JP2018153157A - Ｒｎａ増幅方法、ｒｎａ検出方法及びアッセイキット - Google Patents

Abstract

【課題】簡便、高感度かつ特異性の高いＲＮＡ増幅方法、ＲＮＡ検出方法及びアッセイキットの提供。【解決手段】以下の工程を含む、ＲＮＡ増幅方法。工程（ａ）標的ＲＮＡ中の第１の配列を逆転写して第１の配列と相補的な第１’の配列を含む逆転写産物を得る工程、（ｂ）逆転写産物と標的ＲＮＡとを解離させる工程、（ｃ）伸長化プライマー及び逆転写産物をハイブリダイズさせ、両方を伸長化させて伸長化産物を得る工程、（ｄ）伸長化産物と、プライマーセットと、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一方とを含む増幅反応液を増幅反応条件下で維持し、第１’の配列及び／又はその相補鎖を増幅する工程【選択図】図１

Description

本発明の実施形態は、ＲＮＡ増幅方法、ＲＮＡ検出方法及びアッセイキットに関する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質をコードしていないＲＮＡの１種であり、遺伝子やタンパク質の発現の制御等の役割を担っている。最近の研究によって、ｍｉＲＮＡの発現量と、癌をはじめとした様々な疾患との間に相関があることが分かってきている。そのことから、ｍｉＲＮＡは、疾患に対する新たなバイオマーカーとして期待されている（非特許文献１）。ｍｉＲＮＡの検出は、一般的には、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲによって行われる（非特許文献２）。しかしながら、ｍｉＲＮＡは、およそ２０塩基程度の短い一本鎖ＲＮＡであるため、増幅や検出をすることが困難であり、また、検出の高感度化が難しい。このような状況におい、より精度の高いｍｉＲＮＡの検出方法の開発が求められている。

Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｌｅｎｃｅ ２０１０ Ｗａｎｇ ＺＨ ｅｔ ａｌ. Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ Ｊ （Ｅｎｇｌ） ２０１５

本発明が解決しようとする課題は、簡便、高感度かつ特異性の高いＲＮＡ増幅方法、ＲＮＡ検出方法及びアッセイキットを提供することである。

実施形態に従うＲＮＡ増幅方法は、試料中の、第１の配列を含む標的ＲＮＡを増幅する方法であって、以下の工程を含む。工程（ａ）では、標的ＲＮＡ中の第１の配列を逆転写して第１の配列と相補的な第１’の配列を含む逆転写産物を得る。工程（ｂ）では、逆転写産物と標的ＲＮＡとを解離させる。工程（ｃ）では、伸長化プライマー及び逆転写産物をハイブリダイズさせ、伸長化プライマー及び逆転写産物を伸長化させて、第１’の配列及び／又はその相補鎖を含む二本鎖ＤＮＡの伸長化産物を得る。工程（ｄ）では、伸長化産物と、伸長化産物に結合するプライマーセットと、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一方とを含む増幅反応液を増幅反応条件下で維持する。当該維持によって伸長化産物を鋳型として第１’の配列及び／又はその相補鎖を増幅する。

実施形態のＲＮＡ増幅方法の一例を示すフローチャートである。 標的ＲＮＡ及び逆転写プライマーの一例を示す概念図である。 逆転写産物が生成する過程の一例を示す概念図である。 逆転写産物及び伸長化プライマーの一例を示す概念図である。 伸長化産物の一例を示す概念図である。 伸長化産物が生成する過程の一例を示す概念図である。 伸長化産物とプライマーとの対応を示す模式図である。 実施形態のＲＮＡ検出方法の一例を示すフローチャートである。 例１の実験結果を示すグラフ及び電気泳動写真である。 例２の実験結果を示すグラフ及び電気泳動写真である。

以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。

１．ＲＮＡ増幅方法
実施形態に従うＲＮＡ増幅方法は、試料中の第１の配列を含む標的ＲＮＡを増幅する方法である。

標的ＲＮＡは、実施形態のＲＮＡ増幅方法において検出されるべきＲＮＡである。標的ＲＮＡは、塩基長が概ね５０塩基以下の一本鎖の短鎖ＲＮＡであることが好ましい。短鎖ＲＮＡは、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）、又は核小体低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ）等の機能性ＲＮＡであってもよいし、機能性ＲＮＡでなくてもよい。或いは、人工ＲＮＡ又は５０塩基より長いＲＮＡを断片化して生じたＲＮＡであってもよい。

標的ＲＮＡは、第１の配列を含む。第１の配列は、標的ＲＮＡを検出するための指標となり得る配列である。即ち、第１の配列は、実施形態のＲＮＡ増幅方法における逆転写反応の標的である。なお、第１の配列が逆転写されて生成する、第１の配列の相補鎖である第１’の配列及びその相補鎖は、実施形態のＲＮＡ増幅方法における増幅反応の標的である。例えば、第１の配列は、標的ＲＮＡ中に含まれる標的ＲＮＡに特異的な配列であり得る。第１の配列は、標的ＲＮＡの全長に亘る配列であってもよいし、標的ＲＮＡの全長に亘る配列から選択された一部の連続した配列であってもよい。第１の配列の塩基長は、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であり得る。

ここにおいて「増幅」とは、プライマーセットと酵素を用いて鋳型核酸を連続して複製することを指す。実施形態において、使用され得る増幅法は、プライマーセットを用いて核酸を増幅するそれ自身公知の何れかの増幅法であり得る。増幅法は、例えば、等温増幅法であり得る。等温増幅法は、これらに限定するものではないが、例えば、ＬＡＭＰ、ＳＭＡＰ、ＲＣＡ及びＩＣＡＮなどであり得る。

実施形態に従うＲＮＡ増幅方法について図１を用いて以下に説明する。図１は、ＲＮＡ増幅方法の概略フローを示す。

工程（ａ）において、第１の配列を逆転写して、第１の配列と相補的な第１’の配列を含む逆転写産物を得る。

工程（ａ）は、例えば、試料と、逆転写プライマーと、逆転写酵素とを含む逆転写反応液を逆転写反応条件下に維持することによって行われ得る。

試料は、分析されるべき対象であり、標的ＲＮＡを含む可能性のあるものであればよい。試料は、例えば、動物から採取された血液、血清、白血球、リンパ液、髄液、尿、便、精液、汗、唾液、口腔内粘膜、喀痰、涙液、母乳、羊水、組織、バイオプシー、単離細胞若しくは培養細胞などの物質、植物の器官、単離細胞、培養細胞若しくは抽出物、微生物、細菌、真菌若しくはウイルスを含む混合物、環境から採取された環境物質、合成ＲＮＡを含む混合物、或いはそれらの何れかの混合物などの材料そのものであってもよい。或いは、それらを材料として調製された調製物であってもよい。

