヌクレオシド、ピルビン酸、βメルカプトエタノール、ＥＳＧＲＯ（マウスＬＩＦ；分化抑制因子）、ぺニシリン、ストレプトマイシンを添加した培地を用い、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で対数増殖期まで培養した。このＥＳ細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、１０7細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁し、前述のように調製されたｐＴＶＦｌｏｘＰＧＫｎｅｏｍｐＡ／Ａ４（２０）μｇを添加して、エレクトロポレーション法により導入を行った。ES cells (R1 cells: donated by Dr. Nagy, A (Canada)) were added to high glucose DMEM medium (Invitrogen) containing 20% fetal calf serum, essential amino acids, nucleosides, pyruvate, β mercaptoethanol, ESGRO (mouse) Using a medium supplemented with LIF (differentiation inhibitor), penicillin, and streptomycin, the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 until the logarithmic growth phase. The ES cells were trypsinized and dispersed into single cells, suspended in a medium at 10 7 cells / ml, and pTVFloxPGKneompA / A4 (20) μg prepared as described above was added, Introduction was performed by electroporation.
更に、抗生物質Ｇ４１８を用いたスクリーニングによって、ネオマイシン耐性ＥＳコロニーを選択した。その後、一部の細胞塊をストックした。ストックされた細胞塊の一部を用いてアルコール抽出によってＤＮＡゲノムの抽出を行い、Ｓｔｕ１制限酵素によって消化して得られたＤＮＡ断片をアガロース電気泳動に供した。ＳｔｕＩサイトはネオマイシン耐性遺伝子中に存在し、ネオマイシン耐性遺伝子の挿入によってＳｔｕＩフラグメントのサイズが異なることから、ＡＰＰ遺伝子の適切な位置にネオマイシン遺伝子が導入されていることを指標に遺伝子ノックインを確認した。 Furthermore, neomycin resistant ES colonies were selected by screening with antibiotic G418. Thereafter, a part of the cell mass was stocked. A DNA genome was extracted by alcohol extraction using a part of the stocked cell mass, and the DNA fragment obtained by digestion with Stu1 restriction enzyme was subjected to agarose electrophoresis. Since the StuI site exists in the neomycin resistance gene and the size of the StuI fragment varies depending on the insertion of the neomycin resistance gene, gene knock-in was confirmed using the neomycin gene introduced at an appropriate position of the APP gene as an index.
約１００個のクローンより、配列番号９に示される５'プローブを用いてサザンブロッティングを行い、ハイブリダイズする陽性クローン２個を得た。更に配列番号１０に示される３'プローブを用いてサザンブロッティングを行い、相同組換えが生じていることを確認した。更に、ＰＣＲ法により変異型エクソン１７を有することを確認したところ、最終的に１個の陽性クローンを同定した。得られた陽性クローンの片方のＡＰＰ遺伝子は、図１（ｃ）に示される構造を有していると予測された。
5' probe（配列番号９）
5'-TCCCCCACCCCCTGATATAAAAGGGAAGACTACTTACAAGTTTTCACTAAAATCTCAGAAGTAACTTTAACTGCCGTGTTACTACTCGCATGTGGTGAGGGAGGCTGCATTAGAAAGAAATCACTGTTGATCTAACGAGGAAGTAGGTCAGGTTTTATAAAGGTTTGGAGGAAGATGAAAATAAGCAACCGGGGTGATTTAAAGAGCA-3'
3' Probe（配列番号１０）
5'-TCCTCTCGTCTTCCAACGCGGCTTTACAGAGGCTTGGAGCTCATATTAATCCAGCAGACTCAAGCAAGCACCTCCTCTTCTCCTCACTGGGAGAGGTAGGACAAATATAGAAACAAGAAAAGCCATTAGCTACTGTAGAGAGATGTGTGCCCCGCACAGTCTGCAGAGACTAACACCTGCCCGGCTCTCCGTGACAATGGCTGAGGCAGATTATGTTTACCGTGCCGACCTGATCTTACAGCTGAAGCCTGCTGTAGAGCTCTGGCCTGGCG-3'Southern blotting was performed from about 100 clones using the 5 ′ probe shown in SEQ ID NO: 9 to obtain two positive clones that hybridized. Furthermore, Southern blotting was performed using the 3 ′ probe shown in SEQ ID NO: 10 to confirm that homologous recombination had occurred. Furthermore, when it was confirmed by PCR that the mutant exon 17 was present, one positive clone was finally identified. One APP gene of the obtained positive clone was predicted to have the structure shown in FIG.
5 'probe (SEQ ID NO: 9)
5'-TCCCCCACCCCCTGATATAAAAGGGAAGACTACTTACAAGTTTTCACTAAAATCTCAGAAGTAACTTTAACTGCCGTGTTACTACTCGCATGTGGTGAGGGAGGCTGCATTAGAAAGAAATCACTGTTGATCTAACGAGGAAGTAGGTCAGGTTTTATAAAGGTTTGGAGGAAGATGAAAATAAGCAACCGGGGTGATTA
3 'Probe (SEQ ID NO: 10)
5'-TCCTCTCGTCTTCCAACGCGGCTTTACAGAGGCTTGGAGCTCATATTAATCCAGCAGACTCAAGCAAGCACCTCCTCTTCTCCTCACTGGGAGAGGTAGGACAAATATAGAAACAAGAAAAGCCATTAGCTACTGTAGAGAGATGTGTGCCCCGCACAGTCTGCGCATTGCGCTGTGTG
［ＡＰＰ変異型マウスの作製］
上述のようにして得られた陽性のＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６とＤＢＡ２マウスの交配により得られた８細胞期胚と凝集させ、ＩＣＲ偽妊娠マウス（日本ＳＬＣ社より購入）の子宮に戻してキメラマウスを得た。これらのキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウス（日本ＳＬＣ社より購入）と交配し、生まれたＦ１世代マウスに対してゲノムチェックを行って変異ＡＰＰ遺伝子をヘテロで有するマウスを選別した。変異ＡＰＰ遺伝子をヘテロで有するマウスを、更にＢ６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）と２０世代以上戻し交配をしてコンジェニックマウスを作製した。得られたコンジェニックマウスのうち、生殖系に変異ＡＰＰ遺伝子をホモで有するマウスを選別した。次に、選別されたマウスとＣＡＧ−Ｃｒｅマウス（大阪大学医学部 宮崎純一博士より供与）と交配することにより、ＬｏｘＰにより挟まれたｎｅｏ遺伝子を除去させた。[Preparation of APP mutant mice]
The positive ES cell clone obtained as described above was aggregated with an 8-cell embryo obtained by mating C57BL / 6 and DBA2 mice, and returned to the uterus of ICR pseudopregnant mice (purchased from Japan SLC). Chimeric mice were obtained. These chimeric mice were crossed with C57BL / 6 mice (purchased from SLC, Japan), and F1 generation mice born were subjected to genome check to select mice having heterozygous mutant APP genes. A mouse having a mutant APP gene heterozygously was further backcrossed with a B6 mouse (C57BL / 6) for 20 generations or more to produce a congenic mouse. Among the obtained congenic mice, mice having homozygous mutant APP genes in the reproductive system were selected. Next, the selected mouse and CAG-Cre mouse (provided by Dr. Junichi Miyazaki, Osaka University School of Medicine) were crossed to remove the neo gene sandwiched between LoxP.
