JP2018076237A - ゴボウ抽出物を用いて生成した、弾性線維及びコラーゲンを保護する薬物の用途 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、従来の腱炎治療方法では患者に対する生理的負担が高く、負担がなく且つ有効的な治療選択肢を提供することができないという問題を解決することにある。
【解決手段】本発明は、ゴボウ抽出物を用いて生成した弾性線維及びコラーゲンを保護する薬物の用途を提供し、その実現方法は、有効量のゴボウ抽出物を炎症症状を患う個体に投与し、前記ゴボウ抽出物によって前記個体に対して発生した炎症反応を抑制することで、前記個体の弾性線維及びコラーゲンが損傷しないようにしている。従来の抗炎症方法は、患者に抗炎症薬、ステロイド等の薬物を与えてるが、患者に対して生理的負担が大きいため、本発明は、天然素材であるゴボウを原料として炎症を抑制する用途を提供している。
【選択図】図４Ａ

Description

本発明は、ゴボウ抽出物を用いて生成した、弾性線維及びコラーゲンを保護する薬物の用途、特に、ゴボウ抽出物を医薬品に生成することで、細胞がエラスターゼ、コラゲナーゼ等の炎症物質の影響を受けて損傷することを制御する用途に関するものである。

腱は、結合組織であって、その主要成分は、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）とエラスチン（Ｅｌａｓｔｉｎ）とから組成し、人体における筋肉と骨との間に存在し、主に筋肉の力で骨格を牽引するために用いるとともに、骨格を連動して運動を行うため、腱は人体を活動する際に重要な生理的構造といえる。例えば、重いものを持ち上げる際に力を不適切にかけたり、過度な負荷を長期にわたって使用したり、衝突や圧迫等の様々な要因によって腱に病変を引き起こす恐れがあり、いずれも腱に急性又は慢性の炎症を引き起こす可能性がある。腱が損傷すると、炎症物質であるエラスターゼ（Ｅｌａｓｔａｓｅ）及びコラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）が発生する。エラスターゼが腱細胞生存率に与える影響を示すグラフである図１Ａを参照すると、本実施例では、人間の腱細胞（Ｔｅｎｏｃｙｔｅ）を測定の対象としており、図からわかるとおり、エラスターゼが加わると、人間の腱細胞の生存率は、エラスターゼの濃度が上昇するにつれ、顕著に低下しており、これは、主に、エラスターゼが腱細胞中のエラスチン線維（Ｅｌａｓｔｉｎ ｆｉｂｅｒ）を分解し、腱細胞の損傷及び死亡を引き起こしているからであって、癒合過程に対してマイナス作用を引き起こしている。次に、異なるエラスターゼの濃度における細胞の損傷状況を蛍光色素で呈色した図である図１Ｂ乃至図１Ｄを参照すると、本実施例では、主に、ジアミジノフェニルインドール（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，ＤＡＰＩ）を用いて細胞総数の基準とし、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ緑色蛍光色素を使用して生細胞を染色し、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１赤色蛍光色素を使用して死細胞を染色し、さらに光学測定で呈色率、即ち生存率を得ている。図からわかるとおり、エラスターゼの濃度が上昇すると、腱細胞の生存率は顕著に低下し、エラスターゼの濃度が５０ｍＵになると、腱細胞の生存率は、僅か二割前後しかないが、このような状況は、臨床試験においてもごく稀で、参考モデルとしての価値は比較的低い。コラゲナーゼは、腱細胞中のコラーゲン構造を直接破壊し、急性の腱損傷を形成しているが、このような現象に関しては、実務上において、当該分野において多くの研究検証が行われていることから、ここではこれ以上叙述しない。

図２Ａ及び図２Ｂを参照すると、エラスチン線維は、分解された後にエラスチン分解産物（Ｅｌａｓｔｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＥＤＰ）が発生し、これ等エラスチンの「破片」は、エラスターゼを増加させ、病変の進行を促している。図からわかるとおり、エラスチン分解産物の濃度が上昇すると、エラスターゼの発現量もこれに伴い上昇し、そのうち、α−チューブリン（α−ｔｕｂｕｌｉｎ）は、対照群とすることで、分析時の同量のたんぱく質サンプルの保持を確保している。つまり、エラスターゼによってエラスチン分解産物が発生し、エラスチン分解産物は、エラスターゼをさらに活性化し、損傷を受けた腱を石灰化させて損傷の再発をより容易にし、悪循環を形成している。

