JP2018123252A - Smell enhancer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規な匂いの認識機構に基づいて様々な匂いを増強する素材に関する。 The present invention relates to a material that enhances various odors based on a novel odor recognition mechanism.
香りは、日常生活を豊かに過ごすために重要な役割を担っている。例えば、香りは料理に豊かな風味をもたらし、日用製品に賦香される香りは清潔感など様々な快さを提供している。一方で、不快な香りも重要である。健康や衛生状態が損なわれていることを一早く知らせるためにも、臭気は大きな役割を担っている。これら香りの重要さは、風邪など呼吸器系の疾患が生じた際に食事の味わいが損なわれることや、嗅覚感度を低下した高齢者がガスに賦香された匂いに気づけずに危険を被ることからも想像できる。人々に豊かな生活を提供するために、香りをより明確に感じさせる技術が構築されれば、賦香する香料の量を削減しながらも十分な効果をもたらすことができる。 The scent plays an important role in enriching daily life. For example, the fragrance brings a rich flavor to dishes, and the fragrance added to daily products provides various pleasures such as cleanliness. On the other hand, an unpleasant scent is also important. Odors play a major role in quickly reporting that health and hygiene have been compromised. The importance of these fragrances is that the taste of the meal is impaired when a respiratory illness such as a cold occurs, and the elderly who have decreased olfactory sensitivity suffer from danger without noticing the scent of gas. I can imagine it. In order to provide people with a rich life, if a technology that makes the scent feel more clearly is constructed, it is possible to achieve a sufficient effect while reducing the amount of the fragrance to be scented.
香りの原因となる匂い物質の多くは、分子量約３０〜３００の揮発性の低分子有機化合物である。それら匂い物質は、匂いの質と共に化学構造にも多様性があり、分子生物学的見地からの研究においては、しばしば化学構造に基づく分類がなされる。例えば非特許文献１においては、１２５種類の匂い物質を、アミン類、チオール類、アルコール類、エステル類、エーテル類、アルデヒド類、環状アルカン類、テルペン類、バニリン類、カンファー類、アジン類、ムスク類、ならびにケトン類およびその他、の１３グループに分類している。また特許文献１では、匂い物質をアミン類、アルコール類、アルデヒド類、ケトン類、酸、エステル類、ベンゼン類、バニリン様化合物、およびラクトン類、の９つに分類している。 Many of the odor substances that cause fragrance are volatile low-molecular organic compounds having a molecular weight of about 30 to 300. These odorous substances have a variety of chemical structures as well as odor quality, and are often classified based on chemical structures in studies from the viewpoint of molecular biology. For example, in Non-Patent Document 1, 125 kinds of odorous substances are classified into amines, thiols, alcohols, esters, ethers, aldehydes, cyclic alkanes, terpenes, vanillins, camphors, azines, musks. As well as ketones and others. Further, in Patent Document 1, odor substances are classified into nine types of amines, alcohols, aldehydes, ketones, acids, esters, benzenes, vanillin-like compounds, and lactones.
これら匂い物質は、鼻腔内最深部に広がる嗅神経細胞が有している嗅覚受容体によって認識される。嗅覚受容体は匂い物質を結合して活性化し、嗅神経細胞に電気的興奮を引き起こす。この電気的興奮が神経接続を介して高次脳へと伝達されることにより匂いが知覚される。嗅覚受容体をコードする遺伝子は、ヒトの場合約４００種類が存在する。この大きな受容体数が、上記の様々な匂いの検知を可能にする分子基盤である。これら約４００の嗅覚受容体それぞれは、異なる嗅神経細胞で発現する。一方、同じ嗅覚受容体を発現する嗅神経細胞は、嗅球における軸索の投射先において特有の同領域に収束する。このために、鼻腔内でどの嗅覚受容体が活性化されたかという情報は、発火する嗅球の領域という幾何学的な情報に反映され、失われることなく高次脳領域に伝達される。このように、個々の匂い物質に対して活性化される嗅覚受容体の組み合わせの情報が高次脳領域に伝わり、匂いの質の違いを生させるのだと考えられている。 These odor substances are recognized by olfactory receptors possessed by olfactory nerve cells that spread in the deepest part of the nasal cavity. Olfactory receptors bind and activate odorants, causing electrical excitement in olfactory neurons. This electrical excitement is transmitted to the higher brain through a nerve connection, so that an odor is perceived. In humans, there are about 400 types of genes that encode olfactory receptors. This large number of receptors is the molecular basis that allows the detection of the various odors described above. Each of these about 400 olfactory receptors is expressed in different olfactory neurons. On the other hand, olfactory neurons that express the same olfactory receptor converge in the same region specific to the projection destination of the axon in the olfactory bulb. For this reason, the information on which olfactory receptor is activated in the nasal cavity is reflected in the geometric information of the area of the olfactory bulb that ignites, and is transmitted to the higher brain area without being lost. In this way, it is thought that information on the combination of olfactory receptors activated for individual odor substances is transmitted to the higher brain region, causing a difference in odor quality.
匂いとその認識に関わる嗅覚受容体との関係については知見が蓄積されてきている。それらによると、概して嗅覚受容体は、構造的に類似した匂い物質を選択的に認識する。例えば、非特許文献１では、マウスの約一千の嗅覚受容体のうち約４５％が、化学構造的に１３グループに分類される匂い物質のうち、ただ１グループのみを認識することが示唆されている。特許文献１では、マウスの嗅覚受容体の一つＭＯＲ２１５−１が、上記９グループに分類されるいずれの匂い物質も認識せず、ムスクの香りを呈する大環ケトン構造を選択的に認識することが示されている。対照的に、非特許文献１では、１３．４％の嗅覚受容体は５〜９グループの匂い物質を認識し、特に１．８％は１０〜１２グループという、構造的に極めて幅広い匂い物質を認識することが示唆されている。これら嗅覚受容体はＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体と記述されている。代表的なＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体として、非特許文献１ではマウスＯｌｆｒ４２が挙げられている。またそのヒトの相同遺伝子であるＯＲ２Ｗ１も、非特許文献２によりＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体として挙げられている。 Knowledge has been accumulated about the relationship between odors and olfactory receptors involved in their recognition. According to them, generally olfactory receptors selectively recognize structurally similar odorants. For example, Non-Patent Document 1 suggests that about 45% of about 1,000 olfactory receptors in mice recognize only one group among odorants that are chemically structurally classified into 13 groups. ing. In Patent Document 1, one of the olfactory receptors of mice, MOR215-1, does not recognize any odorous substances classified into the above 9 groups, but selectively recognizes a macrocyclic ketone structure that exhibits a musk scent. It is shown. In contrast, in Non-Patent Document 1, 13.4% of olfactory receptors recognize 5-9 groups of odorants, and in particular 1.8% of groups of 10-12 groups of structurally very broad odorants. It has been suggested to recognize. These olfactory receptors are described as Broadly Tuned olfactory receptors. Non-patent document 1 mentions mouse Olfr42 as a representative Broadly Tuned olfactory receptor. Further, OR2W1, which is a human homologous gene, is also cited as a “Broadly Tuned” olfactory receptor by Non-Patent Document 2.
Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体という幅広い匂い物質を区別なく認識する受容体を備えることに、生物にとってどのような意義があるのだろうか。非特許文献２では、次のような仮説が提唱されている：すなわち、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、(1)検知できる匂い物質の種類を増やすためにある、(2)一つの匂い物質に対して活性化される嗅覚受容体の組み合わせパターンを増やすことに寄与し、匂い間の識別に役立っている、(3)匂いの質を伝えるのではなく、何らかの匂いが存在しているということに気付かせる役割をもつ、(4)匂いの質を伝えるのではなく、匂い物質の総合濃度を認識し知覚強度に変換する、という４つの仮説である。しかし、今のところ、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の役割は定かでない。 What significance does it have for living organisms to provide a broadly odorant receptor that recognizes a wide range of odorants, called the “Broadly Tuned Olfactory Receptor”? Non-Patent Document 2 proposes the following hypothesis: That is, “Broadly Tuned Olfactory Receptor” is (1) To increase the types of odorants that can be detected, (2) For one odorant It contributes to increasing the combination pattern of olfactory receptors activated by the odor, which helps to distinguish between odors. (3) It is noticed that some odor exists rather than telling the quality of the odor. There are four hypotheses: (4) Rather than telling the quality of the odor, it recognizes the total concentration of odorous substances and converts them into perceptual intensity. However, for now, the role of the Bloody Tuned olfactory receptor is uncertain.
特許文献２〜１３には、ＯＲ２Ｗ１を活性化させる化合物が開示されている。しかし、これらの化合物はＯＲ２Ｗ１と共に他の嗅覚受容体の活性も変化させるため、該化合物の匂いの受容にＯＲ２Ｗ１がどのような機序で寄与しているのかは明らかでない。 Patent Documents 2 to 13 disclose compounds that activate OR2W1. However, since these compounds also change the activity of other olfactory receptors together with OR2W1, it is not clear how OR2W1 contributes to the odor reception of the compounds.
従来、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の役割に関して、匂いの質を伝達するのではなく、匂いの総合的な濃度を認識して知覚強度を制御しているという仮説が提唱されていた（非特許文献２）。しかし、この仮説とともに異なる複数の仮説も提唱されており、それら仮説の検証はなされていなかった。さらに、嗅覚受容体は４００種類以上と数が多いこと、およびＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が幅広い匂い物質応答性を有することから、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体のみを活性化させて、そのときに起こる匂い感覚への影響を評価することは困難であった。そのため、従来、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の役割については、信頼できる検証結果は得られていなかった。 Conventionally, regarding the role of the “Broadly Tuned” olfactory receptor, a hypothesis has been proposed that the perceived intensity is controlled by recognizing the total concentration of odors, rather than transmitting the odor quality (Non-patent Document 2). ). However, several different hypotheses have been proposed along with this hypothesis, and the hypotheses have not been verified. Furthermore, since there are a large number of olfactory receptors, more than 400 types, and the broadly tuned olfactory receptors have a wide range of odorant responsiveness, only the budly tuned olfactory receptors are activated, and the odor sensation that occurs at that time It was difficult to assess the impact on Therefore, reliable verification results have not been obtained for the role of the widely tuned olfactory receptor.
逆説的であるが、上記の非特許文献２の仮説(4)が提示されているということは、匂いの知覚強度がどのように生み出されているのかが現在のところ不明であることを意味する。もし、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が匂いの質ではなく強度を制御しているのであれば、その活性を制御することは、香りを、その種類に関わらず、より明確に感じさせる技術として有用である。 Paradoxically, the fact that the hypothesis (4) of Non-Patent Document 2 above is presented means that it is unclear at present how the odor perception intensity is generated. . If Broadly Tuned olfactory receptors control intensity rather than odor quality, controlling their activity is useful as a technique to make the scent feel more clearly regardless of its type. .
本発明者らは、異なる構造的分類に属する様々な種類の匂い物質に対して応答するヒトのＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を同定した。さらに本発明者らは、１種類のＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体のみを選択的に活性化させる物質を見出し、これを用いたＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体単独応答モデルを構築することによって、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の役割を検証することに初めて成功した。その結果、本発明者らは、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の活性を増強させることで、各種匂い物質の匂いを鋭敏に、もしくはより強く感じられるようになることを見出した。これらの結果をもとに、本発明者らは、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を選択的に活性化する物質が、各種匂い物質の匂いの増強に使用できることを見出した。 We have identified human Bloody Tuned olfactory receptors that respond to various types of odorants belonging to different structural classifications. Furthermore, the present inventors have found a substance that selectively activates only one kind of a broadcast-tuned olfactory receptor, and by constructing a single-model of the fully-tuned olfactory receptor using this, For the first time to verify the role. As a result, the present inventors have found that the odors of various odorous substances can be felt sharply or more strongly by enhancing the activity of the Bloody Tuned olfactory receptor. Based on these results, the present inventors have found that substances that selectively activate the Broadly Tuned olfactory receptor can be used to enhance the odor of various odor substances.
本発明は、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を制御することによって、匂いの種類に関わらず匂い感覚の増強を引き起こす物質を提供する。 The present invention provides a substance that causes an increase in odor sensation regardless of the type of odor by controlling the response of the Bloody Tuned olfactory receptor.
したがって、本発明は、アルギニンを有効成分とする、匂い増強剤を提供する。 Therefore, the present invention provides an odor enhancer containing arginine as an active ingredient.
本発明の匂い増強剤は、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体に対する活性化作用に基づいて、様々な匂いを増強することができる。 The odor enhancer of the present invention can enhance various odors based on the activation effect on the Bloody Tuned olfactory receptor.
本明細書において、「嗅覚受容体ポリペプチド」とは、嗅覚受容体またはそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、「嗅覚受容体と同等の機能を有するポリペプチド」とは、嗅覚受容体と同様に、細胞膜上に発現することができ、匂い分子の結合によって活性化し、かつ活性化されると、細胞内のＧαｓもしくはＧαｏｌｆと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる機能を有するポリペプチドをいう。 In the present specification, “olfactory receptor polypeptide” refers to an olfactory receptor or a polypeptide having a function equivalent thereto, and “polypeptide having a function equivalent to an olfactory receptor” refers to an olfactory receptor and Similarly, it can be expressed on the cell membrane, activated by the binding of odor molecules, and when activated, the amount of intracellular cAMP is activated by activating adenylate cyclase in combination with intracellular Gαs or Gαolf. A polypeptide having a function of increasing
本明細書において、「Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体」とは、嗅覚受容体ポリペプチドのうち、異なる匂いを有する複数種の匂い物質に応答する嗅覚受容体をいい、より詳細には、異なる構造的分類に属する複数の匂い物質に応答する嗅覚受容体をいう。匂い物質の構造的分類の例としては、アミン類、チオール類、アルコール類、エステル類、エーテル類、アルデヒド類、環状アルカン類、テルペン類、バニリン類、カンファー類、アジン類、ムスク類、ケトン類、酸類、ベンゼン類、ラクトン類、スルフィド類などが挙げられる。本明細書におけるＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、上記構造的分類のうちの、好ましくは９群以上、より好ましくは１１群以上、さらに好ましくは１３群以上について、それらに対する応答を調べたときに、好ましくは３８％以上の群、より好ましくは７７％以上の群に対して応答する嗅覚受容体である。なお、嗅覚受容体に関する「ある構造的分類の群に対して応答する」とは、嗅覚受容体が、当該構造的分類の群に属する少なくとも１種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上の匂い物質に応答することを意味する。 As used herein, “Broadly Tuned olfactory receptor” refers to an olfactory receptor that responds to a plurality of odorants having different odors among olfactory receptor polypeptides, and more specifically, different structural classifications. An olfactory receptor that responds to a plurality of odorants belonging to. Examples of structural classification of odorous substances include amines, thiols, alcohols, esters, ethers, aldehydes, cyclic alkanes, terpenes, vanillins, camphors, azines, musks, ketones , Acids, benzenes, lactones, sulfides and the like. The “Broadly Tuned Olfactory Receptor” in the present specification is preferably selected from the above-mentioned structural classifications when the response to them is examined for preferably 9 groups or more, more preferably 11 groups or more, and even more preferably 13 groups or more. Are olfactory receptors that respond to groups of 38% or more, more preferably 77% or more. Note that “responding to a certain group of structural classifications” regarding olfactory receptors means that the olfactory receptors belong to at least one group, preferably three or more, more preferably 4 It means responding to odorants over species.