このようにして得られるノックインマウスは、以下のアミノ酸配列からなる変異アミロイドβタンパク質を生合成する。配列番号１で示される変異アミロイドβタンパク質は、下記アミノ酸配列の下線部の第２１〜２２番のアミノ酸配列（ＡＤ）の間でグルタミン酸（Ｅ）が欠失されている。
ＤＡＥＦＧＨＤＳＧＦＥＶＲＨＱＫＬＶＦＦＡＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）The knock-in mouse thus obtained biosynthesizes a mutant amyloid β protein having the following amino acid sequence. In the mutant amyloid β protein represented by SEQ ID NO: 1, the glutamic acid (E) is deleted between the amino acid sequences (AD) of the 21st to 22nd underlined amino acid sequences below.
DAEFFGHDGFEVRHQKLVFF AD VGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 1)
得られたノックインマウス（ｈｏｍｏＫＩと表記することがある）を、温度約２５℃、１２時間／１２時間の明暗サイクル、自由飲水、自由摂食の条件下で４、６、８、１２、１８、２４カ月間に亘り維持した。 The obtained knock-in mouse (sometimes referred to as homoKI) was subjected to 4, 6, 8, 12, 18, under the conditions of a temperature of about 25 ° C., a light / dark cycle of 12 hours / 12 hours, free drinking, and free feeding. Maintained for 24 months.
比較対象として、ヘテロノックイン（＋／−）マウス（ｈｅｔｅｒｏＫＩと表記することがある）、非ノックイン（−／−）マウス（ｎｏｎＫＩと表記することがある）、及びＴＧ２５７６マウスを用い、それぞれｈｏｍｏＫＩと同様の飼育条件で維持した。なお、非ノックインマウスとしてはＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。また、Ｔｇ２５７６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ社より購入）は、アルツハイマー病の脳組織変化の特徴の１つである老人斑を再現可能な疾患モデルマウスである（Ｈｏｌｃｏｍｂ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４；９７−１００，１９９８）。被検動物は、いずれも雄性のマウスを使用した。 Hetero knock-in (+/−) mouse (may be referred to as “heteroKI”), non-knock-in (− / −) mouse (may be referred to as “nonKI”), and TG2576 mouse as comparison targets, respectively, and similar to homoKI Maintained under the breeding conditions. In addition, C57BL / 6 mice were used as non-knock-in mice. Tg2576 mice (purchased from Taconic) are disease model mice that can reproduce senile plaques, which is one of the characteristics of Alzheimer's disease brain tissue changes (Holcomb L et al., Nature Medicine 4; 97-100). 1998). Male mice were used as test animals.
（２）免疫組織化学
各評価に使用する試料を次のように調製した。マウス脳を４容量％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した後、５μｍの厚さの切片を作製した。１００％キシレンに３０分間浸漬することを５回繰り返すことにより脱パラフィン処理を行った。その後、更に１００％アルコールに１０分間浸漬することを５回繰り返し、更にリン酸緩衝液に１０分間浸漬することを２回繰り返して水和処理を行った。このような処理に供した各試料を、以下（Ａ）〜（Ｅ）に記載される抗体を用いて免疫染色を行い、アルツハイマー病の病理学的特徴について評価した。 (2) Immunohistochemistry Samples used for each evaluation were prepared as follows. The mouse brain was fixed with 4% by volume paraformaldehyde and embedded in paraffin, and then a section having a thickness of 5 μm was prepared. The deparaffinization treatment was performed by repeating the immersion in 100% xylene for 30 minutes 5 times. Thereafter, further immersing was performed by repeating immersion in 100% alcohol for 10 minutes 5 times and further immersing in phosphate buffer for 10 minutes twice. Each sample subjected to such treatment was immunostained using the antibodies described in (A) to (E) below, and the pathological features of Alzheimer's disease were evaluated.
（Ａ）アミロイドβの蓄積及び蓄積されたアミロイドβの形態
アルツハイマー病の患者では、脳の海馬にアミロイドβタンパク質が異常蓄積し、それが老人斑を形成することが知られている。しかし、大阪変異を有するアミロイドβタンパク質はアミロイド線維を形成しにくく（即ち、老人斑を形成しにくい）、より神経毒性の強いアミロイドβのオリゴマーの形成が促進されることが知られている（Ｔｏｍｉｙａｍａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６３;３７７-３８７，２００８）。更に、大阪変異を有するアミロイドβタンパク質は、細胞外への分泌が低下し、ニューロン細胞質内に蓄積することが示唆されている（Ｎｉｓｈｉｔｓｕｊｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１７４；９５７−９６９，２００９）。そこで、ｈｏｍｏＫＩマウスの脳における老人斑の形成、アミロイドβタンパク質の蓄積、及びアミロイドβの形態について観察した。(A) Accumulation of Amyloid β and Form of Accumulated Amyloid β It is known that in patients with Alzheimer's disease, amyloid β protein accumulates abnormally in the hippocampus of the brain, which forms senile plaques. However, it is known that an amyloid β protein having an Osaka mutation is less likely to form amyloid fibrils (that is, less likely to form senile plaques), and promotes the formation of oligomers of amyloid β that are more neurotoxic (Tomiyama). T et al., Ann Neurol 63; 377-387, 2008). Furthermore, it has been suggested that the amyloid β protein having the Osaka mutation has a decreased extracellular secretion and accumulates in the neuronal cytoplasm (Nishitsuki K et al., Am J Pathol, 174; 957-969, 2009). ). Therefore, the formation of senile plaques, the accumulation of amyloid β protein, and the morphology of amyloid β in the brains of homoKI mice were observed.
