JP2018143146A - Method for determining inosinic acid content in meat of individual cattle - Google Patents

Method for determining inosinic acid content in meat of individual cattle Download PDF

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a novel indicator that can contribute to the rapid detection of high inosinic acid content in meat of individual cattle.SOLUTION: Provided is a method of determining inosinic acid content in meat of slaughtered animals involving the detection of the presence of a mutation in the NT5E gene region of a nucleic acid specimen isolated from an individual cattle. The NT5E gene region mutation is a mutation that results in a decrease in the function of the NT5E gene or the NT5E protein coded thereby. If at least one mutation is detected on at least one allele of the NT5E gene, it is determined that the inosinic acid content in the meat of the slaughtered animal is high.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定方法、判定試薬及び判定キットに関する。   The present invention relates to a determination method, determination reagent, and determination kit for inosinic acid content in meat after slaughter in cattle individuals.

肉用牛の育種改良において、食味や香りに影響を与える肉質形質は重要な改良形質となっている。しかしながら、肉質形質は、生体では測定ができず、屠畜し熟成後に理化学分析を行うことで得られる形質であるため、容易に測定することができない。   In the breeding improvement of beef cattle, meat quality traits that affect the taste and aroma are important improved traits. However, meat quality traits cannot be measured in living organisms, and cannot be easily measured because they are traits obtained by performing physicochemical analysis after slaughtering and ripening.

イノシン酸(inosine 5'-monophosphate)は、グルタミン酸やアスパラギン酸との相乗効果により強いうま味を示すことからうま味成分として考えられており、味や香りに貢献する重要な肉質形質として知られている。また、黒毛和種集団において、屠畜後の肉中グルタミン酸含量やアスパラギン酸含量の遺伝的寄与は低いが、イノシン酸含量の遺伝的寄与は比較的高いことを本願発明者らが報告している（非特許文献1）。しかしながら、屠畜後の肉中イノシン酸含量の差を屠畜前のウシ生体で予測することができなかったため、枝肉中のイノシン酸含量が高いことが予測される個体を選抜することは困難であった。   Inosine acid (inosine 5'-monophosphate) is considered as an umami component because it exhibits a strong umami taste due to a synergistic effect with glutamic acid and aspartic acid, and is known as an important meat quality trait that contributes to taste and aroma. In addition, in the Japanese black population, the present inventors have reported that the genetic contribution of glutamic acid content and aspartic acid content in meat after slaughter is low, but the genetic contribution of inosinic acid content is relatively high. (Non-patent document 1). However, since the difference in inosinic acid content in meat after slaughter could not be predicted in bovine organisms before slaughtering, it is difficult to select individuals that are predicted to have high inosinic acid content in carcass. there were.

Sakuma et al., Estimates of genetic parameters for chemical traits of meat quality in Japanese Black cattle. Animal Science Journal. (2017) 88: 203-212.Sakuma et al., Estimates of genetic parameters for chemical traits of meat quality in Japanese Black cattle.Animal Science Journal. (2017) 88: 203-212.

ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量に差をもたらす遺伝子の変異を検出する遺伝子診断法を確立すれば、肉中イノシン酸含量の高いウシ個体を生体の状態で迅速に検出できる。本発明は、肉中イノシン酸含量の高いウシ個体の迅速な検出に貢献できる新たな指標を提供することを目的とする。   If a genetic diagnosis method for detecting a mutation in a gene that causes a difference in the inosinic acid content in meat after slaughtering in a bovine individual can be established, a bovine individual having a high inosinic acid content in meat can be rapidly detected in a living state. An object of this invention is to provide the new parameter | index which can contribute to the rapid detection of the bovine individual with high inosinic acid content in meat.

本願発明者らは、鋭意研究の結果、ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量と密接に関連する遺伝子として新規にNT5E（ecto-5'-nucleotidase）遺伝子（Gene ID: 281363）を同定することに成功し、本願発明を完成した。   As a result of intensive research, the inventors of the present application have newly identified the NT5E (ecto-5'-nucleotidase) gene (Gene ID: 281363) as a gene closely related to the inosinic acid content in meat after slaughter in cattle individuals Successfully completed the present invention.

すなわち、本発明は、ウシ個体から分離された核酸試料について、NT5E遺伝子領域における変異の有無を検出することを含む、屠畜後の肉中イノシン酸含量を判定する方法であって、前記変異は、NT5E遺伝子又はこれにコードされるNT5Eタンパク質の機能の低下をもたらす変異であり、NT5E遺伝子の少なくとも一方のアレルに少なくとも１つの前記変異が検出された場合、屠畜後の肉中イノシン酸含量が高いと判定される、方法を提供する。また、本発明は、ウシゲノム上のNT5E遺伝子領域内の少なくとも１つの変異部位を含む領域を増幅する少なくとも１組のプライマーセットを含む、屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の試薬を含む、屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定キットを提供する。さらに、本発明は、ウシ個体から分離された核酸試料について、NT5E遺伝子領域における変異の有無を検出することを含む、屠畜後の肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量を判定する方法であって、前記変異は、NT5E遺伝子又はこれにコードされるNT5Eタンパク質の機能の低下をもたらす変異であり、NT5E遺伝子の少なくとも一方のアレルに少なくとも１つの前記変異が検出された場合、屠畜後の肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量が低いと判定される、方法を提供する。   That is, the present invention is a method for determining inosinic acid content in meat after slaughter, comprising detecting the presence or absence of a mutation in the NT5E gene region for a nucleic acid sample isolated from a bovine individual, A mutation that causes a decrease in the function of the NT5E gene or the NT5E protein encoded thereby, and when at least one of the mutations is detected in at least one allele of the NT5E gene, the inosinic acid content in meat after slaughtering A method is provided that is determined to be high. The present invention also provides a determination reagent for inosinic acid content in meat after slaughter, comprising at least one primer set that amplifies a region containing at least one mutation site within the NT5E gene region on the bovine genome. Furthermore, the present invention provides a determination kit for inosinic acid content in meat after slaughter, comprising the reagent of the present invention. Furthermore, the present invention is a method for determining the inosine content and hypoxanthine content in meat after slaughter, comprising detecting the presence or absence of a mutation in the NT5E gene region for a nucleic acid sample isolated from a bovine individual, The mutation is a mutation that causes a decrease in the function of the NT5E gene or the NT5E protein encoded thereby, and when at least one of the mutations is detected in at least one allele of the NT5E gene, inosin in meat after slaughtering A method is provided wherein the content and hypoxanthine content are determined to be low.

本発明により、屠畜後の肉中イノシン酸含量の高いウシ個体を迅速に検出できる新たな方法が提供される。NT5E遺伝子又はこれにコードされるNT5Eタンパク質の機能の低下をもたらすNT5E遺伝子変異は、屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定指標となる。そのため、当該遺伝子変異を調べることで、肉用牛における肉質形質の遺伝的改良のための選抜を生体のままで迅速に進めることができる。   The present invention provides a new method capable of rapidly detecting bovine individuals with high inosinic acid content in meat after slaughter. The NT5E gene mutation that causes a decrease in the function of the NT5E gene or the NT5E protein encoded thereby serves as a determination index for inosinic acid content in meat after slaughter. Therefore, by examining the gene mutation, selection for genetic improvement of meat quality traits in beef cattle can be rapidly advanced as it is.

