JP2018166512A - 三次元不均一分化組織培養 - Google Patents

Abstract

【課題】インビボ（in vivo）での組織の挙動を示す、細胞培養に基づく新たな組織モデルの提供。【解決手段】少なくとも２つの異なる前駆体及び神経分化層の不均一細胞集団を含むインビトロ培養人工三次元神経組織培養物であって、少なくとも１つの前駆体層が、外側放射状グリア細胞を含み、前記組織が更に、外側又は余剰皮質脳室下帯（outer or extra cortical subventricular zone）と、皮質内側線維層（cortical inner fiber layer）細胞とを含み、前記培養物が三次元マトリックスを含む組織培養物。斯かる組織を生成する方法、及び、前記方法のためのキット。【選択図】なし

Description

本発明は人工組織培養を形成するための場に関する。

ヒトの脳の発生は神経科学における一番の関心の対象である。それは脳の複雑さの本質によるのみならず、この独自の器官の発達の欠損が種々の重篤な神経障害につながるからでもある。例えば頭部及び脳のサイズの顕著な萎縮を特徴とする障害である小頭症（microcephaly：ＭＣＰＨ）は、神経の欠損を生じ、正常脳機能の面での予後は不良である（Cox et al. 2006)。

ＭＣＰＨの原因として幾つかの遺伝子が同定されてきた（Thornton and Woods. 2009）。例えばASPM（Bond et al. 2002）やCDK5RAP2（Bond et al. 2005）等である。これらの何れについても、分裂中の細胞の中心体又は紡錘体極に関与することを示す証拠が挙げられている（Megraw et al. 2011）。特に、ASPMはショウジョウバエ異常紡錘体（asp）のヒトホモログであり、CDK5RAP2はセントロソミン（centrosomin：cnn）のホモログであって、何れも中心体及び紡錘体の組織化を調節している。

従来、ＭＣＰＨの病原性機序やヒト脳の発達におけるこれらのタンパク質の役割を解明することを目指した取り組みは、マウスモデルを用いて行われてきた。しかし、これらの遺伝子のマウス変異体、例えばCDK5RAP2（Barrera et al. 2010, Lizarraga et al. 2010）やASPM（Pulvers et al. 2010）では、これらの遺伝子に変異を有するヒト患者に見られる脳のサイズ顕著な萎縮を再現することができなかった。

哺乳類の脳の発生に関する現在の知見の多くは齧歯類の研究から得られたものである。これらの研究により、哺乳類の神経発生における基本的な機序が多々解明されてきた。齧歯類でもヒトと同様、脳の発達の開始時には神経上皮が膨脹して、神経前駆体の一種である放射状グリア（radial glia：ＲＧ）を生じる（Goetz and Huttner. 2005）。これらのＲＧは、脳室帯（ventricular zone：ＶＺ）内の尖状表面において、均等に分裂して更に２つのＲＧを生じるか、或いは不均等に分裂して一つのＲＧと、より分化の進んだ娘細胞、ニューロン、又は中間前駆体とを生じる。その後これらは外方に移行して脳室下帯（subventricular zone：ＳＶＺ）内に侵入する一方、ニューロンは中間帯（intermediate zone：ＩＺ）内を移動し続け、皮質板（皮質 plate：ＣＰ）内の特定層に定植する。

ヒトの脳も初期発生の段階ではこれらと同じ基本原理に従うものの、齧歯類とは幾つかの重要な違いがあり、これらの違いこそが、発生の進行に従いヒトに見られる神経出力の顕著な拡大へと繋がっている（Fietz and Huttner. 2011, Lui et al. 2011）。例えば、ヒトの脳は外側放射状グリア（outer radial glia：ｏＲＧ）と呼ばれる新規の幹細胞の大集団を発現し（Fietz et al. 2010, Hansen et al. 2010）、これらがＶＺ内の放射状グリアと同様に均等的又は不均等に分裂して、神経出力を拡大する。この細胞集団の存在は齧歯類では極めて限定されているのに対し、ヒトでは外側ＳＶＺ（outer subventricular zone：ＯＳＶＺ）と呼ばれる完全に独立した前駆体層を形成している。更に、前駆体領域の組織化構造もヒトの方が遙かに精緻であり、ＳＶＺは内側線維層（inner fiber layer：ＩＦＬ）によって内側ＳＶＺ（inner subventricular zone：ＩＳＶＺ）とＯＳＶＺとに分断される。ＩＦＬ及びＯＳＶＺは何れもマウスには全く存在しない。

これらの相違点ゆえに、齧歯類においてＭＣＰＨ等の障害をモデリングすることは困難である。また、これらの障害の原因となる神経発生過程の欠損は、マウスでは試験できないことが示唆される。従って、ヒトの脳の発生のパラダイムをインビトロ（in vitro）で再現する方法には、大きな可能性があると言える。

多能性幹細胞からヒトニューロンを誘導するための培養系は種々報告されている。これらのアプローチの多くは、いわゆる神経前駆細胞（neural rosettes）を利用するものである（Wilson and Stice. 2006）。神経前駆細胞は神経上皮の特性を示し、特定の神経細胞サブタイプの純粋集合の形成を誘導するために使用できる。しかし、これらのアプローチでは、インビボ（in vivo）で見られる複雑さや不均一性を再現することはできないため、その可能性は、ヒト脳発生の多くの側面を模倣することに限定されている。

国際公開第WO2011/055855A1号は、ヒト胚性幹細胞が神経前駆体細胞及び杯状突起組織へと分化することを開示する。

国際公開第WO2012/013936A1号は、神経細胞及び培養物の分化を開示する。また、神経前駆構造（rosette structures）を形成する幹細胞及び前駆体細胞を開示する。

欧州特許出願第EP2314671A1号は、ヒト胚性幹細胞からの培養物の誘導を開示する。

Wang et al. (2011) は、マウスにおける放射状グリア様前駆体細胞の同定を開示する。

乳腺（Kenny et al. 2007）、腸（Sato et al. 2009）、網膜（Eiraku et al. 2011, WO2011/055855A1）など、他の系の器官発生の全体的なインビトロ（in vitro）モデルの開発においては顕著な進展が見られるのに対し、発生時の脳全体の３Ｄ培養モデルは確立されていない。しかし、従来の実験では、幾つかの単離神経組織について、自己組織化の原理が示されており、アプローチの可能性が示唆されている。特に、Eiraku et al. (2008)、米国特許出願公開第US2011/0091869A1号は、多能性幹細胞の三次元培養物から背側脳皮質組織が形成されることを記載している。本研究は、脳皮質組織の自己組織化能という注目すべき能力を明らかにするものであり、これらの組織は初期背側皮質発生の多くの側面を再現するものである。しかし、発生した組織はその同一性において前脳の背側皮質に限定されている上に、発生したニューロンは錐体サブタイプ（pyramidal subtype）の特性及び活性を示す一方で、典型的な内側から外側への組織化（inside-out organization）による個別の複数層を形成するものではない。更に、ヒト脳の発生の特徴、例えば外側放射状グリア細胞の存在や前駆体領域の独自の組織化等は存在しない。

従って、本発明の目的は、インビボ（in vivo）での組織の挙動を示す、細胞培養に基づく新たな組織モデルを提供することである。

本発明は、少なくとも２つの異なった前駆体及び神経分化層の不均一細胞集団を含む人工三次元神経組織培養物であって、少なくとも１つの前駆体層が外側放射状グリア細胞を含む組織培養物に関する。また、新しい神経組織を、本明細書中では「オルガノイド」又は「脳オルガノイド」とも呼んでいる。脳オルガノイドは、様々な脳領域の不均一領域化、並びに複雑で、高度に構成された脳皮質の発生を示す。更に、これらの組織は、ヒトに特異的ないくつかの特徴、即ち、マウスには存在しない大きな外側放射状グリア細胞集団の存在と、特別な皮質の脳室下帯層の組織化を示す。外側放射状グリア細胞の存在が、最も区別しやすい特徴の１つであるように思われるが、もちろん他の特徴も同じように存在する。例えば、Eirakuら（2008）は、彼らの培養物において、皮質組織の放射状グリアは１２日目以降減少したので、その位置並びに形態（体液で満たされた脳室様腔への頂端接続を欠く）を特徴とする外側放射状グリア細胞への成熟におそらく失敗したのであろうと記載している。本発明によれば、外側放射状グリア細胞は、好ましくは前駆体層、特に（放射状グリアが存在する）脳室帯を除いた脳室下帯に存在する。他の代替の識別特性、例えば遺伝子発現マーカーについては、以下で更に記載されている。

更に、本発明は、多能性幹細胞の多細胞凝集体を含む人工三次元神経組織培養物を生成する方法であって、前記多細胞凝集体を神経誘導培地中で培養し、更に三次元マトリックス、好ましくはゲル中で培養し、これにより前記細胞を多細胞凝集体へと増殖させ、ここで前記細胞の分化を許容し、そして前記の増殖し且つ任意により分化した細胞の多細胞凝集体を、懸濁培養物中で培養することを含む方法を提供する。様々な前駆体及びニューロン集団を生じる場合があるが、それは、適切な組織化や性状を示す。

幹細胞を培養し、そして、神経細胞や組織に分化させる方法は、Eiraku（2008）、US2011/0091869A1及びWO2011/055855A1によって知られている（前記文献の全てを参照により援用する）。そこに記載された方法は、本発明の組織を得る最初のステップ、特に多能性幹細胞の多細胞凝集体を提供し、そして、神経誘導培地中で前記多細胞凝集体を培養するステップで使用できる。凝集体を培養するステップ中に、多能性幹細胞は神経組織への分化が誘導される。多細胞凝集体を提供するために、例えば、前記多細胞凝集体由来の多能性幹細胞を培養することが可能である。これらの参考文献とは逆に、本発明は更に、三次元マトリックス、好ましくはゲル中で細胞凝集体を培養するステップを含み、驚いたことに、それがはるかに高度な組織発生をもたらした。

本発明は特に、３Ｄインビトロ培養系を使用した、大きくて複雑な脳組織を生成する新手法に関する。本発明の培養物の種々の分化細胞の個々の組織様部分は、三次元的な培養物配置で存在し得る。得られた脳オルガノイドは、全体として脳に酷似した、互いに影響し得る別々のドメインとして組織化された様々な領域独自性を生じさせる。更に、脳の皮質領域は発生中のヒト脳に類似した組織化、並びに多量のｏＲＧ集団の存在を示す。そのうえ、大脳皮質ニューロンは、様々な錐体独自性を形成するまで、さらに、インビボにおける皮質層を連想させるインサイド−アウト様式での組織化さえ形成するまでに成熟する。オルガノイドは、神経学的疾患、例えばＭＣＰＨをモデル化するのに使用できる。特に、本発明は、これらのオルガノイドにおいて患者由来のｉＰＳＣｓ及びｓｈＲＮＡエレクトロポレーションを利用することにより、マウスでモデル化するのが困難であった疾患であるＭＣＰＨの発生機序のモデル化を実証する。

本発明のオルガノイドは、多能性幹細胞を培養することで得られる。原則として、前記細胞はまた、倫理的な理由が許すのであれば、分化全能性を有していてもよい。

「分化全能性」細胞は、発生中に通常起こるような刺激に暴露された後に生殖細胞系を含めた体内のあらゆる細胞型に分化できる。従って、分化全能性細胞とは、完全な生物体に培養、即ち成長が可能である細胞と定義できる。

本発明による方法で使用される細胞は、好ましくは分化全能性ではないが、しかし（厳密には）多能性である。

特定の好ましい態様において、（本発明に関連する全ての更なる態様を含めた）本発明の細胞は、多能性を有するヒト細胞又はヒト以外の霊長類細胞である。

「多能性」幹細胞は、完全な生物体に成長することはできないが、３つの胚葉の全て、即ち、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉を起源とする細胞型を生み出すことは可能なので、生物体の全細胞型を生み出すことが可能であり得る。多能性は、細胞自体、例えば、特定の幹細胞の特徴であり得るか、又はそれは、人工的に誘導され得る。例えば、本発明の好ましい態様において、多能性幹細胞は、体細胞、複能性細胞、分化単能性細胞又は前駆細胞に由来し、ここで多能性が誘導される。そのような細胞は、本明細書中では人工多能性幹細胞とも呼ばれる。体細胞、複能性細胞、分化単能性細胞又は前駆細胞は、例えば患者から使用でき、そしてそれが、多能性細胞に変えられる、即ち本発明の方法に暴露される。斯かる細胞又は得られた組織培養物は、例えば本発明の方法による組織培養物発生中に異常について試験され得る。患者は、例えば神経障害又は脳組織奇形に罹患していてもよい。前記疾患又は奇形の特徴は、本発明のオルガノイドで再現され、そして調査され得る。

「複能性」細胞は、生物体の２以上の別々臓器又は組織のそれぞれについて少なくとも１つの細胞型を生み出すことができ、ここで前記細胞型は、同じ胚葉が起源であっても又は異なる胚葉が起源であってもよいが、生物体の全ての細胞型を生み出すことができるわけではない。

対照的に、「分化単能性」細胞は、たった１つの細胞系統の細胞にしか分化できない。

「前駆細胞」とは、幹細胞のように、分化に対する選択肢、通常たった１種類の標的細胞に限定された、特定の細胞型に分化する能力を有する細胞である。前駆細胞は通常、分化単能性細胞であるが、それはまた、複能性細胞であってもよい。

分化能が低くなるに従って、幹細胞は：分化全能性、複能性、分化単能性、の順で分化する。本発明のオルガノイドの発生中、幹細胞は、多能性細胞（分化全能性細胞もまた可能である）から複能性神経幹細胞に分化し、そして、更に脳層の分化単能性幹細胞に、そして続いて非幹組織細胞に分化する。組織細胞は、例えばグリア細胞などの神経細胞又は神経上皮細胞であってもよい。

本発明の組織培養物は、インビトロで培養される、即ちそれは何れかの段階で動物からの単離された脳ではない。それがヒト多能性幹細胞から培養されるので、このことが、ヒト胎児脳組織サンプルを得る必要なしに、ヒト脳組織の培養を可能にする。加えて、この系は、３Ｄでの誘導脳組織の培養を意味する一方で、単離された動物脳組織は、限定された複能性能力（Reynolds and Weiss. 1992）しか有していない解離神経幹細胞の凝集体であるニューロスフィアを生成するのに３Ｄで使用されるだけであった。これらのニューロスフィアは、インビボにおける脳発生の多くの側面、例えば領域の独自性、前駆体及び分化層の組織化、神経層形成の組織化、を再現できず、そしてそれは、本発明の組織培養物及び／又は方法によって提供できる。本発明の組織培養物は、ニューロスフィアではなく、これらの側面によってニューロスフィアと異なっている。