動物は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類又は節足動物、或いは動物界に属するその他の生物であり得る。哺乳類は、サル及びヒト等の霊長類、マウス及びラット等の齧歯類、イヌ、ネコ及びウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ及びブタ等の家畜などの何れかの哺乳動物であり得る。

試料は、増幅反応を妨害しない状態にあることが好ましい。そのような状態にあることによって、実施形態のＲＮＡ増幅方法において標的ＲＮＡをより効率よく増幅することが可能である。増幅反応を妨害しない状態とは、例えば、試料中の何れかの成分の種類、成分の組み合わせ又は成分の濃度等が、増幅反応速度を低下させる、遅延させる又は停止させるようなものではない状態であることをいう。

上述の材料自体が増幅反応を妨害しない状態にある場合、その材料をそのまま試料として使用してもよい。或いは、得られた材料について、例えば、それ自身公知の何れかの手段により前処理を行って、増幅反応を妨害しない状態又はより増幅に適した状態の試料を得てもよい。前処理は、例えば、細切、ホモジナイズ、遠心、沈殿、抽出及び／又は分離などである。

例えば、抽出は、市販の核酸抽出キットを用いて行われてもよい。核酸抽出キットは、例えば、ｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）ＳＰ Ｋｉｔ（和光純薬製）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ｍｉＲＮＡ（タカラバイオ製）、ｍｉｒｐｒｅｍｉｅｒ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｉｓｏｌａｒｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ製）、ハイピュアｍｉＲＮＡアイソレーションキット（ロシュ・ライフサイエンス製）、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（キアゲン製）などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。或いは、このようなキットを使用せずに、例えば、材料を緩衝液で希釈し、８０℃〜１００℃の加熱処理を行い、遠心分離し、その上清を採取することによって抽出を行い、試料を得てもよい。

逆転写プライマーは、一本鎖ＤＮＡであり、第１の配列を逆転写するためのプライマーである。図２は、標的ＲＮＡ及び実施形態の逆転写プライマーの一例を示す。標的ＲＮＡ（ｉ）は、第１の配列を含む。逆転写プライマー（ｉｉ）は、逆転写プライマー配列及び第１の増幅用配列を含む。逆転写プライマー配列及び第１の増幅用配列は、３’から５’方向に向かってこの順番で逆転写プライマーに含まれる。逆転写プライマーの全長は、２０塩基〜８０塩基であることが好ましい。

逆転写プライマー配列は、第１の配列を逆転写するためのプライマーとして働く配列である。逆転写プライマー配列の塩基配列は、標的ＲＮＡ（ｉ）の第１の配列が全長に亘り逆転写されることが可能となるように選択された、標的ＲＮＡ上の所望の配列と相補的な配列である。逆転写プライマー配列は、例えば、標的ＲＮＡ上の第１の配列の３’末端を含む連続した配列と相補的な配列である。或いは、図２の（ｉ）に示すように、標的ＲＮＡの３’末端と第１の配列の３’末端との間に所望の数の配列が存在するように第１の配列が選択された場合、逆転写プライマー配列は、第１の配列の３’末端と標的ＲＮＡの３’末端との間の配列と相補的であってもよい（図示せず）。逆転写プライマー配列の塩基長は、特に限定されるものではないが、５塩基〜２０塩基、望ましくは７塩基から１５塩基、更に望ましくは、８塩基〜１２塩基であってよい。

第１の増幅用配列は、第１の配列と非相補的な配列であり、かつ後述する伸長化産物に結合するプライマーセットに含まれる少なくとも１つのプライマーが結合するための配列又はその相補鎖を含む。そのような配列の他に、第１の増幅用配列は、所望の配列を含んでいてもよい。それは、例えば、それ自体又はその相補鎖が実施形態のＲＮＡ増幅方法における増幅反応に必要な配列などであり得る。第１の増幅用配列の塩基長は、例えば、２０塩基〜６０塩基であることが好ましい。

第１の増幅用配列の塩基配列は、例えば、後述する工程（ｃ）で用いられる伸長化産物に結合するプライマーセットに含まれるプライマーの塩基配列を予め設計した後に、その構成及び塩基配列に基づいて設計されてもよい。或いは、所望の長さのＤＮＡ配列を第１の増幅用配列として選択し、その塩基配列に基づいて伸長化産物に結合するプライマーセットを設計してもよい。

逆転写プライマー配列及び第１の増幅用配列の間には、スペーサー配列が存在していてもよい。スペーサー配列の塩基長は、例えば、４塩基〜１６塩基であることが好ましい。

逆転写酵素は、公知の何れかの逆転写酵素であればよく、逆転写プライマーの種類及び／又は標的ＲＮＡの種類若しくは配列等に応じて選択される。逆転写酵素の例は、限定するものではないが、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、トランスクリプター逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）トランスクリプター逆転写酵素、又はＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素などが挙げられる。

逆転写反応液は、これらの成分に加えて、更に、逆転写反応に必要な所望の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、塩、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン、及び／又は逆転写酵素の補因子となるイオンなどであり得る。

逆転写反応液を逆転写反応条件下で維持する。逆転写反応条件は、当業者の通常の知識に基づいて、逆転写プライマーの種類、標的ＲＮＡの種類及び／又は逆転写酵素の種類などに依存して選択され得る。逆転写反応条件の例は、例えば、温度４５℃以下を１５分〜１時間などであり得る。

逆転写反応液をこの条件下で維持することによって、第１の配列が逆転写されて、第１の配列と相補的な第１’の配列を含む逆転写産物が得られる。

逆転写産物が生成する過程の一例を図３に示す。図３は、実施形態のＲＮＡ増幅方法で用いられる増幅法がＬＡＭＰ法である場合の例を示す。

まず、標的ＲＮＡ１の第１の配列２に、逆転写プライマー３の逆転写プライマー配列４がハイブリダイズする。逆転写プライマー３は、逆転写プライマー配列４、並びに第１の増幅用配列としてのＢ１配列、Ｂ２配列及びＢ３配列をこの順番で含む。

Ｂ１配列、Ｂ２配列及びＢ３配列は、例えば、後の等温増幅の工程で用いられるＬＡＭＰプライマーセットに基づいて設計される。当該ＬＡＭＰプライマーセットは、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマーと、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマーと、Ｂ３配列を含むＢ３プライマーと、Ｆ３配列を含むＦ３プライマーとを含む（図示せず）。ここで、用語「Ｂ１配列」、「Ｂ２配列」、「Ｂ３配列」、「Ｆ１配列」、「Ｆ２配列」、及び「Ｆ３配列」は、当業者がＬＡＭＰプライマーを設計する際に用いるものと同じ意味で用いられる。また、Ｂ１ｃ配列はＢ１配列と、Ｆ１ｃ配列はＦ１配列と相補的な配列である。第１の増幅用配列中のＢ２配列は、ＢＩＰプライマーのＢ２配列が結合するための配列の相補鎖である。第１の増幅用配列中のＢ３配列は、Ｂ３プライマーのＢ３配列が結合するための配列の相補鎖である。第１の増幅用配列中のＢ１配列は、ＬＡＭＰ増幅反応における増幅産物生成に必要な配列である。