本明細書において、ある物質による「匂いの増強」および「匂いの抑制」とはそれぞれ、個体における該物質存在下での匂いに対する感受性が、該物質の非存在下での感受性と比べて強くなる現象および弱くなる現象をいう。匂いに対する感受性の強弱は、匂いに対する検出強度または検知閾値（感度）を基準に評価することができる。例えば、標的の匂いに対する検出強度が増加、または検知閾値が低下（もしくは検出感度が増加）した場合、該標的の匂いに対する感受性は増強した、すなわち該標的の匂いは増強した、と判断される。また例えば、標的の匂いに対する検出強度が低下、または検知閾値が上昇（もしくは検出感度が低下）した場合、該標的の匂いに対する感受性は抑制された、すなわち該標的の匂いは抑制された、と判断される。 In the present specification, “enhancement of odor” and “inhibition of odor” by a substance are respectively more sensitive to an odor in the presence of the substance in an individual than in the absence of the substance. It refers to phenomena and weakening phenomena. The level of sensitivity to odor can be evaluated based on the detection intensity or detection threshold (sensitivity) for odor. For example, when the detection intensity for the target odor increases or the detection threshold decreases (or the detection sensitivity increases), it is determined that the sensitivity to the target odor has increased, that is, the target odor has increased. Further, for example, when the detection intensity for the target odor is decreased or the detection threshold is increased (or the detection sensitivity is decreased), it is determined that the sensitivity to the target odor is suppressed, that is, the target odor is suppressed. Is done.
本明細書において、「匂いの増強を引き起こす物質」（いわゆる匂い増強剤）および「匂いの抑制を引き起こす物質」（いわゆる匂い抑制剤）とはそれぞれ、その物質を匂いの原因物質と併用（例えば匂いの原因物質と同時にまたは先だって使用）したときに、該匂いの原因物質の匂いを増強させる物質および抑制する物質である。匂い増強剤および匂い抑制剤は、それ自身に匂いを有していてもよい。 In the present specification, “substance causing odor enhancement” (so-called odor enhancer) and “substance causing odor suppression” (so-called odor suppressor) are each used in combination with a substance causing odor (for example, odor A substance that enhances and suppresses the odor of the causative substance of the odor when used at the same time or before). The odor enhancer and the odor suppressor may have an odor themselves.
ＯＲ２Ｗ１（olfactory receptor family 2 subfamily W member 1）は、ヒト嗅覚受容体ポリペプチドである。ＯＲ２Ｗ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の情報は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information；[www.ncbi.nlm.nih.gov]）に登録されている（GeneID:26692、protein_id：NP_112165.1）。ＯＲ２Ｗ１は、アルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体である。 OR2W1 (olfactory receptor family 2 subfamily W member 1) is a human olfactory receptor polypeptide. Information on the nucleotide sequence and amino acid sequence of OR2W1 is registered in NCBI (National Center for Biotechnology Information; [www.ncbi.nlm.nih.gov]) (GeneID: 26692, protein_id: NP — 112165.1). OR2W1 is a Broadly Tuned olfactory receptor that is activated by the binding of odor molecules belonging to alcohols, aldehydes, esters, ketones, acids, terpenes, vanillins, benzenes and lactones.
後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、アルギニンが、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１を選択的に活性化させる一方で、それ自体は匂いを呈しないことを見出した。また本発明者らは、ＯＲ２Ｗ１の活性の高さと匂いの強さとの間に関連性があることを見出した。これらの結果は、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１が匂いの質（特定の匂い）の知覚に関与しない一方、匂いの強さの知覚に関与することを示している。さらに本発明者らは、アルギニンを匂い物質と同時にもしくは該匂い物質に先立って提示すると、該匂い物質に対する検出強度または検知感度を高めることができることを確認した。したがって、アルギニンが、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１の制御を介して様々な種類の匂いを増強することができる物質であることが見出された。 As shown in the examples described below, the present inventors have found that arginine selectively activates the Broadly Tuned olfactory receptor OR2W1, while it does not exhibit an odor itself. The present inventors have also found that there is a relationship between the high activity of OR2W1 and the intensity of odor. These results indicate that the Broadly Tuned olfactory receptor OR2W1 is not involved in perception of odor quality (specific odor), but is involved in perception of odor intensity. Furthermore, the present inventors have confirmed that when arginine is presented simultaneously with or prior to the odor substance, the detection intensity or detection sensitivity for the odor substance can be increased. Thus, arginine has been found to be a substance that can enhance various types of odors through the regulation of the Bloody Tuned olfactory receptor OR2W1.
したがって本発明は、アルギニンを有効成分とする匂い増強剤を提供する。また本発明は、匂い増強剤の製造のためのアルギニンの使用を提供する。また本発明は、匂い増強のためのアルギニンの使用を提供する。また本発明は、対象にアルギニンを有効量で投与することを含む、匂い増強方法を提供する。 Therefore, the present invention provides an odor enhancer containing arginine as an active ingredient. The invention also provides the use of arginine for the production of an odor enhancer. The present invention also provides the use of arginine for odor enhancement. The present invention also provides an odor enhancement method comprising administering an effective amount of arginine to a subject.
本発明において使用されるアルギニンとしては、ｌ−アルギニンおよびｄ−アルギニンが挙げられ、これらは、いずれか一方のみが使用されても、両方組み合わせて使用されてもよい。あるいは、本発明において使用されるアルギニンは、嗅覚受容体に接触する際に遊離形態をとり得るものである限りにおいて、塩、エステル等の形態であってもよい。 Arginine used in the present invention includes l-arginine and d-arginine, and these may be used alone or in combination. Alternatively, the arginine used in the present invention may be in the form of a salt, an ester, or the like as long as it can take a free form upon contact with the olfactory receptor.
アルギニンの塩の例としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等が挙げられる。当該酸付加塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α−ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩が挙げられる。当該金属塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。当該アンモニウム塩の例としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。当該有機アミン付加塩の例としては、モルホリン、ピペリジン等の塩が挙げられる。アルギニンエステルの例としては、アルギニンエチルエステルなどが挙げられる。したがって、本発明において使用されるアルギニンは、ｌ−アルギニン、ｄ−アルギニン、およびこれらの塩もしくはエステルからなる群より選択される少なくとも１種であればよく、好ましくはｌ−アルギニンおよびその塩もしくはエステルからなる群より選択される少なくとも１種である。 Examples of arginine salts include acid addition salts, metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts, and the like. Examples of the acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, and phosphate, and acetate, maleate, fumarate, citrate, malate, lactate, α -Organic acid salts such as ketoglutarate, gluconate, caprylate and the like. Examples of the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt, zinc salt and the like. Examples of the ammonium salt include salts such as ammonium and tetramethylammonium. Examples of the organic amine addition salt include salts of morpholine, piperidine and the like. Examples of arginine esters include arginine ethyl ester. Therefore, the arginine used in the present invention may be at least one selected from the group consisting of l-arginine, d-arginine, and salts or esters thereof, preferably l-arginine and salts or esters thereof. Is at least one selected from the group consisting of
一実施形態において、本発明の匂い増強剤は、アルギニンから本質的に構成され得る。別の一実施形態において、本発明の匂い増強剤は、アルギニンを匂い増強のための有効成分として含有する組成物である。 In one embodiment, the odor enhancer of the present invention can consist essentially of arginine. In another embodiment, the odor enhancer of the present invention is a composition containing arginine as an active ingredient for enhancing odor.
