JP2018153105A - 固定化ポリメラーゼによる修飾ポリヌクレオチド合成法 - Google Patents
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Abstract
Description
メラーゼが電極上の固定支持体に固定化されたバイオセンサが示されている。
[1]鋳型ポリヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチド、修飾核酸を含む核酸基質および核酸ポリメラーゼを含む反応液を用いて核酸増幅反応を行う、修飾核酸を含むポリヌクレチドの合成方法であって、前記核酸ポリメラーゼがタグ配列を有し、タグ配列を介して担体に固定化されていることを特徴とする方法。
[2]タグがビオチンアクセプター配列であり、前記核酸ポリメラーゼはビオチンリガーゼを発現する宿主において産生されたものである、[1]に記載の方法。
[3]修飾核酸がホスホロチオエートまたは下記のKS9である、[1]または[2]に記載の方法。
本発明の方法は、鋳型ポリヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチド、修飾核酸を含む核酸基質および核酸ポリメラーゼを含む反応液を用いて核酸増幅反応を行う、修飾核酸を含むポリヌクレチドの合成方法であって、前記核酸ポリメラーゼがタグ配列を有し、タグ配列を介して担体に固定化されていることを特徴とする方法である。
ポリメラーゼが好ましい。また、PCR反応により増幅を行う場合は耐熱性DNAポリメラーゼが好ましい。より具体的には、Taq DNA ポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific)、Tth DNA ポリメラーゼ(東洋紡)、Vent(exo-) DNA ポリメラーゼ(New England Biolabs)、KOD Dash DNA ポリメラーゼ(東洋紡)などを用いることができる。DNAポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異体が好ましい。
また、1μLあたりの核酸ポリメラーゼの固定化量は0.65〜8.8pmolが好ましい。
タグ親和性部分を有するアフィニティ担体としては、コバルト担体、ニッケル担体等の金属キレート担体、グルタチオン結合担体、マルトース結合担体、S-protein結合担体、抗
体結合担体等が挙げられる。
また、タグとしてHAタグ、FLAGタグ、Mycタグ、GFPタグなどを使用し、アフィニティ担体として、抗HA抗体結合担体、抗FLAG抗体結合担体、抗Mycタグ抗体結合担体、抗GFP抗体結合担体等の抗体結合担体を使用してポリメラーゼを担体に固定化することもできる。
ムのようなビオチンリガーゼを発現する宿主細胞で発現と同時にビオチンがAviTagに結合
した状態で発現され、(ストレプト)アビジン結合担体に固定化される態様が挙げられる。
た核酸(例えば、色素(アクリジン誘導体など)などのインターカレーターを導入した核酸、光架橋性化合物(ソラレン誘導体など)を導入した核酸など)、その他修飾核酸(LNA、BNAなど)などを例示することができる。
使用することもできる。
体でもよい。
体でもよい。
なお、本発明の核酸誘導体を用いて合成されるポリヌクレオチドは一本鎖でも二本鎖でもよい。
ができる。具体的には、修飾核酸を含む核酸基質、鋳型ポリヌクレオチド及びプライマーオリゴヌクレオチドを含む反応液に担体に固定化された核酸ポリメラーゼを加え、反応プログラムに応じて温度を制御することにより核酸合成を行うことができる。
鋳型DNAとしては、天然のDNA、化学合成したDNA又は天然のRNAを逆転写して形成されたcDNAなどを挙げることができ、その長さは特に制限されないが、例えば、50〜200である
。
プライマーの配列も鋳型の増幅したい領域の配列によって適宜設計することができる。得られた修飾核酸は必要に応じ、担体と分離、精製される。
図1に発現させたDNAポリメラーゼの模式図を示す。
KOD exo(-) AviTagは以下のようにして発現させた。
pAviTag C-His Kan Vector DNA(Lucigen)に組み込んだKOD exo(-)遺伝子(WO 2016153053)をBiotin CellF’Chemically Component Cells(Lucigen)に混ぜ、ヒートショック法
によって導入し、LB/Km(30μg/mL)プレートにまいて37℃で静置した。生えてきた
コロニーをLB培地/1%グルコース/Km(30μg/mL)にうえて37℃で振とうした。OD600 0.4〜0.6に到達した時点で20% L-ラムノース,50mM ビオチンを1/100 vol添加し、10%-アラビノースを1/1000 vol添加し、培養温度を30℃に変更して発現誘導を行った。誘
導物質を添加して6時間後に培養液を遠心して上清を除去し、大腸菌を回収した。大腸菌
は−80℃で保存して、精製の際に融解した。
発現誘導8時間の培養液を、遠心(3000g, 15分間)を行い、上清(培地)と沈殿物(菌体)に分けた。沈殿物は緩衝液(10mM リン酸ナトリウム, 100mM NaCl, 1mM ジチオトレイトール, 10%グリセロール)に懸濁し、超音波によって菌体を破砕した。破砕溶液は、遠心(8000g, 5分間)して沈殿物と上清に分けた。上清を0.45μm PVDFメンブレンフィルター(Millipore)に通すことで、微粒子を除去した。得られた溶液は、Hitrap Heparin HP Columns (5mL)(GE health care)を用いて、AKTA (GE health care)で精製した。カラムに吸着したKOD exo(-) AviTagについて、緩衝液(10mM リン酸ナトリウム, 100mM NaCl, 1mM ジチオトレイトール, 10%グリセロール)のNaCl濃度を100mM→2Mへ徐々に上げることで、溶出画分にKOD
exo(-) AviTagのピークを得た。溶出画分は、Amicom Ultra4 (30K) (Millipore)を用い