（Ａ−１）老人斑の形成を観察するため、２４カ月齢のｈｏｍｏＫＩ及びＴｇ２５７６マウスの脳に対して免疫染色を行った。具体的には、前述のように脱パラフィン、水和処理に供された脳切片に対し、一次抗体としてアミロイド線維に強く結合するβ００１抗体（発明者により作製：ウサギ由来ポリクローナル抗体、Ｌｉｐｐａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ，１９９９）を用いて、室温（約２５℃）で１２時間反応させた。一次抗体反応後、脳切片を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ））を使用して洗浄し、その後二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ社 ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて一次抗体の時と同様に反応させ、洗浄した。その後、アビジンビオチン複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ社 ＣＡ，ＵＳＡ）を商品取扱説明書に従い脳切片に塗布し、室温で６０分間反応させた後、一次抗体の時と同様に洗浄した。その後、顕微鏡下で観察した。 (A-1) In order to observe the formation of senile plaques, immunostaining was performed on brains of 24-month-old homoKI and Tg2576 mice. Specifically, β001 antibody (prepared by the inventor: rabbit-derived polyclonal antibody, Lippa C et al.) That strongly binds to amyloid fibrils as a primary antibody against brain sections subjected to deparaffinization and hydration as described above , Arch. Neurol, 1999) at room temperature (about 25 ° C.) for 12 hours. After the primary antibody reaction, the brain section was washed with 100 mM Tris-HCL (pH 7.6) and 150 mM NaCl (Tris-buffered saline (TBS)), and then a biotin-labeled anti-mouse IgG antibody (Vectastein) as a secondary antibody. (CA, USA) and the same reaction as in the case of the primary antibody, followed by washing. Thereafter, an avidin biotin complex (Vectastein CA, USA) was applied to a brain section according to the product instruction manual, reacted at room temperature for 60 minutes, and then washed in the same manner as for the primary antibody. Then, it observed under the microscope.
免疫染色に供した脳切片の海馬付近の写真を図２に示す。図２に示されるように、Ｔｇ２５７６マウスの海馬ではヒトアルツハイマー病患者と同じ老人斑が皮質全体に観察された（図２（ａ））。一方、ｈｏｍｏＫＩでは老人斑が形成されていないことが示された（図２（ｂ））。 A photograph of the vicinity of the hippocampus of a brain section subjected to immunostaining is shown in FIG. As shown in FIG. 2, in the hippocampus of Tg2576 mice, the same senile plaques as in human Alzheimer's disease patients were observed throughout the cortex (FIG. 2 (a)). On the other hand, it was shown that senile plaques were not formed with homoKI (FIG. 2 (b)).
更に、ｈｏｍｏＫＩ（図３（ｂ，ｄ））とｎｏｎＫＩ（図３（ａ，ｃ））を比較すると、ｈｏｍｏＫＩではｎｏｎＫＩには見られないニューロン細胞質におけるアミロイドβタンパク質の異常蓄積が認められた。この結果は、ヒト型の大阪変異が導入されたＡＰＰ-Ｔｇマウス（Ｔｏｍｉｙａｍａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１０）の結果と酷似していた。 Furthermore, when homoKI (FIG. 3 (b, d)) and nonKI (FIG. 3 (a, c)) were compared, abnormal accumulation of amyloid β protein in the neuronal cytoplasm was observed in homoKI, which was not found in nonKI. This result was very similar to the result of APP-Tg mice (Tomiyama T et al., J. Neurosci, 2010) into which the human-type Osaka mutation was introduced.
（Ａ−２）アミロイドβ（Ａβ）タンパク質の蓄積について、更に観察を行うため、まず脱パラフィン及び水和処理後の脳切片を、ｐＨ２に調整された塩酸水溶液中で１０分間ボイルすることにより抗原賦活化処理を行った。その後、Ａβタンパク質に対して１４Ｆ１（マウス由来モノクローナル抗体：ＩＢＬ製，群馬，日本）を一次抗体として用い、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて免疫染色を行った。免疫染色は、上記（Ａ−１）に記載されるβ００１抗体を用いた場合と同様の手法により実施した。 (A-2) To further observe the accumulation of amyloid β (Aβ) protein, the brain section after deparaffinization and hydration was first boiled in an aqueous hydrochloric acid solution adjusted to pH 2 for 10 minutes. Activation processing was performed. Thereafter, 14F1 (mouse-derived monoclonal antibody: manufactured by IBL, Gunma, Japan) was used as the primary antibody for Aβ protein, and immunostaining was performed using a biotin-labeled anti-mouse IgG antibody as the secondary antibody. The immunostaining was performed by the same method as in the case of using the β001 antibody described in (A-1) above.