次に、逆転写酵素（図示せず）によって、標的ＲＮＡ１を鋳型とした、逆転写プライマー配列４の３’末端の５’方向（白抜き矢印で示す）への伸長が進行する。それによって、第１の配列２が逆転写され、第１の配列２と相補的な第１’の配列５が生成する。その結果、第１’の配列５、Ｂ１配列、Ｂ２配列及びＢ３配列をこの順番で含む逆転写産物６が得られる。逆転写産物６は標的ＲＮＡ１とハイブリダイズしている。

次に、工程（ｂ）において、逆転写産物と標的ＲＮＡとを解離する。解離は、例えば、逆転写反応の後、逆転写反応液を８０℃〜１００℃に加熱することによって行うことができる。このような加熱によって、上記のようにＲＮＡが解離されるのと同時に逆転写酵素が失活し得る。それによって、工程（ｂ）以降の工程に逆転写反応が悪影響を及ぼすことを防ぐことができる。次に、工程（ｃ）において、伸長化プライマー及び逆転写産物をハイブリダイズさせ、伸長化プライマー及び逆転写産物を伸長化させて前記第１’の配列及び／又はその相補鎖を含む二本鎖ＤＮＡの伸長化産物を得る。

工程（ｃ）について図４、図５及び図６を用いて更に詳しく説明する。

工程（ｃ）は、例えば、工程（ａ）及び（ｂ）で得られた逆転写産物と、伸長化プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む伸長化反応液を伸長化反応条件下に維持することによって行われ得る。

逆転写産物は、工程（ａ）及び（ｂ）で得られた逆転写産物である。

伸長化プライマーは、一本鎖ＤＮＡであり、逆転写産物とハイブリダイズすることができ、工程（ｄ）で増幅することができる二本鎖ＤＮＡを得るためのプライマーである。図４は、逆転写産物及び伸長化プライマーの一例を示す。逆転写産物（ｉｉｉ）は、第１’の配列及び第１の増幅用配列を含む。伸長化プライマー（ｉｖ）は、伸長化プライマー配列及び第２の増幅用配列を含む。伸長化プライマー配列及び第２の増幅用配列は、３’から５’方向に向かってこの順番で伸長化プライマーに含まれる。

伸長化プライマー配列は、第１’の配列を鋳型として、第１’の配列の全長に亘る配列の相補鎖を生成することが可能となるように選択された配列である。それは、逆転写産物（ｉｉｉ）の３’末端を含む連続した配列と相補的な配列である。伸長化プライマー配列は、逆転写プライマーの３’末端から５’方向に、５塩基以下、望ましくは３塩基以下の配列と相補的な配列を含んでもよい。伸長化プライマー配列の塩基長は、例えば、３０塩基〜１２０塩基であることが好ましい。

第２の増幅用配列は、第１’の配列と非相補的な配列であり、かつ伸長化産物に結合するプライマーが結合できる配列又はその相補鎖を含む。第２の増幅用配列は、後述する伸長化産物に結合するプライマーセットに含まれるプライマーが結合できる配列又はその相補鎖の他に、所望の配列を含んでいてもよい。それは、例えば、それ自体又はその相補鎖が増幅反応に必要な配列などであり得る。第２の増幅用配列の塩基長は、例えば、３０塩基〜９０塩基であることが好ましい。

第２の増幅用配列の塩基配列は、例えば、工程（ｃ）で用いられる伸長化産物に結合するプライマーセットの塩基配列を予め設計した後に、その構成に基づいて設計されてもよい。或いは、所望の長さのＤＮＡ配列を第２の増幅用配列として選択し、その塩基配列に基づいて伸長化産物に結合するプライマーを設計してもよい。

伸長化プライマー配列及び第２の増幅用配列の各配列の間には、スペーサー配列が存在していてもよい。スペーサー配列の塩基長は、例えば、４塩基〜１６塩基であることが好ましい。

ＤＮＡポリメラーゼは、公知の何れかの逆ＤＮＡポリメラーゼであればよく、伸長化プライマーの種類及び／又は逆転写産物の配列等に応じて選択される。そのようなＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｌａｇｍｅｎｔ（Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ）、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｓａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 ９６−７ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＧｓｐＤＤＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、又はＴｉｎ ｅｘｏ− ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、或いはＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをはじめとするＰＣＲ増幅に一般的に用いられる他のＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いることもできる。或いは、ＤＮＡを鋳型とした増幅が可能である逆転写酵素Ｍ−ＭｕＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅなどを用いることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼは、詳しくは後述するが、工程（ｄ）で用いるＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくともどちらか一方であってもよい。

伸長化反応液は、これらの成分に加えて、更に、伸長化反応に必要な所望の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、塩、ｄＮＴＰなどの基質、反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン、及び／又は逆転写酵素の補因子となるイオンなどであり得る。

伸長化反応液を伸長化反応条件下に維持する。伸長化反応条件は、当業者の通常の知識に基づいて、伸長化プライマーの種類、逆転写産物の種類及び／又はＤＮＡポリメラーゼの種類などに依存して選択され得る。伸長化反応の反応温度は酵素の種類に依存するが、例えば、概ね１０℃〜８０℃である。伸長化反応は、反応温度を一定に保持するか、複数の温度帯を一定時間ずつ保持するか、又は複数の温度帯を複数回のサイクルで繰り返すことで実施することが可能である。

伸長化反応液をこの条件下で維持することによって、伸長化プライマーが逆転写産物にハイブリダイズし、伸長化プライマーと逆転写産物とが、互いを鋳型として伸長化し、二本鎖ＤＮＡの伸長化産物を得ることができる。伸長化産物の一例を図５に示した。伸長化産物（ｖ）の一方の鎖は、第２の増幅用配列の相補鎖、第１’の配列、第１の増幅用配列を含み、他方の鎖は、第２の増幅用配列、第１’の配列の相補鎖、第１の増幅用配列の相補鎖を含む。

図６に、標的ＲＮＡ１を解離した図３の逆転写産物６から伸長化産物を得る過程の一例を示す。

まず、逆転写産物６の第１’の配列５に、伸長化プライマー８の伸長化プライマー配列９がハイブリダイズする。伸長化プライマー８は、伸長化プライマー配列９、並びに第２の増幅用配列としてのＦ１配列、Ｆ２配列及びＦ３配列を含む。

Ｆ１配列、Ｆ２配列及びＦ３配列は、例えば、後の工程で用いられるＬＡＭＰプライマーセットに基づいて設計される。当該ＬＡＭＰプライマーセットは、図３で説明したプライマーを含む（図示せず）。第２の増幅用配列中のＦ２配列は、ＦＩＰプライマーのＦ２配列が結合するための配列の相補鎖である。第２の増幅用配列中のＦ３配列は、Ｆ３プライマーのＦ３配列が結合するための配列の相補鎖である。第２の増幅用配列中のＦ１配列は、ＬＡＭＰ増幅反応における増幅産物生成に必要な配列である。