発生中、細胞凝集体は、極性神経上皮構造物及び神経上皮シートを形成し、そしてそれが数個の丸い塊（ロゼット）を発生させる。これらのステップは、Eiraku（2008）、US 2011/0091869 A1及びWO 2011/055855 A1に記載されているとおり、神経誘導培地によって制御できる。例えば標準的な分化培地を使用することによって、神経誘導培地の不存在下、本発明は更に、三次元マトリックス、好ましくはゲル、特に堅く安定したゲル中で培養することを含み、そしてそれが、神経上皮細胞の更なる増殖と分化をもたらす。好適な三次元マトリックスは、コラーゲンを含んでいてもよい。より好ましくは、三次元マトリックスは、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍又はその何れかの成分、例えばラミニンなどからの細胞外マトリックス、コラーゲン、好ましくは四型コラーゲン、エンタクチン、並びに任意により更なるヘパラン硫酸化プロテオグリカン又はそれらの何れかの組み合わせを含んでいてもよい。そのようなマトリックスは、Matrigelである。Matrigelは、当該技術分野（US 4,829,000）で知られていて、以前に３Ｄ心臓組織をモデル化するのに使用された（WO 01/55297 A2）。好ましくは、前記マトリックスは、約６０〜８５重量部％のラミニン、５〜３０重量部％のＩＶ型コラーゲン、任意により１〜１０重量部％のニドゲン、任意により１〜１０重量部％のヘパラン硫酸プロテオグリカン及び１〜１０重量部％のエンタクチンを一部に含む少なくとも３．７ｍｇ／ｍｌの濃度を含む。Matrigelの固形成分は、通例約６０％のラミニン、３０％のＩＶ型コラーゲン、及び８％のエンタクチンを含む。エンタクチンは、ラミニンとコラーゲンとに相互作用する架橋分子である。三次元マトリックスは、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、ＮＧＦ、ＰＤＧＨ、ＩＧＦ（インシュリン様成長因子）、特にＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β、組織プラスミノーゲンアクチベータのいずれか１つなどの成長因子を更に含んでもよい。三次元マトリックスはまた、これらの成長因子のいずれも含んでいなくてもよい。

一般に、前記三次元マトリックスは、三次元構造の生物学的に適合しているマトリックスである。それは好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロナン、メチルセルロース、ラミニン、及び／又はアルギン酸を含む。前記マトリックスは、ゲル、特にヒドロゲルであってもよい。有機化学的ヒドロゲルは、親水基の豊富な、ポリビニールアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラート重合体及び共重合体を含んでもよい。ヒドロゲルは、その中では水が分散媒質であるコロイドゲルとして見られることがある親水性である重合体連鎖のネットワークを含む。ヒドロゲルは、非常に吸収性（それらは９９％超の水を含んでいる）の天然又は合成の重合体である。ヒドロゲルはまた、それらの大きな水分含量のため、天然組織と非常に類似した柔軟度も有する。

増殖後に、細胞凝集体は、懸濁培養物、好ましくはバイオリアクター中で培養できる。前記の懸濁培養物中で培養することはまた、好ましくは神経誘導培地の不存在下でもある。好適な培地は、標準的な分化培地である。

好ましい態様において、培地は、以下の成分を含んでいても、又は欠いていてもよい：

凝集体（胚様体と呼ばれる）として多能性幹細胞を培養するステップのための培地Ａ：血清代替製剤、ウシ胎仔血清、グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、bFGF、好ましくは約４ｎｇ／ｍｌのbFGF、又はそれらの何れかの組み合わせ。特に好ましくは、この培地は、凝集培養物の初期段階のためのROCK阻害剤を含んでいる。斯かる培地は、例えば実施例で使用されるｈＥＳ培地である。

多能性幹細胞の凝集体を神経組織に分化するステップのための培地Ｂ：Ｎ２サプリメント（Price and Brewer. 2001）、グルタミン、非必須アミノ酸、ヘパリン、又はそれらの何れかの組み合わせ。この培地は、好ましくは神経組織を特定の運命へと分化させる成長因子を欠いている。斯かる不存在の成長因子は、Shh、Wnt、Bmp、レチノイド、又はFGFのいずれ、或いはそれらの何れかの組み合わせ、特にそれらの全てであってもよい。斯かる培地は、例えば実施例で使用される神経誘導培地である。

三次元マトリックス、好ましくはゲル中での培養ステップのための培地Ｃ：Ｎ２サプリメント（Price and Brewer. 2001）、Ｂ２７サプリメント（Price and Brewer. 2001）、インスリン、２−メルカプトエタノール、グルタミン、非必須アミノ酸、又はそれらの何れかの組み合わせ。この培地は、好ましくは神経組織を特定の運命へと分化させる成長因子を欠いている。斯かる不存在の成長因子は、Shh、Wnt、Bmp、レチノイド、又はFGFのいずれ、或いはそれらの何れかの組み合わせ、特にそれらの全てであってもよい。斯かる培地は、例えば実施例で使用される分化培地である。

懸濁培養、好ましくはバイオリアクター中での培養ステップのための培地Ｄ：Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、インスリン、２−メルカプトエタノール、グルタミン、非必須アミノ酸、又はそれらの何れかの組み合わせ。この培地は、好ましくは神経組織を特定の運命へと分化させる成長因子を欠いている。斯かる不存在の成長因子は、Shh、Wnt、Bmp、又はFGFのいずれ、或いはそれらの何れかの組み合わせ、特にそれらの全てであってもよい。好ましくは、この培地は、レチノイン酸を含んでいて、錐体の分化及び成熟化を促進する。斯かる培地は、例えば実施例で使用される「分化培地＋ＲＡ」である。

何れの培地も更に栄養素、緩衝剤、酸素を含んでいる。前記培地は更に、成長因子を含んでいても、又は成長因子を欠いていてもよい。存在していても又は欠けていてもよい成長因子は、例えば、ＥＧＦ、FGF、ＮＧＦ、ＰＤＧＨ、ＩＧＦ、特にＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β、組織プラスミノーゲンアクチベータである。好ましい栄養素としては、炭水化物、特にモノヘキソース又はモノペントース、例えばグルコース又はフルクトースなどが挙げられる。好ましい態様において、培地のいずれか１つ、好ましくはその全てが、無血清である。

多能性幹細胞の培養ステップは、好ましくは２〜８日継続して、特に好ましくは５〜７日間にわたって行われる。特に、前記ステップは、培養０〜８日目に行われ得る。多能性幹細胞の凝集体を培養するステップは、好ましくは２〜７日継続して、特に好ましくは４〜６日間行われる。特に、前記ステップは、培養５〜１４日目に行われ得る。三次元マトリックス、好ましくはゲル中で培養するステップは、好ましくは１〜６日継続して、特に好ましくは３〜５日間にわたって行われる。特に、前記ステップは、培養９〜１８日目に行われ得る。続く懸濁培養で培養するステップは、好ましくは少なくとも３日継続して、特に好ましくは少なくとも４又は少なくとも５日継続して行われる。

好ましい態様において、懸濁培養（特に３Ｄマトリックス中での培養後の懸濁培養物）は、撹拌又は振盪培地培養、特に好ましくはバイオリアクターである。この段階の時点で、本発明の培養物は、持続的な栄養補給に依存した拡大サイズに達した。これは、例えば撹拌又は振盪による、細胞のフラッシングによって最もうまく達成される。

好ましい態様において、特に３Ｄマトリックス中での細胞の増殖中、細胞は、分化単能性幹細胞（前駆細胞）に分化することが許容される。このステップ中、組織のような発生は、分化単能性細胞の層の発生を含めた、特有の層の形成を含んで進行し、そしてそれが、分化した神経又は上皮細胞を生み出す。

本発明はまた、前記方法によって入手可能な細胞又は組織培養物に関する。特に、本発明は、少なくとも２つの異なる神経分化層の不均一細胞集団を含むインビトロ培養人工三次元神経組織培養物（「オルガノイド」）を提供する。先に触れたように、好ましくは、少なくとも１つの分化層は外側放射状グリア細胞を含む。

本発明の培養物は、異なる分化グレードの分化組織含有層を発生し得る。３Ｄ構造では、これは、培養物の別々の部分として観察可能であってもよい。好ましい態様において、前記培養物は、少なくとも２つの層を形成する組織部分を含む。斯かる層は、球状組織体周囲に形作られてもよく、例えば（単数若しくは複数の）異なる層がその組織体から発生した。特に、前記組織は、尖状組織部分及び背側組織部分の特有の発生を示し得る。

本発明の組織は、脳又はその前駆体で見られる実質的に全ての細胞を含む脳組織であるか、又は類似している。斯かる細胞は、選択的遺伝子発現マーカーによって同定でき、そのマーカーは、特に信頼区間を含めて、分化細胞の平均を超えるレベルにある。斯かるマーカーは特異的オリゴヌクレオチドプローブによって同定され、好ましくは、特異的オリゴヌクレオチドプローブは、前記標的マーカー核酸、特に標的マーカーｍＲＮＡに排他的に結合する。マーカーは、特異的抗体によって更に同定される。

好ましくは、本発明の培養物の細胞は、前脳マーカーBF1及びSix3から選択される１又は２以上の遺伝子発現マーカーを発現する。代わりに、又は加えて、好ましくは本発明の培養物の細胞は、後脳マーカーKrox20及びIls1から選択される１又は２以上の遺伝子発現マーカーを発現する。発生の特定の段階にて、前脳マーカーは、組織中において、後脳マーカーと比較して、多量に発現される。これは好ましくは、本発明の培養物においても反映される。

本発明の組織培養物は、Otx1、Otx2、FoxG1、Auts2、Tuj1、Brn2、Satb2、Ctip2、カルレチニン、又はそれらの何れかの組み合わせから選択される１又は２以上の遺伝子発現マーカーを発現する細胞を含むことを、或いは又は更に特徴とする。これらのマーカーは、本発明の方法における培養の何れの段階で発現されてもよく、提供された組織培養物で好ましくは発現される。

好ましくは、本発明の培養物は細胞を含み、そしてそれがOtx1及び／又はOtx2を発現している。Otx1及び／又はOtx2は、前脳／中脳独自の細胞で発現される。好ましくは、この組織タイプは本発明の培養物に含まれている。

好ましくは、本発明の培養物は細胞を含み、そしてそれがFoxG1を発現している。FoxG1は背側皮質独自の細胞で発現される。好ましくは、この組織タイプは本発明の培養物に含まれている。

好ましくは、本発明の培養物は細胞を含み、そしてそれがAuts2を発現している。Auts2は前頭皮質独自の細胞で発現される。好ましくは、この組織タイプは本発明の培養物に含まれている。

好ましくは、本発明の培養物は細胞を含み、そしてそれがTuj1を発現している。Tuj1は皮質内側の線維層独自の細胞で発現される。好ましくは、この組織タイプは本発明の培養物に含まれている。内側の線維層（そして、外側の脳室下帯も）の生成は、これまで一度も達成されたことがないため、本発明の組織の指標である。

好ましくは、本発明の培養物は細胞を含み、そしてそれがBrn2を発現している。Brn2は後に生じるニューロン（外側領域のニューロン）の細胞で発現される。好ましくは、この組織タイプは本発明の培養物に含まれている。

好ましくは、本発明の培養物は細胞を含み、そしてそれがSatb2を発現している。Satb2は後に生じるニューロン（外側領域のニューロン）の細胞で発現される。好ましくは、この組織タイプは本発明の培養物に含まれている。

好ましくは、本発明の培養物は細胞を含み、そしてそれがCtip2を発現している。Ctip2はニューロン（内部領域のニューロン）が生じる前の細胞で発現される。好ましくは、この組織タイプは本発明の培養物に含まれている。

好ましくは、本発明の培養物は細胞を含み、そしてそれがカルレチニンを発現している。カルレチニンは背側皮質板内の皮質介在ニューロンの細胞で発現される。好ましくは、この組織タイプ及び／又は皮質介在ニューロンは本発明の培養物に含まれている。

本発明の人工組織はまた、組織内の細胞の成長及び活性に対する任意の外部（例えば、薬物又は他の刺激）又は内部（突然変異）影響の効果を試験する研究手段として使用されることもできる。そのため、追加的な側面において、本発明は、発生的神経組織作用、例えば不全、特に発育不全を調べる方法であって、本発明の方法中の任意の段階で細胞内での所望の遺伝子の発現を減少又は増加させることを含む方法を提供する。所望の遺伝子とは、健全な神経組織の発生中に活性であるとき、不可欠又は有害であることが疑われる遺伝子である。遺伝子の発現を減少又は増加させる方法は、当該技術分野で周知であり、それぞれ、ノックアウト又はノックダウン法（特にＲＮＡ干渉、アンチセンス阻害、ｓｈＲＮＡサイレンシングなど）、或いは導入遺伝子の導入（例えば、ノックイン）が挙げられる。こうした減少又は増加は、例えば、誘導プロモータ、及び／又は条件付きノックアウト又はノックダウン、或いはノックインを有する遺伝子構築物を導入することによって条件付けされたものであり得る。必須遺伝子の条件付き変異の導入又は致死遺伝子の導入は、例えば可逆的な遺伝子トラップを含んでいる、好適な条件付き変異ベクターを使用することによって可能である。条件付き変異は、好ましくは可逆的突然変異を容易にする。可逆的突然変異は、例えばダブルＦｌｅｘシステム（WO 2006/056615 A1; WO 2006/056617 A1; WO 2002/88353 A2; WO 2001/29208 A1）のように、刺激の状況で、それぞれ遺伝子活性又は不活性が覆され得る。突然変異は、ランダム又は特定の遺伝子における位置特異的のいずれかである。よって、本発明の好ましい態様において、可逆的突然変異は多能性幹細胞内に、ランダム（順方向）又は位置特異的（逆方向）突然変異誘導のいずれかで導入される。好適なベクターは、可逆的な変異を含んだ挿入カセットを含んでいる。突然変異は、本発明の方法の任意の段階でオン又はオフに切り換えられる。ベクター又は他の核酸は、当該技術分野で知られている何れかの方法、例えばエレクトロポレーションを用いて細胞内に導入される。所定の突然変異を有する細胞を提供することも、もちろん可能である。斯かる細胞は、患者から単離されてもよく、その後に、多能性幹細胞状態の誘導し、そして例えば先に記載した方法によって、その細胞を本発明の組織内に発生させるステップが続く。前記患者は、所望の特定の疾患、特に神経学的欠損又は脳の奇形に罹患していてもよい。斯かる方法は、小頭症の患者の細胞に関して、以下の実施例に示された。遺伝子Cdk5Rap2の突然変異が発現低下につながるなどの小頭症の遺伝子変異は、実例の突然変異であり、その突然変異が本発明の方法で調査できる。