従来の腱炎の治療方法は、急性の場合、その多くは、アイスパックを用いたり、ステロイドを局部に注射することで腫れや痛みを解消している。慢性の場合、患者は、筋肉の硬直、癒着及び無力等の現象が起こり易いため、その治療方法は、経口抗炎症剤のほかに、患部に対して超音波、ホットパック、電気刺激を施し、治療を促進するとともに、適切な運動を併せることで、筋肉の筋力及び柔軟性を可能な限り、損傷前の水準に回復させている。また、腱にマッサージを施すことも癒着現象の減少を助け、重症者は、手術で結合組織を取り除くことを考慮することができる。

しかし、経口抗炎症剤或いはステロイド等を用いた治療法に伴う副作用は、慢性病を患う一部の患者にとって負担が重く、抗炎症剤の投与量を減らすと、治療の効果が弱くなるという問題が発生してしまう。このため、人体に対してマイナス影響が起こらず且つ腱の急性或いは慢性炎症を有効的に治療する治療方法をどのように提供するかが急務の課題となっている。

本発明の主な目的は、従来の腱炎治療方法では患者に対する生理的負担が高く、負担がなく且つ有効的な治療選択肢を提供することができないという問題を解決することにある。

上述の目的を達成するため、本発明は、有効量のゴボウ抽出物に医薬上可能な成分を結合させて薬物を生成した後炎症症状を患う個体に投与する、ゴボウ抽出物を用いて生成した弾性線維及びコラーゲンを保護する薬物の用途を提供し、そのうち、前記ゴボウ抽出物は、前記個体の弾性線維及びコラーゲンが破壊されないようにするため、前記個体に対して炎症抑制作用を発生している。

前記炎症症状は、少なくとも腱炎を包含し、且つ前記炎症抑制作用は、個体の患部にあるエラスターゼの活性を抑制することで、エラスチン分解産物の生成を抑制することと、個体の患部にあるコラゲナーゼの活性を抑制することとを包含している。

このことから、本発明は、従来の技術と比べ、以下のような有益な効果を有している。
第一に、本発明に係るゴボウ抽出物は、原料としてゴボウ根を用いており、即ち、天然の植物から採取した成分で炎症抑制の効果に達し、患者に対する生理的負担がかからないようにすることができる。また、本発明に係るゴボウ抽出物は、エラスターゼ、コラゲナーゼの活性を抑制するとともに、エラスチン分解産物の生成によってエラスターゼが再度発生するという悪循環を阻止し、損傷した腱が脆弱、石灰化又は断裂したりするといった問題を防ぐことができる。
第二に、本発明に係るゴボウ抽出物は、エラスターゼ等の炎症物質を抑制するだけでなく、細胞がエラスチンを生成することを補助するという用途も有し、細胞が損傷した繊維組織を自己回復することを助けている。

