JP2018162223A - Activity promoter - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、メラノサイト（色素形成細胞）の細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ）、ＥＤＮＲＢ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ｂ）、及びＳＣＦＲ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、別名：ｃ−Ｋｉｔ，ＣＤ１１７）の活性促進剤に関する。また、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｔｙｐｅ Ｍ）の活性促進剤に関する。 The present invention relates to TGFBR2 (Transforming growth factor receptor II), EDNRB (Endothelin receptor type B), and SCFR (Stem cell receptor K), which are cell membrane receptors of melanocytes (pigmented cells). It relates to an activity promoter. Moreover, it is related with the activity promoter of MITF-M (Microphthalmia-Associated Transcription Factor type M) in a melanocyte.
白髪の発生は代表的な老徴であり、外見の印象に与える影響が大きい。若々しくいたいと願う生活者の多くは、染毛剤や染毛料を用いて染色することにより白髪化に対応している。しかし、これらの染毛方法は手間がかかること、髪や頭皮に悪影響を及ぼす可能性があること、さらに自然な色に染まり難いこと等の様々な問題があった。このため、染毛剤や染毛料に頼らない抗白髪方法（例えば、白髪化の予防方法やその改善方法）の開発が求められている。 The occurrence of gray hair is a typical sensation and has a great impact on the appearance impression. Many consumers who want to be youthful respond to whitening by dyeing with a hair dye or hair dye. However, these hair dyeing methods have various problems such as being troublesome, having the possibility of adversely affecting the hair and scalp, and being difficult to dye natural colors. For this reason, development of an anti-white hair method (for example, a method for preventing or improving gray hair) that does not depend on a hair dye or a hair dye is required.
毛髪の色を決定するメラニン色素はメラノサイトで産生される色素成分である。メラノサイトは毛母細胞と隣り合う形で毛球部に存在しており、毛母細胞が細胞分裂して髪が作り出される際に、メラノサイトからメラニン色素が受け渡され、髪の内部に取りこまれる。したがって、メラノサイトにおけるメラニン合成が正常に行われない場合は、髪がメラニンを取り込むことができず、白髪が発生することとなる。 Melanin pigments that determine the color of hair are pigment components produced in melanocytes. Melanocytes are present in the hair bulb adjacent to the hair matrix cells, and when the hair matrix cells divide and produce hair, the melanocytes are transferred from the melanocytes and taken into the hair. . Therefore, when melanin synthesis in melanocytes is not normally performed, hair cannot take up melanin, and gray hair is generated.
メラノサイトにおけるメラニン合成は、ＭＩＴＦ−Ｍが重要な役割を果たしている（非特許文献１）。ＭＩＴＦ−Ｍは、メラノサイト合成に関わる酵素であるチロシナーゼや、その関連タンパク質であるＴＲＰ−１（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＴＲＰ−２（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）の転写制御を行うことが知られている。また、ＭＩＴＦ−Ｍは前記のタンパク質の転写制御以外にも、メラノサイトの分化誘導、遊走、抗アポトーシスに関連することが知られている。 MITF-M plays an important role in melanin synthesis in melanocytes (Non-patent Document 1). MITF-M is known to regulate transcription of tyrosinase, which is an enzyme involved in melanocyte synthesis, and TRP-1 (Tyrosinase related protein-1) and TRP-2 (Tyrosinase related protein-2), which are related proteins. ing. Moreover, MITF-M is known to be related to the induction of melanocyte differentiation, migration, and anti-apoptosis in addition to the above-mentioned transcriptional control of the protein.
上述の通り、白髪化のメカニズムをターゲットとした研究は盛んに行われている。しかしながら、これらの知見は抗白髪の抜本的解決方法の発見には繋がっていない。 As described above, research targeting the mechanism of gray hair has been actively conducted. However, these findings have not led to the discovery of a fundamental solution for anti-white hair.