本発明により増強される標的の匂いの種類としては、特に限定されず、一般的に知られる悪臭または不快臭（例えば、体臭、腋臭、口臭、糞便臭、尿臭、タバコ臭、カビ臭、生乾き臭、腐敗臭、生ごみ臭、汚水臭、排気臭、ダクト臭、排ガス臭、など）；一般的に用いられる香料（例えば、ムスク、シベット、カストリウム、アンバーグリス等の動物性香料；植物由来の精油；ローズ、ジャスミン、ネロリ、ラベンダー、クローブ、ペパーミント、サンダルウッド、シナモン、レモン、オレンジ、ベルガモット等の植物性香料、など）の香り；食品またはその材料の匂い；ならびに、その他匂いを有する物質（例えば化粧品、医薬品、洗浄剤、日用品、など）の匂いなどが挙げられる。好ましい例としては、バラの香りが挙げられ、より詳細な例としては、フェニルエチルアルコール（ＰＥＡ）によるバラの香り、が挙げられる。別の好ましい例としては、ヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）の匂いが挙げられる。 The type of target odor enhanced by the present invention is not particularly limited, and generally known malodor or unpleasant odor (for example, body odor, habit odor, halitosis, fecal odor, urine odor, tobacco odor, mold odor, freshly dried) Odor, rot odor, garbage odor, wastewater odor, exhaust odor, duct odor, exhaust gas odor, etc .; commonly used fragrances (for example, animal fragrances such as musk, civet, castrium, ambergris; plant-derived odors) Essential oils; rose, jasmine, neroli, lavender, clove, peppermint, sandalwood, cinnamon, lemon, orange, bergamot, etc.); odor of food or its ingredients; and other odorous substances ( For example, the odor of cosmetics, medicines, cleaning agents, daily necessities, etc.). Preferable examples include a rose scent, and more specific examples include a rose scent by phenylethyl alcohol (PEA). Another preferred example is the odor of hexylcinnamic aldehyde (HCA).
本発明において、アルギニンが使用される対象としては、上述した標的の匂いの増強を求めるかまたは必要とする哺乳動物が挙げられる。哺乳動物の例としては、ヒト、チンパンジー、サルなどの霊長類、ならびにマウス、ラットなどのげっ歯類が挙げられ、好ましくはヒト、マウスおよびラットが挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられる。 In the present invention, the subject to which arginine is used includes mammals that require or require the above-described target odor enhancement. Examples of mammals include primates such as humans, chimpanzees and monkeys, and rodents such as mice and rats, preferably humans, mice and rats, and more preferably humans.
本発明においてアルギニンを使用する場合の一実施形態は、以下のとおりである：まず、標的の匂いの増強を求めるかまたは必要とする対象に対し、該標的の匂いへの曝露の前もしくはそれと一緒に、アルギニンを投与して、その嗅細胞上のＯＲ２Ｗ１に適用する。このことが、該対象の該標的の匂いに対する感受性の上昇をもたらし、その結果、該対象者が標的の匂いに曝露されると、該標的の匂いを強く感じるか、より低濃度（より高感度）で感知できるようになる。 One embodiment when using arginine in the present invention is as follows: First, for a subject seeking or in need of enhanced target odor, prior to or in conjunction with exposure to the target odor Is administered arginine and applied to OR2W1 on the olfactory cells. This results in an increase in sensitivity of the subject to the target odor, so that when the subject is exposed to the target odor, the subject feels the odor of the target strongly or at a lower concentration (higher sensitivity). ) Can be detected.
ただし、アルギニンは揮発性をもたないため、対象に投与する場合は、アルギニンが対象の嗅細胞に到達するように、鼻腔内投与することが望ましい。鼻腔内投与の手段としては、例えば、アルギニンを含む液体を鼻腔内へスプレーまたは点鼻する方法、アルギニンを含む液体、ゲル、クリーム、軟膏などを鼻腔内へ塗布する方法、アルギニンを含む液体を微粒子化して噴霧し、対象に吸引させる方法、などが挙げられる。 However, since arginine has no volatility, when administered to a subject, it is desirable to administer it intranasally so that arginine reaches the olfactory cells of the subject. As a means for intranasal administration, for example, a method of spraying or nasally spraying a liquid containing arginine into the nasal cavity, a method of applying a liquid containing arginine, a gel, a cream, an ointment or the like into the nasal cavity, a liquid containing arginine as a fine particle And a method of spraying and sucking the target.
したがって、本発明による匂い増強のためのアルギニンの使用の一実施形態としては、アルギニンを含有する液体の、匂い増強のための点鼻用スプレー、点鼻液もしくは吸引用の噴霧剤などにおける使用、ならびに、アルギニンを含有する、匂い増強のための鼻腔内用のゲル、クリームもしくは軟膏などが挙げられる。あるいは、対象に対する、鼻腔内のアルギニンを増加させるようなサプリメントまたは薬剤の投与もまた、本発明による匂い増強のためのアルギニンの使用の一実施形態である。 Therefore, one embodiment of the use of arginine for enhancing odor according to the present invention includes the use of a liquid containing arginine in a nasal spray for enhancing odor, a nasal spray or a spray for inhalation, etc. In addition, nasal gel, cream or ointment containing arginine for enhancing odor may be mentioned. Alternatively, administration of supplements or drugs that increase nasal arginine to a subject is also an embodiment of the use of arginine for odor enhancement according to the present invention.
本発明で使用されるアルギニンの有効量は、対象による標的の匂いの感受性を高めることができる限り、特に限定されない。有効量は、対象や、該対象が知覚したい匂いの強度や感度に合わせて適宜調整することができる。例えば、本発明で使用されるアルギニンを含有する液体、ゲル、クリーム、軟膏等におけるアルギニン濃度は、好ましくは０．３ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上である。一方で、経済性の観点からは、該アルギニンを含有する液体、ゲル、クリーム、軟膏等におけるアルギニン濃度は、３０ｍＭ以下が好ましい。したがって、本発明で使用されるアルギニンを含有する液体、ゲル、クリーム、軟膏等におけるアルギニン濃度は、好ましくは０．３ｍＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜３０ｍＭである。 The effective amount of arginine used in the present invention is not particularly limited as long as it can increase the sensitivity of the target odor by the subject. The effective amount can be appropriately adjusted according to the target and the intensity and sensitivity of the scent that the target wants to perceive. For example, the arginine concentration in the liquid, gel, cream, ointment and the like containing arginine used in the present invention is preferably 0.3 mM or more, more preferably 10 mM or more. On the other hand, from the viewpoint of economy, the arginine concentration in the liquid, gel, cream, ointment and the like containing the arginine is preferably 30 mM or less. Therefore, the arginine concentration in the liquid, gel, cream, ointment and the like containing arginine used in the present invention is preferably 0.3 mM to 30 mM, more preferably 10 mM to 30 mM.
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途、方法等を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。 As exemplary embodiments of the present invention, the following substances, production methods, uses, methods and the like are further disclosed herein. However, the present invention is not limited to these embodiments.
〔１〕アルギニンを有効成分とする匂い増強剤。
〔２〕匂い増強剤の製造のためのアルギニンの使用。
〔３〕匂い増強のためのアルギニンの使用。
〔４〕対象の匂い増強方法であって、それを必要とする対象にアルギニンを有効量で投与することを含む、方法。
〔５〕前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項において、前記アルギニンは、ｌ−アルギニン、ｄ−アルギニン、およびこれらの塩もしくはエステルからなる群より選択される少なくとも１種である。
[1] An odor enhancer containing arginine as an active ingredient.