実施例で同定されたNT5E遺伝子の５つの一塩基置換変異について、Haploviewプログラムを用いてハプロタイプブロック構造を解析した結果である。It is the result of having analyzed the haplotype block structure using the Haploview program about five single base substitution mutation of NT5E gene identified in the Example. 実施例で同定されたNT5E遺伝子の5つの変異部分のうち1つの一塩基置換変異が含まれる領域を示す図である。四角は、変異部分を検出するためのPCRプライマーNT5E-1F及びNT5E-1Rの該当する位置、矢印の向きはプライマーの5'から3'への方向を示す。下線太字は一塩基置換変異部分の位置を示す。It is a figure which shows the area | region where one single base substitution mutation is contained among five mutation parts of NT5E gene identified in the Example. The squares indicate the corresponding positions of PCR primers NT5E-1F and NT5E-1R for detecting the mutated part, and the direction of the arrow indicates the direction from 5 ′ to 3 ′ of the primer. Underlined bold type indicates the position of the single base substitution mutation. 実施例で同定されたNT5E遺伝子の5つの変異部分のうち2つの一塩基置換変異が含まれる領域を示す図である。四角は、変異部分を検出するためのPCRプライマーNT5E-2F及びNT5E-2Rの該当する位置、矢印の向きはプライマーの5'から3'への方向を示す。下線太字は一塩基置換変異部分の位置を示す。It is a figure which shows the area | region where two single base substitution mutations are contained among five mutation parts of the NT5E gene identified in the Example. The squares indicate the corresponding positions of the PCR primers NT5E-2F and NT5E-2R for detecting the mutated part, and the direction of the arrow indicates the direction from 5 ′ to 3 ′ of the primer. Underlined bold type indicates the position of the single base substitution mutation. 実施例で同定されたNT5E遺伝子の5つの変異部分のうち2つの一塩基置換変異が含まれる領域を示す図である。四角は、変異部分を検出するためのPCRプライマーNT5E-3F及びNT5E-3Rの該当する位置、矢印の向きはプライマーの5'から3'への方向を示す。下線太字は一塩基置換変異部分の位置を示す。It is a figure which shows the area | region where two single base substitution mutations are contained among five mutation parts of the NT5E gene identified in the Example. The squares indicate the corresponding positions of the PCR primers NT5E-3F and NT5E-3R for detecting the mutated portion, and the direction of the arrow indicates the direction from 5 ′ to 3 ′ of the primer. Underlined bold type indicates the position of the single base substitution mutation. 実施例で同定されたNT5E遺伝子の変異部位付近の塩基配列の波形データである。図２に示した領域のPCR増幅断片の塩基配列を決定すると、高肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では149番目の塩基がチミンであり、低肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では149番目の塩基にシトシンがみられる。It is the waveform data of the base sequence near the mutation site | part of the NT5E gene identified in the Example. When the base sequence of the PCR-amplified fragment in the region shown in FIG. 2 is determined, the 149th base is thymine in the amplified fragment using the innoic acid content type genomic DNA in the high meat as a template, and the inosinic acid content type in the low meat A cytosine is seen at the 149th base in the amplified fragment using the genomic DNA of. 実施例で同定されたNT5E遺伝子の変異部位付近の塩基配列の波形データである。図３に示した領域のPCR増幅断片の塩基配列を決定すると、高肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では158番目の塩基がアデニンであり、低肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では158番目の塩基にチミンがみられる。It is the waveform data of the base sequence near the mutation site | part of the NT5E gene identified in the Example. When the base sequence of the PCR-amplified fragment in the region shown in FIG. 3 is determined, the 158th base is adenine in the amplified fragment using the genomic DNA of the high inosinic acid content type as a template. In the amplified fragment using the genomic DNA of thymine, thymine is seen at the 158th base. 実施例で同定されたNT5E遺伝子の変異部位付近の塩基配列の波形データである。図３に示した領域のPCR増幅断片の塩基配列を決定すると、高肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では209番目の塩基がグアニンであり、低肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では209番目の塩基にアデニンがみられる。It is the waveform data of the base sequence near the mutation site | part of the NT5E gene identified in the Example. When the base sequence of the PCR-amplified fragment in the region shown in FIG. 3 is determined, the 209th base is guanine in the amplified fragment using the genomic DNA of the high inosinic acid content type as a template, and the inosinic acid content type in the low meat Adenine is seen at the 209th base in the amplified fragment using the genomic DNA of. 実施例で同定されたNT5E遺伝子の変異部位付近の塩基配列の波形データである。図４に示した領域のPCR増幅断片の塩基配列を決定すると、高肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では82番目の塩基がチミンであり、低肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では82番目の塩基にシトシンがみられる。It is the waveform data of the base sequence near the mutation site | part of the NT5E gene identified in the Example. When the base sequence of the PCR-amplified fragment in the region shown in FIG. 4 is determined, the 82nd base is thymine in the amplified fragment using the genomic DNA of high inosinic acid content type as a template, and the inosinic acid content type of low meat A cytosine is seen at the 82nd base in the amplified fragment using the genomic DNA of. 実施例で同定されたNT5E遺伝子の変異部位付近の塩基配列の波形データである。図４に示した領域のPCR増幅断片の塩基配列を決定すると、高肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では120番目の塩基がグアニンであり、低肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAを鋳型とした増幅断片では120番目の塩基にアデニンがみられる。It is the waveform data of the base sequence near the mutation site | part of the NT5E gene identified in the Example. When the base sequence of the PCR-amplified fragment in the region shown in FIG. 4 is determined, the 120th base is guanine in the amplified fragment using the genomic DNA of the high meat inosinic acid content type as a template. Adenine is seen at the 120th base in the amplified fragment using the genomic DNA of.

本発明では、生体のウシ個体から分離された核酸試料を用いてNT5E遺伝子領域の変異を調べることにより、当該ウシ個体の屠畜後の肉中イノシン酸含量、すなわち当該ウシ個体に由来する枝肉中のイノシン酸含量を判定ないしは予測する。   In the present invention, by examining the mutation of the NT5E gene region using a nucleic acid sample isolated from a bovine individual, the inosinic acid content in meat after slaughtering the bovine individual, that is, in the carcass derived from the bovine individual Determine or predict the inosinic acid content of

本発明において、「遺伝子領域」とは、タンパク質をコードする領域と、イントロン領域と、プロモーター領域、3'-及び5'-UTR等の当該遺伝子の発現の制御に関与し得る領域とを含む、ゲノム上の連続した領域をいう。具体的には、「NT5E遺伝子領域」とは、配列番号1に示した配列を含むゲノム上の領域である。配列番号１に示す塩基配列は、ウシゲノム配列であるBtau4.6におけるアクセスナンバーNC_007307に基づいている。以下、本明細書において、NT5E遺伝子領域内の部位に言及する場合、基本的には配列番号1に示す塩基配列における位置で表すものとする。   In the present invention, the `` gene region '' includes a region encoding a protein, an intron region, a promoter region, a region that can be involved in the control of expression of the gene, such as 3′- and 5′-UTR, A continuous region on the genome. Specifically, the “NT5E gene region” is a region on the genome including the sequence shown in SEQ ID NO: 1. The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is based on access number NC_007307 in Btau 4.6, which is a bovine genome sequence. Hereinafter, in this specification, when referring to a site in the NT5E gene region, it is basically represented by a position in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.

NT5E（ecto-5'-nucleotidase）遺伝子は、細胞外にてイノシン酸からイノシンへと分解する酵素NT5E（ecto-5'-nucleotidase）をコードする遺伝子である。本発明におけるNT5E遺伝子領域の変異とは、ウシ個体において屠畜後の肉中イノシン酸分解能の低下をもたらす変異、言い換えると、NT5E遺伝子又はこれにコードされるNT5Eタンパク質の機能の低下をもたらす変異である。そのような変異には、ウシ体内でのNT5E遺伝子の発現量の低下、NT5Eタンパク質の蓄積量の低下、NT5Eタンパク質のイノシン酸分解酵素としての酵素活性の低下が包含される。   The NT5E (ecto-5′-nucleotidase) gene is a gene that encodes the enzyme NT5E (ecto-5′-nucleotidase) that degrades inosine acid to inosine outside the cell. The mutation of the NT5E gene region in the present invention is a mutation that causes a decrease in the ability to degrade inosinic acid in meat after slaughter in a bovine individual, in other words, a mutation that causes a decrease in the function of the NT5E gene or the NT5E protein encoded thereby. is there. Such mutations include a decrease in the expression level of the NT5E gene in bovine, a decrease in the accumulation amount of the NT5E protein, and a decrease in the enzyme activity of the NT5E protein as an inosinolytic enzyme.

NT5E遺伝子領域に存在する任意の変異がNT5Eタンパク質の機能の低下をもたらすかどうかは、変異の位置から判断することができる。例えば、変異がNT5Eタンパク質をコードする領域に存在しアミノ酸置換を伴う一塩基置換変異の場合、その変異は、NT5Eタンパク質の構造に影響を与える変異であると推定することができる。また、NT5E遺伝子領域における変異によりNT5E遺伝子の発現が低下するかどうかについても、変異の位置から判断することができる。例えば、変異がプロモーター領域、3'-及び5'-UTR等の当該遺伝子の発現の制御に関与し得る領域に存在する一塩基置換変異の場合、その塩基は、遺伝子発現の制御に関与している変異であると推定することができる。   Whether any mutation present in the NT5E gene region causes a decrease in the function of the NT5E protein can be determined from the position of the mutation. For example, in the case where the mutation is present in the region encoding the NT5E protein and is a single base substitution mutation accompanied by amino acid substitution, the mutation can be presumed to be a mutation that affects the structure of the NT5E protein. Further, whether or not the NT5E gene expression is decreased by mutation in the NT5E gene region can also be determined from the position of the mutation. For example, in the case of a single-base substitution mutation that exists in a region where the mutation can be involved in the control of the expression of the gene, such as a promoter region, 3′- and 5′-UTR, the base is involved in the control of the gene expression. It can be estimated that this is a mutation.

本発明におけるNT5E遺伝子領域の変異の具体例として、以下の5つの一塩基置換変異を挙げることができる。これら５つの一塩基置換は、後述する通り、非常に強い連鎖の関係にあることが確認されている。
(1) 配列番号１における1028番目（配列番号４では149番目）の塩基がシトシンからチミンになる変異
(2) 配列番号１における2773番目（配列番号７では158番目）の塩基がチミンからアデニンになる変異
(3) 配列番号１における2824番目（配列番号７では209番目）の塩基がアデニンからグアニンになる変異
(4) 配列番号１における7793番目（配列番号１０では82番目）の塩基がシトシンからチミンになる変異
(5) 配列番号１における7831番目（配列番号１０では120番目）の塩基がアデニンからグアニンになる変異 Specific examples of the NT5E gene region mutation in the present invention include the following five single-base substitution mutations. These five single-base substitutions have been confirmed to have a very strong linkage relationship, as will be described later.
(1) Mutation in which the 1028th base in SEQ ID NO: 1 (149th in SEQ ID NO: 4) changes from cytosine to thymine
(2) Mutation in which the 2773rd base in SEQ ID NO: 1 (158th in SEQ ID NO: 7) is changed from thymine to adenine
(3) Mutation in which the 2824th base in SEQ ID NO: 1 (209th in SEQ ID NO: 7) is changed from adenine to guanine
(4) Mutation in which the 7793rd base in SEQ ID NO: 1 (the 82nd in SEQ ID NO: 10) is changed from cytosine to thymine
(5) Mutation in which the base at position 7831 in SEQ ID NO: 1 (120th in SEQ ID NO: 10) is changed from adenine to guanine

もっとも、本発明で指標とし得るNT5E遺伝子の変異はこれらに限定されず、ウシ個体において屠畜後の肉中イノシン酸分解能の低下（NT5E遺伝子又はこれにコードされるNT5Eタンパク質の機能の低下）をもたらす種々のNT5E遺伝子変異が包含される。   However, the NT5E gene mutation that can be used as an index in the present invention is not limited to these, and the bovine individual has reduced inosinic acid resolution in meat after slaughter (decrease in the function of the NT5E gene or the NT5E protein encoded thereby). Various resulting NT5E gene mutations are included.