したがって、本発明の目的は、メラニン合成に重要な役割を果たすことが知られているＭＩＴＦ−Ｍを活性化する、安全且つ安価な活性促進剤を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a safe and inexpensive activity promoter that activates MITF-M, which is known to play an important role in melanin synthesis.
上記の様な事情に鑑み、本発明者は白髪化のメカニズムに着目して鋭意研究を重ねた結果、特定の成分がメラノサイトの特定の細胞膜受容体の活性を促進させること、及びＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進させることを見出して本発明を完成させた。 In view of the circumstances as described above, as a result of intensive studies focusing on the mechanism of gray hair, the present inventor has found that a specific component promotes the activity of a specific cell membrane receptor of melanocytes, and MITF-M The present invention was completed by finding that it promotes activity.
すなわち、本発明は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性促進剤であって、アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とする活性促進剤を提供する。 That is, the present invention provides an activity promoter for TGFBR2, EDNRB, and SCFR, which are cell membrane receptors for melanocytes, and an activity promoter containing asenyaku extract and / or hematin as active ingredients.
また、本発明は、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性促進剤であって、アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とする活性促進剤についても提供する。 In addition, the present invention also provides an activity promoter for MITF-M in melanocytes, which is an active promoter containing asenyaku extract and / or hematin as active ingredients.
本発明によれば、ＭＩＴＦ−Ｍの活性を強力に促進し、さらに安全且つ安価な活性促進剤を提供することができる。したがって、前記の活性促進剤は、メラノサイトにおけるメラニン合成を促進させることができ、例えば白髪化の予防やその改善に利用することが可能である。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the activity promoter of MITF-M can be accelerated | stimulated strongly and a safe and cheap activity promoter can be provided. Therefore, the said activity promoter can promote the melanin synthesis | combination in a melanocyte, for example, can be utilized for prevention of the whitening and its improvement.
本発明は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性促進剤に関する。また、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性促進剤に関する。なお、これらの活性促進剤を「本発明の活性促進剤」と称する場合がある。 The present invention relates to an activity promoter for TGFBR2, EDNRB, and SCFR, which are cell membrane receptors for melanocytes. Moreover, it is related with the activity promoter of MITF-M in a melanocyte. These activity promoters are sometimes referred to as “activity promoters of the present invention”.
本発明の活性促進剤は、アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とし、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性を促進することを特徴とする。また、これらの細胞質受容体を活性化させることにより、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進する。つまり、本発明の活性促進剤は、ＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲを活性化することにより、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進し、その結果、メラニン合成をはじめとする各種の生理作用を発揮する。この生理作用の一つとして、例えば、抗白髪作用（白髪化の予防やその改善）が挙げられる。 The activity promoter of the present invention is characterized by promoting the activity of TGFBR2, EDNRB, and SCFR, which are cell membrane receptors of melanocytes, using an Acacia yak extract and / or hematin as active ingredients. In addition, activation of these cytoplasmic receptors promotes the activity of MITF-M in melanocytes. That is, the activity promoter of the present invention promotes the activity of MITF-M in melanocytes by activating TGFBR2, EDNRB, and SCFR, and as a result, exerts various physiological actions including melanin synthesis. . As one of the physiological actions, for example, an anti-white hair action (prevention of gray hair and improvement thereof) can be mentioned.
なお、本発明の活性促進剤がＭＩＴＦ−Ｍの活性を強力に促進する理由は、その有効成分が、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全てに対して活性があることによるものであると推察される。つまり、本発明の活性促進剤は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全ての活性を促進する活性促進剤といえる。また、本発明の活性促進剤は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全ての活性を促進することにより、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進する活性促進剤といえる。 The reason why the activity promoter of the present invention strongly promotes the activity of MITF-M is that its active ingredient is active against all of melanocyte cell membrane receptors TGFBR2, EDNRB, and SCFR. It is guessed that it is. That is, the activity promoter of the present invention can be said to be an activity promoter that promotes all the activities of TGFBR2, EDNRB, and SCFR, which are cell membrane receptors for melanocytes. The activity promoter of the present invention can be said to be an activity promoter that promotes the activity of MITF-M in melanocytes by promoting all the activities of TGFBR2, EDNRB, and SCFR, which are cell membrane receptors for melanocytes.
