JP2018075013A - 母体血漿の無侵襲的出生前分子核型分析 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】胎児ゲノム中の微小増幅又は微小欠失を検出する方法、システム及び装置が本明細書に開示されている。一部の実施形態において、方法は、生体試料の複数のDNA断片のそれぞれについて配列タグを得ることと、配列タグのゲノム位置を決定することと、複数のゲノム領域のそれぞれにおけるDNAの密度が異常に高いか又は低いかを判断することと、異常に高い密度を有した連続するゲノム領域の集合を微小増幅と識別することと、異常に低い密度を有した連続するゲノム領域の集合を微小欠失と識別することと、を含む。生体試料は、胎児を宿した女性対象から無侵襲的に得られる血液試料であり得る。
【選択図】図1
Description
本出願は、2013年1月10日に出願された「母体血漿の無侵襲的出生前分子核型分析」という名称の米国仮特許出願第61/751,213号、及び、2013年3月15日に出願された「母体血漿の無侵襲的出生前分子核型分析」という名称の米国特許出願第13/837,776号に対する優先権を主張する。それぞれの優先権主張出願は、すべての目的上、その全体において参照により本明細書に援用される。
母体血漿中の胎児DNAの存在によって、無侵襲的出生前検査を刺激する可能性が開かれている[1,2]。近年、出生前検査の目的で循環胎児DNAを分析する超並列配列決定(MPS)の利用への関心が高い。このため、胎児のトリソミー21、13、18、及び選択性染色体異数性は、母体血漿DNAにおいてMPSを用いて検出され[3‐7]、臨床サービスに急速に導入されている。
胎児ゲノム中の微小増幅(microamplification)又は微小欠失を検出する方法、システム及び装置が本明細書に開示されている。一部の実施形態において、方法は、生体試料の複数のDNA断片のそれぞれについて配列タグを得ることと、配列タグのゲノム位置を決定することと、複数のゲノム領域のそれぞれにおけるDNAの密度が異常に高いか又は低いかを判断することと、異常に高い密度を有した連続するゲノム領域の集合を微小増幅と識別することと、異常に低い密度を有した連続するゲノム領域の集合を微小欠失と識別することと、を含む。生体試料は、胎児を宿した女性対象から無侵襲的に得られる血液試料であり得る。
本発明の実施形態は、胎児ゲノム中に微小増幅又は微小欠失が存在するか否かを判断する、方法、システム及び装置を提供する。簡潔にいうと、このような判断は、生体試料を得て、複数のゲノム領域のそれぞれに由来する試料中のゲノムDNAの量を定量することによって、行うことができる。それぞれのゲノム領域の量は、適切に標準化して、その領域の密度(すなわち、それぞれの密度)を求め、基準密度と比較することができる。それぞれの密度と基準密度との間の統計的有意差は、ゲノム領域若しくは複数にわたるゲノム領域内の微小増幅又は微小欠失の存在を示し得る。偽陽性を回避するために、かかる統計的有意差が少なくとも2つの連続するゲノム領域のそれぞれに存在する場合、微小増幅又は微小欠失が識別される。
実施形態は、遺伝子のコピー数又は染色体領域の相違を検出するのに用いることができる。微小増幅(微小重複とも呼ばれる。)から生じる異常に高いコピー数の遺伝子は、これらの遺伝子の過剰発現又は病的発現(pathological expression)を生じることがあり、これらは、癌などの疾患をもたらす。逆に、微小欠失から生じる低いコピー数の遺伝子は、発現の減少、又は生物学的(例えば、酵素)機能の損失を生じることがある。したがって、異常なコピー数の検出は、胎児の出生前又は出生後に直面し得る疾患の早期警告を提供することができる。
図1は、胎児を宿した女性対象から得られる生体試料を分析することによって、胎児のゲノム中の微小増幅又は微小欠失を識別する、方法100のフローチャートであり、生体試料には、胎児及び女性対象からの無細胞DNAが含まれる。
本発明を用いてゲノム微小増幅及び微小欠失を検出するために、参照ゲノム配列は、ゲノム領域又は「ビン」に分割される。試料からのDNA断片は、配列に従ってそれぞれの領域に関連付けされ、それぞれの領域内のDNAの密度が決定される。異常に高いか又は低い密度を有する領域は、「異常」と考えられ、微小増幅又は微小欠失に相当し得る。異常なゲノム領域を識別し、これらが微小増幅又は微小欠失に相当するか否かを判断するための基準及び手順を、以下に説明する。