た限外ろ過によって濃縮後、緩衝液の置換を行い、最終的に保存緩衝液(50mM Tris-HCl, 50mM KCl, 50%グリセロール, 0.1% Tween#20, 0.1% Nonidet p40, pH 8.0)に溶解させて-20℃で保存した。KOD exo(-) AviTagの濃度は、ブラッドフォード法によって決定し保存
緩衝液で目的の濃度に希釈して反応に用いた。
発現誘導した大腸菌のSDS-PAGE
発現誘導8時間の培養液をサンプリングし、遠心(3000g, 15分間)を行い、上清(培地)と沈殿物(菌体)に分けた。沈殿物は緩衝液(10mM リン酸ナトリウム, 100mM NaCl, 1mM ジチオトレイトール, 10%グリセロール)に懸濁し、超音波によって菌体を破砕した。遠心によって上清と沈殿物に分けた。上清は、トリクロロ酢酸(最終10%)を加え、氷浴中で30分間イ
ンキュベートした。その後、遠心(12000g, 5分間)を行い、タンパク質の沈殿を得た。こ
のタンパク質の沈殿に緩衝液(10mM リン酸ナトリウム, 100mM NaCl, 1mM ジチオトレイトール, 10%グリセロール)とSDS サンプル緩衝液(125mM Tris-HCl, 4% SDS, 50%グリセロール, 0.02%ブロモフェノールブルー, pH 6.8)を加えて、95℃3分間加熱した。沈殿物は、SDSサンプル緩衝液(62.5mM Tris-HCl, 2% SDS, 25%グリセロール, 0.01%ブロモフェノールブルー, pH 6.8)を加えて、95℃3分間加熱した。また、分子量マーカーとしてUnsteined protein ladder Broad range (10-250 kDa)を用いた。KOD exo(-) AviTag精製過程で得られたカラムを通過したスルー画分は、SDS サンプル緩衝液(125mM Tris-HCl, 4% SDS, 50%グリセロール, 0.02%ブロモフェノールブルー, pH 6.8)を加えて、95℃3分間加熱した。
精製後のKOD exo(-) AviTagは、母液から10倍, 100倍, 1000倍希釈を行い、SDS サンプル緩衝液(125mM Tris-HCl, 4% SDS, 50%グリセロール, 0.02%ブロモフェノールブルー, pH 6.8)を加え、95℃3分間加熱した。泳動は、10%SDS-PAGEを用いて、20mA, 45分間, 室温で行った。泳動後、固定化(40%メタノール,10%酢酸)で30分間行い、染色(CBB)を1時間行った後、洗浄(40%メタノール,10%酢酸)30分間行った。
図2のレーン5-7は、精製後のポリメラーゼ(KOD exo(-) AviTag)であるが、レーン2(上清)やレーン3(沈殿物)のバンドと見比べると、シングルバンドとなっており、精製されていることが分かる。
Streptavidin beadsへのKOD exo(-) AviTagの結合
Streptavidin beadsへのKOD exo(-) AviTagの結合の概要を図3に示した。
行った。置換後は、保存緩衝液に入れて-20℃で反応に使用するまで保存した。反応に使
用する際は、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回行い、反応に用いた。なお、このStreptavidin Mag Sepharoseの作り方を基準として、KOD exo(-) AviTagの濃度を薄くし、結合量を変えたものを作製した。
洗浄を2回行い、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回行った。置換後は、保存緩衝液に入れて-20℃で反応に使用するまで保存した。反応に使用する際は、1×KOD Dash 添付緩衝
液で置換を2回行い、反応に用いた。
加え、1×KOD Dash 添付緩衝液42 μL加えた。30分間、室温で転倒混和を行った。その後、Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、上清を除き、1×Tris緩衝液で
洗浄を2回行い、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回行った。置換後は、保存緩衝液に入れて-20℃で反応に使用するまで保存した。反応に使用する際は、1×KOD Dash 添付緩衝
液で置換を2回行い、反応に用いた。
置換後は、保存緩衝液に入れて-20℃で反応に使用するまで保存した。反応に使用する際
は、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回行い、反応に用いた。
ビーズを用いたPCRの概要を図4に示す。
ドの合成
・1回目の反応溶液の調製
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag [1])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([1]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM TTP 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
リアクション[1]〜[3]は、Streptavidin Mag Sepharoseを用いているため、PCR反応液か
ら回収した。Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag [1])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([1]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM TTP 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
リアクション[1]〜[3]は、Streptavidin Mag Sepharoseを用いているため、PCR反応液か