アセンヤク抽出物は、アセンヤクの各部位から抽出溶媒を用いて抽出することにより得られるものである。抽出方法は特に限定されず、公知の各種抽出方法を用いることができる。抽出原料としては、アセンヤクの葉、枝、材部、樹皮、根等の部位や、これらを乾燥したものが用いられる。抽出方法としては、常温で、又は加温して、抽出溶媒により抽出すること等が挙げられる。 The asenyaku extract is obtained by extracting from each part of asenyaku using an extraction solvent. The extraction method is not particularly limited, and various known extraction methods can be used. As extraction raw materials, leaves, branches, timber parts, bark, roots and other parts of Acacia yak and dried ones are used. Examples of the extraction method include extraction with an extraction solvent at room temperature or by heating.
抽出溶媒としては、通常の植物の抽出に用いられる溶媒であれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール等の低級一価アルコール、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、水等が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。この中でも、水及びエタノールからなる抽出溶媒、又は水及び１，３−ブチレングリコールからなる抽出溶媒が好ましい。 The extraction solvent is not particularly limited as long as it is a solvent used for normal plant extraction, for example, lower monohydric alcohols such as methanol and ethanol, glycerin, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol and the like. Examples thereof include liquid polyhydric alcohols, lower alkyl esters such as ethyl acetate, water, and the like, and one or a mixture of two or more of these can be used. Among these, an extraction solvent composed of water and ethanol, or an extraction solvent composed of water and 1,3-butylene glycol is preferable.
アセンヤク抽出物は、そのまま用いてもよいが、必要に応じてろ過、濃縮してもよい。また、アセンヤク抽出物をカラムクロマト法等により、分画、精製して用いることもできる。また、アセンヤク抽出物は、減圧乾燥又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製し、適宜製剤化して用いることもできる。なお、アセンヤク抽出物としては、例えば、「アセンヤク抽出液」、「アセンヤク抽出液ＢＧ」（以上、丸善製薬株式会社製）等の市販品を使用することができる。 The asenyaku extract may be used as it is, but may be filtered and concentrated as necessary. Further, the asenyaku extract can be fractionated and purified by column chromatography or the like. In addition, the asenyaku extract can be used after being dried under reduced pressure or lyophilized, then prepared into a powder or paste, and appropriately formulated. In addition, as an asenyaku extract, commercial items, such as "Asenyaku extract" and "Asenyaku extract BG" (above, Maruzen Pharmaceutical Co., Ltd. product), can be used, for example.
ヘマチンは、動物（例えば牛や豚）の血液中に含まれるヘモグロビンを原料として得られる鉄を含むポルフィリン化合物である。ヘマチンの作製方法は特に限定されず、公知の各種作製方法を用いることができる。 Hematin is a porphyrin compound containing iron obtained using hemoglobin contained in the blood of animals (eg, cattle and pigs) as a raw material. The method for producing hematin is not particularly limited, and various known production methods can be used.
ヘマチンはそのまま用いてもよいが、必要に応じてメタノール、エタノール、フェノキシエタノール等の一価アルコール、水等を含んだもの（ヘマチン液）を用いることができる。なお、ヘマチン（ヘマチン液）としては、例えば、「グロスフィリンＰ」（一丸ファルコス株式会社製）等の市販品を使用することができる。 Hematin may be used as it is, but a monohydric alcohol such as methanol, ethanol or phenoxyethanol, water (hematin liquid), or the like can be used as necessary. In addition, as hematin (hematin liquid), commercial items, such as "Grosphylline P" (made by Ichimaru Falcos Co., Ltd.), can be used, for example.