ウシ個体のゲノム上で、NT5E遺伝子の少なくとも一方のアリルに上記定義の通りの変異が少なくとも１つ検出された場合、その個体は屠畜後の肉中イノシン酸含量が高いと判定することができる。ある１つの変異に着目した場合、変異を有しない個体は肉中イノシン酸含量が低く、変異をヘテロで有する個体は肉中イノシン酸含量が中程度に高く、変異をホモで有する個体は肉中イノシン酸含量がより高いと判定することができる。複数の変異部位を調べた場合には、少なくともいずれか１箇所でホモ又はヘテロの変異が検出されれば、該個体は肉中イノシン酸含量が高いと判定してよい。   If at least one mutation as defined above is detected in at least one allele of the NT5E gene on the genome of a bovine individual, the individual can be determined to have a high inosinic acid content in the meat after slaughter. . Focusing on one mutation, individuals who do not have the mutation have a low inosinic acid content in the meat, individuals that have the mutation heterozygously have a moderately high content of inosinic acid in the meat, and individuals that have the mutation in the meat It can be determined that the inosinic acid content is higher. When a plurality of mutation sites are examined, it may be determined that the individual has a high content of inosinic acid in meat if a homo or hetero mutation is detected in at least one of the sites.

核酸試料は特に限定されず、ゲノムDNA試料、RNA試料（全RNA若しくはmRNA）、又はcDNA試料を用いることができる。ウシ個体から採取した血液等の試料より常法に従い核酸試料を調製すればよい。cDNA試料は、ウシ個体由来試料からRNAを分離し、これを鋳型とした逆転写反応により調製することができる。核酸試料としては、作業工程の簡便さから、ゲノムDNA試料を好ましく用いることができる。   The nucleic acid sample is not particularly limited, and a genomic DNA sample, an RNA sample (total RNA or mRNA), or a cDNA sample can be used. A nucleic acid sample may be prepared from a sample such as blood collected from a bovine individual according to a conventional method. A cDNA sample can be prepared by separating RNA from a bovine individual-derived sample and using this as a template for a reverse transcription reaction. As the nucleic acid sample, a genomic DNA sample can be preferably used because of the simplicity of the work process.

核酸試料を用いて遺伝子領域上の変異を調べる具体的な方法としては、例えば、核酸試料をPCR等の核酸増幅反応に付し、増幅断片の塩基配列に基づいて変異の有無を調べる方法が挙げられる。変異により2つの遺伝子型配列との間で制限酵素の認識部位に相違が生じる場合には、増幅断片の制限酵素断片長多型を解析することにより（すなわち周知のPCR-RFLP法により）変異の有無を調べることができる。また、変異の有無を別々の蛍光物質を標識して蛍光検出器で変異検出する方法などによっても調べることができる。一般には、増幅断片の塩基配列を決定して変異の有無を調べる方法がより好ましい。   As a specific method for examining a mutation in a gene region using a nucleic acid sample, for example, a method of subjecting a nucleic acid sample to a nucleic acid amplification reaction such as PCR and examining the presence or absence of a mutation based on the base sequence of the amplified fragment can be mentioned. It is done. If there is a difference in the restriction enzyme recognition site between the two genotype sequences due to the mutation, analysis of the restriction fragment length polymorphism of the amplified fragment (ie, by the well-known PCR-RFLP method) The presence or absence can be examined. In addition, the presence or absence of mutation can be examined by a method of labeling different fluorescent substances and detecting mutation with a fluorescence detector. In general, a method of determining the presence or absence of mutation by determining the base sequence of the amplified fragment is more preferable.

NT5E遺伝子領域の変異として、上記した(1)〜(5)の一塩基置換変異の有無を検出する場合であれば、当該変異部位を含むNT5E遺伝子領域の一部（50bp〜1000bp程度の領域を増幅すれば十分である）をゲノムDNA試料から核酸増幅法により増幅し、増幅断片の塩基配列を決定し、一塩基置換があるか否かを確認すればよい。そのような、NT5E遺伝子領域内の任意の変異部位を含む領域を増幅するためのプライマーセットは、ウシのNT5E遺伝子領域のゲノム配列情報（配列番号１など）に基づいて設計できる。   As a mutation in the NT5E gene region, when detecting the presence or absence of the single base substitution mutation described in (1) to (5) above, a part of the NT5E gene region including the mutation site (a region of about 50 bp to 1000 bp) Amplification is sufficient from a genomic DNA sample by a nucleic acid amplification method, the base sequence of the amplified fragment is determined, and it is confirmed whether or not there is a single base substitution. Such a primer set for amplifying a region including an arbitrary mutation site in the NT5E gene region can be designed based on the genomic sequence information (SEQ ID NO: 1 or the like) of the bovine NT5E gene region.

配列番号２に示す塩基配列のプライマーと配列番号３に示す塩基配列のプライマーとのセットは、配列番号１における1028番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットの一例である。このプライマーセットを用いてPCRを行えば、NT5E遺伝子領域のうちで図２（配列番号4）に示した領域が増幅される。この増幅断片における149番目（配列番号1においては1028番目）の塩基を比較すると、一塩基置換がない場合はシトシンであり（低肉中イノシン酸含量型）、一塩基置換がある場合はチミンである（高肉中イノシン酸含量型）。   The set of the primer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the primer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is an example of a primer set that amplifies a region on the bovine genome containing the 1028th base in SEQ ID NO: 1. When PCR is performed using this primer set, the region shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) in the NT5E gene region is amplified. Comparing the 149th base in this amplified fragment (1028 in SEQ ID NO: 1), it is cytosine when there is no single base substitution (low inosinic acid content type), and thymine when there is a single base substitution. Yes (high inosinic acid content type).

配列番号５に示す塩基配列のプライマーと配列番号６に示す塩基配列のプライマーとのセットは、配列番号１における2773番目及び2824番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットの一例である。このプライマーセットを用いてPCRを行えば、NT5E遺伝子領域のうちで図３（配列番号7）に示した領域が増幅される。この増幅断片における158番目（配列番号1においては2773番目）の塩基を比較すると、一塩基置換がない場合はチミンであり（低肉中イノシン酸含量型）、一塩基置換がある場合はアデニンである（高肉中イノシン酸含量型）。また、この増幅断片における209番目（配列番号1においては2824番目）の塩基を比較すると、一塩基置換がない場合はアデニンであり（低肉中イノシン酸含量型）、一塩基置換がある場合はグアニンである（高肉中イノシン酸含量型）。   The set of the primer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the primer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is an example of a primer set that amplifies the region on the bovine genome containing the 2773rd and 2824th bases in SEQ ID NO: 1. . When PCR is performed using this primer set, the region shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 7) in the NT5E gene region is amplified. Comparing the 158th base in this amplified fragment (2773 in SEQ ID NO: 1), if there is no single base substitution, it is thymine (low inosinic acid content type), and if there is a single base substitution, it is adenine. Yes (high inosinic acid content type). In addition, when comparing the base at position 209 (2824 in SEQ ID NO: 1) in this amplified fragment, when there is no single base substitution, it is adenine (low inosinic acid content type), and when there is a single base substitution It is guanine (high inosinic acid content type).

配列番号8に示す塩基配列のプライマーと配列番号9に示す塩基配列のプライマーとのセットは、配列番号１における7793番目及び7831番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットの一例である。このプライマーセットを用いてPCRを行えば、NT5E遺伝子領域のうちで図４（配列番号10）に示した領域が増幅される。この増幅断片における82番目（配列番号1においては7793番目）の塩基を比較すると、一塩基置換がない場合はシトシンであり（低肉中イノシン酸含量型）、一塩基置換がある場合はチミンである（高肉中イノシン酸含量型）。また、この増幅断片における120番目（配列番号1においては7831番目）の塩基を比較すると、一塩基置換がない場合はアデニンであり（低肉中イノシン酸含量型）、一塩基置換がある場合はグアニンである（高肉中イノシン酸含量型）。   The set of the primer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and the primer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 is an example of a primer set for amplifying a region on the bovine genome containing the 7793rd and 7831st bases in SEQ ID NO: 1. . When PCR is performed using this primer set, the region shown in FIG. 4 (SEQ ID NO: 10) in the NT5E gene region is amplified. Comparing the 82nd base (7793th in SEQ ID NO: 1) in this amplified fragment shows cytosine when there is no single base substitution (low inosinic acid content type), and thymine when there is a single base substitution. Yes (high inosinic acid content type). Also, comparing the 120th base in this amplified fragment (7831 in SEQ ID NO: 1), if there is no single base substitution, it is adenine (low inosinic acid content type), if there is a single base substitution It is guanine (high inosinic acid content type).