抗１４Ｆ１抗体により免疫染色を行ったｈｏｍｏＫＩ、ｈｅｔｅｒｏＫＩ及びｎｏｎＫＩのそれぞれについて、各月齢のマウスの海馬ＣＡ１領域、ＣＡ３領域及びＤＧ領域の切片の写真を図４（１）及び（２）に示す。図４（１）より、ｈｏｍｏＫＩにおいてアミロイドβの蓄積は６か月齢（Ａ、Ｇ及びＭ）では認められなかったが、８カ月齢（Ｂ〜Ｅ、Ｈ〜Ｋ及びＮ〜Ｑ）よりアミロイドβの蓄積が確認された。一方、２４か月齢のｎｏｎＫＩではアミロイドβの蓄積は認められなかった（図４（１）Ｆ、Ｌ及びＲ）。また、ｈｅｔｅｒｏＫＩマウスにおいてもアミロイドβの蓄積は認められなかった（図４（２））。 4 (1) and (2) show photographs of sections of the hippocampal CA1 region, CA3 region and DG region of each age-old mouse for each of homoKI, heteroKI and nonKI which were immunostained with an anti-14F1 antibody. From FIG. 4 (1), amyloid β accumulation was not observed at 6 months of age (A, G and M) in homoKI, but amyloid β was observed at 8 months of age (B to E, H to K and N to Q). Was confirmed. On the other hand, accumulation of amyloid β was not observed in non-KI at 24 months of age (FIG. 4 (1) F, L and R). Also, no accumulation of amyloid β was observed in the heteroKI mice (FIG. 4 (2)).
（Ａ−３）蓄積されたアミロイドβの形態を確認するため、抗アミロイドβオリゴマー抗体Ａ１１抗体（ウサギ由来ポリクローナル抗体：ＣＳＲ Ｊａｐａｎ製）を商品取扱説明書に従い一次抗体として用い、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いて免疫染色を行った。免疫染色は、上記（Ａ−１）に記載されるβ００１抗体を用いた場合と同様の手法により実施した。免疫染色を行ったｈｏｍｏＫＩ、ｈｅｔｅｒｏＫＩ及びｎｏｎＫＩのそれぞれについて、各月齢のマウスの海馬ＣＡ１領域、ＣＡ３領域及びＤＧ領域の切片の写真を図５に示す。図５より、１４Ｆ１抗体（抗アミロイドβ抗体）による染色と類似して、海馬ＣＡ１、ＣＡ３及びＤＧ領域の神経細胞内にアミロイドβオリゴマーの蓄積が観察された（図５Ａ〜Ｏ）。即ち、蓄積しているアミロイドβはオリゴマーの形態をとり、ヒトにおける大阪変異型アルツハイマー病の症状が再現されていることが示された。 (A-3) In order to confirm the form of accumulated amyloid β, anti-amyloid β oligomer antibody A11 antibody (rabbit-derived polyclonal antibody: manufactured by CSR Japan) was used as a primary antibody according to the product instruction manual, and biotinylated anti-rabbit IgG Immunostaining was performed using the antibody as a secondary antibody. The immunostaining was performed by the same method as in the case of using the β001 antibody described in (A-1) above. FIG. 5 shows photographs of sections of hippocampal CA1 region, CA3 region and DG region of each month-old mouse for each of homoKI, heteroKI, and nonKI subjected to immunostaining. From FIG. 5, accumulation of amyloid β oligomers was observed in neurons in hippocampal CA1, CA3, and DG regions, similar to staining with 14F1 antibody (anti-amyloid β antibody) (FIGS. 5A to O). That is, the accumulated amyloid β was in the form of an oligomer, and it was shown that the symptoms of Osaka mutant Alzheimer's disease in humans were reproduced.
（Ｂ）タウタンパク質の異常リン酸化
アルツハイマー病患者における病変の１つに、タウタンパク質が異常なリン酸化を受けて細胞質中で線維化して沈着する現象が知られている。タウタンパク質は、中枢神経細胞に多量に存在し、脳の神経ネットワークを構成する神経軸索の機能に必須なタンパク質であるが、異常リン酸化により蓄積して神経原線維変化を生じ、脳機能の低下を招くとされている。(B) Abnormal phosphorylation of tau protein As one of the lesions in Alzheimer's disease patients, a phenomenon is known in which tau protein is abnormally phosphorylated and fibrotically deposited in the cytoplasm. Tau protein is abundant in central neurons and is essential for the function of nerve axons that make up the neural network of the brain, but accumulates due to abnormal phosphorylation and causes neurofibrillary tangles. It is said to cause a decline.
異常リン酸化されたタウタンパク質の検出においては、抗体反応の前に、内因性のペルオキシダーゼ活性を抑制するため、脱パラフィン処理及び水和処理後の脳切片に対して０．３％Ｈ2Ｏ2／メタノールによる処理を３０分間行い、その後ＴＢＳで２０％に希釈した仔ウシ血清で１時間インキュベートすることによりブロッキング処理を行った。In the detection of abnormally phosphorylated tau protein, 0.3% H 2 O 2 was applied to the deparaffinized and hydrated brain sections in order to suppress endogenous peroxidase activity before the antibody reaction. / Methanol treatment was performed for 30 minutes, followed by incubation with calf serum diluted to 20% with TBS for 1 hour for blocking treatment.
次に、リン酸化特異的な抗タウ抗体である抗ＰＨＦ−１抗体（マウス由来モノクローナル抗体：Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｒｏｎｘ，ＮＹのＤａｖｉｅｓ，Ｐ博士より供与）を１０００倍希釈で一次抗体として用い、室温（約２５℃）で１２時間反応させた。一次次抗体反応後、脳切片を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ））を使用して洗浄した後、ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として用い、一次抗体の時と同様に反応させ、洗浄した。その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたアビジン−ビオチン複合体を二次抗体に結合させ、ＤＡＢ（３，３'−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド：（株）同仁堂化学研究所）を用いて基質を活性化して発色を行い、顕微鏡下で観察した。 Next, an anti-PHF-1 antibody (mouse-derived monoclonal antibody: donated by Dr. Davies, P, Albert Einstein College of Medicine, NY), which is a phosphorylation-specific anti-tau antibody, was used as a primary antibody at a 1000-fold dilution. And allowed to react at room temperature (about 25 ° C.) for 12 hours. After the primary antibody reaction, the brain section was washed with 100 mM Tris-HCL (pH 7.6) and 150 mM NaCl (Tris-buffered saline (TBS)), and then a biotinylated anti-mouse IgG antibody was used as a secondary antibody. The reaction was carried out in the same manner as for the primary antibody, followed by washing. Thereafter, an avidin-biotin complex labeled with horseradish peroxidase (HRP) was bound to the secondary antibody, and the substrate was formed using DAB (3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride: Dojindo Laboratories). When activated, color was developed and observed under a microscope.