次に、ＤＮＡポリメラーゼによって、伸長化プライマー８と逆転写産物６が、互いを鋳型として伸長化する。即ち、伸長化プライマー８の３’末端が逆転写産物６を鋳型として伸長し、同時に、逆転写産物６の５’末端が伸長化プライマー８を鋳型として伸長する（白抜き矢印で示す）。その結果、二本鎖ＤＮＡの伸長化産物１０が生成する。伸長化産物１０は、一方の鎖に、Ｆ１〜Ｆ３配列とそれぞれ相補的なＦ１ｃ〜Ｆ３ｃ配列、第１’配列５、及びＢ１〜Ｂ３配列を含み、他方の鎖に、Ｆ１〜Ｆ３配列、第１’配列５と相補的な配列１１、及びＢ１〜Ｂ３配列とそれぞれ相補的なＢ１ｃ〜Ｂ３ｃ配列を含む。

（ｄ）において、工程（ｃ）で得られた伸長化産物と、伸長化産物に結合するプライマーセットと、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくともどちらか一方を含む増幅反応液を増幅反応条件下で維持し、それによって伸長化産物を鋳型として第１’の配列及び／又はその相補鎖を増幅する。

以下に増幅反応液に含まれる増幅反応のための成分について説明する。

伸長化産物は工程（ｃ）で得られた伸長化産物である。

伸長化産物に結合するプライマーセットは、伸長化産物を鋳型として、第１’の配列又はその相補鎖を増幅するために必要なプライマーの集合体である。伸長化産物に結合するプライマーセットは、例えば、等温増幅プライマーセットであり得る。等温増幅プライマーセットは、少なくとも、第１の増幅用配列又はその相補鎖に結合するための第１のプライマー及び第２の増幅用配列又はその相補鎖に結合するための第２のプライマーを含む。

伸長化産物に結合するプライマーセットは、逆転写プライマー及び伸長化プライマーの塩基配列が予め決定されている場合、逆転写プライマー及び伸長化プライマーの塩基配列と用いられる増幅方法の種類とに基づいて、当業者の通常の知識に基づいて設計されればよい。逆転写プライマー及び伸長化プライマーの塩基配列を決定する前に伸長化産物に結合するプライマーセットの塩基配列を設計する場合、伸長化産物に結合するプライマーセットは、用いられる増幅方法の種類に基づいて、当業者の通常の知識に基づいて設計されればよく、それに基づいて逆転写プライマー及び伸長化プライマーの塩基配列が決定されればよい。

伸長化産物に結合するプライマーセットの一例を図７に示す。図７は、図６に示す伸長化産物１０の第１’の配列５及びその相補鎖５’を増幅するための伸長化産物に結合するプライマーセットを示す。この例では、伸長化産物に結合するプライマーセットは、等温増幅プライマーセットであり、ＢＩＰプライマー１１、ＦＩＰプライマー１２、Ｂ３プライマー１３、Ｆ３プライマー１４を含む。ＢＩＰプライマー１１は、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含み、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列は、この順番で、３’から５’方向に向かって連結されている。Ｂ２配列は、第１の増幅用配列の相補鎖に含まれるＢ２ｃ配列と結合するための配列である。Ｂ１ｃ配列は、Ｂ１配列と相補的な配列である。ＦＩＰプライマー１２は、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含み、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列は、この順番で、３’から５’方向に向かって連結されている。Ｆ２配列は、第２の増幅用配列の相補鎖に含まれるＦ２ｃ配列と結合するための配列である。Ｆ１ｃ配列は、Ｆ１配列と相補的な配列である。Ｂ３プライマー１３は、Ｂ３配列を含む。Ｆ３プライマー１４は、Ｆ３配列を含む。Ｆ３領域及びＢ３領域はなくとも反応は生じる。ＢＩＰプライマーのＢ２配列は、第１の増幅用配列のＢ２配列の相補鎖に結合するための配列である。ＦＩＰプライマーのＦ２配列は、第２の増幅用配列のＦ２配列の相補鎖に結合するための配列である。従って、図７の伸長化産物に結合するプライマーセットは、第１のプライマーとしてＢＩＰプライマーを含み、第２のプライマーとしてＦＩＰプライマーを含む。

Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼは、伸長化産物を鋳型として第１’の配列及びその相補鎖を増幅する増幅反応を触媒するための酵素である。Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼは、それぞれ、一般的にこれらの名前で呼ばれる既知の鎖置換型酵素であればよい。増幅反応液は、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼ又はそれらの組み合わせを含む。増幅反応液中のこれらの酵素の濃度は、２Ｕ〜３２Ｕであり得る。

増幅反応を触媒する酵素としてＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼ又はそれらの組み合わせを用いることにより、第１’の配列及びその相補鎖の全長を含む伸長化産物をより特異的に増幅することが可能である。即ち、例えば、工程（ａ）の逆転写反応及び工程（ｃ）の伸長化反応において、目的とする逆転写産物及び伸長化産物の他に、第１’の配列及びその相補鎖を含まない又はその一部しか含まない非特異的産物が生成し得る。それらが増幅されてしまうと、本来の増幅の対象である第１’の配列及びその相補鎖の全長を含む増幅産物の濃度が低い増幅産物が生成するおそれがある。その場合、標的ＲＮＡを精度よく検出することが困難である。しかしながら、実施形態の方法は、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、非特異的産物の増幅を抑制し、本来の増幅の対象である配列をより多く含む増幅産物を得ることが可能である。従って、これらの酵素を用いることによって、従来では困難であった試料中にわずかしか含まれないＲＮＡの特異的な増幅が可能である。その結果、より簡便、高感度かつ特異的なＲＮＡの増幅方法が提供される。それに加えて、これらの酵素を用いることによって、非特異的産物が多く存在する条件においても標的ＲＮＡの特異的な増幅を行うことが可能である。そのため、詳しくは後述するが、逆転写反応液、伸長化反応液及び増幅反応液を兼ねる反応液中で、逆転写反応及び伸長化反応によって生成した非特異的産物を除去すること、逆転写産物を伸長化反応のために分離すること、及び伸長化産物を増幅反応のために分離することなく、工程（ａ）〜（ｄ）を行うことが可能である。それによって、更に簡便なＲＮＡの増幅方法が提供される。

増幅反応液は、これらの成分に加えて、更に、増幅反応に必要な所望の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、適切な増幅環境を維持するための塩類などであり得る。

増幅反応条件は、当業者の通常の知識に基づいて、プライマーの種類などに依存して選択され得る。増幅反応条件は、例えば、等温増幅条件であり得、例えば、温度５０℃〜７０℃の等温を１５〜９０分間などであり得る。