従って、これらの一塩基置換変異の有無は、簡便には、配列番号１における1028番目（配列番号4においては149番目）、2773番目（配列番号7においては158番目）、2824番目（配列番号7においては209番目）、7793番目（配列番号10においては82番目）、あるいは7831番目（配列番号10においては120番目）が何であるかを確認することによって検出することができる。   Therefore, the presence or absence of these single nucleotide substitution mutations is simply determined by the 1028th position in SEQ ID NO: 1 (149th position in SEQ ID NO: 4), 2773rd position (158th in SEQ ID NO: 7), 2824th position (SEQ ID NO: 7 209), 7793 (82nd in SEQ ID NO: 10), or 7831 (120th in SEQ ID NO: 10) can be detected for confirmation.

上記に例示した5つの一塩基置換変異は高い連鎖の関係を示している。すなわち、配列番号１における1028番目がチミン、2773番目がアデニン、2824番目がグアニン、7793番目がチミン、及び7831番目がグアニンの5つのアリル（高肉中イノシン酸含量型アリル）は強い連鎖の関係にあり、また配列番号1における1028番目がシトシン、2773番目がチミン、2824番目がアデニン、7793番目がシトシン、及び7831番目がアデニンの5つのアリル（低肉中イノシン酸含量型アリル）についても同様に強い連鎖の関係にある。前者をハプロタイプQ、後者をハプロタイプqとすると、ウシ個体は多くの場合、ハプロタイプQ/Qのホモ接合か、ハプロタイプQとqのヘテロ接合か、ハプロタイプq/qのホモ接合のいずれかに分類できる。Q/Qホモ接合のウシ個体は肉中イノシン酸含量が多く、Q/qヘテロ接合のウシ個体は肉中イノシン酸含量が中程度であり、q/qホモ接合のウシ個体は肉中イノシン酸含量が少ないと判定することができる。本発明の方法により屠畜後の肉中イノシン酸含量が多いウシを選抜したい場合には、生体のウシ個体についてハプロタイプQを多く持つ個体を選抜して交配（人工授精も含む）させればよい。   The five single base substitution mutations exemplified above show a high linkage relationship. In other words, five alleles of SEQ ID NO: 1 with thymine at 1028, adenine at 2773, guanine at 2824, thymine at 7793, and guanine at 7831 (high inosinic acid content type allele in high meat) are strongly linked. The same applies to 5 alleles (SEQ ID NO: 1 at cytosine, 2773 at thymine, 2824 at adenine, 7793 at cytosine, and 7831 at adenine). There is a strong chain relationship. If the former is haplotype Q and the latter is haplotype q, bovine individuals can often be classified as either haplotype Q / Q homozygous, haplotype Q / q heterozygous, or haplotype q / q homozygous. . Bovine individuals with Q / Q homozygos have a high inosinic acid content in meat, bovine individuals with Q / q heterozygotes have a moderate inosinic acid content in meat, and bovine individuals with q / q homozygotes have inosinic acid in meat It can be determined that the content is low. When it is desired to select cattle having a high inosinic acid content in the meat after slaughtering according to the method of the present invention, it is only necessary to select and cross (including artificial insemination) an individual having a large amount of haplotype Q among living bovine individuals. .

もっとも、配列番号１における1028番目、2773番目、2824番目、7793番目、及び7831番目の5つの一塩基置換変異間の連鎖関係の程度は、対象となるウシ集団間で異なり得るため、NT5E遺伝子の一方のアリルで必ず高肉中イノシン酸含量型アリル又は低肉中イノシン酸型アリルが揃うとは限らない。従って、本発明では、ハプロタイプQを構成するアリルを少なくとも1つでも持つ場合、肉中イノシン酸含量が多いと判定してよい。すなわち、上記した(1)〜(5)の一塩基置換のうちの少なくともいずれか1つがヘテロ又はホモで検出された場合には、そのウシ個体は屠畜後の肉中イノシン酸含量が高いと判定してよい。   However, since the degree of linkage between the five single-base substitution mutations at 1028, 2773, 2824, 7793, and 7831 in SEQ ID NO: 1 may vary among the target bovine populations, the NT5E gene One allyl does not always have a high meat inosinic acid content type allyl or a low meat inosinic acid type allyl. Therefore, in the present invention, when at least one allyl constituting haplotype Q is present, it may be determined that the inosinic acid content in meat is high. That is, when at least any one of the above-mentioned single base substitutions (1) to (5) is detected heterozygous or homozygous, the bovine individual has a high inosinic acid content in meat after slaughter. You may judge.

イノシン酸の分解産物としてイノシン及びヒポキサンチンが挙げられる。下記実施例で示したように、NT5E遺伝子変異の遺伝子型は、ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量だけでなく、ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量とも高い関連性を示す。すなわち、ハプロタイプq/qホモ接合のウシ個体は肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量が多く、ハプロタイプQ/qヘテロ接合のウシ個体は肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量がやや少なく、ハプロタイプQ/Qホモ接合のウシ個体は肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量がより少ないと判定することができる。よって、NT5E遺伝子領域の一塩基置換変異により、ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量だけでなく、肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量についてもその多寡を判定することができる。   Examples of degradation products of inosinic acid include inosine and hypoxanthine. As shown in the examples below, the genotype of the NT5E gene mutation is high not only in meat inosinic acid content after slaughter in bovine individuals but also in inosin content and hypoxanthine content in slaughtered meat in bovine individuals Show relevance. That is, haplotype q / q homozygous cattle individuals have high inosine content and hypoxanthine content in meat, and haplotype Q / q heterozygous cattle individuals have slightly less meat inosine content and hypoxanthine content, and haplotype Q / Q homozygotes. It can be determined that the mating bovine individuals have less inosine content and hypoxanthine content in meat. Therefore, by the single base substitution mutation in the NT5E gene region, not only the inosinic acid content in meat after slaughter in cattle individuals but also the inosin content and hypoxanthine content in meat can be determined.

NT5E遺伝子における上記定義の通りの変異は、屠畜後の肉中イノシン酸含量の指標となるので、ウシゲノム上のNT5E遺伝子領域内の少なくとも１つの変異部位を含む領域を増幅する少なくとも１組のプライマーセットは、屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定試薬として提供することができる。このプライマーセットは、上述した通り、屠畜後の肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量の判定試薬としても活用できる。なお、このプライマーセットは、変異を有しない配列のウシ由来の核酸試料を鋳型としたPCRに用いれば、当然ながら、変異部位に対応する部位を含む変異のない配列の増幅断片が得られる。   Since the mutation as defined above in the NT5E gene is an indicator of the content of inosinic acid in meat after slaughter, at least one set of primers that amplify a region containing at least one mutation site in the NT5E gene region on the bovine genome The set can be provided as a determination reagent for inosinic acid content in meat after slaughter. As described above, this primer set can also be used as a reagent for determining the inosine content and hypoxanthine content in meat after slaughter. In addition, if this primer set is used for PCR using a bovine-derived nucleic acid sample having a sequence without mutation as a template, an amplified fragment of a sequence without a mutation including a site corresponding to the mutation site can be obtained.

上記プライマーセットが対象とする少なくとも１つの変異部位の具体例としては、上記した５つの部位、すなわち、配列番号１における1028番目（配列番号４では149番目）の塩基、配列番号１における2773番目（配列番号７では158番目）の塩基、配列番号１における2824番目（配列番号７では209番目）の塩基、配列番号１における7793番目（配列番号１０では82番目）の塩基、及び配列番号１における7831番目（配列番号１０では120番目）の塩基から選択される少なくとも１つを挙げることができる。   Specific examples of at least one mutation site targeted by the primer set include the above-mentioned five sites, ie, the 1028th base in SEQ ID NO: 1 (149th in SEQ ID NO: 4), the 2773th in SEQ ID NO: 1 ( 158th base in SEQ ID NO: 7, 2824th base in SEQ ID NO: 1 (209th in SEQ ID NO: 7), 7793 base in SEQ ID NO: 1 (82nd in SEQ ID NO: 10), and 7831 in SEQ ID NO: 1 There may be mentioned at least one selected from the base (120th in SEQ ID NO: 10).

1028番目の塩基を増幅するためのプライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第1027番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、第1029番〜第9000番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり得る。下記実施例で用いられている、配列番号2に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号3に示す塩基配列からなるプライマーとのセットは、このようなプライマーセットの一例である。   The primer set for amplifying the 1028th base includes a forward primer that specifically hybridizes to a partial region in the region of the 1st to 1027th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and 1029 It may be a set with a reverse-side primer that specifically hybridizes to a partial region within the region of No. 9000th base. The set of the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 used in the following examples is an example of such a primer set.

2773番目の塩基を増幅するためのプライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第2772番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、第2774番〜第9000番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり得る。   The primer set for amplifying the 2773th base comprises a forward primer that specifically hybridizes to a partial region in the region of the 1st to 2772th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the 2774th It may be a set with a reverse-side primer that specifically hybridizes to a partial region within the region of No. 9000th base.