免疫染色の結果を図６に示す。図６より、６カ月齢においては、ｈｏｍｏＫＩ、ｈｅｔｅｒｏＫＩ及びｎｏｎＫＩのいずれにもリン酸化タウタンパク質は検出されなかった（図６Ａ、Ｆ及びＫ）。しかし、８か月齢以降になると、ｈｏｍｏＫＩの海馬ＣＡ３領域の苔状線維にリン酸化タウタンパク質が観察された（図６Ｌ〜Ｏ）。一方、ｈｅｔｅｒｏＫＩ、ｎｏｎＫＩでは、８、１２、１８カ月齢において、リン酸化タウタンパク質は観察されず（図４Ａ〜Ｄ及びＦ〜Ｉ）、２４カ月齢でのみ海馬ＣＡ３領域の苔状線維にわずかなリン酸化タウタンパク質が観察された（図６Ｅ及びＪ）。 The result of immunostaining is shown in FIG. From FIG. 6, at 6 months of age, phosphorylated tau protein was not detected in any of homoKI, heteroKI, and nonKI (FIGS. 6A, F, and K). However, after 8 months of age, phosphorylated tau protein was observed in the mossy fibers in the hippocampal CA3 region of homoKI (FIGS. 6L to O). On the other hand, with heteroKI and nonKI, phosphorylated tau protein was not observed at 8, 12, and 18 months of age (FIGS. 4A to D and FI), and only at 24 months of age, there was a slight amount of mossy fibers in the hippocampal CA3 region. Phosphorylated tau protein was observed (FIGS. 6E and J).
（Ｃ）シナプスの変性
アルツハイマー病患者においては、シナプス変性が生じることによって記憶障害を引き起こすと考えられている。そこで、ｈｏｍｏＫＩにおけるシナプス変性について観察を行った。シナプス変性の観察のため、前シナプスのマーカータンパク質であるシナプトフィジンの蛍光染色を行い、シナプス密度の比較を行った。一次抗体としてを商品取扱説明書に従い抗シナプトフィジン抗体（マウス由来モノクローナル抗体：ＳＶＰ−３８；Ｓｉｇｍａ社）を用い、二次抗体としてＦＩＴＣ標識化抗マウス抗体を用いて免疫染色を行った。免疫染色は、上記（Ａ−１）に記載されるβ００１抗体を用いた場合と同様の手法により実施した。その後、共焦点蛍光顕微鏡下で観察を行った。(C) Synaptic degeneration In Alzheimer's disease patients, synaptic degeneration is considered to cause memory impairment. Therefore, observations were made on synaptic degeneration in homoKI. In order to observe synaptic degeneration, fluorescent staining of synaptophysin, which is a presynaptic marker protein, was performed to compare synaptic densities. Immunostaining was performed using an anti-synaptophysin antibody (mouse-derived monoclonal antibody: SVP-38; Sigma) as a primary antibody and a FITC-labeled anti-mouse antibody as a secondary antibody according to the instruction manual for the product. The immunostaining was performed by the same method as in the case of using the β001 antibody described in (A-1) above. Thereafter, observation was performed under a confocal fluorescence microscope.
シナプス密度の計測は、海馬内のＣＡ３領域における錐体細胞層の内側３０μｍ×３０μｍ、及び錐体細胞層内３０μｍ×３０μｍの計３０μｍ×６０μｍの範囲の染色輝度を、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化し、任意単位（Ａｒｂｔａｒｙ ｕｎｉｔ：ＡＵ）で表わした。ニューロンの消失については、海馬のＣＡ３領域のカーブの頂点を中心として、錐体細胞の並びに沿って双方向に１５０μｍ以内の領域にあるＮｅｕＮ染色で陽性となった細胞数をカウントすることにより評価した。結果を図７に示す。（統計処理：ＡＮＯＶＡ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｆｉｓｈｅｒ'ｓ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｓｔ） The synaptic density was measured using the NIH ImageJ software for staining luminance in the range of 30 μm × 60 μm in total 30 μm × 30 μm inside the pyramidal cell layer and 30 μm × 30 μm inside the pyramidal cell layer in the CA3 region in the hippocampus. It was quantified and expressed in arbitrary units (AU). The loss of neurons was evaluated by counting the number of cells that became positive by NeuN staining in the region within 150 μm in both directions along the cone cell centered on the apex of the curve of the CA3 region of the hippocampus. . The results are shown in FIG. (Statistical processing: ANOVA followed by Fisher's protected least significant difference test)
図７に示されるように、６カ月齢のマウスではいずれもシナプス密度に差は見られなかった（図７Ａ、Ｅ及びＩ）。一方、８カ月齢ではｈｏｍｏＫＩマウスにおいて、ｎｏｎＫＩマウス及びｈｅｔｅｒｏＫＩマウスと比べシナプス密度の有意な現象が観察された（図７Ｂ、Ｆ及びＪ）。この時、ｎｏｎＫＩマウスとｈｅｔｅｒｏＫＩマウス間でシナプス密度の有意な差は認められなかった。また、１２カ月齢でも同様に、ｎｏｎＫＩマウスとｈｅｔｅｒｏＫＩマウスのシナプス密度は同程度であるのに対し、ｈｏｍｏＫＩマウスのみでシナプス密度の有意な現象が観察された（図７Ｃ、Ｇ及びＫ）。そして、２４カ月齢になると、ｈｏｍｏＫＩマウスとｎｏｎＫＩマウス間にシナプス密度の差が見られただけでなく、ｈｅｔｅｒｏＫＩマウスにもシナプス密度の低下が見られ、この際のシナプス消失の重篤度は、ｈｏｍｏＫＩマウスが最も重篤度が高く、次いでｈｅｔｅｒｏＫマウス、ｎｏｎＫＩマウスの順であることが示された（図７Ｄ、Ｈ及びＬ）。 As shown in FIG. 7, no difference in synaptic density was observed in any of the 6-month-old mice (FIGS. 7A, E and I). On the other hand, at 8 months of age, a significant phenomenon of synaptic density was observed in homoKI mice compared to nonKI mice and heteroKI mice (FIGS. 7B, F and J). At this time, there was no significant difference in synaptic density between nonKI mice and heteroKI mice. Similarly, at 12 months of age, the synaptic density of nonKI mice and heteroKI mice was similar, whereas a significant phenomenon of synaptic density was observed only in homoKI mice (FIGS. 7C, G and K). And at the age of 24 months, not only was there a difference in synaptic density between homoKI mice and nonKI mice, but there was also a decrease in synaptic density in heteroKI mice, the severity of synapse loss at this time, HomoKI mice were the most severe, followed by heteroK mice followed by nonKI mice (FIGS. 7D, H and L).