本明細書に用いられるゲノム領域のサイズは、施術者が所望するような、及び用いられる配列決定法に適切な種々のサイズとすることができる。小さな領域によって、異常な密度の高い解析が可能になるが、統計的確実性を有する異常な密度を識別するのに多くのDNA断片(したがって、大きな試料)が必要である。逆に、大きな領域は、不十分な解析を提供するが、少ないDNA断片が必要であるにすぎない。好適な実施形態において、等しいサイズのゲノム領域を用いて、染色体及びゲノム全体における密度の比較及び標準化が可能になる。例えば、ゲノム領域のサイズは、100 kb、200 kb、500 kb、1 Mb、2 Mb、5 Mb又は10 Mbのオーダーであってもよい。一部の実施形態において、ゲノム領域は、オーバーラップしていない及び/又は(以下に論じるように)隣接しているが、場合によっては、例えば、領域の端部付近で生じる配列タグの分析を簡素化するために、領域間にオーバーラップ又はギャップがあってもよい。
上述したように、ゲノム領域のそれぞれの密度を、基準密度と比較することができる。基準密度は、複数の種々の方法により、例えば、複数のゲノム領域上のそれぞれの密度を平均するか、又は複数の試料から得られる同じゲノム領域のそれぞれの密度を平均することにより求めることができる。ゲノム領域のそれぞれの密度が異常であるか否かを判断するために、パラメータは、それぞれの密度及び基準密度を用いて算出され、その後、パラメータはカットオフと比較される。パラメータの例としては、2つの値の差、差の絶対値、又は比率が挙げられる。これらの値は、適切に扱うことができ、例えば、スカラーを掛けてパラメータを求めることができ、カットオフとの有意味な比較が可能になる。
一部の実施形態において、それぞれの密度及び基準密度から算出したパラメータが、カットオフを超えているか否かについては、それぞれの密度が異常である(統計的に異なる)か否かを示し得る。パラメータの表示は、それぞれの密度が異常に高いか又は低いか否かを示し、微小増幅又は微小欠失をそれぞれ示唆し得る(が、決定的ではない)。例えば、パラメータが、それぞれの密度と基準密度との間の単純な差である場合、異常に高く低いそれぞれの密度はそれぞれ、パラメータの正負の表示に相当する。したがって、カットオフは、正又は負であってもよく、また、パラメータがカットオフを超えることは、正のカットオフを超えるか、又は負のカットオフを下回ることを意味すると理解することができる。同様に、パラメータが比率である場合において、特定の値よりも大きいか、又はその値の逆数よりも小さいと、カットオフを超え得る。カットオフは、施術者によって所望されるように、選択することができる。例えば、これは任意であってもよいし、又は、異常な密度の判断が、所望レベルの統計的確実性によって行われることを保証するように選択されてもよい。
上述したように、特定のゲノム領域におけるDNAのそれぞれの密度は、基準密度と比較され、それぞれの密度が異常であるか否かが判断される。基準密度は、1つの試料又は複数の試料から得たデータを用いて種々の多くの方法により算出することができる。1つの試料の場合、基準密度は、例えば、ゲノム領域の集合のそれぞれの密度の平均とすることができる。この集合は、染色体の一部若しくは全部、複数の染色体又は全ゲノムに相当し得る。複数の試料の場合、それぞれの試料は、通常、異なる個体から得られる。ゲノム領域の基準密度は、その領域又は領域の集合のそれぞれの密度であり、個々において平均することができる。一部の実施形態において、生体試料は、微小増幅又は微小欠失の欠如を反映した基準密度を確立するために、公知の正常な胎児核型を有する妊婦対象から得られる。そして、基準密度は、未知の胎児核型を有する試験対象のそれぞれの密度と比較することができる。一部の実施形態において、胎児の複数の(又はすべての)核型の個々は未知であり、また、基準密度は、これらの個々の試料中に存在し得る異常についての予備知識なしで算出される。
ゲノム領域のそれぞれの密度が異常である(基準密度よりも静的に高いか又は低い)と判明した後、ゲノム領域が、少なくとも1つの他の異常なゲノム領域と連続している場合、微小増幅又は微小欠失を識別することができる。上述したように、行われるかかる識別については、それぞれの密度は、連続する領域に対して同じ方向の基準密度から外れる必要がある。したがって、微小増幅は、それぞれの密度がそれぞれの領域において異常に高い連続するゲノム領域に相当し、また、微小欠失は、それぞれの密度が異常に低い連続するゲノム領域に相当する。