2824番目の塩基を増幅するためのプライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第2823番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、第2825番〜第9000番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり得る。   The primer set for amplifying the 2824th base includes a forward primer that specifically hybridizes to a partial region in the region of the 1st to 2823th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and 2825 It may be a set with a reverse-side primer that specifically hybridizes to a partial region within the region of No. 9000th base.

7793番目の塩基を増幅するためのプライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第7792番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、第7794番〜第9000番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり得る。   The primer set for amplifying the 7793rd base is a forward primer that specifically hybridizes to a partial region in the region of the 1st to 7792th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and 7794th It may be a set with a reverse-side primer that specifically hybridizes to a partial region within the region of No. 9000th base.

7831番目の塩基を増幅するためのプライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第7830番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、第7832番〜第9000番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットであり得る。   A primer set for amplifying the 7831st base comprises a forward primer that specifically hybridizes to a partial region in the region of the 1st to 7830th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, It may be a set with a reverse-side primer that specifically hybridizes to a partial region within the region of No. 9000th base.

なお、2773番目の塩基と2824番目の塩基は近接しているため、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第2772番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、第2825番〜第9000番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットを用いてこれら２つの部位を含む領域を増幅してもよい。下記実施例で用いられている、配列番号5に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号6に示す塩基配列からなるプライマーとのセットは、このようなプライマーセットの一例である。   Since the 2773rd base and the 2824th base are close to each other, the forward side specifically hybridizes to the partial region in the region of the 1st to 2722th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. You may amplify the area | region containing these 2 site | parts using the set of a primer and the reverse side primer which hybridizes specifically to the partial area | region in the area | region of the 28th-9000th base. The set of the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 used in the following examples is an example of such a primer set.

同様に、7793番目の塩基と7831番目の塩基も近接しているため、配列番号１に示す塩基配列中の第1番〜第7792番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーと、第7832番〜第9000番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーとのセットを用いてこれら２つの部位を含む領域を増幅してもよい。下記実施例で用いられている、配列番号8に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号9に示す塩基配列からなるプライマーとのセットは、このようなプライマーセットの一例である。   Similarly, since the 7793rd base and the 7831st base are also close, forward specifically hybridizes to a partial region in the region of the 1st to 7792th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A region containing these two sites may be amplified using a set of a side primer and a reverse primer that specifically hybridizes to a partial region in the region of the 7832nd to 9000th bases. The set of the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 used in the following examples is an example of such a primer set.

なお、「フォワード側プライマー」とは、配列表に実際に示されている塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするプライマーであり、「リバース側プライマー」とは、配列表に実際に示されている塩基配列にハイブリダイズするプライマーである。   The “forward primer” is a primer that hybridizes to the complementary strand of the base sequence actually shown in the sequence listing, and the “reverse primer” is the base actually shown in the sequence listing. A primer that hybridizes to a sequence.

「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイズの条件下において、対象とする領域にのみハイブリダイズし、その他の領域には実質的にハイブリダイズしないという意味である。「通常のハイブリダイズの条件下」とは、通常のＰＣＲのアニーリングやプローブによる検出に用いられる条件下のことをいい、例えば、Taqポリメラーゼを用いたＰＣＲの場合には、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3〜9.0)、1.5mM MgCl2といった一般的な緩衝液を用いて、54℃〜60℃程度の適当なアニーリング温度で反応を行なうことをいう。ただし、適当なアニーリング温度及びハイブリダイゼーション温度は、上記例示に限定されず、プライマー又はプローブのTm値及び実験者の経験則に基づいて定められ、当業者であれば容易に定めることができる。「実質的にハイブリダイズしない」とは、全くハイブリダイズしないか、するとしても対象とする領域にハイブリダイズする量よりも大幅に少なく、相対的に無視できる程度の微量しかハイブリダイズしないという意味である。 “Specifically hybridize” means that under normal hybridization conditions, it hybridizes only to the region of interest and does not substantially hybridize to other regions. “Normal hybridization conditions” refer to the conditions used for normal PCR annealing and probe detection. For example, in the case of PCR using Taq polymerase, 50 mM KCl, 10 mM Tris- The reaction is carried out using a general buffer solution such as HCl (pH 8.3 to 9.0) and 1.5 mM MgCl 2 at an appropriate annealing temperature of about 54 ° C. to 60 ° C. However, the appropriate annealing temperature and hybridization temperature are not limited to the above examples, and are determined based on the Tm value of the primer or probe and the empirical rule of the experimenter, and can be easily determined by those skilled in the art. “Substantially does not hybridize” means that it does not hybridize at all, or even if it is significantly less than the amount hybridized to the target region, and hybridizes only in a relatively negligible amount. is there.

そのような条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーとしては、ハイブリダイズする部分領域と完全に相補的な塩基配列を有するプライマーが好ましいが、通常、10％以下の塩基が置換した配列を有するプライマーを用いても、対象とする部分領域にハイブリダイズして増幅が起きる場合がある（ただし、「10％以下の塩基が置換した塩基配列」は、もとの塩基配列のうち3'末端の塩基以外の塩基が置換されていることが好ましい）。また、この分野で周知の通り、プライマーの5'末端側に例えば制限酵素認識配列等の任意の配列を付加しても、対象とする部分領域に特異的にハイブリダイズし、目的の領域を増幅することができる。   As a primer that specifically hybridizes under such conditions, a primer having a base sequence that is completely complementary to the hybridizing partial region is preferable, but usually a primer having a sequence in which 10% or less of the base is substituted. May cause amplification by hybridizing to the target partial region (however, “a base sequence substituted with 10% or less of the base” is the base at the 3 ′ end of the original base sequence). It is preferable that a base other than is substituted). As is well known in this field, even if an arbitrary sequence such as a restriction enzyme recognition sequence is added to the 5 ′ end of the primer, it hybridizes specifically to the target partial region and amplifies the target region. can do.

従って、配列番号1に示す塩基配列中の第1番〜第1027番塩基、第1番〜第2772番塩基、第1番〜第2823番塩基、第1番〜第7792番塩基、及び第1番〜第7830番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするフォワード側プライマーには、対象領域内の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上の塩基配列からなるプライマー、及び該塩基配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列からなるプライマー、並びにこれらのプライマーの5'末端側に付加配列を有するプライマーが包含される。すなわち、該フォワード側プライマーは、配列番号1に示す塩基配列中の第1番〜第1027番塩基、第1番〜第2772番塩基、第1番〜第2823番塩基、第1番〜第7792番塩基、及び第1番〜第7830番塩基の領域内の連続する15塩基以上の塩基配列又は該塩基配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列をその3'末端側に含むプライマーであり得る。   Accordingly, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the 1st to 1027th bases, the 1st to 2772th bases, the 1st to 2823th bases, the 1st to 7792th bases, and the first The forward primer that specifically hybridizes to a partial region in the region of the No. 7830 base, a primer comprising a base sequence of 15 bases or more, preferably 18 bases or more in the target region, and the base Primers having a base sequence in which 10% or less of the bases in the sequence are substituted, and primers having an additional sequence on the 5 ′ end side of these primers are included. That is, the forward primer is the 1st to 1027th bases, the 1st to 2772th bases, the 1st to 2823th bases, the 1st to 2823th bases, the 1st to 7792th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A primer comprising at the 3 ′ end side a base sequence of 15 or more bases in the region of No. 1 base and No. 1 to 7830 bases, or a base sequence substituted with 10% or less of the base sequences possible.

同様に、配列番号1に示す塩基配列中の第1029番〜第9000番塩基、第2774番〜第9000番塩基、第2825番〜第9000番塩基、第7794番〜第9000番塩基、及び第7832番〜第9000番塩基の領域内の部分領域に特異的にハイブリダイズするリバース側プライマーには、対象領域内の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上の塩基配列と相補的な配列からなるプライマー、及び該相補的な配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列からなるプライマー、ならびにこれらのプライマーの5'末端側に付加配列を有するプライマーが包含される。すなわち、該リバース側プライマーは、配列番号1に示す塩基配列中の第1029番〜第9000番塩基、第2774番〜第9000番塩基、第2825番〜第9000番塩基、第7794番〜第9000番塩基、及び第7832番〜第9000番塩基の領域内の連続する15塩基以上からなる塩基配列と相補的な配列又は該相補的な配列のうち10％以下の塩基が置換した塩基配列をその3'末端側に含むプライマーであり得る。   Similarly, the 1029th to 9000th base, 2774th to 9000th base, 2825th to 9000th base, 7794th to 9000th base, and the 8th base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 The reverse primer that specifically hybridizes to a partial region within the region of the 782nd to 9000th bases is a sequence complementary to the base sequence of 15 or more bases, preferably 18 or more bases in the target region. And a primer having a base sequence in which 10% or less of the complementary sequence is substituted, and a primer having an additional sequence on the 5 ′ end side of these primers. That is, the reverse side primer, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 from the 1029th to the 9000th base, the 2774th to the 9000th base, the 2825th to the 9000th base, the 7794th to the 9000th A base sequence that is complementary to a base sequence consisting of 15 bases and a base sequence consisting of 15 bases or more in the region of bases 7832 to 9000, or a base sequence in which 10% or less of the complementary sequences are substituted. It may be a primer included on the 3 ′ end side.