（Ｄ）グリア細胞の活性化
グリア細胞の活性化は脳内の炎症の指標となることが知られている。そこで、ミクログリアとアストロサイトを対象としてグリア細胞の活性化について観察した。ミクログリアの観察のためには、抗Ｉｂａ１抗体（ウサギ由来ポリクローナル抗体：Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ 製）を商品取扱説明書に従い一次抗体として使用した。また、アストロサイトの観察のためには、抗ＧＦＡＰ抗体（マウス由来モノクローナル抗体：Ｃａｐｐｅｌ，ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製）を商品取扱説明書に従い免疫染色を行った。免疫染色は、上記（Ｂ）に記載される抗ＰＨＦ−１抗体を用いた場合と同様の手法により実施した。抗Ｉｂａ１抗体による染色結果を図８に示し、抗ＧＦＡＰ抗体による染色結果を図９に示す。(D) Activation of glial cells It is known that activation of glial cells serves as an indicator of inflammation in the brain. Therefore, we observed the activation of glial cells in microglia and astrocytes. For the observation of microglia, an anti-Iba1 antibody (rabbit-derived polyclonal antibody: manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was used as a primary antibody according to the product instruction manual. For observation of astrocytes, immunostaining was performed using an anti-GFAP antibody (mouse-derived monoclonal antibody: Cappel, manufactured by ICN Pharmaceuticals) according to the instruction manual for the product. The immunostaining was performed by the same method as that using the anti-PHF-1 antibody described in (B) above. The result of staining with the anti-Iba1 antibody is shown in FIG. 8, and the result of staining with the anti-GFAP antibody is shown in FIG.
図８に示されるように、ｈｏｎｏＫＩマウスについて月齢ごとに比較すると、８カ月齢まではっきりとしたミクログリアの活性化は見られなかった（図８Ａ及びＧ）。しかし、１２か月齢以降ではミクログリアの明らかな活性化が見られ脳内で炎症が起きていることが示された（図８Ｂ〜Ｄ及びＨ〜Ｊ）。また、ｈｅｔｅｒｏＫＩマウス及びｎｏｎＫＩマウスについては２４カ月齢においても、いずれもミクログリアの活性化は見られなかった（図８Ｅ、Ｆ、Ｋ及びＬ）。 As shown in FIG. 8, when compared to each month of age for the honoKI mice, no clear microglia activation was seen until 8 months of age (FIGS. 8A and G). However, after 12 months of age, microglia was clearly activated, indicating that inflammation occurred in the brain (FIGS. 8B to D and H to J). Furthermore, no activation of microglia was observed in the hetero-KI mice and non-KI mice even at 24 months of age (FIGS. 8E, F, K, and L).
また、図９に示されるように、抗Ｉｂａ１抗体による染色結果と同様に、ｈｏｍｏＫＩマウスについて８カ月齢まではっきりとしたアストロサイトの活性化は見られなかった（図９Ａ及びＧ）。しかし、１２か月齢以降ではアストロサイトの明らかな活性化が見られ、脳内で炎症が起きていることが示された（図９Ｂ〜Ｄ及びＨ〜Ｊ）。また、ｈｅｔｅｒｏＫＩマウス及びｎｏｎＫＩマウスについては２４カ月齢においても、いずれもアストロサイトの活性化は見られなかった（図９Ｅ、Ｆ、Ｋ及びＬ）。 In addition, as shown in FIG. 9, similar to the result of staining with the anti-Iba1 antibody, no clear activation of astrocytes was observed in the homoKI mice until 8 months of age (FIGS. 9A and G). However, after 12 months of age, clear activation of astrocytes was observed, indicating that inflammation was occurring in the brain (FIGS. 9B-D and HJ). Furthermore, no activation of astrocytes was observed in the hetero-KI mice and non-KI mice even at 24 months of age (FIGS. 9E, F, K and L).