微小欠失又は微小重複検出の感度及び特異性は、試料中の胎児%、配列決定及び配列させた血漿DNA分子の数、並びに異常のサイズを含む種々のパラメータによる影響を受ける可能性がある。したがって、コンピュータシミュレーション解析は、1)既存の配列決定の深度によって微小欠失/微小重複サイズ(例えば、〜3 Mbのサイズ)の検出感度と、2)特定の胎児%(例えば、5%)における特定の感度(例えば、95%/99%)を達成するように解析するのに必要な分子数を決定するために行うことができる。
dは、異常の染色体数の変化であり(dは、微小欠失において−1、及び微小重複において+1と等しい。)、
Tは、全ゲノムのビンの総数である。
本実施例は、ヒト胎児及び母体DNA中の微小増幅及び微小欠失を識別するために提供される。
イルミナHiSeq 2000シークエンサにおけるフローセルの1つのレーンを用いて、6つの試験事例及び8つの対照の母体血漿試料をそれぞれ分析した。平均2億1100万(範囲:1億7700万〜2億3600万)のDNA断片を、それぞれの血漿DNA試料から配列決定した。かかる配列決定によって、平均1億4400万(範囲:9600万〜1億8000万)の配列と、半数体ヒトゲノムの4.81倍に相当する事例ごとの非重複配列決定リードが生じた。
それぞれの事例の全ゲノムにおける1 Mbのビンのzスコアを、Circosプロット[21]を用いてプロットした(図2)。試験試料では、94.9%〜98.7%の1 Mbのビンが正常な表現を示した。3つの連続するビンが同じ異常を示した場合にのみコピー数異常とする上述の基準によって、偽陽性のないすべての事例において、コピー数異常が正確に識別された。
過少表現又は過剰表現を示す領域のDNA配列を用いて、母体血漿中の胎児%を推定した(図5)。このアプローチは、この方法を用いて、男性胎児を保有する3つの事例(すなわち、事例02、03及び04)では染色体Yに基づく方法[4]を用いて算出された胎児%を比較することによって検証された。胎児%の値は、2つの方法の間で非常に一致していた(図5)。胎児のデノボコピー数異常を有する5つの事例では、胎児%は、9.2%から17.8%の範囲であった。事例05では、微小重複のゲノム表現によって推定された胎児%は、96.7%であり、このことは、循環DNAのほとんどすべてが、この変化を有することを示唆していた。この結果は、母親が異常を保有しているという事実と一致している。
コンピュータシミュレーションを、ショットガンMPS系無侵襲的出生前分子核型分析(shotgun MPS-based noninvasive prenatal molecular karyotyping)の診断感度を決定するために用いた(図6)。〜1億5000万のリードの既存の配列決定深度によって、胎児%が5%である場合、3 Mbの染色体異常を検出する診断感度は、およそ96%であった。胎児%が6%に達すると、感度は99%まで増加する。小さいサイズの染色体異常を検出するために、多くの血漿DNA分子を分析する必要があった。図7は、3つの連続するビンの基準を用いて、95%/99%の感度とともに、3 Mb、2 Mb及び1 Mbの診断解像度を達成するのに必要な血漿DNA分子の数を示している。95%の診断感度を達成するために、それぞれのビンは、およそ42,000の分子を分析する必要があった。したがって、95%の診断感度で2 Mb及び1 Mbの微小欠失/微小重複を検出するのに分析される必要がある血漿DNA分子の総数はそれぞれ、1億9200万及び3億8000万であった。99%の診断感度を達成するために、分析される必要がある分子の総数は、2つの異なる解像度でそれぞれ、2億4000万及び4億8000万であった。
本研究では、胎児の染色体微小欠失及び微小重複の無侵襲的出生前検出についての実行可能性は、ゲノムワイドレベルにおいて、3 Mbの解像度で実証された。5つの事例において、染色体3q、4q若しくは22qに関与する胎児由来のサブ染色体の欠失又は重複が検出された。6番目の事例では、非常に高いzスコアによって証明されるように、染色体22qの母体由来微小重複が検出された。実際に、事例04及び06は、胎児の微小重複が、母体血漿から無侵襲的に検出されたことを初めて示す。これらの結果は、1つ又は少数のゲノム領域におけるコピー数異常の試験に主に焦点を置いている、Petersら[8]及びJensenら[9]による先の報告と比較して重要な一歩を示している。本明細書に示されているデータは、ゲノムワイド規模でサブ染色体コピー数異常を検出するのに、換言すれば、胎児分子核型を得るのにショットガンMPSを用いることができることを明確に実証している。