本発明の活性促進剤は、頭皮に塗布されることにより経皮的に吸収されて毛根部位に達し、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＦＲ、ＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進させる。本発明の活性促進剤はこれらの作用を有することにより、抗白髪剤として用いることができる。さらに、本発明の活性促進剤は抗白髪剤として、スカルプケア剤等の皮膚外用品や、シャンプー、トリートメント剤等の頭髪料に配合して用いることができる。 When applied to the scalp, the activity promoter of the present invention is absorbed transcutaneously to reach the hair root site, and promotes the activity of melanocyte cell membrane receptors TGFBR2, EDNRB, SCFR, and MITF-M. The activity promoter of the present invention can be used as an anti-whitening agent by having these actions. Furthermore, the activity promoter of the present invention can be used as an anti-whitening agent by blending it into an external skin product such as a scalp care agent or a hair preparation such as a shampoo or treatment agent.
本発明の皮膚外用品及び頭髪料は、例えば、液状、ミスト状、霧状、乳液状、クリーム状、ジェル状、ワックス状、フォーム状等の各種剤形に調製して使用できる。また、本発明の所望の効果の発現が阻害されない範囲であれば、例えば、低級アルコール、多価アルコール、糖アルコール、紫外線吸収剤、香料、防腐剤、キレート剤、抗菌剤、酸化防止剤、保湿剤、清涼剤、ビタミン類、カチオン性ポリマー、ノニオン性ポリマー、両性ポリマー、アニオン性ポリマー、植物抽出液、噴射剤、ｐＨ調整剤、アミノ酸、抗炎症剤、収斂剤、色素、増粘剤等のその他の添加剤を含んでいてもよい。 The external skin product and hair preparation of the present invention can be prepared and used in various dosage forms such as liquid, mist, mist, emulsion, cream, gel, wax and foam. Moreover, as long as expression of the desired effect of the present invention is not inhibited, for example, lower alcohol, polyhydric alcohol, sugar alcohol, ultraviolet absorber, fragrance, preservative, chelating agent, antibacterial agent, antioxidant, moisturizing agent Agents, fresheners, vitamins, cationic polymers, nonionic polymers, amphoteric polymers, anionic polymers, plant extracts, propellants, pH adjusters, amino acids, anti-inflammatory agents, astringents, pigments, thickeners, etc. Other additives may be included.
本発明の活性促進剤を皮膚外用品又は頭髪料に使用する場合、アセンヤク抽出物の配合量はその使用態様に応じて適宜調整されるが、製剤全体の０．０００２〜０．２質量％の範囲で配合することが好ましく、０．００１〜０．１質量％の範囲で配合することがより好ましく、０．００２〜０．０４質量％の範囲で配合することが更に好ましい。なお、アセンヤク抽出物の配合量は固形分換算を基準とする。 When the activity promoter of the present invention is used for an external skin product or a hair preparation, the amount of the asenyaku extract is appropriately adjusted according to the use mode, but it is 0.0002 to 0.2% by mass of the whole preparation. It is preferable to mix | blend in the range, It is more preferable to mix | blend in the range of 0.001-0.1 mass%, It is still more preferable to mix | blend in the range of 0.002-0.04 mass%. In addition, the blending amount of asenyaku extract is based on solid content conversion.
本発明の活性促進剤を皮膚外用品又は頭髪料に使用する場合、ヘマチンの配合量はその使用態様に応じて適宜調整されるが、製剤全体の０．０００１〜０．１質量％の範囲で配合することが好ましく、０．０００５〜０．０５質量％の範囲で配合することがより好ましく、０．００１〜０．０２質量％の範囲で配合することが更に好ましい。なお、ヘマチンの配合量は固形分換算を基準とする。 When the activity promoter of the present invention is used for an external skin product or hair preparation, the amount of hematin is appropriately adjusted according to the use mode, but in the range of 0.0001 to 0.1% by mass of the whole preparation. It is preferable to mix | blend, It is more preferable to mix | blend in the range of 0.0005-0.05 mass%, It is still more preferable to mix | blend in the range of 0.001-0.02 mass%. In addition, the compounding quantity of hematin is based on solid content conversion.