本発明は更に、所望の発生的神経組織欠損を治療するのに好適な候補治療薬を選別する方法であって、突然変異を調査するために前記方法を行い、そして前記方法中の何れかの段階で、好ましくは全ての段階で前記細胞に候補薬剤を投与することを含む方法を提供する。この側面によると、候補治療薬は、突然変異を有する何れかの細胞に効果を有するかについて選別され得るが、その候補治療薬は先に記載したとおり導入される。所定の突然変異を有する患者の細胞を使用して、先に記載したように多能性幹細胞状態を誘導し、そして組織発生を誘導する本発明の方法をおこなうことも、もちろん可能である。特に、本発明は、小頭症における突然変異の調査を提供し、そして、突然変異に影響する、例えば突然変異遺伝子、例えば小頭症におけるCdk5Rap2の機能不全又は過剰発現を補う医薬品の選別を可能にする。陽性の候補薬物は、比較のために突然変異なしで本発明の組織生成法をおこなうことによって、例えば健全な多能性幹細胞を使用することによって、観察できるように、正常細胞発生を復元する化合物である場合がある。

もちろん、異常分化につながる突然変異なしに、正常組織に何れかの効果を有する候補薬物、例えば候補治療薬を選別することも同様に可能である。よって、更にもう１つの側面において、本発明は神経作用に関して候補薬物を試験する方法であって、候補薬物を人工培養物に投与し、前記培養物の細胞について所望の活性を決定し、当該活性を、前記候補薬物を投与せずに培養した細胞の活性と比較することを含み、ここで、活性の差分が神経作用を示す方法に関する。代謝回転又は神経のシグナル伝達を含めた本発明の細胞又は組織の何れかの活性の類が、候補薬物で捜索され得る。要するに、本発明の高度に分化した組織は、あらゆる薬物のあらゆる効果を試験する脳の性状に関するモデルとして使用できる。斯かる方法はまた、何れかの種類の疾患を治療することを意図した治療薬を、神経、特に本発明の組織培養物で観察できる脳組織に対して副作用を有しているか試験するのにも使用されるだろう。

本発明はまた、神経細胞を得るのに使用できる。特に、本発明は、人工培養物を提供し、所望の分化神経細胞を単離するステップを含むか、又は所望の分化神経細胞を単離するステップを更に含む、本発明に従って人工組織培養物を生成するステップを含む分化神経細胞を得る方法を提供する。本発明の培養物又は組織から単離されたそうした細胞は、先に触れたヒト以外の動物又はヒトの脳組織から単離された細胞と同様の形態的性質を表す利点を有している。

本発明は更に、本発明の組織培養物を生成するためのキットであって、先に記載した培地のいずれか１つ、特に先に記載した三次元マトリックス及び栄養素を含む培地と、レチノイン酸及び栄養素を含む培地と共に、任意により、栄養素及びROCK阻害剤を含む培地を更に含み、及び／又は任意により、栄養素を含むが、神経組織を特定の運命へと分化させる成長因子を欠損する培地を更に含む培地を含むコンテナを含むキットを提供する。

前記キットは、三次元マトリックスを含むが、好ましくは神経組織を特定の運命へと分化させる成長因子を欠損する培地Ｃを更に含む。斯かる不存在の成長因子とは、Shh、Wnt、Bmp、レチノイド、FGFのいずれか１つ、又はそれらの何れかの組み合わせ、特にそれらの全てであってもよい。この培地は、好ましくは更に細胞栄養素を含む。特に好ましくは、前記培地は、Ｎ２サプリメント（Price and Brewer. 2001）、Ｂ２７サプリメント（Price and Brewer. 2001）、インスリン、２−メルカプトエタノール、グルタミン、非必須アミノ酸、又はそれらの何れかの組み合わせも含む。

前記キットは、レチノイン酸及び栄養素を含む培地Ｄを更に含む。この培地は、好ましくは三次元マトリックスを欠く。特に好ましくは、前記培地は、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、インスリン、２−メルカプトエタノール、グルタミン、非必須アミノ酸、又はそれらの何れかの組み合わせも含む。この培地は、好ましくは神経組織を特定の運命へと分化させる成長因子を欠損する。斯かる不存在の成長因子とは、Shh、Wnt、Bmp、FGFのいずれか１つ、又はそれらの何れかの組み合わせ、特にそれらの全てであってもよい。

任意により、前記キットは、ROCK阻害剤及び栄養素を含む培地Ａを更に含んでもよい。特に好ましくは、前記培地は、血清代替製剤、ウシ胎仔血清、グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、bFGF、好ましくは約４ｎｇ／ｍｌのbFGF、又はそれらの何れかの組み合わせを含む。

任意により、前記キットは、栄養素を含んでいるが、神経組織を特定の運命へと分化させる成長因子を欠く培地Ｂを更に含んでもよい。斯かる不存在の成長因子とは、Shh、Wnt、Bmp、レチノイド、FGFのいずれか１つ、又はそれらの何れかの組み合わせ、特にそれらの全てであってもよい。特に好ましくは、前記培地は、Ｎ２サプリメント（Price and Brewer. 2001）、グルタミン、非必須アミノ酸、ヘパリン、又はそれらの何れかの組み合わせを含む。

本発明のキットは好ましくは、多能性幹細胞を培養するステップ、多能性幹細胞の凝集体を培養するステップ、三次元マトリックス、好ましくはゲル中で培養するステップ、懸濁培養、好ましくはバイオリアクターにより培養するステップから選択される、先に記載のステップのいずれか１つのための培地を含む。特に、三次元マトリックス、好ましくはゲル中で培養するステップと懸濁培養で培養するステップのための培地の組み合わせ；又は多能性幹細胞の凝集体を培養するステップと三次元マトリックス、好ましくはゲル中で培養するステップのための培地の組み合わせが好ましい。好ましくは、別々のステップをおこなうための培地は、バイアル又はフラスコなどの別々のコンテナ中に提供される。本発明の培地のいずれか１つが、先に触れた緩衝剤、安定化剤、栄養素などの更なる補助剤を含んでもよい。前記培地は、固形物、乾燥形態又は水性形態で提供されてもよい。

本明細書中に記載した任意の方法又は生成物を、本明細書中に記載したその他の方法又は生成物に関しても実行することができること、更には、異なる態様が組み合わせられ得ることも企図される。

出願当初の特許請求の範囲は、任意の出願した特許請求の範囲又は出願した特許請求の範囲の組み合わせに複数従属している特許請求の範囲をカバーすることが企図される。

特許請求の範囲及び／又は明細書において、「含む（comprising）」という用語と共に使用される場合、単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の使用は「１つの」を意味し得るが、「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１つ又は２つ以上」の意味とも一致する。

本明細書中で考察する任意の態様を、本発明の任意の方法又は生成物に関しても実行することができ、逆もまた同様であることが企図される。特定の条件に関して考察した任意の態様を、異なる条件に関しても適用又は実行できる。更に、本発明の組成物及びキットは、本発明の方法を達成するのに使用できる。

本出願を通じて、「約」という用語は、値を決定するために使用したデバイス又は方法に対する誤差の標準偏差を含むことを示すために使用され得るか、又は設定値で±１０％を指し得る。

本発明は、以下の図面及び実施例によって更に例示されるが、本発明のこれらの態様に制限されることはない。

図１．脳のオルガノイド培養系の説明と特徴づけ。ａ．方法でより詳細に説明される培養系の図解。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）をフィーダーによりコロニー培養物から分離し、３つの胚葉に分化し始める胚様体と呼ばれる浮遊凝集体に植え替えた。これらを６日間、少量のbFGFを含む培地で増殖させ、次いで、規定の神経誘導培地を含む低接着プレートに移して、他の胚葉の増殖を制限しながら、神経外胚葉の増殖をサポートした。１１日目に、神経外胚葉組織をMatrigel液滴に移し、分化培地中での浮遊培養で培養し、続いて、レチノイン酸（ＲＡ）を含む分化培地中での回転バイオリアクターにより培養した。それぞれの段階のイメージの例を図解の下に示す。ｂ．このアプローチ（左のパネル）を使用して生成される神経上皮組織は、Matrigelを用いない静置懸濁液による培養物（右のパネル）に比べて、より大きく且つより持続していた。このアプローチはまた、より大きい体液の充填した腔、並びに神経性Ｎ−カドヘリンタンパク質の典型的な頂部局在化を有する組織を生成した（矢印）。ｃ．切出し及び免疫組織化学により、高度な組織が、神経前駆体（Sox2、赤）及びニューロン（Tuj1、緑）（矢印）を含めた神経組織の種々の不均一領域を有する複雑な形態を表すことが明らかになった。ｄ．低倍率の明視野造影により、脳室を連想させる大きな体液の充填した腔（白い矢印）、並びに網膜の色素上皮の存在（黒い矢印）によって示されるように、網膜を含めた神経組織の様々な発生を更に明らかになった。ｅ．静置培養物と比べた脳オルガノイドのヘマトキシリン−エオシン染色により、前脳皮質（矢印）及び脈絡叢（くさび形）などの脳領域を連想させる基礎構造を有する全体的なより大きな組織が明らかになった。

図２．ヒト脳オルガノイドは様々な脳領域の独自性を再現する。ａ．分化の１２、１６、及び２０日間の時点での皮質オルガノイドにおける後脳マーカー（Krox20及びIsl1）並びに前脳マーカー（BF1及びSix3）のＲＴ−ＰＣＲ。ヒト胎児脳ｃＤＮＡを陽性対照として使用した。ｂ．中−後脳境界を連想させる後脳の隣接部位（矢印）を有する前／中脳の独自性が主を明らかにする、分化の１６及び２０日間の時点における前脳／中脳マーカーOtx1／2（緑）及び後脳マーカーGbx2（赤）の免疫組織化学。ＤＡＰＩは核をマークする（青）。ｃ．オルガノイド内の背側皮質の不連続部位を明らかにする、マーカーFoxG1（赤）の免疫組織化学。ｄ．オルガノイド内の脳皮質葉の小区域化を明らかにする、前頭葉マーカーAuts2（赤）の染色。ｅ．腹側皮質の独自性のマーカーNkx2.1（赤）及び背側皮質をマークするPax6（緑）の染色により、背側部と腹側部の隣接が明らかになる。連続切片におけるカルレチニン（緑）の染色により、オルガノイドの腹側部の皮質介在ニューロンの産生が明らかになる。ｆ．独立した脳オルガノイド内の海馬領域を明らかにする、ニューロピリン−２（Nrp2、赤）の染色、並びにフリズルド−９（赤）及びProx1（緑）の同時染色。ｇ．脈絡叢の典型的な形態も表す領域を明らかにする、脈絡叢のマーカートランスサイレチン（ＴＴＲ）の免疫組織化学的染色。

図３．脳オルガノイドの背側皮質における前駆帯の型とおりの組織化。ａ．脳室帯及び基底部に蓄積している新生ニューロンを連想させる領域内の体液の充填した腔に隣接する前駆体の尖状−基底組織化を再現する脳オルガノイド内の典型的な大きい（直径約１ｍｍ）背側皮質領域におけるニューロン（Tuj1、緑）及び放射状グリア前駆体（Pax6、赤）の免疫組織化学。ｂ．インビボに酷似した脳室下帯局在性を明らかにする、ＩＰマーカーTbr2（赤）の染色。ｃ．有糸分裂中の細胞をマークするためのホスホ−ヒストンＨ３（PH3、緑）の染色。前駆体の分裂は主に尖状面で起きたが、いくつかの分裂はＩＰｓ又はoRGsに属し得る脳室下帯領域で見ることができる。Pax6（赤）は放射状グリアをマークする。ｄ．尖状面における典型的な分裂を明らかにする放射状グリアの有糸分裂マーカーホスホ−ビメンチン（緑）の免疫組織化学。ｅ．放射状グリア細胞形態に典型的な長い基底突起を明らかにする分裂放射状グリアのホスホ−ビメンチン染色（緑）の高倍率画像。ｆ．エレクトロポレーション法の図解。プラスミドＤＮＡをオルガノイド内の体液の充填した腔に注入し、そして電気パルスを、その腔に隣接したエレクトポレーション細胞（放射状グリア前駆体）に適用した。これらは、いくつかの領域のエレクトロポレーション（右のパネル、緑のGFP）及びＲＧｓの高能率のエレクトロポレーション（下のパネル、緑のGFP）をもたらした。ｇ．神経上皮の形態を明らかにする、初期組織（１８日）内のGFPエレクトポレーション前駆体（矢印）。ｈ．典型的な双極性形態（くさび形）を有する放射状グリア（矢印）を明らかにする、３０日の時点のGFPエレクトポレーション組織。ｉ．長い尖状突起及び基底突起（くさび形）を呈する放射状グリア（矢印）を有するより高度でより厚い皮質領域を明らかにする、３６日の時点でのGFPエレクトポレーション組織。

図４．脳オルガノイドの放射状グリアはインビボで見られる典型的な特徴を呈する。ａ．双極性突起に沿った細胞体（矢印）の動きを示しているエレクトポレーション放射状グリア（GFP、緑）のライブ造影のフレーム。時間と分による時間を、右上に示す。ｂ．細胞周期依存的な核移動を明らかにする、BrdUのパルス−チェイス実験。BrdU投与１時間の時点で、BrdU陽性（緑）の放射状グリア（Sox2、赤）はＶＺの基底領域に位置した。BrdUを洗い落とした４時間後に、多くのBrdU＋細胞が、尖状に移行したのを見ることができたのに対して、洗浄の６時間後に、いくつかの細胞しか尖状面に見られなかった。ｃ．分裂の平面配向にある後期（矢印）中に尖状面での有糸分裂細胞を明らかにするホスホ−ビメンチン染色（緑）。ｄ．尖状面に対する放射状グリア細胞の分裂の方向の定量は、０〜３０度（平面）、３０〜６０度（斜め）及び６０〜９０度（垂直）の区分で示された。５つの異なる脳皮質領域からのｎ＝２７の細胞。ｅ．BrdUの短い一時間のパルスと、それに続く１６時間のチェイス後のGFPエレクトポレーション組織における系統トレーシング。娘細胞対は、GFP及びBrdUによる同時標識によってマークされる。同じ独自性（Sox2陽性、青、くさび形）の娘細胞を有する対称分裂、並びに非対称分裂（矢印）が観察され得る。ｆ．３つの独立した皮質組織からの１８細胞対に関する定量の結果をｅに示す。バーの上の数字は各カテゴリの娘対の数を表す。