[2] Use of arginine for the production of an odor enhancer.
[3] Use of arginine for odor enhancement.
[4] A method for enhancing the odor of a subject, comprising administering an effective amount of arginine to a subject in need thereof.
[5] In any one of [1] to [4], the arginine is at least one selected from the group consisting of l-arginine, d-arginine, and salts or esters thereof.
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。 EXAMPLES Hereinafter, an Example is shown and this invention is demonstrated more concretely.
参考例
１）試験物質
フェニルエチルアルコール（ＰＥＡ）（２−Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）
ヘキシルシンナムアルデヒド（ＨＣＡ）（２−（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）ｏｃｔａｎａｌ）（花王株式会社）
ｌ−アルギニン（Ｗａｋｏ社）
ｄ−アルギニン（東京化成工業社）
ｌ−ヒスチジン（Ｗａｋｏ社）
Reference Example 1) Test substance Phenylethyl alcohol (PEA) (2-Phenyleneethanol; Sigma-Aldrich)
Hexylcinnamaldehyde (HCA) (2- (phenylmethylidene) octanal) (Kao Corporation)
l-Arginine (Wako)
d-Arginine (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
l-Histidine (Wako)
２）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、バリアントを含む４２７種のヒト嗅覚受容体それぞれをコードする遺伝子をクローニングした。各遺伝子は、ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に組換えた。
2) Cloning of human olfactory receptor genes Based on sequence information registered in GenBank, genes encoding 427 human olfactory receptors including variants were cloned. Each gene was cloned by PCR using human genomic DNA female (G1521: Promega) as a template. Each gene amplified by the PCR method was recombined downstream of the Flag-Rho tag sequence on the pME18S vector.
３）ｐＭＥ１８Ｓ−ヒトＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ヒトＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組み込んだ。
3) Preparation of pME18S-human RTP1S vector A gene encoding human RTP1S was incorporated into the EcoRI and XhoI sites of the pME18S vector.
４）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体４２７種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で１５分静置した。マルチウェルプレート（３８４または９６ウェルプレート、ＢｉｏＣｏａｔ）の各ウェルに、反応液を添加し、次いでＨＥＫ２９３細胞を播種した。３８４ウェルプレートには、反応液４．４μＬ、ＨＥＫ２９３細胞（２０×１０4細胞／ｃｍ2）４０μＬを添加した。９６ウェルプレートには、反応液１０μＬ、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）９０μＬを添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。対照として、嗅覚受容体を発現させない細胞（ｍｏｃｋ）を用意した。
4) Preparation of olfactory receptor-expressing cells HEK293 cells each expressing 427 types of human olfactory receptors were prepared. A reaction solution having the composition shown in Table 1 was prepared and allowed to stand for 15 minutes in a clean bench. The reaction solution was added to each well of a multiwell plate (384 or 96 well plate, BioCoat), and then HEK293 cells were seeded. To the 384 well plate, 4.4 μL of the reaction solution and 40 μL of HEK293 cells (20 × 10 4 cells / cm 2 ) were added. To the 96-well plate, 10 μL of the reaction solution and 90 μL of HEK293 cells (3 × 10 5 cells / cm 2 ) were added. The cells were cultured for 24 hours in an incubator maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 . As a control, cells that do not express olfactory receptors (mock) were prepared.
５）嗅覚受容体のルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本発明での匂い物質、試験物質、またはアンタゴニストに対する細胞の応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率または細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、匂い物質または試験物質の刺激後２．５〜４時間後に製品の操作マニュアルに従って測定を行った。ホタルルシフェラーゼ由来の発光値をウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値で除した値ｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃを算出した。下記式に従って、試験物質刺激に対する嗅覚受容体の応答性の指標としてＦｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅを、また嗅覚受容体に対するアンタゴニスト活性レベルの指標として匂い応答（％）を算出した。
Ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ＝Ｘ／Ｙ
Ｘ：試験物質単独刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
Ｙ：試験物質刺激なしの場合のｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
匂い応答（％）＝（Ｚ’−Ｙ’）／（Ｘ’−Ｙ’）×１００
Ｘ’：匂い物質単独刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
Ｙ’：匂い物質刺激なしの場合のｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
Ｚ’：匂い物質とアンタゴニストとの共刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
5) Luciferase assay of olfactory receptor The olfactory receptor expressed in HEK293 cells increases the amount of intracellular cAMP by coupling with intracellular Gαs and activating adenylate cyclase. In the present invention, a luciferase reporter gene assay was used to measure the response of cells to odorants, test substances, or antagonists, monitoring the increase in intracellular cAMP level as a luminescence value derived from the firefly luciferase gene (fluc2P-CRE-hygro). . In addition, a renilla luciferase gene fused to the downstream of the CMV promoter (hRluc-CMV) was simultaneously introduced, and used as an internal standard for correcting errors in gene transfer efficiency or cell number. The activity of luciferase was measured using a Dual-Glo ™ luciferase assay system (Promega) and measured according to the operation manual of the product 2.5 to 4 hours after stimulation of the odorant or test substance. A value fLuc / hRluc obtained by dividing the luminescence value derived from firefly luciferase by the luminescence value derived from Renilla luciferase was calculated. According to the following formula, Fold increase was used as an index of olfactory receptor responsiveness to test substance stimulation, and odor response (%) was calculated as an index of antagonist activity level to olfactory receptor.
Fold increase = X / Y
X: fLuc / hRluc induced by single test substance stimulation
Y: fLuc / hRluc without test substance stimulation
Odor response (%) = (Z′−Y ′) / (X′−Y ′) × 100
X ′: fLuc / hRluc induced by odorant single stimulation
Y ′: fLuc / hRluc without odor substance stimulation
Z ′: fLuc / hRluc induced by costimulation of odorant and antagonist
実施例１ Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１の応答
構造的分類の異なる様々な匂い物質に対する嗅覚受容体の応答選択性を調べた。本実施例では、化学構造の共通性に基づく１１群（アルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類、ムスク類、環状アルカン類、ラクトン類、各群はそれぞれ３種類の匂い物質を含む）からの３３種類の化合物を匂い物質として用いた。
Example 1 Response of Broadly Tuned Olfactory Receptor OR2W1 The response selectivity of the olfactory receptor to various odorants having different structural classifications was examined. In this example, 11 groups (alcohols, aldehydes, esters, ketones, acids, terpenes, vanillins, benzenes, musks, cyclic alkanes, lactones, each group based on common chemical structure) 33 kinds of compounds from each containing 3 kinds of odor substances) were used as odor substances.
各匂い物質のＤＭＥＭ溶液（Ｎａｃａｌａｉ）を、匂い物質の溶解度と細胞毒性を考慮して、可能な限り高い濃度で調製した（３０μＭから３０００μＭ）。参考例２）〜４）に従って作製した嗅覚受容体発現細胞の培養物から培地を取り除き、各ウェルに該匂い物質溶液を３０μＬずつ添加して、参考例５）と同様の手順でルシフェラーゼアッセイを行った。細胞をＣＯ２インキュベータ内で２．５〜４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた後、その発現量を発光量を指標に測定した。 A DMEM solution (Nacalai) of each odorant was prepared at the highest possible concentration (30 μM to 3000 μM) taking into account the odorant solubility and cytotoxicity. The medium is removed from the culture of olfactory receptor-expressing cells prepared according to Reference Examples 2) to 4), 30 μL of the odorant solution is added to each well, and a luciferase assay is performed in the same procedure as in Reference Example 5). It was. The cells were cultured in a CO 2 incubator for 2.5 to 4 hours to fully express the luciferase gene in the cells, and the expression level was measured using the luminescence level as an indicator.