なお、本発明の活性促進剤は、抗白髪剤以外にも、皮膚の抗白斑治療剤、抗皮膚黒色化剤、美白剤といった皮膚化粧料としても好適に用いることができる。 In addition to the anti-whitening agent, the activity promoter of the present invention can also be suitably used as a skin cosmetic such as a skin anti-white spot therapeutic agent, anti-skin blackening agent, and whitening agent.
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
［被験物質１（１．０体積％のアセンヤク抽出物を含む培地）の調製］
１５μＬのアセンヤク抽出液（２質量％のアセンヤクエキスを含むアセンヤク抽出物；丸善製薬株式会社製）を１４８５μＬのＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳを１．０体積％含む表皮メラニン細胞用増殖培地；以下、「Ｍｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）」と称する）に添加し、混和後にフィルター濾過処理を行うことにより１．０体積％のアセンヤク抽出物を含む培地を調製した。
[Preparation of test substance 1 (medium containing 1.0% by volume of asenyaku extract)]
1485 μl of medium 254 (a growth medium for epidermal melanocytes containing 1.0% by volume of HMGS), hereinafter referred to as “medium 254 ( Medium containing 1.0% by volume of asenyaku extract was prepared by adding a filter filtration treatment after mixing.
［被験物質２（０．１体積％のアセンヤク抽出物を含む培地）の調製］
アセンヤク抽出物の配合量を０．１体積％としたこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより０．１体積％のアセンヤク抽出物を含む培地を調製した。
[Preparation of test substance 2 (medium containing 0.1% by volume of asenyaku extract)]
A medium containing 0.1% by volume of asenyaku extract was prepared by performing the same operation as that for preparing test substance 1 except that the amount of the asenyaku extract was 0.1% by volume.
［被験物質３（１．０体積％のヘマチン液を含む培地）の調製］
アセンヤク抽出液の代わりにグロスフィリンＰ（１質量％のヘマチンを含むヘマチン液；一丸ファルコス株式会社製）を用い、ヘマチン液の終濃度が１．０体積％となるように使用したこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより１．０体積％のヘマチン液を含む培地を調製した。
[Preparation of test substance 3 (medium containing 1.0% by volume of hematin solution)]
Tested except that Grosphylin P (hematin solution containing 1% by weight of hematin; manufactured by Ichimaru Falcos Co., Ltd.) was used instead of the Asenyaku extract, and the final concentration of hematin solution was 1.0% by volume. A medium containing 1.0% by volume of hematin solution was prepared by performing the same operation as the preparation of substance 1.
［被験物質４（０．１体積％のヘマチン液を含む培地）の調製］
ヘマチン液の配合量を０．１体積％としたこと以外は被験物質３の調製と同様の操作を行うことにより０．１体積％のヘマチン液を含む培地を調製した。
[Preparation of test substance 4 (medium containing 0.1% by volume of hematin solution)]
A medium containing 0.1% by volume of hematin solution was prepared by performing the same operation as the preparation of test substance 3 except that the amount of hematin solution was 0.1% by volume.
［被験物質５（１．０体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地）の調製］
アセンヤク抽出液の代わりにサンショウ抽出液−Ｊ（０．１８質量％のサンショウ果皮エキスを含むサンショウ果皮抽出物；丸善製薬株式会社製）を用い、終濃度が１．０体積％となるように使用したこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより１．０体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地を調製した。
[Preparation of test substance 5 (medium containing 1.0% by volume salamander extract)]
A salamander extract-J (a salmon peel extract containing 0.18% by weight of a salamander extract; manufactured by Maruzen Pharmaceutical Co., Ltd.) is used instead of the asenyaku extract, resulting in a final concentration of 1.0% by volume. A medium containing 1.0% by volume of salamander peel extract was prepared by performing the same operation as in the preparation of Test Substance 1 except that the test substance 1 was used.