図５．脳オルガノイドは、典型的な形態と泳動挙動を有するoRGs及びニューロンを生じさせる。ａ．Sox2（赤、放射状グリア）及びTuj1（緑、ニューロン及び突起）の染色は、尖状脳室帯（ＶＺ）から切り離され、ヒト皮質の発生に類似して組織化される外側放射状グリアの存在を明らかにする。ＶＺ及びＳＶＺは、内側の線維層（ＩＦＬ）に酷似したTuj1+繊維層によってoRGs（ＯＳＶＺ）の層と切り離されているように見える。ｂ．典型的な細胞形態を有する、即ち基底突起が存在するが（くさび形）、尖状突起を欠く分裂oRGs（矢印）を明らかにする、ホスホ−ビメンチン（緑）の免疫組織化学。分裂直後、娘細胞対を見ることができ、その１つが基底を引き継ぐ。尖状（Ａ）は下に向けられるが、基底（Ｂ）は上に向けられる。ｃ．直近に分裂した娘細胞対におけるホスホ−ビメンチン（緑）の染色は、一方の娘細胞がｏＲＧ（Sox2+、赤）として維持されるのに対して、もう片方はSox2発現を欠く（くさび形）ことを明らかにする。ｄ．尖状面（破線）に対する垂直（６０〜９０度）方向を明らかにする、後期の有糸分裂ｏＲＧの分裂方向。この方向の定量は、右側に示されている。ｅ．早くに生じたニューロンのマーカーCtip2（緑）及び遅くに生じたニューロンのマーカーBrn2（赤）の免疫組織化学は、分化３０日の時点で初歩的な分離を呈する独立したニューロン集団を明らかにする。ｆ．分化７５日の時点での、早くに生じたもの（Ctip2、緑）と遅くに生じたもの（Satb2、赤）の分離は、インビボで見られるそれを連想させるインサイド−アウト組織化をより明確にする。ｇ．腹側皮質（図２ｅ）から生成された皮質介在ニューロンのカルレチニン染色（緑）は、尖状「脳室」表面に対して垂直な突起を誘導する背側皮質組織（FoxG1、赤）内への接線方向の遊走の典型的な形態を示す。ｈ．GFP（緑）エレクトポレーション中枢ニューロン（矢印）、錐体路に見られるのと類似した軸索バンドリング（くさび形）の徴候を有する長い軸索を伸長する。ｉ．複雑な形態及び軸索分枝（くさび形）を示すGFP（緑）エレクトポレーションニューラル軸索の高倍率画像。ｊ．脳オルガノイドの個々のニューロン（くさび形）における自然発生的なカルシウム上昇を明らかにする、Fluo-4カルシウム感受性染料を用いたライブ造影からの疑似カラー色分け地図のフレーム。時間を分：秒で示す。

図６．患者から生成される脳オルガノイドはｉＰＳＣｓ又はｓｈＲＮＡエレクトロポレーションモデル小頭症をもたらした。ａ．脳及び頭部のサイズ減少、並びに単純な皮質の折り重なり（矢印）を示す、年齢が同じ対照（下）と比較した出生時（上）に撮られた患者A3842のＭＲＩスキャン。矢状断Ｔ１（左）及び軸位断Ｔ２（右）の画像。スケールバー１ｃｍ。ｂ．各親から受け継がれる異型接合ナンセンス突然変異の度合いが強まっていることを実証する配列決定クロマトグラム。ｃ．A3842患者のタンパク質欠損を明らかにする、対照及び患者（A3842）の皮膚線維芽細胞からの溶解物中のCdk5Rap2タンパク質のウエスタンブロット。ビンキュリン（ＶＣＬ）は、添加対照として示される。ｄ．対照における中心体（ＣＰＡＰ、緑）の局在性を明らかにするが、患者の繊維芽細胞では染色を欠いている、患者（A3842）及び対照の繊維芽細胞におけるCdk5Rap2の免疫細胞化学的染色。ｅ．分化６、１１、１５、及び２２日の時点で誘導された（系列１Ｍをここに示す、全ての系列を図９に示す）対照ｉＰＳＣｓと患者から生成される脳オルガノイドの典型的な明視野画像。対照は大きな体液の充填した皮質領域を呈するが、患者由来組織は厚い皮質組織がわずかな領域しかない高い突起伸展を示した。ｆ．少ないニューロン（ダブルコルチン、DCX、緑、矢印）とより小さい前駆帯（Sox2、赤、くさび形）を明らかにする、分化３０日目の組織から誘導した（系統１０Ｍを代表例として示す）対照及び患者の免疫組織化学。ｇ．患者由来組織（系統１Ｍ及び１４Ｂをここに示す）における小さい前駆帯及び増加したニューロンを明らかにする、早期ステージ（２２日目）におけるニューロン（Tuj1、緑）及び放射状グリア（Sox2、赤）の染色。ｈ．患者由来（系列１４Ｂ）組織における増加したニューロン（Tuj1、緑、矢印）を示す発生させた皮質組織の高倍率画像。ｉ．GFP（緑）とCdk5Rap2に対するｓｈＲＮＡｓ又はスクランブルｓｈＲＮＡを同時エレクトポレーションしたｈＥＳ細胞由来オルガノイド。Cdk5Rap2 ｓｈＲＮＡｓをエレクトポレーションした領域は、Sox2+（赤）の前駆体の損失、及びダブルコルチン（DCX、青）ニューロンの増加を示した。ｊ．Cdk5Rap2 ｓｈＲＮＡをエレクトポレーションしたGFP（緑）により神経の形態を示すｉ．の結果の高倍率画像。これらは、スクランブル又は隣接する非エレクトポレーション組織と比べて、増加したDCX（青）発現及びSox2（赤）の損失を呈する。

図７．複数のヒト多能性幹細胞からの脳オルガノイドの生成。ａ．ヒトH9ES細胞並びにヒトｉＰＳ細胞から生成したオルガノイドのヘマトキシリン−エオシン染色により、同じようなサイズ及び複雑な形態、並びに下のパネル内に高倍率で示された高度な前脳組織の存在が示される。ｂ．ヒトH9ES細胞とヒトｉＰＳ細胞の両方から生成された組織におけるＮ−カドヘリン（緑）及び新生ニューロン（ダブルコルチン、DCX、赤）の染色により、両方のタイプの組織における類似した組織化、及び完全な尖状基底極性が明らかになる。

図８．脳オルガノイドの分化中の神経の独自性。分化９日の時点で多能性の独自性が減少した一方で、神経の独自性は活性化されたことを明らかにする、未分化ヒトＥＳ細胞並びに分化後６及び９日の時点での多能性マーカーOct4及びNanog、並びに神経の独自性マーカーSox1及びPax6のＲＴ−ＰＣＲ。

図９．患者由来ｉＰＳＣｓ及び脳オルガノイドの特徴づけ。ａ．A3842患者の皮膚線維芽細胞から得られたｉＰＳ細胞は、典型的なＥＳ細胞様形態を呈する。４つの系列をこの典型的な形態及び多能性に基づく分析のために選択した。ｂ．多複能性を明らかにする患者由来ｉＰＳ細胞コロニーのアルカリホスファターゼ染色（青）。ｃ．通常のｈＥＳ細胞について確立されたプロトコール及びタイミングを使用した患者（系列１Ｍ）及び対照の典型的な初期オルガノイド培養物。患者組織ははるかに小さく、増殖しなかったので、神経組織を生じさせるようにプロトコールをわずかに改変しなければならなかった。ｄ．多くした開始細胞数を使用した患者由来組織は、神経上皮を示すが、対照由来組織で見られる厚い体液の充填した皮質組織を形成しない。ｅ．Cdk5Rap2に対して４つの別々のｓｈＲＮＡｓを形質移入された293T細胞の内因性Cdk5Rap2のウエスタンブロット。ｓｈＲＮＡ１及び２は最も効果的であったが、ｓｈＲＮＡ４はタンパク質のわずかな減少しかもたらさなかった。チューブリンを添加対照として示す。

図１０．ヒト脳オルガノイドは様々な脳領域の独自性を再現する。ａ．表面のプレプレート（上の角カッコ）及び基底の神経ＩＺ様層（下の角カッコ）を明らかにする、プレプレートマーカーTbr1（赤）及び神経マーカーMAP2（緑）の染色。ｂ〜ｃ．様々な脳領域の独自性の染色：前脳（ｂ）；前頭葉前部皮質（個々の境界に注意、矢印）、Auts2（ｃ）；海馬、Nrp2、Fzd9、Prox1。ｄ．型とおりの層形成：レチナール色素上皮（ＲＰＥ）、外顆粒層（ＯＮＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）、を呈する網膜組織のヘマトキシリン−エオシン染色。スケールバー：１００μｍ。

図１１．前駆体の型とおりの組織化及び挙動。ａ．表面のプレプレート（上の角カッコ）及び基底の神経ＩＺ様層（下の角カッコ）を明らかにする、プレプレートマーカーTbr1（赤）及び神経マーカーMAP2（緑）の染色。ｂ．ＩＰｓ（矢印）のＳＶＺ局在性を明らかにする、ＩＰマーカーTbr2（赤）の染色。

図１２．大脳皮質ニューロンの組織化及び成熟化。ａ．放射状組織化（MAP2、角カッコｉ）の初期徴候を有するプレプレート（Tbr1）、及びＶＺ／ＳＶＺ（角カッコｉｉｉ）に隣接したＩＺ様層（角カッコｉｉ）の存在を示す、３０日目の免疫組織化学的染色。ＤＡＰＩは核をマークする（青）。ｂ．背側皮質組織の基底面に沿ってカハール−レツィウス細胞を示すリーリン染色。ｃ．蛍光（任意の単位）の変化によって評価されるグルタミン酸適用（所望の領域、ＲＯＩ、左のパネルで概説）によるカルシウム上昇の単独細胞トレーシング。矢印はグルタミン酸の添加時間をマークする。ｄ．ＴＴＸの添加前（左のパネル）後（右のパネル）のカルシウム上昇の単独細胞トレーシング（左の画像にＲＯＩをマークした）。スケールバー：１００μｍ。

図１３．小頭症の脳オルガノイドモデリング。ａ．患者由来組織（１４Ｂ）において増加したニューロン（Tuj1、矢印）を示す、２２日目の時点での染色。ｂ．対照と比べて、神経の独自性を有するBrdU＋細胞のより高い割合及びＶＺにおける低下を示す、対照及び患者由来オルガノイド（１４Ｂ）におけるBrdUパルスチェイス。結果を右側に定量化した。エラーバーは、標準偏差＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定である。各条件に関してｎ＝３のオルガノイドである（対照では総３００個の細胞、患者では２０４個の細胞）。ｃ．ＲＧ有糸分裂を示す、対照及び患者由来組織（１４Ｂ）におけるＰ−ビメンチン染色。後期の対照ＲＧｓは、もっぱら横方向（０〜３０度の角度、矢印）に分裂したが、患者ＲＧｓは、多くが斜めや垂直方向を示した（くさび形）。結果を右側に定量化した（Ｐ＜０．０１、２×３のフィッシャーの直接確率検定、それぞれ＞５つの皮質領域から、対照ではｎ＝１１の細胞、患者由来ではｎ＝１５の細胞）。

図１４．複数のヒト多能性幹細胞からの脳オルガノイドの生成。ａ．静置培養物と比べた脳オルガノイドのヘマトキシリン−エオシン染色により、前脳皮質（矢印）及び脈絡叢（くさび形）などの脳領域を連想させる基礎構造を有する全体的なより大きな組織が明らかになった。ｂ．脳皮質分子層を連想させる層形成（棒線）、並びに髄膜（くさび形）及び脈絡叢（矢印）を連想させる組織を明らかにする、ヘマトキシリン−エオシン染色したオルガノイドの高倍率画像。ｃ．外部に沿って発生している皮質領域を有する脳オルガノイドの内部領域（矢印）における細胞死を明らかにする、TUNEL染色（緑）。ＤＡＰＩは核をマークする（青）。

図１５．脳オルガノイドの分化中の神経の独自性。ａ．皮質葉マーカーLmo4（前頭側及び後頭側マーカー、緑）及びTshz2（後頭側マーカー、赤）の染色。１つの領域（上のパネル）における両方の予想される核染色（矢印、くさび形）が後頭側の独自性を示唆する一方で、Lmo4染色（矢印）だけが別の領域（下のパネル）においてはっきりと分かり、前頭側の独自性を示唆していることに注意する。ＤＡＰＩは核をマークする（青）。ｂ．１つの部分の中に腹側（くさび形）及び背側（左上）の両方の領域を含むオルガノイド上での腹側マーカーNkx2.1（赤）及び皮質介在ニューロンマーカーカルレチニン（緑）の染色。右側の画像は、左側の低倍率画像で概説された領域のより高倍率の繋ぎ合わせた画像である。カルレチニン介在ニューロンは、遊走と背側皮質に向かう移動の典型的な形態を有する２つの領域の間に見られる（矢印）。スケールバー：１００μｍ。

図１６．放射状グリア細胞の組織化及び形態。ａ．神経前駆体特異的Baf53aがＶＺ ＲＧｓで発現したが、ニューロン特異的Baf53bがＶＺの外側のDCX+（赤）ニューロンで発現されていることを示す、同じ組織の連続切片におけるクロマチンリモデリングＢＡＦ成分Baf53a（緑、上のパネル）及びBaf53b（緑、下のパネル）の染色。ｂ．放射状グリア細胞の形態に典型的な長い基底突起を明らかにする、分裂放射状グリアのホスホ−ビメンチン染色（緑）の高倍率画像。

図１７．中枢ニューロンの独自性の空間的組織化及び特徴。ａ．ＣＰ発生の初期を連想させる初歩的な空間分離を明らかにする、３０日目でのプレプレートマーカーTbr1（緑）及び深層マーカーCtip2（赤）の染色。ｂ．蛍光（任意の単位）の変化によって評価される、個々のニューロン（所望の領域、ＲＯＩ、左のパネルで概説）におけるカルシウム上昇の単独細胞トレーシング。

図１８．皮質発生に関するヒト特徴はマウスオルガノイドでは再現しなかった。ａ．全ての領域（角カッコ）でＶＺから離れているように見えるが、皮質組織（大きい角カッコ）の厚い部分の間でより離れ、そして、Tuj1+繊維層を有するoRGs（くさび形で境界が定められた）の切り離された領域の存在を明らかにする、図５ａに示した領域の低倍率画像。オルガノイド全体は図１ｃで見られる。ｂ．ヒトに比べて全体的に小さいオルガノイドのサイズ並びに小さい皮質領域（矢印）を明らかにする、ニューロン（Tuj1、緑）及び神経前駆体（Sox2、赤）について染色したマウスＥＳＣｓ由来脳オルガノイドの低倍率画像。ｃ．ヒトで見られるものなどのように別々の層に組織化していない数個だけのoRGs（くさび形）の存在を明らかにする、ＲＧ前駆体（Sox2、赤）について染色したマウス脳オルガノイドにおける皮質の独自性の領域の高倍率画像。

図１９．患者の成長パラメーター。ａ．全ての成長パラメーターが、全ｚ−スコアが年齢及び性別（破線）についての母平均から−２未満の標準偏差で、出産時及び出生後の両方で有意に低下していた。出産時及び３^１/_２歳の現在の年齢における体重（ｗｇｔ）、身長（ｈｇｔ）、及び頭囲（前後径周囲、ｏｆｃ）。頭囲は身長や体重よりも厳密に影響し、脳の体積がより重篤な成長制限の結果として過度に低いことを示唆している。