結果を図１に示す。図１は、ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１を発現させた細胞が応答を示した匂い物質の群を示し、嗅覚受容体が群内の３種類の物質の全てに応答を示した群を「活性あり」（黒丸）、群内のいずれか１つ以上の物質に応答を示さなかった群を「活性なし」（−）で示す。ＯＲ２Ｗ１は、調べた匂い物質群のうちの約８０％（１１群の匂い物質グループのうち９群）に応答した。この結果から、ＯＲ２Ｗ１が、様々な匂い物質の群を認識できるＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体であることが確認された。 The results are shown in FIG. FIG. 1 shows a group of odorous substances to which cells expressing human olfactory receptor OR2W1 responded, and the group in which the olfactory receptors responded to all three kinds of substances in the group is “active”. (Black circle), a group that did not respond to any one or more substances in the group is indicated by “no activity” (−). OR2W1 responded to about 80% of the investigated odorant groups (9 out of 11 odorant groups). From this result, it was confirmed that OR2W1 is a Broadly Tuned olfactory receptor capable of recognizing various groups of odor substances.
実施例２ Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体選択的リガンド
試験物質として、ｌ−アルギニンおよびｌ−ヒスチジンを使用した。これらの試験物質をリンガー液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４（ＮａＯＨ））に溶解させて試験物質溶液を調製した。この試験物質溶液を用いて、参考例２）〜５）の手順に従って、ＯＲ２Ｗ１発現細胞でルシフェラーゼアッセイを行った。結果を図２Ａに示す。ＯＲ２Ｗ１は、ｌ−アルギニンに対して濃度依存的な応答を示した（図２Ａ中央上）。一方、ｌ−ヒスチジンに対しては、ＯＲ２Ｗ１発現細胞は応答を示さなかった（図２Ａ中央下）。
Example 2 Broadly Tuned Olfactory Receptor Selective Ligand As test substances, 1-arginine and 1-histidine were used. These test substances were dissolved in Ringer's solution (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 , 10 mM HEPES, 5 mM Glucose, pH 7.4 (NaOH)) to prepare a test substance solution. Using this test substance solution, a luciferase assay was performed on OR2W1-expressing cells according to the procedures of Reference Examples 2) to 5). The result is shown in FIG. 2A. OR2W1 showed a concentration-dependent response to l-arginine (top center of FIG. 2A). On the other hand, the OR2W1-expressing cells did not respond to l-histidine (lower center in FIG. 2A).
さらに、４２７種類の嗅覚受容体について、参考例２）〜５）の手順に従って、ｌ−アルギニンおよびｌ−ヒスチジン（１０ｍＭ）に対する応答を調べた。その結果、ＯＲ２Ｗ１以外にｌ−アルギニンに応答する嗅覚受容体は認められなかった（図２Ａ右上）。なお、調べたいずれの嗅覚受容体もｌ−ヒスチジンには応答しなかった（図２Ａ右下）。したがって、ｌ−アルギニンがＯＲ２Ｗ１を選択的に活性化する物質であることが示された。 Furthermore, 427 types of olfactory receptors were examined for responses to l-arginine and l-histidine (10 mM) according to the procedures of Reference Examples 2) to 5). As a result, no olfactory receptor responding to l-arginine other than OR2W1 was observed (upper right of FIG. 2A). In addition, none of the olfactory receptors examined responded to l-histidine (FIG. 2A, lower right). Therefore, it was shown that l-arginine is a substance that selectively activates OR2W1.
同様の手順で、ｄ−アルギニンに対するＯＲ２Ｗ１応答を調べた。すなわち、ＯＲ２Ｗ１発現細胞にｄ−アルギニンを投与し、４時間後にルシフェラーゼの発現を評価した。その結果、図２Ｂに示すとおり、ｄ−アルギニンもＯＲ２Ｗ１を活性化した。 In a similar procedure, the OR2W1 response to d-arginine was examined. That is, d-arginine was administered to OR2W1-expressing cells, and luciferase expression was evaluated 4 hours later. As a result, as shown in FIG. 2B, d-arginine also activated OR2W1.
実施例３ ｌ−アルギニンの点鼻による嗅覚への影響
１）匂いの検出閾値（感度）への効果
ＯＲ２Ｗ１選択的リガンドであるアルギニンの嗅覚に対する作用を、官能試験によって評価した。生理食塩水（大塚製薬）、ｌ−アルギニン１０ｍＭ生理食塩水溶液、およびｌ−ヒスチジン１０ｍＭ生理食塩水溶液の３サンプルを、点鼻スプレー（ＫＴ１１０−１０２、アズワン株式会社）に調製した。匂い物質としては、三叉神経系を活性化しないものとして官能試験に広く用いられバラの匂いを呈するフェニルエチルアルコール（ＰＥＡ）を選択した。０．００１から１００μＭまでの１１段階の濃度のＰＥＡ水溶液を試験液として用意し、３ｍＬずつ２０ｍＬ容のガラスバイアル（マルエム）に入れた。
Example 3 Effect of l-arginine on olfaction by nasal nose 1) Effect on detection threshold (sensitivity) of odor The action of arginine which is an OR2W1 selective ligand on olfaction was evaluated by a sensory test. Three samples of physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), l-arginine 10 mM physiological saline solution, and l-histidine 10 mM physiological saline solution were prepared in a nasal spray (KT110-102, ASONE CORPORATION). As the odor substance, phenylethyl alcohol (PEA), which is widely used in sensory tests and exhibits a rose odor, was selected as one that does not activate the trigeminal nervous system. A PEA aqueous solution having a concentration of 11 steps from 0.001 to 100 μM was prepared as a test solution, and 3 mL each was placed in a 20 mL glass vial (Marume).
実験は、投与者と被験者の双方にブラインドをかけて行われた。投与者は、被験者の鼻腔内のできる限り深部にスプレーの噴出口をセットし、一度スプレーをした。これにより噴出される液量はおよそ１００〜２００μＬである。スプレー前およびスプレー後１分後に、被験者に水溶液のみが入ったバイアル２本と、試験液のバイアル１本の計３本を提示し、どのバイアルに匂いが入っているかを質問した。試験液のバイアルを正答できた場合は一段階低い濃度、誤答した場合は一段階高い濃度の試験液を用いて再試験した。誤答を挟んで３度連続で正答した濃度を検知閾値とした。スプレー後に再度行う閾値試験は、スプレー前の閾値濃度の１０倍濃度より始めた。生理食塩水、アルギニン、ヒスチジンいずれかを点鼻し閾値試験を行った後、２時間半以上の間隔を空けてから他のサンプルを点鼻し、閾値試験を行った。サンプル点鼻前後で、被験者のＰＥＡに対する検知閾値を測定した。サンプル点鼻前の閾値濃度／サンプル点鼻後の閾値濃度を計算することにより、閾値変化率を求めた。 The experiment was performed blinding both the admin and the subject. The administrator set the spray outlet as deep as possible in the nasal cavity of the subject and sprayed it once. The amount of liquid ejected by this is about 100-200 microliters. Before spraying and 1 minute after spraying, subjects were presented with 2 vials containing only the aqueous solution and 1 vial of test solution, and asked which vial had odor. When the test solution vial could be answered correctly, the test solution was retested using a test solution having a lower concentration by one step, and when the test solution was incorrect, a test solution having a higher concentration by one step. The density that was correctly answered three times in succession across the wrong answer was taken as the detection threshold. The threshold test performed again after spraying started with a concentration 10 times the threshold concentration before spraying. A threshold test was performed by nasalizing any one of physiological saline, arginine, and histidine, and another sample was nasalized after an interval of two and a half hours and a threshold test was performed. The detection threshold for the subject's PEA was measured before and after the sample nasal drop. The threshold change rate was obtained by calculating the threshold concentration before sample nose / threshold concentration after sample nose.