（Ｅ）神経細胞の脱落
アルツハイマー病患者では、神経細胞の広範な脱落が認められ、次第に脳が委縮していくことが知られている。神経細胞の脱落については、２４カ月齢のｈｏｍｏＫＩ、ｈｅｔｅｒｏＫＩ及びｎｏｎＫＩマウスにおいて成熟した神経細胞に特異的に発現するマーカータンパク質ＮｅｕＮを指標とし細胞数を計測することにより評価した。前述のように脱パラフィン処理及び水和処理に供した脳切片に対し、クエン酸バッファー（ｐＨ６）中で３０分間ボイルすることにより抗原賦活化処理を行った。その後、一次抗体としてＮｅｕＮタンパク質に対する抗体（抗ＮｅｕＮ抗体：マウス由来モノクローナル抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔｓ製）を商品取扱説明書に従い免疫染色を行った。免疫染色は、上記（Ｂ）に記載される抗ＰＨＦ−１抗体を用いた場合と同様の手法により実施した。免疫染色後、海馬ＣＡ３領域のカーブの頂点を中心として、錐体細胞の並びに沿って双方向に１５０μｍ以内の領域にあるＮｅｕＮ抗体による染色で陽性となった細胞数をカウントすることにより行った。（統計処理：ＡＮＯＶＡ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｆｉｓｈｅｒ'ｓ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｓｔ）(E) Nerve cell loss It is known that in Alzheimer's disease patients, a wide range of nerve cell loss is observed and the brain gradually contracts. Neuronal loss was evaluated by measuring the number of cells using as a marker the marker protein NeuN that is specifically expressed in mature neurons in 24-month-old homoKI, heteroKI and nonKI mice. As described above, the brain sections subjected to the deparaffinization treatment and the hydration treatment were subjected to an antigen activation treatment by boiling for 30 minutes in a citrate buffer (pH 6). Thereafter, an antibody against NeuN protein (anti-NeuN antibody: mouse-derived monoclonal antibody: manufactured by Millipore Bioscience Research Reagents) was immunostained as a primary antibody according to the product instruction manual. The immunostaining was performed by the same method as that using the anti-PHF-1 antibody described in (B) above. After immunostaining, the number of cells that became positive by staining with NeuN antibody in the region of 150 μm or less in both directions along the pyramidal cell array with the apex of the curve of the hippocampal CA3 region as the center was counted. (Statistical processing: ANOVA followed by Fisher's protected least significant difference test)
抗ＮｅｕＮ抗体を用いた免疫染色の結果を図１０に示す。また、図１０において（Ａ）ｎｏｎＫＩ、（Ｂ）ｈｅｔｅｒｏＫＩ及び（Ｃ）ｈｏｍｏＫＩの脳切片の代表例をそれぞれ示す。図１０に示されるように、２４カ月齢においてｈｏｍｏＫＩマウスでは、ｈｅｔｅｒｏＫＩマウス及びｎｏｎＫＩマウスに比べて優位な神経細胞の減少が見られた。一方、ｈｅｔｅｒｏＫＩマウスとｎｏｎＫＩマウス間で神経細胞数の有意な差は認められなかった。 The result of immunostaining using anti-NeuN antibody is shown in FIG. FIG. 10 shows representative examples of brain sections of (A) nonKI, (B) heteroKI, and (C) homoKI. As shown in FIG. 10, in the homoKI mouse at 24 months of age, a significant decrease in nerve cells was seen compared to the heteroKI mouse and the nonKI mouse. On the other hand, there was no significant difference in the number of neurons between the heteroKI mice and the nonKI mice.
以上（Ａ）〜（Ｅ）の免疫染色の結果をまとめると、ｈｏｍｏＫＩマウスでは８カ月齢以降に海馬の神経細胞内にアミロイドβタンパク質がオリゴマーの形態で蓄積していることが示された。一方、老人斑はいずれのマウスでも観察されなかった。また、アミロイドβタンパク質の蓄積と同時に、８カ月齢よりｈｏｍｏＫＩマウスにおいて、タウタンパク質の異常リン酸化、シナプス消失が生じていた。更に、１２カ月齢以降のｈｏｍｏＫＩマウスにおいて、海馬にミクログリア及びアストロサイトのグリア細胞の活性化が見られ、２４カ月齢のｈｏｍｏＫＩマウスでは海馬ＣＡ３領域で顕著な神経細胞の脱落が見られた。 Summarizing the results of immunostaining of (A) to (E) above, it was shown that homoid β protein accumulated in oligomeric form in hippocampal neurons after 8 months of age in homoKI mice. On the other hand, senile plaques were not observed in any mouse. Simultaneously with the accumulation of amyloid β protein, abnormal phosphorylation of tau protein and loss of synapse occurred in homoKI mice from 8 months of age. Furthermore, activation of microglia and astrocyte glial cells was observed in the hippocampus in homomo KI mice after 12 months of age, and significant neuronal loss was observed in the hippocampal CA3 region in 24-month-old homo KI mice.
今回作製されたｈｏｍｏＫＩマウスにおいて、既に公知のＴｇ２５７６マウスと同様に老人斑以外の全てのアルツハイマー病の特徴的病理変化が出現していることから、大阪変異の単独の効果としてアルツハイマー病を発症していることが示された。また、大阪変異をヘテロで有する変異体（ｈｅｔｅｒｏＫＩマウス）においては２４カ月の高齢になるまでｈｏｍｏＫＩマウスに見られたような病理変化が生じなかったという結果は、実際の大阪変異保持家系における劣性遺伝によるアルツハイマー病の発症を再現するものである。 In the homoKI mouse produced this time, all Alzheimer's disease characteristic pathological changes other than senile plaques have appeared as in the already known Tg2576 mouse. It was shown that Moreover, in the mutants having heterozygous Osaka mutations (heteroKI mice), the pathological changes as seen in homoKI mice did not occur until 24 months of age. It reproduces the onset of Alzheimer's disease.
（３）モリス水迷路試験
アルツハイマー病による学習記憶障害について、モリス水迷路試験により評価した。モリス水迷路試験は、海馬に関係する空間学習記憶機能を測定するための行動解析法として知られている。モリス水迷路試験は以下の方法により行った。 (3) Morris water maze test Learning memory impairment due to Alzheimer's disease was evaluated by the Morris water maze test. The Morris water maze test is known as a behavioral analysis method for measuring spatial learning memory functions related to the hippocampus. The Morris water maze test was conducted by the following method.
（装置）
装置は、円筒形プール（直径９６ｃｍ、深さ６０ｃｍ）を床上にセットした。このプールに深さ３０ｃｍまで水（室温）を入れ、透明なプラットフォームが水面下１ｃｍに沈むようにセットした。また、水に酸化チタンで白濁させることで、プラットフォームが水泳中のマウスに見えないようにした。プラットフォームに到達するまでの時間を肉眼で観察して計測した。(apparatus)
The apparatus was a cylindrical pool (diameter 96 cm, depth 60 cm) set on the floor. Water (room temperature) was poured into the pool to a depth of 30 cm, and the transparent platform was set to sink 1 cm below the water surface. In addition, the platform was made invisible to the swimming mouse by making the water cloudy with titanium oxide. The time to reach the platform was measured with the naked eye.
（手順）
モリス水迷路実験は５日間行った。１〜５日目に、トレーニングはマウス１匹につき１日に連続して５回、マウスにプラットフォームの位置を記憶させるトレーニングを行った。トレーニングでは、１回当たり６０秒間泳がせ、プラットフォームに到達した時間（逃避潜時：秒）を記録した。(procedure)
The Morris water maze experiment was conducted for 5 days. On the 1st to 5th days, the training was performed for the mice to memorize the position of the platform 5 times a day for each mouse. In the training, each swim was performed for 60 seconds, and the time to reach the platform (escape latency: seconds) was recorded.