図２０．患者由来ｉＰＳＣｓ及び脳オルガノイドの特徴づけ。ａ．２２日目の初期における対照及び２系統の患者由来組織（１Ｍ及び１４Ｂ）の脳皮質領域内のSox2+前駆体及びTuj1+ニューロンのパーセンテージの定量化。エラーバーは対照と比較したＳ．Ｅ．Ｍ．＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。各系統についてｎ＝４の組織。ｂ．GFP単独（左のパネル）又はGFP及びCDK5RAP2発現構築物（右のパネル）のいずれかをエレクトポレーションされた患者由来組織（系列１４Ｂ）に関する明視野画像。対照と比べて、CDK5RAP2エレクトポレーション組織におけるより大きい神経上皮組織（矢印）の存在に注意する。ｃ．エレクトロポレーションの６日後の対照における複数のGFP+ニューロン（くさび形）の存在を明らかにするが、CDK5RAP2エレクトポレーション組織が複数のGFP+放射状グリア（矢印）を示す、GFP対照（左のパネル）及びCDK5RAP2同時エレクトポレーション患者由来組織（１４Ｂ）におけるGFP染色（緑）。

図２１．ヒトオルガノイドにおけるｓｈＲＮＡ媒介CDK5RAP2ノックダウン。ａ．CDK5RAP2に対して４つの別々のｓｈＲＮＡｓを形質移入された293T細胞の内因性CDK5RAP2のウエスタンブロット。ｓｈＲＮＡ１及び２は最も効果的であったが、ｓｈＲＮＡ４はタンパク質のわずかな減少しかもたらさなかった。チューブリンを添加対照として示す。ｂ．スクランブル対照又はｓｈＲＮＡ同時エレクトポレーション組織においてSox2+前駆体の独自性又はDCX+神経の独自性を呈するGFP+エレクトポレーション細胞のパーセンテージの定量化。対照と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定、各ｓｈＲＮＡについてｎ＝４の組織。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．。

実施例１：方法
プラスミド構築物及び材料。ｓｈＲＮＡの同時エレクトロポレーション及びライブ造影に使用されるGFPプラスミドは、pCAG-GFP（Addgene plasmid 11150）であった。ヒトCDK5RAP2を標的とするｓｈＲＮＡｓを、ｐＳｕｐｅｒ ｓｈＲＮＡ発現ストラテジ（OligoEngine）を使用してクローン化した。標的配列は、以下のとおりであった：ｓｈＲＮＡ１ AGGACGTGTTGCTTCAGAAAT（配列番号１）、ｓｈＲＮＡ２ AGAGTCAGCCTTCTGCTAAAG（配列番号２）、ｓｈＲＮＡ３ GTGGAAGATCTCCTAACTAAA（配列番号３）、ｓｈＲＮＡ４ ACTATGAGACTGCTCTATCAG（配列番号４）。CDK5RAP2発現構築物を、ＡｔｔＢ部位を有するプライマーを使用してＭＧＣヒトCDK5RAP2 ｃＤＮＡ（クローンＩＤ：9052276）からCDK5RAP2のＰＣＲ増幅によるゲートウェイシステム（Invitrogen）を使用して生成した：フォワード：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGATGGACTTGGTGTTGGAAGA（配列番号５）、リバース：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGCTTTATTGGCTGAAAGTTCTTCTC（配列番号６）。CDK5RAP2を、ディスティネーションベクターpcDNA3.1/nV5-DEST内にクローン化した。

脳オルガノイドの培養物条件。標準核型及び汚染のないことが検証済みのヒトＨ９ＥＳ（WA09）を、継代２６でWiCellから得た。多能性及び汚染がないことが検証済みのｉＰＳ細胞をSystem Biosciences（SC101A-1）から得た。全てのヒトＰＳＣ系列を、マイコプラズマ陰性の状態であることを定期的にチェックし、承認した。ヒト胚幹（ＥＳ）細胞又は誘導した多能性幹（ｉＰＳ）細胞を、WiCellプロトコールに従って、ＣＦ−１γ線照射ＭＥＦｓ上で維持した。オルガノイド培養の０日目に、ＥＳＣｓ又はｉＰＳＣｓを、ジスパーゼ処置によってＭＥＦｓから剥離し、そして幹細胞のトリプシン処理前にＭＥＦｓからの幹細胞コロニーの重力分離によってＭＥＦｓを取り除いて、単独細胞を生成した。次いで、４５００個の細胞を、低濃度bFGF（５分の１に低減）及び５０μΜのROCK阻害剤を含むｈＥＳ培地中、超低結合９６ウェルプレートの各ウェルで平板培養した。

胚様体（ＥＢｓ）を６日間１日おきに播種し、次いでＤＭＥＭ／Ｆ１２、１：１００のＮ２サプリメント（Invitrogen）、Glutamax（Invitrogen）、ＭＥＭ−ＮＥＡＡ、及び１μｇ／ｍｌのヘパリン（Sigma）含有神経誘導培地の入った低接着２４ウェルプレートに移した。これらは神経上皮組織を形成し始め、そしてそれを５日間１日おきに播種した。プロトコールの１１日目には、３ｍｍの小さい窪みのあるパラフィルムシート上の冷Matrigel内へのピペット注入によって、Matrigel液滴中に組織を移した。これらの液滴を３７℃にてゲル化させ、続いてそれをパラフィルムから取り出し、そしてＤＭＥＭ／Ｆ１２と、１：２００のＮ２サプリメント、１：１００のビタミンＡ不含Ｂ２７サプリメント（Invitrogen）、３．５μｌ／Ｌの２−メルカプトエタノール、１：４０００のインスリン（Sigma）、１：１００のGlutamax（Invitrogen）、及び１：２００のＭＥＭ−ＮＥＡＡ含有Neurobasalとの１：１混合物を含む分化培地中で培養した。

４日間の定常増殖後に、組織液滴を、Ｂ２７サプリメントを除き、ビタミンＡを使用した上述の分化培地が入った回転バイオリアクターに移した。レチノイン酸がインビボにおいて神経分化に重要であることが示されたので、我々は、脳オルガノイドを分化させるのに使用される最後の培地中にそれを入れた。

マウスオルガノイドの培養条件。マウスＡ９ＥＳ細胞を、マイトマイシンＣ培養不活性化ＭＥＦｓ上で培養し、そして標準的なプロトコール（Tremml et al. 2008）に従ってパッサージした。マウスオルガノイドの生成のために、以下の改変をしてオルガノイドのプロトコールを適用した：細胞をトリプシン処理し、そして２０００個の幹細胞を、Eirakuらによって記載された分化培地（１０μΜのＳＢ４３１５４２を含むが、Ｄｋｋ−１を含まない培地）中、超低結合９６ウェルプレートの各ウェル内で平板培養した。マウス組織に関して、形態に従ってより早い時期にそれを使用したという例外はあるものの、その後のステップを、同一の培地成分を使用してヒトオルガノイドの方法に従って進めた。ＥＢｓを、４日目に神経誘導培地に移し、６日目にMatrigel液滴に埋め込み、そして９日目に回転バイオリアクターに移した。

オルガノイドのエレクトロポレーション。エレクトロポレーションを、ともにBTX Harvard Apparatus製のペトリディッシュ組織電極とエレクトロ−スクエア−ポレーター（ECM830）を使用して行われた。合計３μｌの２μｇ／μｌの総プラスミド（ライブ造影のためのGFP、ｓｈＲＮＡ実験のための１．８μｇ／μｌのｓｈＲＮＡ＋０．２μｇ／μｌのGFP）を、オルガノイド内の４〜５か所の位置に注入し、そしてエレクトロポレーションを、５パルス、８０Ｖ、５０ｍｓの持続、１秒間隔で抗生物質不含分化培地中おこなった。救済実験のために、GFP発現プラスミドとCDK5RAP2構築物を等しい濃度で同時エレクトポレーションした（それぞれ１μｇ／μｌ）。

オルガノイドにおけるライブ造影。ライブ造影を、温度及びＣＯ_２制御装置を備えたLSM780共焦点レーザー走査型システム（Zeiss）を使用しておこなった。カルシウムイメージングに関して、Ｆｌｕｏ−４ダイレクト（Life Technologies）を製造業者に従って準備し、そして造影開始６０分前に適用した。造影は、４９４ｎｍの励起と５１６ｎｍの発行にて実施し、フレームは１００フレームを２０秒ごとに撮影した。カルシウムイメージングのデータ分析を、ImageJ（Fiji）を使用しておこなった。所望の領域（ＲＯＩｓ）を手作業で選択し、そして平均蛍光を各タイムフレームについて計算した。変化は、蛍光を以下のとおり計算した：ΔＦ／Ｆ＝（Ｆ−Ｆ_基礎量）／Ｆ_{バックグラウンド}、ここで、Ｆ_基礎量は造影を通じた最低平均蛍光値であり、それに対しＦ_{バックグラウンド}は全フレームを通じて平均した平均蛍光である。グルタミン酸は造影中、１００μΜの終濃度で浴適用によって培地に追加した。ＴＴＸは造影の間、１μΜの終濃度の溶液槽適用によって培地に追加し、そして造影を１０分のインキュベーション時間後に再開した。

組織構造及び免疫蛍光法。組織を４℃にて２０分間、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、続いてＰＢＳで１０分間、３回洗浄した。組織を、３０％のスクロース中に一晩浸し、次いで、１０％／７．５％のゼラチン／スクロース内に埋め込み、そして２０μｍの凍結切片にした。組織切片を、ヘマトキシリン／エオシンによって染色するか又は免疫染色に使用した。免疫組織化学のために、切片を、ブロックし、そしてＰＢＳ中の０．２５％トリトン−Ｘ、４％通常ロバ血清中で透過処理した。次いで、切片を、以下の希釈倍率の０．１％のトリトン−Ｘ、４％の通常ロバ血清中の一次抗体とインキュベートした：Ｎ−カドヘリン（マウス、BD Biosciences 610920、1:500）、Sox2（ウサギ、Chemicon、AB5603、1:300）、Tuj1（マウス、Covance MMS-435P、1:750）、TUNEL（In Situ Cell Death Detection Kit-Fluorescein、Roche）、FoxG1（ウサギ、Abcam ab18259、1:200）、Emx1（ウサギ、Sigma HPA006421、1:50）、Krox20（ウサギ、Covance PRB-236P、1:100）、Pax2（マウス、Abnova H00005076-M01、1:200）、Lmo4（ヤギ、Santa Cruz sc-11122、1:50）、Tshz2（ウサギ、Sigma SAB4500379、1:50）、Otx1+2（ウサギ、Abcam ab21990、1:200）、Gbx2（ヤギ、Santa Cruz sc22230、1:100）、Auts2（ウサギ、Sigma HPA000390、1:250）、Nkx2.1（ウサギ、Epitomics 6594-1、1:250）、Pax6（マウスモノクローナル、DSHB、1:200）、Pax6（ウサギ、Covance PRB-278P、1:300）、カルレチニン（マウス、Swant 6B3、1:100）、Nrp2（ヤギ、RandD systems AF2215、1:40）、Fzd9（ウサギ、Acris SP4153P、1:200）、Prox1（マウス、Chemicon MAB5654、1:200）、TTR（sheep、AbD Serotec AHP1837、1:100）、Tbr2（ウサギ、Chemicon AB9618、1:500）、Tbr1（ウサギ、Abcam ab31940、1:300）、MAP2（マウス、1:300）、PH3（ウサギ、Cell Signaling Technology 9706S、1:300）、Ｐ−ビメンチン（マウス、MBL International D076-3S、1:250）、BrdU（３７℃にて２０分間、２ＮのＨＣｌ中でプレインキュベーション、ラット、AbD Serotec OBT0030CX、1:500）、Baf53a（ウサギ、Bethyl IHC-00287、1:250）、Baf53b（ウサギ、Abcam ab140642、1:250）、リーリン（マウス、Millipore MAB5366、1:200）、Ctip2（ラット、Abcam ab18465、1:100）、Satb2（ウサギ、Abcam ab34735、1:100）、DCX（ヤギ、Santa Cruz sc-8066、1:300）、Brn2（ヤギ、Santa Cruz sc-6029、1:40）。使用した二次抗体は、ロバAlexaFluor４８８、５６８、及び６４７アジュバント（Invitrogen、1:500）であった。BrdUで染色した切片に関して、切片を最初に３７℃にて２０分間、２ＮのＨＣｌ中でインキュベートし、続いてブロッキング前にＰＢＳで３回洗浄した。

ＲＴ−ＰＣＲ。全ｍＲＮＡサンプルを、Trizol試薬（Invitrogen）を使用して三連で、オルガノイド又はｈＥＳ細胞全体から単離した。混入する可能性があるＤＮＡを、DNA-Free（Ambion）を使用して取り除き、そして１μｇのＲＮＡをSuperScript III（Life Technologies）を使用したｃＤＮＡ合成に使用した。各プライマー対に関するＰＣＲ条件及びサイクル数（２５〜３５サイクル）を、ｈＥＳ ｃＤＮＡ又はヒト胎児脳ｃＤＮＡ（Invitrogen）を使用して経験的に決定した。サイクルを、９４℃にて３０秒間の変性、プライマー対に依存する、５８〜６２℃にて４５秒間のアニーリング、そして、７２℃にて３０秒間の伸長により実施した。使用したプライマー対は、以下のとおりであった：Oct4a Ｆｏｒ ggagaagctggagcaaaacc（配列番号７）、Ｒｅｖ tggctgaataccttcccaaa（配列番号８）；Nanog Ｆｏｒ gatttgtgggcctgaagaaa（配列番号９）、Ｒｅｖ ctttgggactggtggaagaa（配列番号１０）；Sox1 Ｆｏｒ tatcttctgctccggctgtt（配列番号１１）、Ｒｅｖ gggtcttcccttcctcctc（配列番号１２）；Pax6 Ｆｏｒ agttcttcgcaacctggcta（配列番号１３）、Ｒｅｖ attctctccccctccttcct（配列番号１４）；Actb Ｆｏｒ aaatctggcaccacaccttc（配列番号１５）、Ｒｅｖ agaggcgtacagggatagca（配列番号１６）；BF1 Ｆｏｒ aggagggcgagaagaagaac（配列番号１７）、Ｒｅｖ tgaactcgtagatgccgttg（配列番号１８）、Six3 Ｆｏｒ ctatcaacaacccccaacca（配列番号１９）、Ｒｅｖ agccgtgcttgtcctagaaa（配列番号２０）、Krox20 Ｆｏｒ ttgaccagatgaacggagtg（配列番号２１）、Ｒｅｖ cttgcccatgtaagtgaaggt（配列番号２２）；Isl1 Ｆｏｒ gctttgttagggatgggaaa（配列番号２３）、Ｒｅｖ actcgatgtgatacaccttgga（配列番号２４）。