その結果、ｌ−アルギニンの点鼻後の被験者で、ＰＥＡ検知閾値が統計学的に有意に低下した（図３）。このような効果は、ＯＲ２Ｗ１を活性化しない生理食塩水およびｌ−ヒスチジンを点鼻した場合には認められなかった。これらの結果から、ｌ−アルギニンがＰＥＡの匂いに対する人の検知閾値（感度）を上昇させることが明らかになり、またｌ−アルギニンにより唯一活性化されるＯＲ２Ｗ１がその効果をもたらしていることが示唆された。 As a result, the PEA detection threshold value was statistically significantly decreased in subjects after nasal drop of l-arginine (FIG. 3). Such an effect was not observed when nasally irrigated with physiological saline that does not activate OR2W1 and l-histidine. These results show that l-arginine increases the human detection threshold (sensitivity) to the scent of PEA, and suggests that OR2W1, which is only activated by l-arginine, has its effect. It was done.
２）匂いの検出強度への効果
匂い物質およびｌ−アルギニンに同時曝露した場合と、匂い物質単独曝露の場合とを比べて、匂い物質の匂いが増強されるかを調べた。匂い物質は、ＰＥＡまたはヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）を用いた。匂い物質を終濃度０．１ｍＭ濃度となるように、ｌ−アルギニン生理食塩水溶液および対照であるｌ−ヒスチジン生理食塩水溶液（いずれも１０ｍＭ）にそれぞれ添加した。得られた溶液を、超音波式ネブライザ（ＮＥ―Ｕ０７；オムロン 霧化粒子径１〜８μｍ（全体積粒子径分布の８０％））を用いて噴霧量最大で約１７０μＬ（約２０秒間）で噴霧し、被験者に吸引させ、匂い強度を評価した。
匂いの強度は、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｅｎｓｅｓ，１９９６，２１：３２３−３４）の方法に従って、下記に示すＬａｂｅｌｅｄ Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ Ｓｃａｌｅ（ＬＭＳ）により評価した。すなわち、スケール全長を１００％として、各ラベルを次の位置に設定した：Ｂａｒｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ，１．４％；Ｗｅａｋ，６．１％；Ｍｏｄｅｒａｔｅ，１７．２％；Ｓｔｒｏｎｇ，３５．４％；Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ，５３．３％；Ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｉｍａｇｉｎａｂｌｅ，１００％。
2) Effect on detection intensity of odor The effect of enhancing the odor of the odor substance was examined by comparing the case of simultaneous exposure to the odor substance and l-arginine with the case of exposure to the odor substance alone. As the odor substance, PEA or hexylcinnamic aldehyde (HCA) was used. The odorant was added to the l-arginine physiological saline solution and the control l-histidine physiological saline solution (both 10 mM) to a final concentration of 0.1 mM. The obtained solution was sprayed at a maximum spray amount of about 170 μL (about 20 seconds) using an ultrasonic nebulizer (NE-U07; OMRON atomized particle size of 1 to 8 μm (80% of the total volume particle size distribution)). The subjects were inhaled and the odor intensity was evaluated.
The intensity of the odor was evaluated by the following Labeled Magnet Scale (LMS) according to the method of Green et al (Chemical senses, 1996, 21: 323-34). That is, each label was set to the following position, with the total length of the scale as 100%: Barely detectable, 1.4%; Weak, 6.1%; Moderate, 17.2%; Strong, 35.4%; Very strong , 53.3%; Strongest imageable, 100%.
結果、ｌ−アルギニンとの併用により、ＰＥＡおよびＨＣＡの両匂い物質の匂い強度が統計学的に有意に増強された（図４）。一方、ｌ−ヒスチジンとの併用では、いずれの匂い物質でも匂い強度の増強効果は認められなかった。これらの結果から、ｌ−アルギニンが匂いに対する人の検出強度を上昇させることが明らかになり、またｌ−アルギニンにより唯一活性化されるＯＲ２Ｗ１がその効果をもたらしていることが示唆された。 As a result, the combined use with 1-arginine statistically significantly enhanced the odor intensity of both the PEA and HCA odorants (FIG. 4). On the other hand, when used in combination with l-histidine, no odor intensity enhancing effect was observed with any odor substance. From these results, it was revealed that l-arginine increases the human detection intensity for odors, and it was suggested that OR2W1, which is only activated by l-arginine, has the effect.
３）匂いの質への効果
もし、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が匂いの質ではなく強度のみを制御するのであれば、ＯＲ２Ｗ１単独での活性化は匂いの質（特定の匂い）を呈さないはずである。そこでｌ−アルギニンを用いて約４００の嗅覚受容体のうちＯＲ２Ｗ１だけを活性化したときに、人に匂いの感覚が生じるのかを調べた。ｌ−アルギニンは揮発性をもたないため、生理食塩水に溶かしたｌ−アルギニンを、点鼻スプレーを使用して、５名の被験者の鼻腔内に投与した。その結果、ｌ−アルギニンの点鼻は匂いの感覚を生じさせなかった。なお、別の物質を同様の手法で点鼻した場合には５名中３名で匂いの感覚が生じたことから、本手法で点鼻した物質が嗅上皮に到達することは確認された。これらの結果は、ＯＲ２Ｗ１の活性化が、匂いの質（特定の匂い）の発生に関与しないことを示唆している。さらにこの実験結果は、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が、匂いの質（特定の匂い）を生み出すのではないという仮説（非特許文献２参照）を支持している。
3) Effect on odor quality If the Broadly Tuned olfactory receptor controls only the intensity, not the odor quality, activation with OR2W1 alone should not exhibit odor quality (specific odor) is there. Therefore, it was investigated whether or not the odor sensation occurs when only OR2W1 of about 400 olfactory receptors is activated using l-arginine. Since l-arginine is not volatile, l-arginine dissolved in physiological saline was administered intranasally to five subjects using a nasal spray. As a result, the nasal nose of l-arginine produced no odor sensation. In addition, when another substance was instilled by the same technique, odor sensation occurred in 3 out of 5 persons, and thus it was confirmed that the substance instilled by this technique reaches the olfactory epithelium. These results suggest that the activation of OR2W1 is not involved in the generation of odor quality (specific odor). Furthermore, this experimental result supports the hypothesis (see Non-Patent Document 2) that the “Broadly Tuned” olfactory receptor does not produce odor quality (specific odor).
実施例４ ＰＥＡ、ＨＣＡのＯＲ２Ｗ１への作用
ＰＥＡおよびＨＣＡに対するＯＲ２Ｗ１発現細胞の応答を調べた。結果、ＯＲ２Ｗ１はＰＥＡに応答し、ＨＣＡには応答しなかった（図５）。このことから、図４で示されたｌ−アルギニンによる匂い増強作用は、ＰＥＡなどＯＲ２Ｗ１が応答する匂い物質に限られるのではなく、ＨＣＡなどＯＲ２Ｗ１が応答しない匂いにも適用できることが示された。
Example 4 Effects of PEA and HCA on OR2W1 The response of OR2W1-expressing cells to PEA and HCA was examined. As a result, OR2W1 responded to PEA and did not respond to HCA (FIG. 5). From this, it was shown that the odor enhancing action by l-arginine shown in FIG. 4 is not limited to the odorant to which OR2W1 responds, such as PEA, but can also be applied to the odor to which OR2W1 does not respond, such as HCA.