下記実施例で用いられている、配列番号2に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号3に示す塩基配列からなるプライマーとのセット、配列番号5に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号6に示す塩基配列からなるプライマーとのセット、及び配列番号8に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号9に示す塩基配列からなるプライマーとのセットは、実施例で同定されたNT5E遺伝子領域における一塩基置換変異を検出するための好ましいプライマーセットの一例であるが、ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定試薬に使用可能なNT5E遺伝子領域を増幅するプライマーセットはこれらに限定されない。   A set of a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the sequence shown in SEQ ID NO: 6 used in the following Examples The set consisting of the primer consisting of the base sequence and the set consisting of the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 are single nucleotide substitution mutations in the NT5E gene region identified in the Example However, the primer set for amplifying the NT5E gene region that can be used as a reagent for determining the content of inosinic acid in meat after slaughtering in cattle individuals is not limited to these primer sets.

ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定試薬は、上記したプライマーセットの少なくともいずれか１つのみからなるものであってもよいし、プライマーを緩衝液等に溶解させた形態であってもよく、また、乾燥させたプライマーと緩衝液等とをセットにした形態であってもよい。さらに、該試薬は、プライマーの分解防止等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。   The determination reagent for inosinic acid content in meat after slaughter in bovine individuals may consist of at least one of the primer sets described above, or the primer is dissolved in a buffer solution or the like. Alternatively, it may be in the form of a set of a dried primer and a buffer solution. Further, the reagent may contain various additives useful for preventing the decomposition of the primer.

上記したウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定試薬は、他の試薬類と適宜に組み合わせて、ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定キットとして提供することができる。PCR等の核酸増幅法に必要なプライマー以外の他の試薬類は周知である。例えば、該判定キットには、上記したウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定試薬のほか、核酸増幅反応の反応液を調製するための緩衝液や、耐熱性ポリメラーゼ等がさらに含まれ得る。   The above-described determination reagent for inosinic acid content in meat after slaughter in bovine individuals can be provided as a determination kit for inosinic acid content in meat after slaughtering in bovine individuals by appropriately combining with other reagents. . Reagents other than the primers necessary for nucleic acid amplification methods such as PCR are well known. For example, the determination kit further includes a determination reagent for the content of inosinic acid in meat after slaughter in the bovine individual, a buffer for preparing a reaction solution for nucleic acid amplification reaction, a heat-resistant polymerase, and the like. Can be.

以下、本発明についての実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。以下の記載では、特に説明がない場合には、J. Sambrook & D. W. Russell (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) に記載の方法、あるいはそれを適宜修飾又は改変した方法により行なった。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って行なった。   Hereinafter, it demonstrates more concretely based on the Example about this invention. However, the present invention is not limited to the following examples. In the following description, unless otherwise specified, J. Sambrook & DW Russell (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) This was carried out by the method described, or a method that was appropriately modified or modified. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, the procedures were performed according to the instructions of the attached protocol unless otherwise specified.

１．ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量に関連する遺伝子の同定
(1) ウシNT5E遺伝子の塩基配列の決定
まず、肉中イノシン酸含量に関連するウシ染色体領域を同定すべく、屠畜後の牛肉中イノシン酸の測定値が得られている黒毛和種集団（571頭）について、全常染色体をカバーする40,657個のSNPを用いて解析を行なった結果、第9番染色体上に肉中イノシン酸含量と強い関連を示す領域（肉中イノシン酸含量制御領域）が同定された。この肉中イノシン酸含量制御領域内に存在する遺伝子について、タンパク質コード領域、プロモーター領域、各遺伝子の発現制御に関与し得る3'-及び5'-UTRの領域の塩基配列を解読し、肉中イノシン酸含量と変異との関連性を調査したところ、NT5E遺伝子領域中に特に肉中イノシン酸含量の差を生じる特異的な一塩基置換変異を5カ所見出した（表1）。これら5カ所の一塩基置換変異は、配列番号1における1028番目、2773番目、2824番目、7793番目、及び7831番目の塩基であり、NCBIのdbSNPに登録されている一塩基置換変異であった。 1. Identification of genes associated with meat inosinic acid content after slaughter in cattle individuals
(1) Determination of the base sequence of bovine NT5E gene First, to identify bovine chromosomal regions related to the content of inosinic acid in meat, the Japanese black population that has obtained measured values of inosinic acid in beef after slaughter ( 571) were analyzed using 40,657 SNPs covering all autosomes, and as a result, the region on chromosome 9 shows a strong association with inosinic acid content in meat (inosinic acid content control region in meat) Was identified. For the genes present in the inosinic acid content control region in meat, the base sequences of the protein coding region, promoter region, and 3'- and 5'-UTR regions that can be involved in the expression control of each gene are decoded. When the relationship between the inosinic acid content and the mutation was investigated, five specific single-base substitution mutations were found in the NT5E gene region that caused a difference in inosinic acid content in meat (Table 1). These five single-base substitution mutations were the 1028th, 2773rd, 2824th, 7793th, and 7831th bases in SEQ ID NO: 1, and were single-base substitution mutations registered in the NCBI dbSNP.

屠畜後の牛肉中イノシン酸含量の測定は、佐久間弘典ら、Estimates of genetic parameters for chemical traits of meat quality in Japanese Black cattle. Animal Science Journal. (2017) 88: 203-212.の手法に従い、以下の通りに実施した。   Measurement of inosinic acid content in beef after slaughter was performed according to the method of Hironori Sakuma et al., Estimates of genetic parameters for chemical traits of meat quality in Japanese Black cattle.Animal Science Journal. (2017) 88: 203-212. Carried out as follows.

山形県内で飼養された黒毛和種について、屠畜後16〜19日に冷凍した第7胸椎部位のロース肉を山形県内の市場にて購入した。このロース肉のうち胸最長筋について、筋線維方向と垂直に約15g切り出した試料をミンチし、そのうち0.10gをイノシン酸測定試料として用いた。試料に超純水、N-ヘキサン、内部標準としてシチジン溶液を混合し、ホモジナイズ後、上清のヘキサン層を除去し、下層を得た。その後アセトニトリルでタンパク質を除去後、上清を0.45μmマイクロフィルターで漉し、濾過液20μlに180μlの超純水を混合した試料を高速液体クロマトグラフィーで測定し、肉中イノシン酸含量を求めた。   For Japanese black cattle bred in Yamagata Prefecture, the 7th thoracic spine loin meat frozen 16-19 days after slaughtering was purchased at a market in Yamagata Prefecture. Of this loin meat, about 15 g of the longest breast muscle was cut out in a direction perpendicular to the direction of the muscle fibers and minced, and 0.10 g of the sample was used as an inosinic acid measurement sample. The sample was mixed with ultrapure water, N-hexane, and a cytidine solution as an internal standard. After homogenization, the hexane layer of the supernatant was removed to obtain a lower layer. After removing the protein with acetonitrile, the supernatant was filtered with a 0.45 μm microfilter, and a sample in which 20 μl of the filtrate was mixed with 180 μl of ultrapure water was measured by high performance liquid chromatography to determine the inosinic acid content in the meat.

肉中イノシン酸含量と一塩基置換変異との関連性の調査は、以下の通りに実施した。まず、環境効果である性、屠畜年、屠畜月、熟成日、飼養場、及び屠畜月齢を補正した補正済み表型値を用いて、40,657個のSNPを用いて構成したゲノム関係行列を変量効果として混合モデルによるWald検定を実施した。   The investigation of the relationship between the content of inosinic acid in meat and the single base substitution mutation was performed as follows. First, a genome-related matrix composed of 40,657 SNPs, using corrected tabular values corrected for environmental effects such as sex, slaughter year, slaughter month, maturation date, farm, and slaughter age. Was subjected to Wald test using a mixed model.

検出された5カ所の一塩基置換変異のうち、配列番号1における1028番目、2773番目、及び2824番目の変異は、NT5E遺伝子のタンパク質をコードする領域に位置付けられており、すべてアミノ酸置換を伴う一塩基置換変異であった。また、配列番号1における7793番目及び7831番目の変異は、NT5E遺伝子の3'-UTRの当該遺伝子の発現の制御に関与し得る領域に位置付けられていた。これらのことから、配列番号1における1028番目、2773番目、2824番目、7793番目、及び7831番目の一塩基置換変異は、屠畜後の肉中イノシン酸含量の差を生じる変異であることが示唆された。   Of the five single nucleotide substitution mutations detected, the 1028th, 2773rd, and 2824th mutations in SEQ ID NO: 1 are located in the region encoding the protein of the NT5E gene and are all accompanied by amino acid substitutions. It was a base substitution mutation. In addition, the 7793rd and 7831st mutations in SEQ ID NO: 1 were located in a region that can be involved in the regulation of the expression of the 3′-UTR of the NT5E gene. From these, it is suggested that the 1028th, 2773rd, 2824th, 7793th, and 7831th single nucleotide substitution mutations in SEQ ID NO: 1 are mutations that cause a difference in inosinic acid content in meat after slaughtering It was done.