倫理的声明。本研究は、香港共同中文大学(the Joint Chinese University of Hong Kong)‐病院当局新界東部クラスタ臨床研究倫理委員会(Hospital Authority New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee)によって承認された。妊婦は、香港のプリンス・オブ・ウェールズ病院(the Prince of Wales Hospital)、クォンワウ病院(the Kwong Wah Hospital)、及びトゥサンユク病院(the Tsan Yuk Hospital)、並びにソウルのアサン医療センター(the Asan Medical Center)からの書面によるインフォームドコンセントによって募集した。
胎児DNAは、妊婦の血漿中に存在する。母体血漿DNAの超並列配列決定を用いて、無侵襲的に、胎児トリソミー21、18、13、及び選択性染色体異数性が検出された。超並列配列決定を用いて、母体血漿から胎児の微小欠失の検出について記載された事例報告がされている。しかしながら、これらの先の報告は、多型依存性であるか、又は1つ若しくは少数のゲノムの選択部分に限定された統計分析が用いられている。本実施例において、手順は、母体血漿DNAの超並列配列決定により、全ゲノムにおいて3 Mbの解像度で無侵襲的出生前核型分析を行うことが報告された。この方法を用いて、6つの事例から得られた血漿を分析した。5つの事例では、胎児の微小重複又は微小欠失が、母体血漿から成功裡に検出された。胎児の微小重複を有する2つの事例は、母体血漿からのかかる変化の最初の無侵襲的出生前検出を示した。他の事例では、血漿DNA配列決定の結果は、妊娠した母親が、微小重複のキャリアであることが一致した。無侵襲的出生前核型分析の診断解像度を2 Mb及び1 Mbまで向上させるために配列決定し配列させる必要がある、血漿DNA分子の数を決定するのにシミュレーション解析を行った。結論として、超並列配列決定により母体血漿から無侵襲的出生前分子核型分析は実施可能であり、無侵襲的出生前検査の診断範囲を高めた。
本明細書に言及されているコンピュータシステムはいずれも、いずれかの適切な数のサブシステムを利用することができる。かかるサブシステムの例を、コンピュータ機器900により図9に示している。一部の実施形態において、コンピュータシステムには、サブシステムがコンピュータ機器の構成要素であり得る、単一のコンピュータ機器が含まれる。他の実施形態において、コンピュータシステムには、それぞれサブシステムである複数のコンピュータ機器と、内部要素とが含まれ得る。
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Claims (20)
- 胎児を宿した女性対象から得られる生体試料を分析することによって、前記胎児のゲノム中の微小増幅又は微小欠失を識別する方法であって、前記生体試料には、前記胎児及び前記女性対象からの無細胞DNAが含まれ、前記方法は、
前記生体試料の複数のDNA断片のそれぞれについて1以上の配列タグを得ることと、
複数のゲノム領域のそれぞれについて、前記配列タグのゲノム位置を決定することと、
コンピュータシステムによって、前記ゲノム領域内にゲノム位置を有する配列タグから、前記ゲノム領域内のDNA断片のそれぞれの量を決定することと、
前記それぞれの量を標準化して、それぞれの密度を求めることと、
該それぞれの密度と基準密度を比較して、前記それぞれの密度が、前記基準密度と統計的に異なるか否かを識別することと、
前記基準密度と統計的に異なるそれぞれの密度を有すると識別されたいずれかの前記ゲノム領域が、前記基準密度と統計的に異なるそれぞれの密度を有すると識別された別のゲノム領域と連続しているか否かを判断することと、
前記基準密度よりも統計的に高いそれぞれの密度を有すると識別された少なくともN(Nは2以上の整数である。)の第1のゲノム領域が連続している場合、該第1の連続するゲノム領域を、微小増幅と識別することと、
前記基準密度よりも統計的に低いそれぞれの密度を有すると識別された少なくともNの第2のゲノム領域が連続している場合、該第2の連続するゲノム領域を、微小欠失と識別すること、
とを含む、方法。 - 前記生体試料が、母体血液、血漿、血清、尿又は唾液である、請求項1に記載の方法。
- 前記配列タグが、超並列配列決定によって得られる、請求項1に記載の方法。