ら回収した。Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag [1])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([1]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×添付緩衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×添付緩衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
PCR反応液を回収し、ウレア色素(7M Urea, 3mM EDTA, 0.1% BPB)を28 μL加え、95℃, 5
分間変性させた。ウェルには、各サンプル2 μLをロードし、泳動を行った。泳動は、200V, 100mA, 35分, 45℃で行った。バンドの確認は、外部レーザー(488nm)を照射して、確
認した。
KOD exo(-) AviTag
KOD exo(-) AviTag beads
dNTPs (Roche Diagnostics K. K., 日本)
KS9(特開2013-40108号公報)
DNAテンプレート(70 mer)
5′-/6-FAM/TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-(30 random bases)-TGG TCC GTG AGC CTG ACA CC-3′(配列番号1)
DNAプライマー[1] (20 mer)
5′-/6-FAM/TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-3′(配列番号2)
DNAプライマー[2] (20 mer)
5′-GGT GTC AGG CTC ACG ACG GAC CA-3′(配列番号3)
図5では、KOD exo(-) AviTag beadsにおける3回目までの天然型とKS9を用いたPCRの結果
を示した。ビーズへのポリメラーゼの結合量を変えたところ、最も濃いポリメラーゼで処理したビーズ([1])でKS9を用いたPCR反応の結果(レーン2-4)は、1回目では、目的のバン
ドが見られるが、2回目以降では、目的の位置のバンドが薄くなる。3回目では、見られなくなった。最も濃いポリメラーゼ濃度に対して1/20に希釈したポリメラーゼ濃度で処理したビーズ([2])による天然型を用いたPCRの結果(レーン5-7)は、1〜3回目共に、反応が進
んでいた。さらに、1/20に希釈したポリメラーゼ濃度で処理したビーズ([2])によるKS9を用いたPCRの結果(レーン8-10)も、1〜3回目共に、反応が進んでいた。
含むポリヌクレオチドの合成
・1回目の反応溶液の調製
ネガティブコントロール(比較例:KOD exo(-)をタグを使用せずにNHSビーズに固定化)
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) beads ([4]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
ネガティブコントロールとリアクション[1]は、Streptavidin Mag Sepharoseを用いてい
るため、PCR反応液から回収した。Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後
、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
ネガティブコントロール
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) beads ([4]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
ネガティブコントロールとリアクション[2]は、Streptavidin Mag Sepharoseを用いてい
るため、PCR反応液から回収した。Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後
、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
ネガティブコントロール
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) beads ([4]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
PCR反応液を回収し、ウレア色素(7M Urea, 3mM EDTA, 0.1% BPB)を28 μL加え、95℃, 5
分間変性させた。ウェルには、各サンプル2 μLをロードし、泳動を行った。泳動は、200V, 100mA, 35分, 45℃で行った。バンドの確認は、外部レーザー(488nm)を照射して、確
認した。
KOD exo(-) AviTag beads
KOD exo(-) beads
dNTPs (Roche Diagnostics K. K., 日本)
KS9(特開2013-40108号公報)
DNAテンプレート(70 mer)
5′-/6-FAM/TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-(30 random bases)-TGG TCC GTG AGC CTG ACA CC-3′(配列番号1)
DNAプライマー[1] (20 mer)
5′-/6-FAM/TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-3′(配列番号2)
DNAプライマー[2] (20 mer)
5′-GGT GTC AGG CTC ACG ACG GAC CA-3′(配列番号3)
図6では、KOD exo(-) AviTag beadsとKOD exo(-) beadsにおける3回目までのKS9を用い
たPCRの結果を示した。KOD exo(-)のAviTagが無い場合のビーズ([4])を用いた反応は、反応が進行しなかった(レーン2-4)。1/20に希釈したポリメラーゼ濃度で処理したビーズ([2])によるKS9を用いたPCRの結果(レーン8-10)は、1〜3回目共に、反応が進んでいた。これ