増幅反応液を増幅反応条件下で維持することによって、伸長化産物を鋳型として第１’の配列及び／又はその相補鎖が増幅される。

実施形態のＲＮＡ増幅方法によって、試料中の標的ＲＮＡをより簡便、高感度かつ特異的に増幅することができる。

更なる実施形態において、工程（ｃ）の伸長化反応液に含まれるＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一方、又はその組み合わせを含むものであってもよい。その場合、工程（ｃ）で用いられるＤＮＡポリメラーゼは、工程（ｄ）で増幅反応に用いられてもよい。即ち、例えば、伸長化反応液にＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼ或いはその組み合わせをＤＮＡポリメラーゼとして含ませておき、伸長化反応か終わった後に、増幅反応液に増幅用の酵素を添加せずに工程（ｄ）を行ってもよい。その場合、用いる酵素の量が少なく、コストを削減できる。また、実験の手順がより簡便となる。

以上に説明した逆転写反応、伸長化反応及び増幅反応は、逆転写反応液と伸長化反応液と増幅反応液を兼ねる反応液中で行うことができる。即ち、例えば、逆転写反応を行う前に、逆転写反応液に予め伸長化反応及び増幅反応に必要な成分を含ませておいてもよく、又は、各反応の後、その反応液に次の反応に必要な成分を添加して次の反応に用いてもよい。或いは、各反応の後、その反応液の全て又は一部を、次の反応に必要な成分を含む溶液に添加してもよい。その場合、逆転写反応及び伸長化反応によって生成した非特異的産物を除去すること、逆転写産物を伸長化反応のために分離すること、及び伸長化産物を増幅反応のために分離することなどを行う必要がないため、操作がより簡便である。これは、非特異的産物が存在する条件でも目的産物を特異的に増幅できるＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼを、増幅反応に用いることによって可能となる。

２．ＲＮＡ検出方法
更なる実施形態において、標的ＲＮＡの検出方法が提供される。

図８は、実施形態のＲＮＡ検出方法の一例を示す概略フローである。実施形態のＲＮＡ検出方法は、実施形態のＲＮＡ増幅方法の工程（ａ）〜（ｄ）を実行し、工程（ｄ）の増幅反応条件下での維持中又は維持後に、得られた増幅産物を検出すること（工程（ｅ））を含む。

増幅産物の検出は、例えば、濁度、蛍光、又は電気化学的信号等を指標に行われることができる。濁度を指標にする増幅産物の検出は、例えば、濁度計、吸光度計、及び目視などで行えばよい。蛍光を指標にする増幅産物の検出は、例えば、カルセインを含む蛍光試薬やインターカレータなど、増幅産物又は増幅反応の存在に応じて蛍光を生ずる試薬を用い、生じた蛍光を検出することにより行われればよい。電気化学的信号を指標にする増幅産物の検出は、例えば、インターカレータなど、増幅産物又は増幅反応の存在に応じて酸化還元反応等の電気化学的信号を生ずる試薬を用い、生じた信号を検出することにより行われればよい。増幅産物の検出は、増幅反応の開始から特定の時点で行われてもよいし、経時的に行われてもよい。経時的とは、連続的であってもよいし、間欠的、即ち所望の時間間隔で複数の時点で検出することであってもよい。

また、増幅反応及び／又は増幅産物の検出は、増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを検出することによっても検出することができる。ハイブリダイゼーションの検出は、プローブ固定基体により行われ得る。プローブ固定基体は、基体と、基体上に固定されている複数種類のプローブとを備える。プローブは、各検出用領域の配列と同じ配列又はその相補配列を含み得る。それによってプローブは、対応する配列を含む増幅産物とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションを検出することにより増幅産物の存在又は存在量を検知する。それによって、当該検出方法は、試料中の標的核酸の存在又は存在量を検出する。

プローブ固定基体は、例えば狭義には、一般的に使用される「ＤＮＡチップ」、「ＤＮＡアレイ」などの用語と同義と解されてもよく、互いに交換可能に使用され得る。また例えばＤＮＡチップなどの小型のプローブ固定基体と、例えば増幅反応部、流路などを構成するために必要な他の構成部材とが一体化されてなる検出用カセット、カートリッジなどのデバイスもプローブ固定基体と解され得る。その場合、増幅反応及び／又は検出は、ＤＮＡチップ内の温度及び／又は試料及び反応液の移動等を自動制御できる装置によって自動的に行われ得る。

前記検出の結果から、試料中の標的ＲＮＡの有無及び／又は量を決定することができる。決定は、例えば、濁度又は蛍光が予め定められた閾値を超えるまでに要する時間を立ち上がり時間として計測することによって行われる。標的ＲＮＡが存在する場合には、より早い時点で濁度又は蛍光の増加の立ち上がりが観察される。又は、立ち上がり時間によって標的ＲＮＡの濃度を決定することができる。或いは、標的ＲＮＡの濃度の決定は、例えば、標的ＲＮＡの存在量が既知の異なる複数の標準試料の測定結果から検量線を作成し、前記検出結果と検量線とを比較することによって行うことができる。

ＲＮＡ検出方法の更なる実施形態において、増幅産物を特定の制限酵素によって断片化することによって、第１’の配列及びその相補鎖を他の配列と分離し、第１’の配列及びその相補鎖を検出してもよい。その場合、増幅産物が特定の制限酵素で切断できる配列を含むように、逆転写プライマー、伸長化プライマー及び伸長化産物に結合するプライマーセットが設計される。その場合、増幅反応の後、増幅産物を対応する制限酵素で処理し、例えば、電気泳動する。電気泳動によって、試料中に標的ＲＮＡが存在し、増幅産物中に第１’の配列及びその相補鎖を含む配列が存在する場合、それらの産物は、特定の位置に一つのバンドとして現れる。それによって、試料中における標的ＲＮＡの有無をより明確に判断することができる。

実施形態のＲＮＡ検出方法によれば、簡便、高感度かつ特異的に標的ＲＮＡを検出することができる。

また、標的ＲＮＡが、例えば、特定の疾患に罹患した細胞において発現する或いは発現量が増加又は減少するＲＮＡである場合、実施形態の検出方法で標的ＲＮＡを検出することによって、試料の採取元である生体が特定の疾患に罹患しているか否かをより簡便、高感度かつ特異的に判断することができる。特定の疾患は、例えば、乳癌、大腸癌又は肺癌等の癌、又は他の疾患等であり得る。また例えば、標的ＲＮＡが特定の細菌又はウイルスにおいて発現する或いは発現量が増加又は減少するＲＮＡである場合、実施形態の検出方法で標的ＲＮＡを検出することによって、試料の特定の細菌又はウイルスなどの存在、又は試料の採取元である生体が特定の細菌又はウイルスに感染しているか否かなどをより簡便、高感度かつ特異的に判断することができる。