実施例５ ＯＲ２Ｗ１活性化が匂い強度に与える影響
１）図１に示すように、ＯＲ２Ｗ１は１１群の匂い物質グループのうちの８０％に応答した。一方、香りが弱い微香性香料に絞ってＯＲ２Ｗ１の応答性を調べた結果、明確な応答を示したものは６８種類のうち１０％に満たなかった。これらの結果から、香料のＯＲ２Ｗ１活性化能の強さと匂い強度との関係性が示唆された。
Example 5 Effect of OR2W1 activation on odor intensity 1) As shown in FIG. 1, OR2W1 responded to 80% of 11 odorant groups. On the other hand, as a result of investigating the responsiveness of OR2W1 by focusing on a slightly fragrant fragrance having a weak fragrance, less than 10% of 68 kinds showed a clear response. From these results, the relationship between the strength of the OR2W1 activation ability of the fragrance and the odor intensity was suggested.
２）ＯＲ２Ｗ１に対する活性化作用の異なる香料による、他の香料の匂いの増強作用を調べた。試験物質として、１）においてＯＲ２Ｗ１に対する活性化作用が確認されなかった微香性香料（化合物Ａ）および最も高い活性化作用が確認された微香性香料（化合物Ｂ）を用いて、ＰＥＡまたはヒドロキシシトロネラール（ＨＣ）の匂いの増強効果を調べた。
二つの綿球を用意し、一方には試験物質（化合物ＡまたはＢ）、もう一方には匂い物質（ＰＥＡまたはＨＣ）を染み込ませ、それぞれをガラスバイアルに入れ、サンプルとした。５人の被験者が、匂い物質単独、匂い物質＋化合物Ａ、匂い物質＋化合物Ｂ、匂い物質単独、の順にサンプルを提示されて、それぞれについて匂い物質の匂い強度を評価した。また、化合物ＡおよびＢ単独での匂い強度を評価した。匂いの強度の評価は、実施例３と同様の手順で行った。結果を図６に示す。
2) The effect of enhancing the odor of other fragrances by the fragrances having different activation effects on OR2W1 was examined. As a test substance, PEA or hydroxycitrone was used using a slightly fragrant fragrance (compound A) in which the activation action on OR2W1 was not confirmed in 1) and a slightly fragrant fragrance (compound B) in which the highest activation action was confirmed. The effect of enhancing the odor of Lar (HC) was examined.
Two cotton balls were prepared, one was impregnated with a test substance (compound A or B) and the other was impregnated with an odor substance (PEA or HC), and each was placed in a glass vial to prepare a sample. Five subjects were presented with samples in the order of odor substance alone, odor substance + compound A, odor substance + compound B, and odor substance alone, and the odor intensity of the odor substance was evaluated for each sample. Further, the odor intensity of compounds A and B alone was evaluated. The evaluation of odor intensity was performed in the same procedure as in Example 3. The results are shown in FIG.
３）さらに、１０種類のＯＲ２Ｗ１アンタゴニスト化合物について、スカトール臭の抑制作用およびスカトール受容体活性抑制作用を調べた。スカトール受容体としては、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３およびＯＲ８Ｈ１（特許第５５９３２７１号公報）が知られているが、これらのうちＯＲ２Ｗ１によってスカトール臭強度が制御されている可能性を検証した。参考例２）〜５）と同様の手順で、該アンタゴニスト化合物存在下での匂い応答（％）を測定した。
アンタゴニスト化合物のスカトール臭の抑制作用は以下の手順で調べた。ガラス瓶（柏洋硝子Ｎｏ．１１、容量１１０ｍＬ）に綿球を入れ、この綿球に、悪臭としてプロピレングリコールで１０5倍に希釈したスカトール、およびアンタゴニスト化合物を各々２０μＬ滴下した。ガラス瓶を一晩室温で静置し、匂い分子をガラス瓶中に十分揮発させた後、官能試験によりスカトール臭の匂いを評価した。官能試験ではスカトール臭単独での匂いの強さを５とし、アンタゴニスト化合物を混合した場合の悪臭の強さを０から１０（０．５刻み）の２０段階で評価した。小さい値ほどスカトール臭が弱いことを表す。官能試験は４〜８名で行い、結果の平均値を求めた。
結果を図７に示す。図７の各図の横軸は、アンタゴニスト化合物を表し、左図の縦軸は、各アンタゴニスト化合物存在下でのスカトールに対するＯＲ２Ｗ１活性（匂い応答（％））を表す。匂い応答（％）が高いほどアンタゴニスト化合物のアンタゴニスト活性が低いことを意味する。右図の縦軸は、アンタゴニスト化合物のスカトール臭抑制作用の強さを示す（４〜８名による官能評価の平均値）。受容体アッセイにおいてＯＲ２Ｗ１のスカトール認識を抑制した化合物はすべて、官能試験においてスカトール臭を抑制した。これは、ＯＲ２Ｗ１の活性が匂いの強さの認識に強く貢献していることを示唆する。
3) Furthermore, 10 kinds of OR2W1 antagonist compounds were examined for their skatole odor inhibitory action and skatole receptor activity inhibitory action. As skatole receptors, OR2W1, OR5K1, OR5P3 and OR8H1 (Japanese Patent No. 5593271) are known. Of these, the possibility that the skatole odor intensity is controlled by OR2W1 was verified. The odor response (%) in the presence of the antagonist compound was measured in the same procedure as in Reference Examples 2) to 5).
The inhibitory effect of antagonist compounds on skatole odor was examined by the following procedure. A cotton ball was placed in a glass bottle (Kyoyo Glass No. 11, volume 110 mL), and 20 μL each of skatole diluted 10 5 times with propylene glycol as an offensive odor and an antagonist compound were added dropwise to the cotton ball. The glass bottle was allowed to stand at room temperature overnight, and the odor molecules were sufficiently volatilized in the glass bottle, and then the odor of skatole odor was evaluated by a sensory test. In the sensory test, the intensity of the odor of skatole odor alone was set to 5, and the intensity of bad odor when the antagonist compound was mixed was evaluated in 20 levels from 0 to 10 (in 0.5 increments). The smaller the value, the weaker the skatole odor. The sensory test was performed by 4 to 8 persons, and the average value of the results was obtained.
The results are shown in FIG. The horizontal axis of each figure in FIG. 7 represents an antagonist compound, and the vertical axis of the left figure represents OR2W1 activity (odor response (%)) to skatole in the presence of each antagonist compound. A higher odor response (%) means a lower antagonist activity of the antagonist compound. The vertical axis of the right figure shows the strength of the skatole odor suppressing action of the antagonist compound (average value of sensory evaluation by 4 to 8 persons). All compounds that suppressed OR2W1 skatole recognition in the receptor assay suppressed skatole odor in the sensory test. This suggests that the activity of OR2W1 strongly contributes to the perception of odor intensity.
上記１）〜３）の結果からは、実施例３〜４の結果を踏まえると、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１が、様々な匂い物質についての、匂いの質ではなく、匂いの強さの情報を伝達している嗅覚受容体であることが示唆される。アルギニンは、このＯＲ２Ｗ１を活性化させることによって、それ自身の匂いを発生させることなく、様々な匂いの増強をもたらすことができる。 From the results of the above 1) to 3), based on the results of Examples 3 to 4, the Bloody Tuned olfactory receptor OR2W1 provides information on odor intensity, not odor quality, for various odor substances. It is suggested that it is a transmitting olfactory receptor. Arginine can bring about various odor enhancements by activating this OR2W1 without generating its own odor.
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