［被験物質６（０．１体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地）の調製］
サンショウ果皮抽出物の配合量を０．１体積％としたこと以外は被験物質５の調製と同様の操作を行うことにより０．１体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地を調製した。
[Preparation of test substance 6 (medium containing 0.1% by volume salamander peel extract)]
A medium containing 0.1% by volume of a salamander peel extract was prepared by performing the same operation as the preparation of the test substance 5 except that the blending amount of the salamander peel extract was 0.1% by volume.
［被験物質７（１．０体積％のホップ花抽出物を含む培地）の調製］
アセンヤク抽出液の代わりにホップ抽出液ＢＧ−ＪＮ（１．８質量％のホップ花エキスを含むホップ花抽出物；丸善製薬株式会社製）を用い、ホップ花抽出物の終濃度が１．０体積％となるように使用したこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより１．０体積％のホップ花抽出物を含む培地を調製した。
[Preparation of test substance 7 (medium containing 1.0% by volume of hop flower extract)]
A hop extract BG-JN (a hop flower extract containing 1.8% by mass of a hop flower extract; manufactured by Maruzen Pharmaceutical Co., Ltd.) is used instead of the asenyaku extract, and the final concentration of the hop flower extract is 1.0 volume. The medium containing 1.0% by volume of hop flower extract was prepared by performing the same operation as that for the preparation of Test Substance 1, except that it was used so that the concentration of hop flower was 1%.
［被験物質８（０．１体積％のホップ花抽出物を含む培地）の調製］
ホップ花抽出物の配合量を０．１体積％としたこと以外は被験物質７の調製と同様の操作を行うことにより０．１体積％のホップ花抽出物を含む培地を調製した。
[Preparation of test substance 8 (medium containing 0.1% by volume of hop flower extract)]
A medium containing 0.1% by volume of a hop flower extract was prepared by performing the same operation as the preparation of the test substance 7, except that the amount of the hop flower extract was 0.1% by volume.
［陰性対照１の調製］
ブタンジオールを終濃度が１．０体積％となるようにＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）に添加し、陰性対照１を調製した。
[Preparation of negative control 1]
Butanediol was added to Medium 254 (containing HMGS) to a final concentration of 1.0% by volume to prepare negative control 1.
［陰性対照２の調製］
ブタンジオールを終濃度が０．１体積％となるようにＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）に添加し、陰性対照２を調製した。
[Preparation of negative control 2]
Butanediol was added to Medium 254 (containing HMGS) to a final concentration of 0.1% by volume to prepare negative control 2.
［メラノサイトの調製］
ヒトメラノサイトはＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）を培養液とし、Ｔ７５フラスコを用いてＣＯ2インキュベーター（５体積％ＣＯ2、３７℃）内で必要細胞数に達するまで培養した。その後、Ｔ７５フラスコから培地を除き、１０ｍＬのＨＥＰＥＳを添加、細胞を洗浄後に３ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、すぐに２ｍＬの添加したトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を除去、室温にて１〜２分静置し、細胞を剥離した。その後、１０ｍＬのＨＥＰＥＳを加え細胞を回収し、さらに１０ｍＬのトリプシン中和液を添加・混合し、その細胞溶液を１７０×ｇ、５分間遠心した。沈殿（細胞）にＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）を添加、懸濁後に細胞数を血球計算板にて測定することによりヒトメラノサイトを調製した。
[Preparation of melanocytes]
Human melanocytes were cultured using Medium 254 (including HMGS) as a culture solution and using a T75 flask in a CO 2 incubator (5 vol% CO 2 , 37 ° C.) until the required number of cells was reached. Thereafter, the medium is removed from the T75 flask, 10 mL of HEPES is added, the cells are washed, 3 mL of trypsin / EDTA solution is added, and 2 mL of the added trypsin / EDTA solution is immediately removed, and left at room temperature for 1-2 minutes. And the cells were detached. Thereafter, 10 mL of HEPES was added to recover the cells, and 10 mL of a trypsin neutralizing solution was further added and mixed, and the cell solution was centrifuged at 170 × g for 5 minutes. Medium 254 (including HMGS) was added to the precipitate (cells), and after suspension, human melanocytes were prepared by measuring the number of cells with a hemocytometer.