細胞培養及びウエスタンブロット。ＨＥＫ293T細胞を、１０％のＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で培養し、４０％の時点で６ウェルディッシュ（BD Falcon）に分け、続いて翌日、TurboFect（Thermo Scientific）を使用して５μｇのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションをおこなった。細胞を２日後に溶解し、ウサギ抗CDK5RAP2（A300-554A, Bethyl labs, 1: 10,000）を使用してウエスタンブロットをおこない、続いてマウス抗アルファチューブリン（マウス、Sigma T6199, 1:10,000）についてブロットした。皮膚線維芽細胞を、皮膚パンチ生検によって得、amnioMAX C-100完全培地（Invitrogen）で培養し、そして５％のＣＯ_２及び３％のＯ_２にて３７℃のインキュベータ内で維持した。細胞を、プロテアーゼインヒビター錠剤（Roche）を補った５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８、２８０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ_４Ｏ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール中で溶解した。タンパク質サンプルを、３〜８％のＴｒｉｓ−アセタートゲル（Invitrogen）で泳動し、続いてウサギ抗CDK5RAP2（A300-554A, Bethyl labs, 1:2, 000）及びマウス抗ビンキュリン（V9264, Sigma, 1:2,000）を使用して免疫ブロッティングをおこなった。免疫蛍光法をおこなうために、患者の繊維芽細胞を、−２０℃のメタノール中で７分間固定し、次いでＰＢＳ／１％のウシ血清アルブミン中でブロッキングした。次いで、細胞を、ブロッキング溶液中のウサギ抗CDK5RAP2（A300-554A, Bethyl labs, 1:2,000）及びマウス抗ＣＰＡＰ（SC-81432, Santa Cruz Biotechnology, 1:100）中でインキュベートした。使用した二次抗体は、ロバAlexaFluor４８８及び５６８アジュバント（Invitrogen、1:500）であった。

調査課題及び遺伝子同定。ゲノムＤＮＡを、標準的な方法によって患者３８４２及び患者の親の末梢血から抽出した。告知同意を家族から得、そして、試験はMulti-centre Research Ethics Committee for Scotland（04:MRE00/19）に承認された。エクソン全体の捕獲と配列決定を、Welcome Trust Sanger Institute（WTSI）, UKでおこなった。ＤＮＡは、SureSelect Human All Exon 50Mbキット（Agilent, Santa Clara, CA）を使用したエクソン全体の捕獲と増幅前に超音波処理（Covaris, Woburn, Massachusetts, USA）によって１５０ｂｐの長さに剪断した。断片を、Illumina Hiseqプラットフォームを使用して配列決定した。７６ｂｐの対合末端配列読出しを、ＢＷＡを使用したＵＣＳＣゲノムブラウザｈｇ１９参照配列に対して整列させた。配列変異体を、GenomeAnalysisTK（www.broadinstitute.org/gatk/）を使用して得、転写産物及びタンパク質の影響、polyphen、condel、及びSIFTスコアを注記した。突然変異を、ABI3730キャピラリーシーケンサ（Applied Biosystems）により色素ターミネータ化学反応を使用したＰＣＲ産物の双方向配列決定法によって確認した。

患者ｉＰＳＣの再プログラミング。患者の皮膚線維芽細胞を、Oct4、Sox2、Klf4、及びc-Mycのレンチウイルスデリバリーを使用して再プログラムした。レンチウイルス作製：ウイルスパッケージングベクター（ｔａｔ、ｒｅｖ、ｇａｇ／ｐｏｌ、それぞれ１．５μｇ、及びｖｓｖ−ｇ、３μｇ）及びｌｏｘＰフランクドＯＫＳＭ再プログラミングベクター（ｏｃｔ−４、ｋｌｆ４、ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、３０μｇ）から成るＤＮＡミックスを、２９３細胞内に形質移入した。要するに、１１２．５μｌのＦｕｇｅｎｅ６を、連続的にボルテックスにかけながら２ｍｌのＤＭＥＭに滴下して加え、続いてＲＴにて１０分間インキュベーションに供した。ＤＮＡミックスを、ボルテックスにかけながらＤＭＥＭ／Ｆｕｇｅｎｅ６ミックスに加えて、最終的なトランスフェクションミックスを生成した。ＲＴにて１５分間のインキュベーション後に、トランスフェクションミックスを、８０％コンフルエントの２９３細胞に加え、１３ｍｌの２９３培地中で培養した。トランスフェクション後４８ｈ、６０ｈ、及び７２ｈに、ウイルス含有培地を採取し、そして新鮮培地に置換した。ウイルス上清を４℃で保存した。ヒト皮膚線維芽細胞の再プログラミング：１×１０^５の皮膚線維芽細胞を、インフェクションの前日に１０ｃｍ及び６ｃｍの０．１％のゼラチンコート培養ディッシュ上に播種した。細胞を、４μｇ／ｍｌのポリブレンを補った皮膚線維芽細胞培地と１：１で混合したウイルス上清と一緒に１２ｈインキュベートした。その後、細胞を、１×ＰＢＳで洗浄し、皮膚線維芽細胞培地中でもう２日間培養した。２日間の培地後に、１０ｎｇ／ｍｌのbFGF（peprotech, cat.nr: 100-18B）、１０μｍのＣＨＩＲ９９０２１（stemgent, cat.nr: 04-0004）、及び１μＭのＰＤ０３２５９０１（stemgent, cat.nr: 04-0006）を補ったヒトｉＰＳＣｓ培地に切り換え、そして、細胞を２１日間培養した。培地を毎日交換した。形態的な外観によって同定した、より大きくなったコロニーを釣り上げ、そして不活性化ＣＦ−１ ＭＥＦｓ（global stem, cat.nr: GSC-6201M）上にパッサージした。患者由来ｉＰＳ系列を、健常ドナー（System Biosciences, SC101A-1）由来の対照ｉＰＳ細胞と比較した。アルカリホスファターゼ染色を、Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit（Vector Laboratories, SK5300）を使用しておこなった。患者及び対照ｉＰＳＣ由来オルガノイドにおける定量を、ImageJでコード化したファイル名を使用してブラインド化しておこなった。

患者の臨床的概要。患者A3842は、妊娠２２／４０週の時点で明らかな脳のサイズの顕著な低下を伴う、胎児期から成長制限を呈した。妊娠は、そのほかの点では普通に進行し、そして患者は、１．８２ｋｇ（−３．９ ｓ．ｄ．）の体重で正期に生まれた。出生後、３年７カ月の時点で身長が７３ｃｍ（−６．７ ｓ．ｄ．）、そして重度の不均衡な小頭症を患ったままで、頭囲が３５ｃｍ（−１３．２ ｓ．ｄ．）であるように、成長も少なかった。患者はかなり突き出した目をしていて、すり鉢状の間隔の広い歯を有するが、その他は検査のときに目立たなかった。混合性伝導性／感音性難聴は別として、神経学的欠損又は他の系における何れの先天異常も無いことは明らかであった。発生の診査事項は、わずかに／中程度の遅延があった。妊娠２２／４０における神経イメージングにより、小さい前頭葉及び脳梁の部分欠損を伴う平滑な脳（妊娠のこの時点で通常明らかな大脳外側溝が存在していなかった）を実証した。出生後、ＭＲＩにより、単純化された旋回パターン及び標準的な厚さの大脳皮質を有する小頭症であることを実証した。要約すれば、臨床所見は、CENPJ及びCEP152などの他の中心体小頭症遺伝子について報告された原発性小頭症−小頭症原発性小人症スペクトラムの原因となる成長パラメーターを伴った、CDK5RAP2原発性小頭症の先の症例と一致した（聴覚障害は以前にCDK5RAP2で報告されていた）。

実施例２：脳オルガノイドの生成のためのスピニング・ドロップレット法
様々な臓器系のインビトロモデルの最近の進展が、多能性幹細胞が全組織を形成する高い自己組織化能力を実証した。ヒト脳の複雑さと不均一をモデル化するアプローチを開発する際に、我々は、この概念を当てにし、人工的に特定の脳領域を駆動する成長因子のあらゆるパターニングを省略した。代わりに、我々は、外発的に特定の脳領域の形成を駆動するより、組織の成長要求性を改善すること、及び本来備わっているきっかけが発生に影響を及ぼすのに必要な環境を提供すること焦点を当てた。

我々は、改変アプローチを用いて、神経のロゼット病を生成するのに使用したもの（Xia and Zhang. 2009）と同じ胚様体から神経外胚葉を生成することから始めた。しかしながら、我々のアプローチにおける主要な相違点は、これらの神経外胚葉組織がその後３Ｄ培養物の状態を維持し、Matrigel液滴内に埋め込まれ、そしてそれが、次いで養分吸収を促進し、そしてより大きくより複雑な組織の培養を可能にするために回転バイオリアクターに移したことである（図１ａ）。

このスピニング・ドロップレットアプローチは、脳室を連想させる体液の充填した腔を囲む大きくて、連続した神経上皮の形成につながった（図１ｂ）。これらの神経上皮は神経に特異的なＮ−カドヘリンの特徴的発現を示し、そしてそれは神経上皮が発生するために典型的な尖状−基底極性を反映する内部表面に明確に局在化した。更に、神経上皮は、数個の小さいロゼット様神経上皮の凝集体を代わりに形成するEirakuら（2008）と同じように生成した組織よりも、更に大きく、連続していた（図１ｂ、ｅ）。

これらの組織が更に発生を続けられるようにすると、オルガノイドは、非常に大きく（直径が最大４ｍｍ）、様々な脳領域を連想させる構造特性を有する高度に複雑化した不均一組織を形成し（図１ｃ〜ｅ）、そしてそれは、回転バイオリアクター内で維持した場合、無期限に（現在は最長１０カ月）生存できた。組織学及び全体的な形態解析により、脳の皮質、脈絡叢、網膜、及び髄膜を連想させる領域が明らかになった。重要なことには、組織は一般的に、循環系、並びに酸素及び栄養素の交換の不足によって生じ得る制限のサイズまで到達する。これと一致して、大規模な細胞死はこれらの組織のコアで見られたが（図１４ｃ）、様々な脳領域は外側に沿って発生した。更に、脳オルガノイドは、同様の全体的な形態及び複雑さで、ヒトＥＳ細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）の両方から再現性良く生成でき（図７ａ、ｂ）、このアプローチが様々なヒト多能性幹細胞に適用できることを示唆している。

実施例３：脳オルガノイドは様々な個別の脳領域を示す。
全体的な形態分析により、脳オルガノイドが不均一な脳領域を示したことが示唆されたので、次に、我々はこれらの組織の領域独自性を特徴づけしようと考えた。これらの組織のうまくいっている神経誘導を示して、我々は最初に多能性及び神経の独自性の数種類のマーカーについてＲＴ−ＰＣＲをおこない（図８）、そして多能性マーカーOct4及びNanogがオルガノイド分化の過程で減少したが、神経の独自性マーカーSox1及びPax6が上方制御されたことがわかった。

次に、我々はオルガノイド全体の神経の独自性の局所マーカーを調べ（図２ａ）、それにより前脳マーカー（BF1及びSix3）並びに後脳マーカー（Krox20及びIsl1）の両方を明らかにし、その組織内の不均一集団が示唆された。しかしながら、我々は、組織がより進行した段階まで発生したとき、前脳マーカーは高度に発現したまま維持され、後脳マーカーが減少し始めたことに気付き、これらの独自性の組織内での相対量が分化の過程にわたって変化したことが示唆された。このことは、正常ヒト脳の発生が、前脳組織の発生的増殖に起因して、これらの独自性の相対量における同様の変化を反映し、最終的にヒト脳の約８５％を構成するという事実の観点から特に興味深い。

次いで、我々は、細胞が、全体的な形態が示唆しただろうとおりに、オルガノイド内の不連続部位として発生したこれらの脳領域の独自性を有するか、又は組織内にランダムに点在したのかを調べた。これを試験するために、我々は、これらの組織（図２ｂ）の初期発生中の２つの時点にて、前脳及び中脳、並びに後脳の独自性のマーカーの免疫組織化学的染色をおこなった。我々は、Pax6発現によって前脳の独自性、そして、Otx1/2発現によって前脳／中脳の独自性のといくつかの領域を明確に同定することができた。これらの領域は、これらのマーカーを欠くが、後脳マーカーGbx2、Krox20、及びPax2について陽性である領域に隣接して位置しており、それが、初期の中脳−後脳境界を連想させ、類似した局所連絡や相互抑制の可能性を示唆した。我々は、Gbx2陽性の領域は、発生が進むにつれて大きく減少し、図２ａで見られた結果に類似していたが、Otx1/2陽性の前脳組織は増殖し続けたことを更に観察した。

次に、我々は、前脳の小領域が識別できるかどうか試験するために発生した組織を更に調べた。我々は、前脳マーカーFoxG1の染色をおこなうと（図２ｃ）、そのマーカーは典型的な脳皮質の形態を表す領域を標識した。これらの領域の多くはまたEmx1陽性でもあって（図２ｄ）、背側皮質の独自性を示した。我々は、このマーカーで陽性に染色され、且つ典型的な背側皮質の形態を示した脳オルガノイド内のいくつかの不連続部位を同定できた。我々はまた、マーカーAuts2について染色することによって、背側皮質、即ち前頭皮質内の下位特性についても試験した（図２ｄ）。Auts2染色はニューロンに見られ、背側皮質の異なる領域を標識し、そして前記組織内の皮質葉の下位特性が示唆された。後頭葉マーカーであるTshz2（図１５ａ）及び前頭葉と後頭葉のマーカーであるが、頭丁に不存在であるLmo4（図１５ｂ）。これらのマーカーはニューロンに見られ、背側皮質の異なる領域を標識し、そして皮質葉の下位特性が示唆された。

更に、他の脳皮質領域、即ち腹側皮質（図２ｅ）及び海馬（図２ｆ）を染色することにより、同様にこれらの独自性を示すオルガノイド内の不連続部位を同じように明らかにした。注目すべきことには、腹側前脳領域に生じた介在ニューロンが、腹側組織から背側組織への遊走と一致する形態及び位置を呈した（図１５ｂ）。背側皮質内では、これらのニューロンは尖状面に対して平行な神経突起を示して、インビボにおける接線方向の遊走に見られる遊走性の継続を連想させた（図５ｇ）。特に、腹側部（Nkx2.1陰性オルガノイドの４／４）を欠損するオルガノイドの背側皮質では、カルレチニン陽性介在ニューロンが不存在であったため、腹側前脳で生じた介在ニューロンが背側皮質に遊走したことが示唆された。このことは、脳オルガノイドが発生する際に、遠く離れた領域が互いに影響を及ぼす可能性を示唆している。