エラスターゼの濃度が腱細胞の生存率に及ぼす影響を示すグラフである。 異なるエラスターゼの濃度で腱細胞の生存率に及ぼす影響を示す図である。 異なるエラスターゼの濃度で腱細胞の生存率に及ぼす影響を示す図である。 異なるエラスターゼの濃度で腱細胞の生存率に及ぼす影響を示す図である。 エラスチン分解産物の濃度がエラスターゼの発現に及ぼす影響を示すグラフである。 異なるエラスチン分解産物の濃度でエラスターゼの発現に及ぼす影響を示す図である。 本発明に係るゴボウ抽出物の濃度が腱細胞の生存率に及ぼす影響を示すグラフである。 本発明に係るゴボウ抽出物の濃度がエラスターゼを含有する腱細胞の生存率に及ぼす影響を示すグラフである。 ５０μｇ／ｍｌのエラスチン分解産物に異なる濃度の本発明に係るゴボウ抽出物を加えた際炎症物質の発現に及ぼす影響を示す図である。 図４Ｂの実験条件におけるエラスターゼの発現を示すグラフである。 図４Ｂの実験条件におけるマトリックスメタロプロティナーゼ２の発現を示すグラフである。 図４Ｂの実験条件におけるマトリックスメタロプロティナーゼ９の発現を示すグラフである。 本発明に係るゴボウ抽出物の濃度が腱細胞にあるエラスチンの発現量に及ぼす影響を示すグラフである。 異なるゴボウ抽出物の濃度でエラスチンの発現に及ぼす影響を示す図である。 本発明に係るゴボウ抽出物の濃度がエラスターゼを含有する腱細胞にあるエラスチンの発現量に及ぼす影響を示すグラフである。 異なるゴボウ抽出物の濃度でエラスターゼを含有する腱細胞にあるエラスチンの発現に及ぼす影響を示す図である。 本発明に係るゴボウ抽出物が異なる濃度でエラスターゼが腱細胞を損傷させる程度に及ぼす影響を示すグラフである。 本発明に係るゴボウ抽出物が異なる濃度でエラスターゼが腱細胞を損傷させる程度に及ぼす影響を示す図である。

本発明は、主体としてゴボウ抽出物（Ａｒｃｔｉｕｍ ｌａｐｐａ ｅｘｔｒａｃｔ）を用い、腱炎を抑制且つ治療する用途に応用するものである。本発明で述べている「ゴボウ抽出物」とは、具体的に、皮付きのゴボウ根を原料とし、まず、溶剤と原料とを均一に混合した後、超音波振動を介して原料中の細胞壁を破砕することで、抽出効率を向上させるとともに、遠心分離機等によって残渣及び抽出液を分離させ、この抽出した、植物の有効成分を多く含む抽出液は、最後に、粉末状或いは液体状のゴボウ抽出物に収集して生成することができる。抽出過程では、主に、ゴボウの中にある炭水化物、繊維を取除き、ポリフェノール類（クロロゲン酸、カフェー酸等）、ビタミン、アミノ酸、鉱物等といった有効成分を残している。本発明の実験において、台湾元弘草本科研有限公司（Ｂｉｏｍｅｄ ｈｅｒｂａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏ． ｌｔｄ）が販売している商品番号６−１１６Ｃゴボウ抽出物粉末剤を使用し、前記ゴボウ抽出物を水に溶解して得た溶液を利用して実験を行い、前記ゴボウ抽出物は、少なくとも０．３５ｍｇ／ｇ〜０．７５ｍｇ／ｇのクロロゲン酸を含有し、且つ個体に投与する有効投与量は、毎日５００〜１０００ｍｇが好ましい。

図３を参照すると、ゴボウ抽出物の濃度と細胞生存率との対照図であって、本発明に係る図面において、ゴボウ抽出物は、いずれもＡＬと称し、細胞生存率は、ｓｕｒｖｉｖａｌ ｃｅｌｌｓ％で示している。本発明に係る実験は、人間の腱細胞（Ｔｅｎｏｃｙｔｅ）を使用し、４０００００ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋの濃度でシャーレ内に播種し、細胞で覆われるまで一日培養している。シャーレが細胞で覆われたら、培地をＳＦ培地（ＳＦ ｍｅｄｉｕｍ）に置き換え、各シャーレに対してエラスターゼ２０ｍＵを処理している。エラスターゼ処理の後、各シャーレに対して前記ゴボウ抽出物を溶解した溶液を添加し、処理した後の２４時間後に細胞内タンパク質を取り出し、その上清液を遠心分離させた後再度上清液を回収してサンプルを調製している。対照群（図面においてＣＴＬと称す）はエラスターゼを添加していないシャーレにある上清液を使用し、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）で細胞生存率の評価を行っている。グラフの最も左側は、対照群であって、右に向かうにつれ前記ゴボウ抽出物の濃度が徐々に上がっており、グラフからわかるとおり、本発明に係るゴボウエキスを含有する溶液は、異なる濃度においても、腱細胞の生存率に影響が及んでいないことから、前記ゴボウ抽出物は、腱細胞に対して損害が発生しないと確認することができる。