［被験物質等の活性試験］
培養して得られたヒトメラノサイトを１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ／ウェルの２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター内（５体積％ＣＯ2、３７℃）で、２４時間培養後、ウェルに被験物質１〜８、陰性対照１、２をそれぞれ０．５ｍＬずつ添加した。その後、２４時間培養し、細胞を回収した。
[Activity test for test substances]
Human melanocytes obtained by culturing were seeded in a 24-well plate of 1.5 × 10 5 cells / 0.5 mL / well and cultured for 24 hours in a CO 2 incubator (5 vol% CO 2 , 37 ° C.). In each well, 0.5 mL each of test substances 1 to 8 and negative controls 1 and 2 was added. Then, it culture | cultivated for 24 hours and collect | recovered cells.
上記試験から得られた各細胞からトータルＲＮＡを回収した。ＲＮＡ抽出はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン株式会社製）を用いて行った。具体的には、ＩＳＯＧＥＮ溶液によりサンプルの細胞を溶解した後、クロロホルムを加えて遠心分離し、水相に溶解しているＲＮＡを得た。その後、水相にイソプロパノールを加えてＲＮＡを沈殿させＲＮＡを単離した。 Total RNA was collected from each cell obtained from the above test. RNA extraction was performed using ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.). Specifically, sample cells were lysed with an ISOGEN solution, and chloroform was added and centrifuged to obtain RNA dissolved in the aqueous phase. Thereafter, isopropanol was added to the aqueous phase to precipitate RNA and to isolate RNA.
ｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて行った。具体的には、ＲＮＡが入ったチューブにｃＤＮＡ合成に必要な試薬（ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒｓ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ、ＭｇＣｌ2、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ）を加えた後、２５℃にて１０分間、５０℃にて５０分間、８５℃にて５分間の条件で順次反応させてｃＤＮＡを合成した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲチューブにサンプル（合成させたｃＤＮＡ）を調製し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ リアルタイムＰＣＲシステムを用いて、ＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＦＲ、ＭＩＴＦ−Ｍの遺伝子の発現量を定量した。ＰＣＲ反応終了後にＰＣＲ産物の解離曲線を求めた。各遺伝子の発現量はΔΔＣｔ値として算出した。 cDNA synthesis was performed using SuperScript III First-Strand Synthesis System (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.). Specifically, reagents necessary for cDNA synthesis (random hexamers, dNTP mix, MgCl 2 , DTT, RNaseOUT, SuperScript III RT) are added to a tube containing RNA, and then at 25 ° C. for 10 minutes at 50 ° C. For 50 minutes at 85 ° C. for 5 minutes to synthesize cDNA. Samples (synthesized cDNA) were prepared in Real-time PCR tubes, and the expression levels of TGFBR2, EDNRB, SCFR, and MITF-M genes were quantified using an Applied Biosystems real-time PCR system. After completion of the PCR reaction, a PCR product dissociation curve was obtained. The expression level of each gene was calculated as a ΔΔCt value.