３、アッセイキット
実施形態によれば、試料中の第１の配列を含む標的ＲＮＡを増幅又は検出するためのアッセイキットが提供される。

実施形態のアッセイキットは、逆転写プライマーと、逆転写酵素と、伸長化プライマーと、伸長化産物に結合するプライマーセットと、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼ又はその組み合わせとを含む。更に、アッセイキットは、逆転写反応、伸長化反応及び／又は増幅反応に必要な更なる成分を含んでいてもよい。

アッセイキットは、更に、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼとは異なるＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよい。

これらの成分は、上述したものである。これらの成分は、別々に容器に収容されていてもよいし、これらの何れかの組み合わせ又は全ての成分が一体として同じ容器に含まれていてもよい。

このようなアッセイキットによれば、標的ＲＮＡをより簡便、高感度かつ特異的に検出することが可能である。

［例］
例１（比較例）：ＧｓｐＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼを用いたＬＡＭＰ法によるＲＮＡの検出
（１）逆転写反応
まず、異なる濃度の合成ｍｉＲＮＡ（１Ｅ＋３、１Ｅ＋４、１Ｅ＋５、１Ｅ＋６及び０コピー）含む複数の逆転写反応液（２０μＬ）を調製した。逆転写反応液は、それぞれ、上記合成ｍｉＲＮＡの他に更に、何れも終濃度で、５ｎＭの逆転写プライマー、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．８Ｍのベタイン、１．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、４ＵのＲＮａｓｅＯＵＴを含む。各逆転写反応液を、１６℃で３０分、４２℃で３０分、８５℃で５分維持し、逆転写反応を行った。

（２）伸長化反応
続いて、各逆転写反応液に４．４５ｎＭの伸長化プライマー、０．４ＵのＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）を添加し、伸長化反応液を調製した。各伸長化反応液を、９５℃で２分維持した後、（９５℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒）×３５サイクルを行い、次いで７２℃で５分で維持し、伸長化反応を行った。

（３）ＬＡＭＰ増幅反応
何れも終濃度で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．８Ｍのベタイン、１．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．６μＭのＦＩＰプライマー、１．６μＭのＢＩＰプライマー、０．８μＭのＬＦプライマー、及び８ＵのＧｓｐＤＮＡポリメラーゼを含む溶液に、それぞれ、伸長化反応後の伸長化反応液（１０μＬ）をとって添加し、複数の２５μＬのＬＡＭＰ増幅反応液を調製した。ポジティブコントロールとして、目的の伸長化産物の配列を有する合成ＤＮＡ（１Ｅ＋５コピー）を含む反応液を用意した。ネガティブコントロールとして、核酸鎖を含まない溶液を用意した。各ＬＡＭＰ増幅反応液、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールを６５℃、９０分に維持し、ＬＡＭＰ増幅反応を行った。各液について濁度を経時的に測定した。

ＤＮＡポリメラーゼとして、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼを含むＬＡＭＰ増幅反応液を同様に作成し、同様に増幅反応と濁度の検出とを行った。

（４）電気泳動
次いで、各反応液を制限酵素ＨｉｎｆＩで処理し、増幅産物を断片化した後、それぞれ電気泳動を行った。本実験は、１種類の反応液につき２つのチューブ（２反復）で実験を行った。結果を図９に示す。

図９（ａ）はＧｓｐＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）はＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）はＢｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼでの結果を示す。各図は、上記各反応液の濁度の立ち上がり時間と、電気泳動写真とを示す。

ＧｓｐＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋６コピー（１０＾６）含む反応液でのみ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋６コピー（１０＾５）以上含む反応液でのみ、ポジティブコントロール（ＰＣ）と同じバンドパターンが得られた。何れの酵素を用いた場合においても、ｍｉＲＮＡの濃度が、ポジティブコントロール（ＰＣ）と同じバンドパターンが得られた濃度よりも低い場合では、増幅産物は生成する（濁度の立ち上がりがある）ものの、標的であるｍｉＲＮＡの配列が特異的に増幅されなかった。

例２（実施例）：Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼを用いたＬＡＭＰ法による短鎖ＲＮＡの検出
ＬＡＭＰ増幅酵素としてＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼを用いて、比較例と同様の方法で、ｍｉＲＮＡを逆転写し、伸長化し、増幅した。結果を図１０に示す。図１０（ａ）はＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの結果を示す。各図は、上記各液の濁度の立ち上がり時間と、電気泳動写真とを示す。

Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合は、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋５コピー（１０＾５）、１Ｅ＋４コピー（１０＾４）、１Ｅ＋３コピー（１０＾３）を含む反応液で、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼを用いた場合は、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋６コピー（１０＾６）、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋５コピー（１０＾５）、１Ｅ＋４コピー（１０＾４）を含む反応液でポジティブコントロール（ＰＣ）と同じバンドパターンが得られた。従って、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼを用いた場合では、ＧｓｐＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ポリメラーゼを用いた場合よりも、よりｍｉＲＮＡの濃度が少ない反応液から、目的の遺伝子を特異的に増幅できることが明らかとなった。

例３：１１種類の鎖置換型酵素の増幅能及び増幅の特異性の評価
試料中の長鎖ＤＮＡ（逆転写及び伸長化をする必要がない）を増幅する場合に検出感度が高く、増幅速度が速い又は特異的な増幅が可能であることが一般的に知られている１１種類の鎖置換型酵素（例１及び２に用いた酵素を含む）について、それぞれをＬＡＭＰ増幅酵素として用いて上記比較例と同様の実験を行い、増幅の有無と特異性を評価した。結果を表１に示す。

表中の「増幅の有無」は濁度測定の結果を示し、「＋」は合成ｍｉＲＮＡの濃度が１０＾５コピー／２５μＬである場合に濁度の立ち上がりが観察されたことを示し、「−」は濁度の立ち上がりが観察されず、増幅ができなかったことを示す。「特異的増幅」は、電気泳動の結果を示し、「＋」は、ｍｉＲＮＡの濃度が１０＾４コピー／２５μＬ以下の条件で特異的増幅が可能であることを示し、「−」は、前記条件で特異的増幅が不可であることを示す。なお、増幅ができなかったサンプルについては、電気泳動は行わなかった。表１の結果から、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼによれば、ｍｉＲＮＡが１Ｅ＋４コピー（１０＾４）以下の反応液で特異的な増幅が可能であることが分かった。

これらの実験から、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼによれば、試料中にわずかしか含まれておらず、かつ短鎖で分解しやすいｍｉＲＮＡを簡便、高感度かつ特異的に増幅及び検出する方法が提供されることが見出された。

１…標的ＲＮＡ ２…第１の配列 ３…逆転写プライマー
４…逆転写プライマー配列 ５…第１’の配列 ５’…第１’の配列の相補鎖
６…逆転写産物 ８…伸長化プライマー ９…伸長化プライマー配列
１０…伸長化産物