次に、図４Ａを参照すると、本発明に係るゴボウ抽出物の濃度がエラスターゼを含有する腱細胞の生存率に及ぼす影響を示すグラフである。図１Ａからわかるとおり、エラスターゼ２０ｍＵの際、腱炎患者の臨床例と最も近似することから、図４Ａにおける横軸は、エラスターゼ２０ｍＵを基準とし、本発明に係るゴボウ抽出物を１部、３部、７部及び１５部それぞれ投入し、１部あたり前記ゴボウ抽出物の濃度は１ｍｇ／ｍｌで、同じように、４８時間経過後、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ緑色蛍光色素を使用して生細胞を染色し、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１赤色蛍光色素を使用して死細胞を染色し、さらに光学測定で呈色率を取得して腱細胞の生存率を得ている。図からわかるとおり、前記ゴボウ抽出物の濃度が上昇すると、腱細胞の生存率も相対的に上昇している。このため、本発明に係るゴボウ抽出物は、確かに、細胞がエラスチンを生成するように補助する用途を有するとして特徴づけることができ、特に、前記ゴボウ抽出物の投入濃度が１５ｍｇ／ｍｌの際、腱細胞の殆どはアポトーシスが発生していない。

次に、図４Ｂ乃至図４Ｅを参照すると、上述したことからわかるとおり、損傷した腱細胞にあるエラスチン分解産物（Ｅｌａｓｔｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ，ＥＤＰ）には、炎症物質を誘発するエラスターゼ及びマトリックスメタロプロティナーゼ９（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９，ＭＭＰ９）のメカニズムが存在し、本発明では、炎症物質に近似するマトリックスメタロプロティナーゼ２（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ２，ＭＭＰ２）と併せて、ウェスタンブロッティングを行ってその発現量を検出するとともに、β−アクチン（β−Ａｃｔｉｎ）を内部参照の基準としている。図４Ｃ乃至図４Ｅからわかるとおり、腱細胞中に、５０μｇ／ｍｌのＥＤＰと、１部、３部、７部及び１５部等の異なる濃度のゴボウ抽出物とを加えると、エラスターゼの発現量は、ゴボウ抽出物の濃度の上昇に伴い、顕著に低下し、マトリックスメタロプロティナーゼ２の発現量の勾配は、エラスターゼより緩やかであるものの、やはり、ゴボウ抽出物の濃度の上昇に伴い、徐々に低下し、マトリックスメタロプロティナーゼ９の発現量は、ゴボウ抽出物が３部、７部、１５部の際、同じような結果を示している。従って、上述した実験から、本発明に係るゴボウ抽出物は、確かに、損傷した腱が慢性炎症になることを抑制する効果を有し、且つゴボウ抽出物は天然成分であるため、一部の慢性病患者に対しての副作用の懸念も少ない上、腱炎を治療する効果を有している。

本発明は、前記ゴボウ抽出物が弾性線維に対してどのような影響を及ぼすかをさらに討究しており、図５Ａ及び図５Ｂを参照すると、腱細胞にあるエラスチンは、ウェスタンブロッティングを行ってその発現量を検出するとともに、β−アクチン（β−Ａｃｔｉｎ）を内部参照の基準としていることを示している。本実施例は、人間の腱細胞を使用して培養を行い、異なる濃度の前記ゴボウ抽出物で各シャーレに対して処理を行っている。図５Ａからわかるとおり、前記ゴボウ抽出物の濃度が高くなるにつれ、エラスチンの発現量もまたこれに伴い向上しており、実施例１に係る図３にある結果と総合すると、前記ゴボウ抽出物は、腱細胞を損傷しないだけでなく、エラスチンの増殖効率を向上させる効果をさらに有するとともに、腱細胞が弾性線維を組成することに対して有益な効果をもたらすことがわかる。