モリス水迷路試験を１０カ月齢のｎｏｎＫＩマウス１０匹と９カ月齢のｈｏｍｏＫＩマウス１０匹についてそれぞれ実施し、各群で記録された逃避潜時（秒）の平均値を試験日ごとに算出した。 The Morris water maze test was performed on 10 10 month old non-KI mice and 10 9 month old homoKI mice, respectively, and the average value of escape latency (seconds) recorded in each group was calculated for each test day.
モリス水迷路試験の結果を図１１に示す。図１１より、モリス水迷路試験においてｎｏｎＫＩでは日を追うごとに逃避潜時が短縮されていくのに対し、ｈｏｍｏＫＩでは５日経過後も１日目と同程度の逃避潜時であった。即ち、ｈｏｍｏＫＩでは、アルツハイマー病の特徴である空間学習記憶障害が再現されていた。よって、本発明のノックインマウスは、アルツハイマー病の病理及び行動所見のいずれの特徴も忠実に再現されたモデル動物であることが示された。 The results of the Morris water maze test are shown in FIG. From FIG. 11, in the Morris water maze test, the escape latencies were shortened each time the non-KI tracked, whereas in the homoKI, the escape latencies were the same as those on the first day even after 5 days. That is, in homoKI, the spatial learning memory disorder that is characteristic of Alzheimer's disease has been reproduced. Therefore, it was shown that the knock-in mouse of the present invention is a model animal that faithfully reproduces both the features of Alzheimer's disease pathology and behavioral findings.
配列番号１は、変異アミロイドβタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３は、TV-A-F5'(NotI)プライマーの塩基配列である。
配列番号４は、TV-A-F3'(NarI)プライマーの塩基配列である。
配列番号５は、TV-Am-M5'プライマーの塩基配列である。
配列番号６は、TV-Am-M3'(AscI)プライマーの塩基配列である。
配列番号７は、TV-AM-R5'(PmeI)プライマーの塩基配列である。
配列番号８は、TV-Am-R3'(AatII)プライマーの塩基配列である。
配列番号９は、サザンハイブリダイゼーションに使用した５'プローブの塩基配列である。
配列番号１０は、サザンハイブリダイゼーションに使用した３'プローブの塩基配列である。SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the mutant amyloid β protein.
SEQ ID NO: 3 is the nucleotide sequence of the TV-A-F5 ′ (NotI) primer.
SEQ ID NO: 4 is the base sequence of TV-A-F3 ′ (NarI) primer.
SEQ ID NO: 5 is the base sequence of TV-Am-M5 ′ primer.
SEQ ID NO: 6 is the base sequence of TV-Am-M3 ′ (AscI) primer.
SEQ ID NO: 7 is the base sequence of TV-AM-R5 ′ (PmeI) primer.
SEQ ID NO: 8 is the base sequence of TV-Am-R3 ′ (AatII) primer.
SEQ ID NO: 9 is the base sequence of the 5 ′ probe used for Southern hybridization.
SEQ ID NO: 10 is the base sequence of the 3 ′ probe used for Southern hybridization.
Claims (11)
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるマウス型変異アミロイドβタンパク質をコードする変異ＡＰＰ遺伝子、又は
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から数えて第５番目のグリシン残基、第１０番目のフェニルアラニン残基、及び第１３番目のアルギニン残基以外の領域の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、マウス体内で発現することによりアルツハイマー病を誘発するポリペプチドをコードする変異ＡＰＰ遺伝子。 The knock-in mouse in which the mutant amyloid precursor protein (mutant APP) gene shown in the following (a) or (b) is knocked in and has the mutant APP gene homozygously:
(A) a mutant APP gene encoding a mouse mutant amyloid β protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) a fifth glycine counted from the N-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It consists of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids other than the residue, the 10th phenylalanine residue, and the 13th arginine residue are substituted, deleted, inserted or added, and is expressed in the mouse body A mutant APP gene encoding a polypeptide that induces Alzheimer's disease.
請求項１に記載のノックインマウス又はその生体の一部であってアルツハイマーの病変部に被検物質を適用する工程、及び前記ノックインマウス又はその生体の一部におけるアルツハイマー病の症状の改善の有無を調べ、アルツハイマー病の症状を改善した被検物質を選択する工程、を含むスクリーニング方法。A method for screening a preventive and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease,
The step of applying a test substance to a lesioned part of the knock-in mouse or the living body thereof according to claim 1 and Alzheimer , and whether or not the knock-in mouse or a part of the living body is improved in symptoms of Alzheimer's disease Screening, and selecting a test substance that has improved the symptoms of Alzheimer's disease.
請求項１に記載のノックインマウス又はその生体の一部であってアルツハイマーの病変部に被検物質を適用する工程、及び前記ノックインマウス又はその生体の一部におけるアルツハイマー病の症状の改善効果を調べる工程、を含む薬効評価方法。 A method for evaluating the efficacy of a preventive and / or therapeutic drug for Alzheimer's disease,
The step of applying a test substance to a lesioned part of Alzheimer 's knocked-in mouse or a part of the living body thereof according to claim 1, and the effect of improving the symptoms of Alzheimer's disease in the knock-in mouse or a part of the living body thereof A medicinal effect evaluation method including a process.
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるマウス型変異アミロイドβタンパク質をコードする変異ＡＰＰ遺伝子、又は
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から数えて第５番目のグリシン残基、第１０番目のフェニルアラニン残基、及び第１３番目のアルギニン残基以外の領域の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、マウス体内で発現することによりアルツハイマー病を誘発するポリペプチドをコードする変異ＡＰＰ遺伝子。 Use of the mutant amyloid precursor protein (mutant APP) gene shown in the following (a) or (b) for the production of a model animal of Alzheimer's disease (excluding humans) :
(A) a mutant APP gene encoding a mouse mutant amyloid β protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) a fifth glycine counted from the N-terminus in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It consists of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids other than the residue, the 10th phenylalanine residue, and the 13th arginine residue are substituted, deleted, inserted or added, and is expressed in the mouse body A mutant APP gene encoding a polypeptide that induces Alzheimer's disease.
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