増幅曲線と閾値線との交点より、Ｃｔ値（ＰＣＲサイクル数）を算出した。目的遺伝子のＣｔ値より内部標準ＧＡＰＤＨ２遺伝子のＣｔ値を引いたＣｔ（目的遺伝子）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ２）＝ΔＣｔ値である。さらにΔＣｔ値より溶媒対照区の平均ΔＣｔ値を引いたΔＣｔ（サンプル処理区）−ΔＣｔ（ブランク区）＝ΔΔＣｔ値とする。ΔΔＣｔ値を乗数項に代入した２−ΔΔＣｔ値が相対発現量となる。 The Ct value (number of PCR cycles) was calculated from the intersection of the amplification curve and the threshold line. Ct (target gene) −Ct (GAPDH2) = ΔCt value obtained by subtracting the Ct value of the internal standard GAPDH2 gene from the Ct value of the target gene. Further, ΔCt (sample treatment group) −ΔCt (blank group) = ΔΔCt value obtained by subtracting the average ΔCt value of the solvent control group from the ΔCt value. The 2-ΔΔCt value obtained by substituting the ΔΔCt value into the multiplier term is the relative expression level.
以上の結果を図１〜５に纏めた。得られた結果から、被験物質１〜４（特に被験物質２の０．１体積％のアセンヤク抽出物を含む培地、及び被験物質３の１．０体積％のヘマチン液を含む培地）はＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性を促進させると共に、ＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進することが示された。ここから、本発明の活性促進剤がＭＩＴＦ−Ｍの活性を強力に促進する理由は、その有効成分であるアセンヤク抽出物及びヘマチン液が、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全てに対して活性があることによるものであると推察される。つまり、本発明の活性促進剤は、ＭＩＴＦ−Ｍの活性に由来する前記の３つの細胞膜受容体に作用し、その相乗効果により強力なＭＩＴＦ−Ｍ活性促進作用を発揮すると推察される。 The above results are summarized in FIGS. From the obtained results, test substances 1 to 4 (in particular, a medium containing 0.1% by volume of asenyaku extract of test substance 2 and a medium containing 1.0% by volume of hematin solution of test substance 3) are TGFBR2, It was shown to promote the activity of MITF-M as well as the activity of EDNRB and SCFR. From this, the reason why the activity promoter of the present invention strongly promotes the activity of MITF-M is that the Asenya extract and hematin solution, which are the active ingredients, of TGFBR2, EDNRB, and SCFR, which are melanocyte cell membrane receptors It is inferred that this is due to activity against all. That is, it is speculated that the activity promoter of the present invention acts on the three cell membrane receptors derived from the activity of MITF-M, and exerts a strong MITF-M activity promoting action due to its synergistic effect.
その一方で、被験物質５〜８（サンショウ果皮抽出物を含む培地、及びホップ花抽出物を含む培地）では、ＭＩＴＦ−Ｍの活性促進作用がほとんど見られなかった。これは、サンショウ果皮抽出物及びホップ花抽出物が、ＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの細胞膜受容体のうち、２つ以下の細胞膜受容体しか活性を示さないことに起因すると推察される。つまり、サンショウ果皮抽出物及びホップ花抽出物はＭＩＴＦ−Ｍの活性に由来する前記の細胞膜受容体を活性化するものの、その２つ以下にしか活性を示さないため、結果的にＭＩＴＦ−Ｍ活性促進作用は低くなると推察される。 On the other hand, in test substances 5 to 8 (medium containing a salamander extract and a medium containing a hop flower extract), the activity promoting action of MITF-M was hardly observed. This is presumed to be due to the fact that the salamander peel extract and the hop flower extract have activity of no more than two cell membrane receptors of TGFBR2, EDNRB, and SCFR. That is, although the salamander peel extract and the hop flower extract activate the cell membrane receptors derived from the activity of MITF-M, they exhibit activity only in two or less of them, resulting in the MITF-M. It is presumed that the activity promoting action is lowered.
Claims (2)
アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とする活性促進剤。 An activity promoter for TGFBR2, EDNRB, and SCFR, which are cell membrane receptors for melanocytes,
An activity promoter comprising asenyaku extract and / or hematin as active ingredients.
アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とする活性促進剤。 An activity promoter for MITF-M in melanocytes,
An activity promoter comprising asenyaku extract and / or hematin as active ingredients.
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