最後に、これらの脳皮質の独自性とは別の他の脳構造、即ち脈絡叢（図２ｇ）を観察することができ、さらに未成熟な網膜（図１０ｄ）さえ観察することができた。全体的に見て、調べた組織全てが、背側皮質形態を有する領域を示し（３５／３５、１００％）、大部分が脈絡叢（２５／３５、７１％）を示し、そしていくつかがNkx2.1免疫反応性によって決定される腹側前脳の独自性（１２／３５、３４％）を示したが、ほんのいくつかだけが網膜組織（レチナール色素上皮の存在によって決定された、４／３５、１１）を示した。これらの結果は、脳オルガノイドが個別の、しかし互いに依存しているドメインに組織化された様々な脳領域の独自性を発生させたことを示唆している。

実施例４：背側皮質の組織化及び放射状グリア細胞の挙動は、脳オルガノイドにおいて再現される。
我々はヒト背側皮質の発生と疾患のモデリングに興味を持っていたので、次に、我々は脳オルガノイド内の背側皮質領域の組織化を調べた。放射状グリア前駆体（ＲＧｓ）及び新生ニューロンのマーカーに関する染色（図３ａ）により、脳室を連想させる大きい体液の充填した腔に隣接してＲＧｓが層を形成する典型的な前駆帯の組織化が明らかになり、脳室帯（ＶＺ）の形成が示唆された。Tbr1を染色することにより（図１１ａ）、神経の独自性及び発生プレプレート（ＣＰに対する前駆体）への放射状移動の適切な発生が明らかになった。更に、神経の前駆体及び神経特異的ＢＡＦ成分を染色することにより、神経運命指定中、クロマチン再モデリング複合体における特徴スイッチが明らかになった（図１６ａ）。更に、中間前駆体（ＩＰ）のマーカーTbr2（図３ｂ）を染色することにより、ＶＺに隣接するＩＰｓの薄層が明らかになり、それが脳室下帯（ＳＶＺ）を連想させた。これにより、背側皮質組織はインビボで見られるのと酷似した典型的な前駆帯の組織化を表す。

次に、我々はこれらの前駆体の挙動が哺乳類の大脳皮質で見られる挙動を反映したものかどうか調べた。我々は、ホスホヒストンＨ３（PH3）を染色しすることによってこれらの組織内での増殖を調べ（図３ｃ）、そして体液の充填した腔に隣接する尖状表面にて分割する細胞の大部分が、一般的に尖状面で分裂するＲＧｓの分裂をマークし得ることを観察した。我々は、ＩＰｓの一過性増幅分裂を多分反映している、ＶＺの外側においてたまに起こる分裂、及び最近同定された幹細胞集団である外側放射状グリアの潜在的分裂（以下で更に詳細に考察する）を更に観察できた。

更に、我々が有糸分裂ＲＧｓのマーカーであるホスホ−ビメンチン（図３ｄ）を染色したとき、尖状表面に現れる分裂の大部分がPH3染色に類似しているが、また、これらの組織の外部表面までずっと伸びている透明な基底突起も観察できた（図３ｅ）。このことは、これらの組織内のＲＧｓがインビボで見られる典型的な尖状基底形態を再現したことを示唆している。

これを更に詳細に調べるために、我々はエレクトロポレーションアプローチを使用して個々のＲＧｓを標識しようと考えた。マウス胚脳における子宮内エレクトロポレーション我々の経験を利用して、我々はGFPをコードするプラスミドＤＮＡを、これらの組織の体液の充填した腔に注入し、次いでこれらの脳室様腔に隣接するＲＧｓをエレクトポレーションするために方形波パルス電場を適用する技術を開発した（図３ｆ）。このアプローチは、体液の充填した腔に隣接して位置するいくつかの領域内及び細胞におけるGFPの再現性のよい発現につながった。

我々がこれらの背側皮質領域内でGFP標識細胞を調べたとき、我々は成長の様々なステージで典型的な形態を有するＲＧｓを同定できた（図３ｇ）。例えば、早期ステージの組織では、ＲＧｓは発生初期に見られる偽重層構造を反映する神経上皮の形態を示した。しかしながら、後期組織は、これらの細胞の双極性形態を反映しているより長く伸びた尖状突起及び基底突起を有するＲＧｓを示した。

尖状面にて起こったＲＧｓの分裂の観察は、ＲＧｓが典型的な細胞周期依存的な核移動を受け得ることを示唆している。これを試験するために、我々は脳オルガノイドにおけるGFPをエレクトポレーションしたＲＧｓのライブ造影をおこなった。我々は、細胞周期依存的な核移動と一致する尖状突起及び基底突起に沿った細胞体の動きを示したＲＧｓの多くの例を観察することができた（図４ａ）。

更に、我々は、前記細胞が細胞周期依存的な核移動を受けていた場合に予想されるように、ＲＧｓの核が時間とともに外側ＶＺ局在から尖状面に向かって移動したかどうか試験するためにＳ期マーカーBrdUを用いてパルス−チェイス実験をおこなった。実際、BrdUの短い１時間のパルス後に、細胞の大部分はＶＺの外側領域に局在化していた（図４ｂ）。しかしながら、洗浄及び４時間又は６時間のチェイス後、我々は、尖状表面のより近くに、及び尖状表面に隣接した、BrdUに関して陽性に染色された細胞核を次第に数多く観察できた。これは典型的なＲＧの細胞周期依存的な核移動挙動と一致している。

次に、我々は尖状表面におけるＲＧｓの分裂様式を調べた。我々は、うまい具合に尖状表面にてＰ−ビメンチン染色した有糸分裂ＲＧｓについて既に観察していたので（図４ｃ）、我々はこの染色から分裂面を明確に識別できた。そのため、我々は分裂面の決定をおこなって（図４ｄ）、これらの脳オルガノイド内のヒトＲＧｓが、他のモデルシステム、即ち発生マウス新皮質で見られるものと同様の有糸分裂方向を示すかどうか調べた。我々は主として面方向について観察すると、その方向は尖状表面に対して平行であったが（図４ｄ）、それは他の哺乳類の新皮質の発生において観察されることが多かった。しかしながら、我々はまた、かなり多い斜め方向も観察したが、それは、発生している齧歯動物の新皮質について一般的に記載されたより、これらのヒト組織においてより大規模まで存在していた。興味深いことに、これらの計測値は最近のヒト脳に関する記載の同じ傾向を反映しており、脳オルガノイドがヒト皮質発生の側面を再現できたことが示唆された。

我々は更に、ヒト脳オルガノイドのＲＧｓが対称的に分裂し得るのか又は非対称的に分裂し得るのか試験するために、これらの分裂の運命可能性を調べた。我々は、GFPのエレクトロポレーションをおこない、続いて短いBrdUパルス−チェイスをおこなって、少数の細胞の分裂を系統トレースした。我々が二重標識娘細胞対を調べたとき、我々は、対称自己更新ＲＧ運命、並びに一方の娘細胞だけしかＲＧのまま維持されない非対称運命の両方を観察できた（図４ｅ、ｆ）。このことは、これらのヒト組織で生成したＲＧｓが対称分裂及び非対称分裂の両方を受ける可能性があることを示唆している。

実施例５：機能的な大脳皮質ニューロンの形成
放射状に組織化されるＣＰの形成は、前駆体であるプレプレートの形成で始まる。この初期の組織化を試験するために、我々は、プレプレートのマーカーTbr1並びに神経マーカー３８であるＭａｐ２について３０日オルガノイドについて染色した（図１２ａ）。これにより、プレプレートを連想させる基底神経層の存在、及びＩＺを連想させる尖状隣接部位が明らかになった。更に、我々は基底面に沿ってリーリン陽性ニューロンを観察することができ、ＣＰアーキテクチャの生成において重要な集団であるカハール−レツィウス細胞の存在が示唆された。

インビボにおいて、背側中枢ニューロンは、成熟し、そして長距離軸索を伸ばす。我々はこれらの特徴について試験するために、GFPエレクトロポレーションをおこない、そして神経形態を調べた。GFP標識軸索投射により、複雑な分枝と成長円錐挙動（図５ｉ）を示し、そして軸索バンドリングを連想させる様式で長距離軸索投射した（図５ｈ）。

最後に、我々は、Ｃａ^２＋振動を検出するためのカルシウム色素造影をおこなうことによって、脳オルガノイド内のニューロンが神経活動を呈することができるか試験し、それにより、個々の細胞における自然発生的なカルシウム上昇が明らかになった（図５ｊ、図１７ｂ）。更に、我々は、外因性グルタミン酸を適用し（図１２ｃ）、より頻繁なカルシウムスパイクを観察したので、グルタミン酸作動性受容体活性が示唆された。最後に、我々は、テトロドトキシン（ＴＴＸ）の適用によって作動電位遮断をおこなって、そして弱まったカルシウム上昇を観察したので、カルシウムスパイクがニューロン活性に依存していることが示唆された（図１２ｄ）。

実施例６：ヒト大脳皮質発生における以後の事象の再現
脳オルガノイドが神経発生におけるヒト固有のプロセスを試験するのに使用できるか調べるために、我々は発生的により高度な背側皮質組織において前駆帯の形態を調べた。これらの領域は、より高度な段階まで発生させた場合、一般的にはるかに厚くて、且つ非常に大きくなった（オルガノイド内のただ一つの背側皮質領域が直径最大１ｍｍまで成長できた）。我々は、ＲＧｓ及びニューロンを染色し、そして尖状表面から置き換えられるように見える多くのSox2陽性前駆体を観察した（図５ａ、図１８ａ）。これらの前駆体のマーカーの独自性及び位置は、その前駆体がマウスや他の下等哺乳類と比べて、ヒト大脳皮質では代表が多すぎる最近同定された前駆体タイプである外側放射状グリア（oRGs）を表す可能性を指摘する。

このＯＳＶＺ様組織化がインビトロの人工構造である可能性を除外するために、我々は前記方法をマウスＥＳ細胞に適合させて、マウスの脳オルガノイドを生成して、同様の組織化が存在するか調べた（図１８ｂ及びｃ）。我々は、ヒトと比べて、マウスオルガノイドではるかに小さい皮質組織、及びＯＳＶＺ様領域に蓄積しなかったごく稀なoRGsを観察した。これらの結果は、ＯＳＶＺ及びＩＦＬ様層がヒトオルガノイドに特異的であることを示唆している。

我々は、これらのかなり豊富なoRGsが、ヒトは見られるが、マウス発生皮質では見られない内側線維層を連想させるTuj1陽性線維層によって尖状ＶＺと隔てられているように見えることを更に観察した（図５ａ）。この組織化は、ヒト脳オルガノイドがマウスでモデル化できなかったヒトに特異的な皮質の発生の少なくともいくつかの側面を再現できたことを示唆している。

これらの潜在的oRGsを更に特徴づけするように、我々はＰ−ビメンチン染色をおこなって、それらの形態を調べ、これらの細胞から発している明白な基底突起を観察したが、それらは尖状突起を欠いていた（図５ｂ）。ＲＧマーカーの独自性と共にこの形態は、oRGsの顕著な特徴であり、これらの基底部置き換えSox2及びＰ−ビメンチン陽性前駆体は実際にはヒトoRGsを表していることが示唆された。

次に、我々は、これらのoRGsの分裂様式を調べ、そしてＰ−ビメンチンで娘細胞対を標識した際に、一方の娘細胞だけがSox2発現を維持する非対称分裂を確認できた（図５ｃ）。更に、我々は、尖状表面に対する分裂面を計測でき、oRGsの大部分が尖状表面に対して垂直に分裂したことがわかった（図５ｄ）。これらの知見は、脳オルガノイドがヒトoRGsの種々側面を試験するための有用なモデル系となり得ることを示唆している。

ヒト脳オルガノイドの最終的な特徴づけとして、我々は、背側皮質領域に生じたニューロンの独自性及び挙動を説明しようと考えた。我々は、これらの組織の高度な成長ステージ中に脳皮質マーカーで染色することによって開始した。中枢ニューロンを提供する先の方法により、様々な層独自のニューロンを生成することができ、そして我々はこのアプローチを使用していくつかの層の独自性を同様に生成することができた。しかしながら、他の方法がニューロン層の空間的組織化を全く再現できなかったのに対して、我々の脳オルガノイドは少なくとも層の初歩的な分離を示し（図５ｅ）、そしてこの空間分離は、組織を発達させるにつれて、より大きくなった。

更に、我々は、インビボにおける哺乳類大脳皮質の発生に見られるインサイド−アウトパターンを連想させる組織化を観察した。具体的には、Brn2及びSatb2によってマークされる遅く生じたニューロンほど組織のより外側の領域に局在化するのに対して、Ctip2によってマークされる早く生じたニューロンほどより内側の領域に残る（図５ｅ、ｆ）。これは、以前に説明された大脳皮質ニューロンを生成するインビトロの方法の何れよりも、これらの３Ｄ組織がニューロン移動事象をより正確に再現し得ることを示唆している。

これらの流れに沿って、我々は背側皮質板内のカルレチニン陽性皮質介在ニューロンを更に観察し、接線方向の遊走と一致した尖状表面に対して水平な移動プロセスを示した（図５ｇ）。これらオルガノイドの他の領域の中で、我々は、背側皮質から完全に外される、カルレチニン陽性ニューロンを呈する腹側皮質領域を同定できた。このことは、カルレチニン陽性介在ニューロンが、インビボにおける大脳皮質の発生に酷似して、非常に長距離にわたって背側皮質内の目的地に到着するまで移動できることを示唆している。

次に、我々は、エレクトロポレーション数日後に、組織内のGFPエレクトポレーション細胞を調べることによって、背側中枢ニューロンの形態を精査した。我々は、オルガノイド内の同じ遠方の位置に一緒に長距離軸索を投射した、多分ほとんど同時に生じた、成熟皮質錐体細胞の塊を同定できた（図５ｈ）。更に、錐体ニューロン軸索投射は、インビボで記載されたものに類似した複雑な分枝及び成長円錐挙動を示した（図５ｉ）。

最後に、我々は、Ｃａ２＋振動を検出するためのカルシウムイメージングをおこなうことによって、脳オルガノイド内に生じたニューロンが、神経活動を示すか試験した。カルシウム感受性染料Ｆｌｕｏ−４を使用することで、我々は単一のニューロンの自然発生的なカルシウム上昇を検出できた（図５ｊ）。これらの知見は、脳のオルガノイドのニューロンが成熟化とシナプス活動が可能であることを示唆している。