(2) ウシNT5E遺伝子領域内の一塩基置換変異の連鎖の程度
検出された5カ所の一塩基置換変異について、一塩基置換変異間の連鎖の程度を示す連鎖不平衡係数r2値(%)（値は0〜100の範囲であり、100に近いほど連鎖の程度が高い）を求めたところ、一塩基置換変異間のr2値の範囲は80〜100と高い連鎖の関係を示していた（図1）。配列番号1における1028番目ではチミン、2773番目ではアデニン、2824番目ではグアニン、7793番目ではチミン、及び7831番目ではグアニンの5つのアリルは非常に高い連鎖の関係にあった。また、配列番号1における1028番目ではシトシン、2773番目ではチミン、2824番目ではアデニン、7793番目ではシトシン、及び7831番目ではアデニンの5つのアリルについても同様に非常に高い連鎖の関係にあった。 (2) Degree of linkage of single-base substitution mutations in the bovine NT5E gene region About the five single-base substitution mutations detected, linkage disequilibrium coefficient r 2 value indicating the degree of linkage between single-base substitution mutations (%) (The value ranges from 0 to 100, the closer to 100, the higher the degree of linkage), and the r 2 value range between single base substitution mutations showed a high linkage relationship of 80 to 100 (Figure 1). In SEQ ID NO: 1, the five alleles of thymine at position 1028, adenine at position 2773, guanine at position 2824, thymine at position 7793, and guanine at position 7831 were very highly linked. Similarly, 5 alleles of cytosine in SEQ ID NO: 1 were cytosine, 2773 was thymine, 2824 was adenine, 7793 was cytosine, and 7831 was adenine.

図1は、Haploviewプログラム(Barrett et al.. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. (2005) 21: 263-265)により作成した。   FIG. 1 was prepared by the Haploview program (Barrett et al. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. (2005) 21: 263-265).

(3) NT5E遺伝子変異が牛肉中イノシン酸含量、イノシン含量、及びヒポキサンチン含量に及ぼす影響
NT5E遺伝子変異の遺伝子型と牛肉中イノシン酸含量との関係を調べるため、上記で示した黒毛和種571頭の肉中イノシン酸含量と、高い連鎖の関係にある5カ所の一塩基置換のうちの第1028番の一塩基置換変異の遺伝子型との関係を比較した。その結果、表２に示す通り、当該第1028番塩基がホモでチミンであるウシ個体が最も肉中イノシン酸含量が高く、ホモでシトシンのウシ個体が最も肉中イノシン酸含量が低く、チミン／シトシンヘテロ型のウシ個体では肉中イノシン酸含量が中等度に高いことがわかった。すなわち、配列番号1における第1028番の一塩基置換変異のアリルであるチミンをゲノム上に多く有するウシ個体はシトシンを多く有するウシ個体に比べて屠畜後の肉中イノシン酸含量が有意に高いことがわかった。 (3) Effects of NT5E gene mutation on inosinic acid content, inosine content and hypoxanthine content in beef
In order to investigate the relationship between the genotype of NT5E gene mutation and the content of inosinic acid in beef, among the 571 Kuroge Japanese beef inosinic acid contents shown above, the 5 single-base substitutions that are highly linked Were compared with the genotype of the 1028 single nucleotide substitution mutation. As a result, as shown in Table 2, a bovine individual whose base 1028 is homozygous and thymine has the highest inosinic acid content in meat, and a homozygous and cytosine bovine individual has the lowest inosinic acid content in meat, Cytosine heterozygous cows were found to have moderately high inosinic acid content in meat. That is, bovine individuals having a large amount of thymine, which is the allele of the single-base substitution mutation of number 1028 in SEQ ID NO: 1, in the genome have significantly higher inosinic acid content in meat after slaughter than bovine individuals having a large amount of cytosine I understood it.

同ウシ個体について、NT5E遺伝子変異の遺伝子型と牛肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量との関係についても同様に調べた。牛肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量は、牛肉中イノシン酸含量と同様の方法で測定した。その結果、配列番号1における第1028番の一塩基置換変異のアリルであるチミンを多く有するウシ個体はシトシンを多く有するウシ個体に比べて屠畜後の肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量が有意に低かった（表2）。このことから、NT5E遺伝子変異の遺伝子型は、牛肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量とも有意な関連性を示すことがわかった。   About the same cow individual, the relationship between the genotype of the NT5E gene mutation and the inosine content and hypoxanthine content in beef was also examined. The inosine content and hypoxanthine content in beef were measured in the same manner as the inosine acid content in beef. As a result, bovine individuals with a large amount of thymine, which is the allele of the single-base substitution mutation No. 1028 in SEQ ID NO: 1, have significantly higher inosine content and hypoxanthine content in the meat after slaughter than bovine individuals with a large amount of cytosine. It was low (Table 2). From this, it was found that the genotype of the NT5E gene mutation was significantly related to the inosine content and hypoxanthine content in beef.

２．ウシのゲノムDNA上のNT5E遺伝子の変異の有無の確認
ウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量に関連する変異部位を含むDNA断片を増幅するためのプライマーNT5E-1F、NT5E-1R、NT5E-2F、NT5E-2R、NT5E-3F、及びNT5E-3Rを合成した。配列表の配列番号2、3、5、6、8、及び9にそれぞれプライマーNT5E-1F、NT5E-1R、NT5E-2F、NT5E-2R、NT5E-3F、及びNT5E-3Rの塩基配列を示す。 2. Confirmation of NT5E gene mutation in bovine genomic DNA Primers NT5E-1F, NT5E-1R, NT5E for amplifying DNA fragments containing mutation sites related to inosinic acid content in meat after slaughter in cattle -2F, NT5E-2R, NT5E-3F, and NT5E-3R were synthesized. The nucleotide sequences of primers NT5E-1F, NT5E-1R, NT5E-2F, NT5E-2R, NT5E-3F, and NT5E-3R are shown in SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 6, 8, and 9 in the sequence listing, respectively.

ウシ個体の肉片からフェノール・クロロホルム法によりゲノムDNAを抽出した。第1028番チミンをホモに持ち肉中イノシン酸含量が高いウシ個体群に由来するゲノムDNAを高肉中イノシン酸含量型のゲノムDNA、第1028番シトシンをホモに持ち肉中イノシン酸含量が低いウシ個体群に由来するゲノムDNAを低肉中イノシン酸含量型のゲノムDNAとした。これらのゲノムDNAを鋳型とし、プライマーNT5E-1F及びNT5E-1R、NT5E-2F及びNT5E-2R、並びにNT5E-3F及びNT5E-3Rを用いたPCR(98℃で10秒、55℃で30秒、68℃で40秒間からなる工程を1サイクルとした30サイクル反応)を行い、3130蛍光DNAシークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いてPCR生成物の塩基配列を決定し、高肉中イノシン酸含量型DNAと低肉中イノシン酸含量型DNAとの間で各塩基置換部位の塩基を比較した。   Genomic DNA was extracted from meat pieces of bovine individuals by the phenol / chloroform method. Genomic DNA derived from a bovine population with homozygous 1028 thymine and high inosinic acid content in meat High inosinic acid content type genomic DNA in bovine meat, with homozygous 1028 cytosine and low inosinic acid content in meat Genomic DNA derived from the bovine population was used as genomic DNA of low meat inosinic acid content type. Using these genomic DNAs as templates, PCR using primers NT5E-1F and NT5E-1R, NT5E-2F and NT5E-2R, and NT5E-3F and NT5E-3R (98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, Perform a 30-cycle reaction with a 40-second process at 68 ° C), determine the nucleotide sequence of the PCR product using a 3130 fluorescent DNA sequencer (Applied Biosystems), and inosinic acid content in high meat The bases of each base substitution site were compared between the type DNA and the low inosinic acid content type DNA in the meat.

図２に示した配列番号1における880〜1179番塩基の領域（配列番号４）のPCR増幅断片の配列を比較すると、上記で確認された通り、高肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片では149番目（配列番号1における1028番目）の塩基がチミン（T）であったが、低肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片ではシトシン（C）であった（図５）。   Comparing the sequences of the PCR amplified fragments in the region of bases 880 to 1179 (SEQ ID NO: 4) in SEQ ID NO: 1 shown in FIG. 2, as confirmed above, the amplified fragments derived from the inosinic acid content type in the high meat The base at position 149 (position 1028 in SEQ ID NO: 1) was thymine (T), but it was cytosine (C) in the amplified fragment derived from the low inosinic acid content type (Fig. 5).

図３に示した配列番号1における2616〜2903番塩基の領域（配列番号7）のPCR増幅断片の配列を比較すると、高肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片では158番目（配列番号1における2773番目）の塩基がアデニン（A）であったが、低肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片ではチミン（T）であった（図６）。また、209番目（配列番号1における2824番目）の塩基は、高肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片ではグアニン（G）であったが、低肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片ではアデニン（A）であった（図７）。連鎖解析結果の通り、1028番チミンに非常に強く連鎖しているアレルが高肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片で、また1028番シトシンに非常に強く連鎖しているアレルが低肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片で、それぞれ確認された。   Comparing the sequences of the PCR amplified fragments of the region from the 2616th to 2903th bases (SEQ ID NO: 7) in SEQ ID NO: 1 shown in FIG. The 2773th base was adenine (A), but it was thymine (T) in the amplified fragment derived from the low inosinic acid content type (Fig. 6). The base at position 209 (position 2824 in SEQ ID NO: 1) was guanine (G) in the amplified fragment derived from the inosinic acid content type in high meat, but adenine in the amplified fragment derived from the inosinic acid content type in low meat. (A) (FIG. 7). As shown in the results of the linkage analysis, the allele that is very strongly linked to 1028 thymine is an amplified fragment derived from the inosinic acid content type in high meat, and the allele that is very strongly linked to 1028 cytosine is inosine in low meat Each of the amplified fragments derived from the acid content type was confirmed.