上述した実施例２に引続き、本発明は、腱細胞中にエラスターゼを加えたら、前記ゴボウ抽出物は依然として弾性線維に対して有益な影響をもたらすのか否かをさらに討究している。図６Ａ及び図６Ｂを参照すると、腱細胞にあるエラスチンは、ウェスタンブロッティングを行ってその発現量を検出するとともに、β−アクチン（β−Ａｃｔｉｎ）を内部参照の基準としていることを示している。本実施例は、人間の腱細胞を使用して培養を行い、図６Ａにおいて、対照群は、腱細胞だけのシャーレで、その他の各シャーレは、濃度が２０ｍＵのエラスターゼを投入し、０部、１部、３部、７部及び１５部等の異なる濃度のゴボウ抽出物で処理を行っている。図６Ａからわかるとおり、前記ゴボウ抽出物の濃度が高くなるにつれ、エラスチンの発現量もまたこれに伴い向上しており、実施例２の結果と総合すると、前記ゴボウ抽出物は、腱細胞を損傷しないだけでなく、エラスチンの増殖効率をさらに向上させることができるとともに、腱細胞による弾性線維の組成を補助する効果をもたらすことがわかる。

本発明は、前記ゴボウ抽出物が、細胞に対して損傷を引き起こすコラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を抑制すると、どのような影響を及ぼすのかをさらに討究している。本実施例において、人間の腱細胞を使用し、４０００００ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋの濃度でシャーレ内に播種し、細胞で覆われるまで一日培養している。シャーレが細胞で覆われたら、培地をＳＦ培地（ＳＦ ｍｅｄｉｕｍ）に置き換え、各シャーレに対してコラゲナーゼ０．２ｍＵを処理している。コラゲナーゼ処理の後、各シャーレに対して１部、３部、７部及び１５部の濃度（１部あたりの濃度１ｍｇ／ｍｌ）の前記ゴボウ抽出物を溶解した溶液を添加し、処理した後の２４時間後に細胞内タンパク質を取り出し、その上清液を遠心分離させた後再度上清液を回収してサンプルを調製している。対照群はコラゲナーゼを添加していないシャーレにある上清液を使用している。本実施例では、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ緑色蛍光色素を使用して生細胞を染色し、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１赤色蛍光色素を使用して死細胞を染色し、さらに光学測定で細胞死亡数を得ている。図７のように、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１赤色蛍光色素が呈色した細胞数は、対照群が最も少なく、コラゲナーゼしか添加していないものが最も多くなっており、前記ゴボウ抽出物を添加したサンプルにおいて、細胞の損傷比率は一律、コラゲナーゼしか添加していないものより少なく、現在の実験データでは、前記ゴボウ抽出物の濃度と腱細胞の損傷程度との関連性を確認することができないものの、前記ゴボウ抽出物は、コラゲナーゼによる腱細胞の損傷程度を低減する効果を有するとして特徴づけることができる。

応用上、本発明に係る前記ゴボウ抽出物は、一定量を様々なものに添加することができる。前記ゴボウ抽出物は、医薬上可能な成分、例えば、塩類、促進剤、賦形剤等を結合させて経口剤や注射剤を生成したり、前記ゴボウ抽出物をドレッシング材に生成して急性期用の外用薬として使用したり、さらには前記ゴボウ抽出物で健康食品を生成したりすることもできる。なお、上述した医薬品や健康食品等の製品は、あくまでも例示に過ぎず、本発明が請求する範囲を限定するものではない。

なし

Claims (2)

1. 有効量のゴボウ抽出物に医薬上可能な成分を結合させて薬物を生成した後炎症症状を患う個体に投与する、ゴボウ抽出物を用いて生成した弾性線維及びコラーゲンを保護する薬物の用途であって、
   そのうち、前記ゴボウ抽出物は、前記個体の弾性線維及びコラーゲンが破壊されないようにするため、前記個体に対して炎症抑制作用を発生することを特徴とする、ゴボウ抽出物を用いて生成した弾性線維及びコラーゲンを保護する薬物の用途。
2. 前記炎症症状は、少なくとも腱炎を包含し、且つ前記炎症抑制作用は、個体の患部にあるエラスターゼの活性を抑制することで、エラスチン分解産物の生成を抑制することと、個体の患部にあるコラゲナーゼの活性を抑制することとを包含することを特徴とする請求項１に記載の、ゴボウ抽出物を用いて生成した弾性線維及びコラーゲンを保護する薬物の用途。