実施例７：脳オルガノイドは小頭症をモデル化し、且つ、未熟神経の分化に関与する。
小頭症は、（平均を２標準偏差より大きく下回る）小さい頭囲で示される神経発生障害であり、そしてそれは、大きく低減した脳サイズの発生が原因である。いくつかの遺伝子が原発性小頭症、並びに小頭性骨異形成性原発性小人症（ＭＯＰＤ）やゼッケル症候群などのいくつかの重複疾患で同定された。モデル系における徴候は、これらの疾患で同定された遺伝子の多くが中心体又はＤＮＡ修復において機能し得ることを示唆していたが、マウス変異体は同じ重症度の表現型を示さないことが多かったので、ヒト小頭症表現型はモデル化することが著しく難しかった。この疾患が発生中の脳の肥大の欠損を反映し、且つ、ヒト脳は増殖機構において重要な分岐を呈するので、我々は、ヒト脳オルガノイドの方がこの疾患の側面のより良好なモデルとなり得ると仮定した。

我々は、重度の小頭症（年齢及び性別に関する平均を−１３．２標準偏差下回る）（図６ａ）及び低い身長（−６．７ ｓ．ｄ．）を有する患者を割り出し、そしてexome配列決定法で配列決定し、キャピラリー配列決定法で確認したとき（図６ｂ）、彼は、これまでに同定された原発性小頭症遺伝子CDK5RAP2のコード配列内に変異群を切断する異型接合の度合いが強まっていた（図６ｂ）。両突然変異共に、タンパク質の類似領域における未成熟終止コドンをもたらしたので、これがホモ接合ヌル突然変異を反映する可能性があることが示唆された。

我々は、この患者から皮膚線維芽細胞を得て、ウエスタンブロット法（図６ｃ）並びにCdk5Rap2タンパク質の免疫細胞化学的染色（図６ｄ）をおこなった。我々は、これらの患者細胞内にタンパク質が検出できず、小頭症がCdk5Rap2タンパク質の不存在に起因するという仮説が支持された。

我々のオルガノイド系の表現型をモデル化するために、次に、我々は４種類の十分に説明されている再プログラミング因子：Oct4、Sox2、c-Myc、及びKlf4、のレンチウイルスデリバリーを使用して、これらの患者の皮膚線維芽細胞の再プログラミングをおこなった。我々は、ｉＰＳＣｓのいくつかの独立したクローンを生成することができ、そして、形態及び多能性に関してこれらの４つを特徴づけた。４つの系列全てが、類似した倍増時間、並びに対照のヒトｉＰＳＣｓと区別がつかないコロニー形態を呈した（図９ａ）。全ての系列が、胚様体を形成し、そして多能性マーカーであるアルカリホスファターゼに関して陽性染色を呈した（図９ｂ）。

次に、我々は、これらの４つの系列の全てから脳オルガノイドの培養をおこなって、そして神経誘導培地に移したときに、対照と比較して、ＥＢｓが更に発生することがなく、代わりに非常に小さいまま維持された（図９ｃ）ことを観察した。我々は、患者もまた、小人症を示しているので、恐らく、全体的な成長もまた、同様に乱れているのではないかと仮定した。これにより、我々は、二倍の開始数のｉＰＳＣｓを平板培養することによってプロトコールをわずかに改変し、それにより、神経誘導に移す前により多く遠くＥＢｓを発生させることを可能にした。実際には、このアプローチは、神経外胚葉とその後の神経組織の形成を可能にした。しかしながら、全体的な形態により、４つの系列全てが対照組織と比べて、より小さい神経上皮組織と高度な神経突起伸展を示したことが明らかになった（図６ｅ及び図９ｄ）。

このことを更に調べるために、我々は、組織を先の段階まで発達させ、前駆体及びニューロンを免疫組織化学的に染色することによって全体的な形態を調べた（図６ｆ）。我々は、対照と比べて非常にわずかな体液の充填した管腔を囲んでいる前駆体を示す、ほんのわずかな領域しか持たない全体的に小さい神経組織を観察できた。これらの全体的に小さい神経組織は、小頭症を患っているヒトに見られる大きく低下した脳サイズを連想させた。

次に、我々はこれらの患者の脳オルガノイドで見られる発育不全の原因を調べようと考えた。このために、我々は前駆体及びニューロンに関する免疫組織化学によって早期の組織を調べた。この段階の対照組織が主に前駆体で構成される多数の大きい体液の充填した組織を示した一方で、我々は患者由来組織において前駆体で囲まれた小さな体液の充填した管腔をごく稀にしか観察できなかった（図６ｇ、図２０ａ）。更に、患者組織は、対照と比較して、比較的多いニューロンを呈し、恐らく前駆体を犠牲にした、未成熟な神経分化が示唆された（図６ｈ）。この可能性を試験するために、我々はBrdUパルス−チェイス実験をおこない、未成熟な神経原性非増殖性分裂と一致する、患者オルガノイドにおけるBrdU+/DCX+細胞数の急増を明らかにした（図１３ｄ）。

これらの患者組織は神経誘導開始前にさえCdk5Rap2タンパク質を欠いているので、次に、我々は、脳オルガノイドの形成後のタンパク質の急性損失が同様の欠損をもたらすかどうか調査した。このために、我々はヒト293T細胞において内因性Cdk5Rap2をノックダウンすることがわかっている３種類の独立したｓｈＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２、ｓｈＲＮＡ４）を伴ったGFPの同時エレクトポレーションによってCdk5Rap2のＲＮＡｉ媒介ノックダウンをおこなった（図９ｅ）。３種類のｓｈＲＮＡｓ全てが同様の結果、即ち、エレクトロポレーションの領域内におけるSox2+前駆体の急激な損失とDCX+新生ニューロンの増大をもたらした（図６ｉ）。注目すべきは、ｓｈＲＮＡ４は同じ効率のノックダウンを示さなかったので、おそらく、このｓｈＲＮＡがより弱い表現型をもたらす。

最後に、我々は前記表現型がCDK5RAP2タンパク質を再導入することによって救済できるか試験した。我々は、１２日目の患者オルガノイドにGFP及びCDK5RAP2の同時エレクトポレーションをおこない、そして６日後に調べた。CDK5RAP2の高度な過剰発現は毒性であったので（データ未掲載）、高いGFPシグナルを有する細胞はこの時点まで生き残らなかった。しかしながら、我々は、GFPだけをエレクトポレーションした組織と比較して、より大きい神経上皮を有するCDK5RAP2をエレクトポレーションした組織内の領域を観察できた（拡張データ図７ｇ）。この効果は低レベルのCDK5RAP2再発現を有する生存細胞に起因して起こり得る。この解釈を支持するように、GFPの染色により（図２０ｃ）、放射状グリア細胞形態を有するCDK5RAP2同時エレクトポレーション患者オルガノイドにおける多くの低レベルGFP+細胞が明らかになった（５４％＋／−２ ＳＥＭ、３つの組織からｎ＝７４の細胞）。対照的に、GFPを単独でエレクトポレーションした患者オルガノイドにおけるGFP+細胞は、著しく少ない放射状グリアしか有しない神経形態を主に呈した（１９％＋／−１１ ＳＥＭ、３つの組織からｎ＝１０２の細胞、Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。これにより、我々は、表現型がCDK5RAP2の損失に特異的であると結論を下した。

我々が更に詳細にこの表現型を調べたとき、我々は、GFP ｓｈＲＮＡ同時エレクトポレーション細胞のほとんど全てが神経形態を呈し、DCXを同時染色したことを観察できた（図６ｊ）。これらの知見は、患者由来組織と同様に、Cdk5Rap2の急性ノックダウンが前駆体を犠牲にして未成熟な神経分化につながることを示唆している。これは、前駆体の損失が全体的な組織成長の最終的な減少に通じると予想されるので、患者由来組織並びに小頭症の患者で見られる全体的なサイズ減少に通じる可能性がある。

更なる独立したアプローチとして、我々は、内因性CDK5RAP2をノックダウンすることがわかっている２種類の独立したｓｈＲＮＡｓを用いた同時エレクトポレーションGFPによってCDK5RAP2のＲＮＡｉノックダウンをおこなった（図２１ａ）。両ｓｈＲＮＡｓとも、前駆体メインテナンス（図２１ｂ）よりむしろニューロン産生において統計的に有意な増大を反映する、Sox2+前駆体の急激な損失とDCX+ニューロンの増大につながった（図６ｊ、図２１ｂ）。これらの知見は、CDK5RAP2の損失が前駆体を犠牲にした未成熟な神経分化に通じるという結論を支持している。

実施例８：再現
ヒトの脳の発生は、我々が紐解き始めるだけの多くの独特な特徴を呈している。我々がヒトの脳の発生に関して知っていることの大部分は、齧歯動物や他の下等哺乳類と共通した基本的なプロセスに限定されていた。脳発生の基本的な機構を理解するのにこれらの洞察が必要不可欠であるのに対して、これらの神経発生的な試験は、モデル系の利用可能性によって制限されてきた。

我々は、ヒト多能性幹細胞からの脳オルガノイドのインビトロ培養によるヒト神経発生的プロセスの試験に対する新規アプローチを確立した。この方法は、マウスやラットと共通した神経発生のこれらの基本的機構だけを再現するのではなく、ヒトの脳の発生の多くの特徴もまた示した。我々は、この方法が様々なヒトに特異的な神経発生的プロセスの試験を可能にすることを期待している。

更に、神経科学の第一の目標は、ヒトの神経学的疾患の本質を理解することである。我々は、これらの脳オルガノイドにおいてヒト神経発生障害である小頭症の少なくともいくつかの側面をモデル化した。患者由来組織内の前駆帯が初期前駆体を犠牲にして未成熟な神経分化を示すという知見は、放射状グリア前駆体の始祖集団が患者組織において適切に増殖せず、これにより全体的に小さい脳につながるモデルを支持している。

これはまた、マウスモデルがなぜヒトにおける疾患の重症度を再現できなかったのかについても説明し得る。神経前駆体のマウス始祖集団は、神経発生の開始前にヒトにおけるのと同じ程度まで増殖を受けないと仮定される。これにより、マウスの始祖集団におけるこの増殖の崩壊が、ヒトで見られるような影響の重篤さにつながらないのだろう。全体的に見て、我々の知見は、我々がこのインビトロ培養系をヒトの神経発生及び神経学的疾患の側面をモデル化するために利用できること、そして、願わくは、これらの疾患の根本原因に関する新たな洞察を提供するのに利用できることを示唆している。

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これらの引用文献は援用により本明細書に組み込まれる。引用文献に関するいかなる記載も、従来技術の自認として解すべきではない。

Claims (17)

1. 少なくとも２つの異なる前駆体及び神経分化層の不均一細胞集団を含むインビトロ（in vitro）培養人工三次元神経組織培養物であって、
   少なくとも１つの前駆体層が、外側放射状グリア細胞を含み、前記組織が更に、外側又は余剰皮質脳室下帯（outer or extra cortical subventricular zone）と、皮質内側線維層（cortical inner fiber layer）細胞とを含み、
   前記培養物が三次元マトリックスを含み、前記三次元マトリックスはヒドロゲルであるか、或いは、前記培養物が、神経分化多細胞凝集体を三次元マトリックス内で培養して得られる、組織培養物。
2. 前記組織の部分は少なくとも２つの層を形成し、好ましくは少なくとも１つの層は球状組織体周囲に形成される、請求項１に記載の組織培養物。
3. 前記組織は尖状（apical）組織部分及び背側（dorsal）組織部分を発生させる、請求項１又は２に記載の組織培養物。
4. 前記組織は脳組織である、請求項１〜３の何れか一項に記載の組織培養物。
5. 前記培養物の細胞は、前脳マーカーBF1及びSix3並びに後脳マーカーKrox20及びIls1から選択される１又は２以上の遺伝子発現マーカーを発現し、好ましくは前脳マーカーの発現量は後脳マーカーと比べて増加している、請求項１〜４の何れか一項に記載の組織培養物。
6. 前記培養物の細胞は、Otx1、Otx2、FoxG1、Auts2、Tuj1、Brn2、Satb2、Ctip2、カルレチニンから選択される１又は２以上の遺伝子発現マーカーを発現する、請求項１〜５の何れか一項に記載の組織培養物。
7. 前記培養物が、多能性細胞を培養することにより得られる、請求項１〜６の何れか一項に記載の組織培養物。
8. 人工組織培養物を生成する方法であって、
   ａ）多能性幹細胞の多細胞凝集体を提供し、
   ｂ）前記多細胞凝集体を神経誘導培地中で培養することにより、前記多細胞凝集体を神経組織へと分化させ、
   ｃ）前記多細胞凝集体を三次元マトリックス、好ましくはゲル中で培養し、これにより多細胞凝集体内の前記細胞を増殖させつつ、前記細胞の分化を許容し、次いで
   ｄ）前記ｃ）の増殖した細胞の多細胞凝集体を、懸濁培養物中で培養する
   ことを含む方法。
9. 前記多能性細胞は人工多能性細胞、特に患者より単離された人工多能性細胞である、請求項８に記載の方法。
10. 前記増殖細胞は分化単能性幹細胞へと分化する、請求項８又は９に記載の方法。
11. 前記三次元マトリックスは、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍由来のコラーゲン又は細胞外マトリックス、或いはラミニン、コラーゲン、エンタクチン、及びヘパラン硫酸化プロテオグリカン、又はこれらの組み合わせから選択されるその成分を含む、請求項８又は９に記載の方法。
12. 発生的神経組織作用を調べる方法であって、請求項８〜１１の何れか一項に記載の方法の何れかの段階で、細胞内での所望の遺伝子の発現を減少又は増加させることを含む方法。
13. 所望の発生的神経組織欠損の治療に適した候補治療薬を選別する方法であって、請求項１２に記載の方法を実施し、前記方法の何れかの段階で、好ましくは全ての段階で、前記候補薬剤を前記細胞に投与することを含む方法。
14. 候補薬物の神経作用を試験する方法であって、候補薬物を請求項１〜７の何れか一項に記載の人工培養物に投与し、前記培養物の細胞について所望の活性を決定し、当該活性を、前記候補薬物を投与せずに培養した細胞の活性と比較することを含み、活性の差分が神経作用を示す、方法。
15. 分化神経細胞を得る方法であって、請求項１〜７の何れか一項に記載の人工培養物を提供し、所望の分化神経細胞を単離することを含み、或いは、請求項８〜１１の何れか一項に記載の人工組織培養物生成方法を実施し、更に所望の分化神経細胞を単離することを含む方法。
16. 請求項８〜１１の何れか一項に記載の方法により得られうる人工組織培養物。
17. 請求項１〜７の何れか一項に記載の人工三次元神経組織培養物を生成し、或いは請求項８〜１５の何れか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    ｉ）三次元マトリックス及び栄養素を含む培地と、
    ii）レチノイン酸及び栄養素を含む培地と、
    iii）ａ）栄養素及びｂ）ROCK阻害剤、インシュリン、又はヘパリンを含む培地とを含み、
    更に任意により、栄養素を含むが、神経組織を特定の運命へと分化させる成長因子を欠損する培地を更に含む、キット。