らの結果からタグ配列を介して担体に固定化された核酸ポリメラーゼを使用することで修飾核酸を含むポリヌクレオチドが効率よく増幅できることが分かった。
・1回目の反応溶液の調製
ネガティブコントロール
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 水10 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATP, dCTP 2 μL (最終濃度0.2 mM),KOD exo(-) AviTag beads [1] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを20, 30回くり返した。リアクション[1]は20サイクル, リアクション[2]は30サイクル
リアクション[1]〜[2]は、Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、1×KOD
Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag beads [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを20, 30回くり返した。リアクション[1]は20サイクル, リアクション[2]は30サイクル
リアクション[1]〜[2]は、Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、1×KOD
Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag beads [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを20, 30回くり返した。リアクション[1]は20サイクル, リアクション[2]は30サイクル
PCR反応液を回収し、ウレア色素(7M Urea, 3mM EDTA, 0.1% BPB)を28 μL加え、95℃, 5
分間変性させた。ウェルには、各サンプル2 μLをロードし、泳動を行った。泳動は、200V, 100mA, 35分, 45℃で行った。バンドの確認は、外部レーザー(488nm)を照射して、確
認した。
KOD exo(-) AviTag beads
dNTPs (Roche Diagnostics K. K., 日本)
dATPαS, dCTPαS (Jena Bioscience, ドイツ)
用いた配列
DNAテンプレート(74 mer)
5′-CAG TCC GGA TGC TCT AGA GTG ACT GGT CAA GGC GGG TAC AGG ACA CAA CGA CAC GAA TCT CGT GAA GCC GAG CG-3′(配列番号4)
DNAプライマー[1] (21 mer)
5′-/6-FAM/CGC TCG GCT TCA CGA GAT TCG-3′(配列番号5)
DNAプライマー[2] (23 mer)
5′-/Biotin/CAG TCC GGA TGC TCT AGA GTG AC-3′(配列番号6)
図6では、ホスホロチオエートを含むアプタマーの相補鎖を鋳型としたKOD exo(-) AviTag beadsのPCR反応の結果を示した。KOD exo(-) AviTag beads [2]の20サイクルの結果(レーン4-6)は、使用回数の増加に伴い、目的の位置のバンドが濃くなった。KOD exo(-) AviTag beads [2]の30サイクルの結果(レーン7-9)は、使用回数の増加に伴い、目的の位置のバンドが濃くなり、プライマーもほぼ消費されていた。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2017050614A JP7011145B2 (ja) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | 固定化ポリメラーゼによる修飾ポリヌクレオチド合成法 |
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---|---|---|---|
JP2017050614A JP7011145B2 (ja) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | 固定化ポリメラーゼによる修飾ポリヌクレオチド合成法 |
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---|---|---|---|---|
WO2011002010A1 (ja) * | 2009-07-03 | 2011-01-06 | 株式会社日立製作所 | 高感度蛍光検出デバイス |
WO2012124377A1 (ja) * | 2011-03-15 | 2012-09-20 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置 |
-
2017
- 2017-03-15 JP JP2017050614A patent/JP7011145B2/ja active Active
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2011002010A1 (ja) * | 2009-07-03 | 2011-01-06 | 株式会社日立製作所 | 高感度蛍光検出デバイス |
WO2012124377A1 (ja) * | 2011-03-15 | 2012-09-20 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
日本化学会第97春季年会予稿集, JPN6021015662, 3 March 2017 (2017-03-03), pages 2 - 42, ISSN: 0004495096 * |
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