- Nが3である、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノム領域がオーバーラップしていない、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノム領域が隣接している、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノム領域が等しいサイズである、請求項1に記載の方法。
- それぞれのゲノム領域のサイズが約1Mbである、請求項7に記載の方法。
- 前記ゲノム領域のそれぞれの密度が、前記ゲノム領域のDNA断片のそれぞれの量を、複数のゲノム領域のDNA断片の総量で割ることによって求められる、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノム領域のそれぞれの密度が、前記ゲノム領域のDNA断片のそれぞれの量と等しい、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノム領域の基準密度が、前記ゲノム領域において微小増幅又は微小欠失を示さない1以上の他の生体試料から決定される、複数のそれぞれの密度の平均又は中央値である、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノム領域の基準密度が、他のゲノム領域について求められる、複数のそれぞれの密度の平均又は中央値である、請求項1に記載の方法。
- 微小増幅又は微小欠失が母性遺伝されているか否かを判断するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記微小増幅又は前記微小欠失に相当する前記連続するゲノム領域のそれぞれにおいて、前記それぞれの密度と前記基準密度との間の差が特定のカットオフを超える場合、微小増幅又は微小欠失が母性遺伝されていると判断され、前記特定のカットオフが、前記それぞれの密度及び前記基準密度が統計的に異なるか否かを判断するのに用いられるカットオフよりも大きい、請求項13に記載の方法。
- 複数の指示を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を備えたコンピュータ製品であって、該コンピュータ製品は、実行される場合、前記胎児を宿した女性対象から得られる生体試料を分析することによって、胎児のゲノム中の微小増幅又は微小欠失を識別するように、コンピュータシステムを制御し、前記生体試料には、前記胎児及び前記女性対象からの無細胞DNAが含まれ、該方法は、
前記生体試料の複数のDNA断片のそれぞれについて1以上の配列タグを得ることと、
複数のゲノム領域のそれぞれについて、前記配列タグのゲノム位置を決定することと、
前記ゲノム領域内にゲノム位置を有する配列タグから、前記ゲノム領域内のDNA断片のそれぞれの量を決定することと、
前記それぞれの量を標準化して、それぞれの密度を求めることと、
該それぞれの密度と基準密度を比較して、前記それぞれの密度が、前記基準密度と統計的に異なるか否かを識別することと、
前記基準密度と統計的に異なるそれぞれの密度を有すると識別されたいずれかの前記ゲノム領域が、前記基準密度と統計的に異なるそれぞれの密度を有すると識別された別のゲノム領域と連続しているか否かを判断することと、
前記基準密度よりも統計的に高いそれぞれの密度を有すると識別された少なくともN(Nは2以上の整数である。)の第1のゲノム領域が連続している場合、該第1の連続するゲノム領域を、微小増幅と識別することと、
前記基準密度よりも統計的に低いそれぞれの密度を有すると識別された少なくともNの第2のゲノム領域が連続している場合、該第2の連続するゲノム領域を、微小欠失と識別すること、
とを含む、コンピュータ製品。 - Nが3である、請求項15に記載のコンピュータ製品。
- 前記ゲノム領域がオーバーラップしていない、請求項15に記載のコンピュータ製品。
- 前記ゲノム領域が隣接している、請求項15に記載のコンピュータ製品。
- 前記ゲノム領域が等しいサイズである、請求項15に記載のコンピュータ製品。
- 前記ゲノム領域のそれぞれの密度が、前記ゲノム領域のDNA断片のそれぞれの量を、複数のゲノム領域のDNA断片の総量で割ることによって求められる、請求項15に記載のコンピュータ製品。
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