ＤＮＡポリメラーゼは、公知の何れかの逆ＤＮＡポリメラーゼであればよく、伸長化プライマーの種類及び／又は逆転写産物の配列等に応じて選択される。そのようなＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ）、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｓａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 ９６−７ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＧｓｐＳＳＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、又はＴｉｎ ｅｘｏ− ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、或いはＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをはじめとするＰＣＲ増幅に一般的に用いられる他のＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いることもできる。或いは、ＤＮＡを鋳型とした増幅が可能である逆転写酵素Ｍ−ＭｕＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅなどを用いることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼは、詳しくは後述するが、工程（ｄ）で用いるＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくともどちらか一方であってもよい。

［例］
例１（比較例）：ＧｓｐＳＳＤＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼを用いたＬＡＭＰ法によるＲＮＡの検出
（１）逆転写反応
まず、異なる濃度の合成ｍｉＲＮＡ（１Ｅ＋３、１Ｅ＋４、１Ｅ＋５、１Ｅ＋６及び０コピー）含む複数の逆転写反応液（２０μＬ）を調製した。逆転写反応液は、それぞれ、上記合成ｍｉＲＮＡの他に更に、何れも終濃度で、５ｎＭの逆転写プライマー、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．８Ｍのベタイン、１．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、４ＵのＲＮａｓｅＯＵＴを含む。各逆転写反応液を、１６℃で３０分、４２℃で３０分、８５℃で５分維持し、逆転写反応を行った。

（３）ＬＡＭＰ増幅反応
何れも終濃度で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．８Ｍのベタイン、１．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．６μＭのＦＩＰプライマー、１．６μＭのＢＩＰプライマー、０．８μＭのＬＦプライマー、及び８ＵのＧｓｐＳＳＤＤＮＡポリメラーゼを含む溶液に、それぞれ、伸長化反応後の伸長化反応液（１０μＬ）をとって添加し、複数の２５μＬのＬＡＭＰ増幅反応液を調製した。ポジティブコントロールとして、目的の伸長化産物の配列を有する合成ＤＮＡ（１Ｅ＋５コピー）を含む反応液を用意した。ネガティブコントロールとして、核酸鎖を含まない溶液を用意した。各ＬＡＭＰ増幅反応液、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールを６５℃、９０分に維持し、ＬＡＭＰ増幅反応を行った。各液について濁度を経時的に測定した。

図９（ａ）はＧｓｐＳＳＤＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）はＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）はＢｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼでの結果を示す。各図は、上記各反応液の濁度の立ち上がり時間と、電気泳動写真とを示す。

ＧｓｐＳＳＤＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋６コピー（１０＾６）含む反応液でのみ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋６コピー（１０＾５）以上含む反応液でのみ、ポジティブコントロール（ＰＣ）と同じバンドパターンが得られた。何れの酵素を用いた場合においても、ｍｉＲＮＡの濃度が、ポジティブコントロール（ＰＣ）と同じバンドパターンが得られた濃度よりも低い場合では、増幅産物は生成する（濁度の立ち上がりがある）ものの、標的であるｍｉＲＮＡの配列が特異的に増幅されなかった。

Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合は、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋５コピー（１０＾５）、１Ｅ＋４コピー（１０＾４）、１Ｅ＋３コピー（１０＾３）を含む反応液で、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼを用いた場合は、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋６コピー（１０＾６）、ｍｉＲＮＡを１Ｅ＋５コピー（１０＾５）、１Ｅ＋４コピー（１０＾４）を含む反応液でポジティブコントロール（ＰＣ）と同じバンドパターンが得られた。従って、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼを用いた場合では、ＧｓｐＳＳＤＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ポリメラーゼを用いた場合よりも、よりｍｉＲＮＡの濃度が少ない反応液から、目的の遺伝子を特異的に増幅できることが明らかとなった。

これらの実験から、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｍＤＮＡポリメラーゼによれば、試料中にわずかしか含まれておらず、かつ短鎖で分解しやすいｍｉＲＮＡを簡便、高感度かつ特異的に増幅及び検出する方法が提供されることが見出された。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
試料中の、第１の配列を含む標的ＲＮＡを増幅する方法であって
工程（ａ）前記標的ＲＮＡ中の前記第１の配列を逆転写して前記第１の配列と相補的な第１’の配列を含む逆転写産物を得ること、
工程（ｂ）前記逆転写産物と前記標的ＲＮＡとを解離させること、
工程（ｃ）伸長化プライマー及び前記逆転写産物をハイブリダイズさせ、前記伸長化プライマー及び前記逆転写産物を伸長化させて、前記第１’の配列及び／又はその相補鎖を含む二本鎖ＤＮＡの伸長化産物を得ること、並びに
工程（ｄ）前記伸長化産物と、前記伸長化産物に結合するプライマーセットと、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一方とを含む増幅反応液を増幅反応条件下で維持すること、それによって前記伸長化産物を鋳型として前記第１’の配列及び／又はその相補鎖を増幅すること
を含むＲＮＡ増幅方法。
［２］
前記工程（ａ）における前記逆転写産物が、前記試料と、逆転写プライマー配列及び第１の増幅用配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む逆転写プライマーと、逆転写酵素とを含む逆転写反応液を逆転写反応条件下に維持することによって得られる［１］に記載の方法。
［３］
前記工程（ｃ）における前記伸長化産物は、前記逆転写産物と、前記逆転写産物の３’末端を含む連続した配列と相補的な伸長化プライマー配列及び第２の増幅用配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む伸長化プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む伸長化反応液を伸長化反応条件下に維持し、前記伸長化プライマー及び前記逆転写産物をハイブリダイズさせ、前記伸長化プライマー及び前記逆転写産物を互いを鋳型として伸長化させることによって得られる［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記伸長化産物の一方の鎖が前記第２の増幅用配列の相補鎖、前記第１’の配列及び前記第１の増幅用配列を含み、他方の鎖が前記第２の増幅用配列、前記第１’の配列の相補鎖及び前記第１の増幅用配列の相補鎖を含む二本鎖ＤＮＡである［３］に記載の方法。
［５］
前記伸長化産物に結合するプライマーセットは、前記伸長化産物の前記第１の増幅用配列又はその相補鎖に結合するための第１のプライマー及び前記伸長化産物の前記第２の増幅用配列又はその相補鎖に結合するための第２のプライマーを少なくとも含む
［３］又は［４］に記載の方法。
［６］
前記標的ＲＮＡが、短鎖ＲＮＡである［１］〜［５］の何れか１つに記載の方法。
［７］
前記増幅反応条件が、等温増幅反応条件である［１］〜［６］の何れか１つに記載の方法。
［８］
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼ又はその組み合わせである［３］に記載の方法。
［９］
試料中の、第１の配列を含む標的ＲＮＡを検出する方法であって、
［１］〜［８］の何れか１つに記載のＲＮＡ増幅方法の前記工程（ａ）〜（ｄ）を実行すること、及び
工程（ｅ）前記工程（ｄ）の前記増幅反応条件下での維持中又は維持後に、得られた増幅産物を検出すること
を含むＲＮＡ検出方法。
［１０］
試料中の第１の配列を含む標的ＲＮＡを増幅又は検出するためのアッセイキットであって、
前記第１の配列を逆転写するための逆転写プライマー；
逆転写酵素；
伸長化産物を得るための伸長化プライマー；
前記伸長化産物に結合するためのプライマーを含む前記伸長化産物に結合するプライマーセット；及び
Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一方
を含むアッセイキット。
［１１］
前記逆転写プライマーは、前記第１の配列を逆転写するためのプライマー配列及び第１の増幅用配列をこの順番で含み、前記第１の配列を逆転写して前記第１の配列と相補的な第１’の配列を含む逆転写産物を得るためのプライマーであり、
前記伸長化プライマーは、前記逆転写産物の３’末端を含む連続した配列と相補的な伸長化プライマー配列及び第２の増幅用配列をこの順番で含み、前記逆転写産物とハイブリダイズして、前記伸長化プライマー及び前記逆転写産物を互いを鋳型として伸長化させて、一方の鎖が前記第２の増幅用配列の相補鎖、前記第１’の配列及び前記第１の増幅用配列を含み、他方の鎖が前記第２の増幅用配列、前記第１’の配列の相補鎖及び前記第１の増幅用配列の相補鎖を含む伸長化産物を得るためのプライマーであり、
前記伸長化産物に結合するプライマーセットは、前記伸長化産物の前記第１の増幅用配列又はその相補鎖に結合するためのプライマー及び前記伸長化産物の前記第２の増幅用配列又はその相補鎖に結合するためのプライマーを含む
［１０］に記載のアッセイキット。
［１２］
更にＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼとは異なるＤＮＡポリメラーゼを含む［１０］又は［１１］に記載のアッセイキット。
［１３］
前記伸長化産物に結合するプライマーセットが、等温増幅プライマーセットである［１０］〜［１２］の何れか１つに記載のアッセイキット。