図４に示した配列番号1における7712〜8306番塩基の領域（配列番号10）のPCR増幅断片の配列を比較すると、高肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片では82番目（配列番号１における7793番目）の塩基がチミン（T）であったが、低肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片ではシトシン（C）であった（図８）。また、120番目（配列番号１における7831番目）の塩基は、高肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片ではグアニン（G）であったが、低肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片ではアデニン（A）であった（図９）。連鎖解析結果の通り、1028番チミンに非常に強く連鎖しているアレルが高肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片で、また1028番シトシンに非常に強く連鎖しているアレルが低肉中イノシン酸含量型由来の増幅断片で、それぞれ確認された。   Comparing the sequences of the PCR amplified fragments in the region of 7712 to 8306 bases (SEQ ID NO: 10) in SEQ ID NO: 1 shown in FIG. 4, the amplified fragment derived from the inosinic acid content type in the high meat was the 82nd (in SEQ ID NO: 1). The 7793th base was thymine (T), but the amplified fragment derived from the low inosinic acid content type was cytosine (C) (FIG. 8). The 120th base (7831 in SEQ ID NO: 1) was guanine (G) in the amplified fragment derived from the inosinic acid content type in the high meat, but adenine in the amplified fragment derived from the inosinic acid content type in the low meat. (A) (FIG. 9). As shown in the results of the linkage analysis, the allele that is very strongly linked to 1028 thymine is an amplified fragment derived from the inosinic acid content type in high meat, and the allele that is very strongly linked to 1028 cytosine is inosine in low meat Each of the amplified fragments derived from the acid content type was confirmed.

以上より、非常に強い連鎖関係にある1028番目がチミン、2773番目がアデニン、2824番目がグアニン、7793番目がチミン、及び7831番目がグアニンの5つのアリルは全て高イノシン酸含量の指標となることが確認された。図５〜９に示すように、当該部位における塩基を調べることにより、NT5E遺伝子の高イノシン酸含量型と低イノシン酸含量型を簡便に見分けることができることが確認された。   From the above, 5 alleles with very strong linkages, thymine at 1028, adenine at 2773, guanine at 2824, thymine at 7793, and guanine at 7831 are all indicators of high inosinic acid content. Was confirmed. As shown in FIGS. 5 to 9, it was confirmed that the high inosinic acid content type and the low inosinic acid content type of the NT5E gene can be easily distinguished by examining the bases at the site.

本発明により、NT5E遺伝子はウシ個体における屠畜後の肉中イノシン酸含量に関わる遺伝子であり、ここで述べるDNA診断法で確実にNT5E遺伝子における変異の有無を判定し、ウシ個体における肉中イノシン酸含量の差を判別可能であることが明らかとなった。   According to the present invention, the NT5E gene is a gene related to the inosinic acid content in meat after slaughter in bovine individuals, and the presence or absence of mutations in the NT5E gene is reliably determined by the DNA diagnosis method described herein, and inosine in meat in bovine individuals. It became clear that the difference in acid content was distinguishable.

Claims (9)

ウシ個体から分離された核酸試料について、NT5E遺伝子領域における変異の有無を検出することを含む、屠畜後の肉中イノシン酸含量を判定する方法であって、前記変異は、NT5E遺伝子又はこれにコードされるNT5Eタンパク質の機能の低下をもたらす変異であり、NT5E遺伝子の少なくとも一方のアレルに少なくとも１つの前記変異が検出された場合、屠畜後の肉中イノシン酸含量が高いと判定される、方法。   A method for determining the content of inosinic acid in meat after slaughter, comprising detecting the presence or absence of a mutation in the NT5E gene region of a nucleic acid sample isolated from a bovine individual, wherein the mutation is in the NT5E gene or in this It is a mutation that causes a decrease in the function of the encoded NT5E protein, and when at least one of the mutations is detected in at least one allele of the NT5E gene, it is determined that the inosinic acid content in meat after slaughtering is high. Method. 下記の少なくともいずれか１つがヘテロ又はホモで検出された場合、屠畜後の肉中イノシン酸含量が高いと判定される、請求項１記載の方法。
(1) 配列番号１における1028番目（配列番号４では149番目）の塩基がシトシンからチミンになる変異
(2) 配列番号１における2773番目（配列番号７では158番目）の塩基がチミンからアデニンになる変異
(3) 配列番号１における2824番目（配列番号７では209番目）の塩基がアデニンからグアニンになる変異
(4) 配列番号１における7793番目（配列番号１０では82番目）の塩基がシトシンからチミンになる変異
(5) 配列番号１における7831番目（配列番号１０では120番目）の塩基がアデニンからグアニンになる変異 The method according to claim 1, wherein if at least one of the following is detected as hetero or homo, the inosinic acid content in meat after slaughter is determined to be high.
(1) Mutation in which the 1028th base in SEQ ID NO: 1 (149th in SEQ ID NO: 4) changes from cytosine to thymine
(2) Mutation in which the 2773rd base in SEQ ID NO: 1 (158th in SEQ ID NO: 7) is changed from thymine to adenine
(3) Mutation in which the 2824th base in SEQ ID NO: 1 (209th in SEQ ID NO: 7) is changed from adenine to guanine
(4) Mutation in which the 7793rd base in SEQ ID NO: 1 (the 82nd in SEQ ID NO: 10) is changed from cytosine to thymine
(5) Mutation in which the base at position 7831 in SEQ ID NO: 1 (120th in SEQ ID NO: 10) is changed from adenine to guanine 核酸試料がゲノムDNA試料である、請求項１又は２記載の方法。   The method according to claim 1 or 2, wherein the nucleic acid sample is a genomic DNA sample. ウシゲノム上のNT5E遺伝子領域内の少なくとも１つの変異部位を含む領域を増幅する少なくとも１組のプライマーセットを含む、屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定試薬。   A reagent for determining inosinic acid content in meat after slaughter, comprising at least one primer set that amplifies a region containing at least one mutation site within the NT5E gene region on the bovine genome. 前記少なくとも１つの変異部位は、配列番号１における1028番目（配列番号４では149番目）の塩基、配列番号１における2773番目（配列番号７では158番目）の塩基、配列番号１における2824番目（配列番号７では209番目）の塩基、配列番号１における7793番目（配列番号１０では82番目）の塩基、及び配列番号１における7831番目（配列番号１０では120番目）の塩基から選択される少なくとも１つである、請求項４記載の試薬。   The at least one mutation site is the 1028th base in SEQ ID NO: 1 (149th in SEQ ID NO: 4), the 2773rd base in SEQ ID NO: 1 (158 in SEQ ID NO: 7), the 2824th in SEQ ID NO: 1 (sequence At least one selected from the base at number 209 in number 7), the base at 7793 in sequence number 1 (the 82nd in sequence number 10), and the base at 7831 in sequence number 1 (the 120th in sequence number 10) The reagent according to claim 4, wherein 少なくとも１組のプライマーセットは、配列番号１における1028番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセット、配列番号１における2773番目の塩基及び／又は2824番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセット、配列番号１における7793番目の塩基及び／又は7831番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットから選択される少なくとも１組のプライマーセットを含む、請求項４又は５記載の試薬。   At least one primer set is a primer set that amplifies a region on the bovine genome containing the 1028th base in SEQ ID NO: 1, and a region on the bovine genome containing the 2773rd base and / or 2824th base in SEQ ID NO: 1. 6. The primer set for amplification, comprising at least one primer set selected from a primer set for amplifying a region on the bovine genome containing the 7793th base and / or the 7831st base in SEQ ID NO: 1. Reagent. 少なくとも１組のプライマーセットは、配列番号２に示す塩基配列のプライマーと配列番号３に示す塩基配列のプライマーとのセット、配列番号５に示す塩基配列のプライマーと配列番号６に示す塩基配列のプライマーとのセット、及び配列番号８に示す塩基配列のプライマーと配列番号９に示す塩基配列のプライマーとのセットから選択される少なくとも１組のセットを含む、請求項６記載の試薬。   At least one primer set consists of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6. And a set of at least one set selected from the set of the primer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and the primer of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. 請求項４〜７のいずれか１項に記載の試薬を含む、屠畜後の肉中イノシン酸含量の判定キット。   A determination kit for inosinic acid content in meat after slaughter, comprising the reagent according to any one of claims 4 to 7. ウシ個体から分離された核酸試料について、NT5E遺伝子領域における変異の有無を検出することを含む、屠畜後の肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量を判定する方法であって、前記変異は、NT5E遺伝子又はこれにコードされるNT5Eタンパク質の機能の低下をもたらす変異であり、NT5E遺伝子の少なくとも一方のアレルに少なくとも１つの前記変異が検出された場合、屠畜後の肉中イノシン含量及びヒポキサンチン含量が低いと判定される、方法。   A method for determining the content of inosine and hypoxanthine in meat after slaughter, comprising detecting the presence or absence of a mutation in the NT5E gene region for a nucleic acid sample isolated from a bovine individual, wherein the mutation comprises the NT5E gene Or a mutation that causes a decrease in the function of the encoded NT5E protein, and when at least one of the mutations is detected in at least one allele of the NT5E gene, the inosine content and hypoxanthine content in meat after slaughtering are Method determined to be low.
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