Claims (13)

1. 試料中の、第１の配列を含む標的ＲＮＡを増幅する方法であって
   工程（ａ）前記標的ＲＮＡ中の前記第１の配列を逆転写して前記第１の配列と相補的な第１’の配列を含む逆転写産物を得ること、
   工程（ｂ）前記逆転写産物と前記標的ＲＮＡとを解離させること、
   工程（ｃ）伸長化プライマー及び前記逆転写産物をハイブリダイズさせ、前記伸長化プライマー及び前記逆転写産物を伸長化させて、前記第１’の配列及び／又はその相補鎖を含む二本鎖ＤＮＡの伸長化産物を得ること、並びに
   工程（ｄ）前記伸長化産物と、前記伸長化産物に結合するプライマーセットと、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一方とを含む増幅反応液を増幅反応条件下で維持すること、それによって前記伸長化産物を鋳型として前記第１’の配列及び／又はその相補鎖を増幅すること
   を含むＲＮＡ増幅方法。
2. 前記工程（ａ）における前記逆転写産物が、前記試料と、逆転写プライマー配列及び第１の増幅用配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む逆転写プライマーと、逆転写酵素とを含む逆転写反応液を逆転写反応条件下に維持することによって得られる請求項１に記載の方法。
3. 前記工程（ｃ）における前記伸長化産物は、前記逆転写産物と、前記逆転写産物の３’末端を含む連続した配列と相補的な伸長化プライマー配列及び第２の増幅用配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む伸長化プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む伸長化反応液を伸長化反応条件下に維持し、前記伸長化プライマー及び前記逆転写産物をハイブリダイズさせ、前記伸長化プライマー及び前記逆転写産物を互いを鋳型として伸長化させることによって得られる請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記伸長化産物の一方の鎖が前記第２の増幅用配列の相補鎖、前記第１’の配列及び前記第１の増幅用配列を含み、他方の鎖が前記第２の増幅用配列、前記第１’の配列の相補鎖及び前記第１の増幅用配列の相補鎖を含む二本鎖ＤＮＡである請求項３に記載の方法。
5. 前記伸長化産物に結合するプライマーセットは、前記伸長化産物の前記第１の増幅用配列又はその相補鎖に結合するための第１のプライマー及び前記伸長化産物の前記第２の増幅用配列又はその相補鎖に結合するための第２のプライマーを少なくとも含む
   請求項３又は４の何れか１項に記載の方法。
6. 前記標的ＲＮＡが、短鎖ＲＮＡである請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
7. 前記増幅反応条件が、等温増幅反応条件である請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
8. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼ又はその組み合わせである請求項３に記載の方法。
9. 試料中の、第１の配列を含む標的ＲＮＡを検出する方法であって、
   請求項１〜８の何れか１項に記載のＲＮＡ増幅方法の前記工程（ａ）〜（ｄ）を実行すること、及び
   工程（ｅ）前記工程（ｄ）の前記増幅反応条件下での維持中又は維持後に、得られた増幅産物を検出すること
   を含むＲＮＡ検出方法。
10. 試料中の第１の配列を含む標的ＲＮＡを増幅又は検出するためのアッセイキットであって、
    前記第１の配列を逆転写するための逆転写プライマー；
    逆転写酵素；
    伸長化産物を得るための伸長化プライマー；
    前記伸長化産物に結合するためのプライマーを含む前記伸長化産物に結合するプライマーセット；及び
    Ｔｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一方
    を含むアッセイキット。
11. 前記逆転写プライマーは、前記第１の配列を逆転写するためのプライマー配列及び第１の増幅用配列をこの順番で含み、前記第１の配列を逆転写して前記第１の配列と相補的な第１’の配列を含む逆転写産物を得るためのプライマーであり、
    前記伸長化プライマーは、前記逆転写産物の３’末端を含む連続した配列と相補的な伸長化プライマー配列及び第２の増幅用配列をこの順番で含み、前記逆転写産物とハイブリダイズして、前記伸長化プライマー及び前記逆転写産物を互いを鋳型として伸長化させて、一方の鎖が前記第２の増幅用配列の相補鎖、前記第１’の配列及び前記第１の増幅用配列を含み、他方の鎖が前記第２の増幅用配列、前記第１’の配列の相補鎖及び前記第１の増幅用配列の相補鎖を含む伸長化産物を得るためのプライマーであり、
    前記伸長化産物に結合するプライマーセットは、前記伸長化産物の前記第１の増幅用配列又はその相補鎖に結合するためのプライマー及び前記伸長化産物の前記第２の増幅用配列又はその相補鎖に結合するためのプライマーを含む
    請求項１０に記載のアッセイキット。
12. 更にＴｉｎ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ及びＢｓｍＤＮＡポリメラーゼとは異なるＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１０又は１１記載のアッセイキット。
13. 前記伸長化産物に結合するプライマーセットが、等温増幅プライマーセットである請求項１０〜１２の何れか１項に記載のアッセイキット。

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