JP2018072641A - シート照明顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】照明光による非等速な走査が行われる場合であっても、照明範囲において均一な積算照度を得ることができるような技術を提供する。
【解決手段】シート照明顕微鏡１０は、撮像面８と共役な観察光学面上からの光を取り込む観察光学系６と、観察光学系６の光軸と直交する方向から照明光を照射し、照明光を標本Ｓに集光する照明光学系１１と、を備え、照明光学系１１は、観察光学面上で照明光の集光位置を移動させる第１の集光位置移動装置である集光位置移動装置３と、集光位置移動装置３による集光位置の移動速度に応じて照明光の強度を変調する照明光強度変調素子２と、を含むことを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、撮像面と共役な面上で照明光を走査させるシート照明顕微鏡に関する。

蛍光標本を観察する際に、観察光学系の光軸に対して垂直な方向からシート状の照明光（以下、シート光とも記載する）を照射する観察手法である、シート照明観察が知られている。シート照明観察では、標本上における撮像面と共役な面（以下、観察光学面とも記載する）にシート光を照射することで観察光学面からの蛍光を取り込む。

この観察手法によれば、一般的な透過型、反射型の顕微鏡と比較して、標本への照明光の照射領域の少なさから標本の褪色性や光毒性を抑えることができる。また、シート光の厚さを薄くすることで観察光学系の光軸方向の分解能を向上させることができることも特徴である。

シート照明観察に関する先行例として、下記のような技術が開示されている。

特許文献１では、ＴＡＧレンズを用いてシート光を走査することで、高速な走査、観察を可能としている。

中国特許出願公開第104407436号明細書

一方、特許文献１のように、シート光を高速に走査する場合、非等速に走査が行われ、照明範囲中で位置毎の積算照度が不均一となることがある。尚、観察光学面中のシート光を走査する範囲を照明範囲とする。また、一度の走査中での照明光の照射位置における累積の照度値を積算照度とする。具体的には、照明範囲の中心と比べて照明範囲の端部において走査速度が遅くなり、端部での積算照度が過剰となってしまう。このような状態では、積算照度が均一となる照明範囲の中心領域しか画像として用いることができない、積算照度が過剰となる標本の領域の褪色を進めてしまう、等の弊害が生じてしまう。

以上の実情を鑑み、本発明では、照明光による非等速な走査が行われる場合であっても、照明範囲において均一な積算照度を得ることができるような技術を提供することを目的とする。

本発明の一態様におけるシート照明顕微鏡は、撮像面と共役な観察光学面上からの光を取り込む観察光学系と、前記観察光学系の光軸と直交する方向から照明光を照射し、前記照明光を標本に集光する照明光学系と、を備え、前記照明光学系は、前記観察光学面上で前記照明光の集光位置を移動させる第１の集光位置移動装置と、前記第１の集光位置移動装置による前記集光位置の移動速度に応じて前記照明光の強度を変調する照明光強度変調素子と、を含むことを特徴とする。

本発明のシート照明顕微鏡によれば、照明光による非等速な走査が行われる場合であっても、照明範囲において均一な積算照度を得ることができる。

第１の実施形態におけるシート照明顕微鏡の構成を示す図。 第１の実施形態における計算装置の機能構成を示す図。 第２の実施形態におけるシート照明顕微鏡の構成を示す図。 第２の実施形態におけるシート照明顕微鏡で行われる処理の手順を説明するフローチャート。 撮像処理の手順を説明するフローチャート。 第２の実施形態の変形例におけるシート照明顕微鏡の構成の一部を示す図。 第２の実施形態の別の変形例におけるシート照明顕微鏡の構成の一部を示す図。 第３の実施形態におけるシート照明顕微鏡の構成を示す図。 第４の実施形態における計算装置の機能構成を示す図。 第４の実施形態におけるシート照明顕微鏡で行われる処理の手順を説明するフローチャート。 フィルタ処理の手順を説明するフローチャート。

以下、本発明の第１の実施形態におけるシート照明顕微鏡１０について図面を用いて説明する。第１の実施形態は、本発明の大まかな特徴を説明するための実施形態であり、シート照明顕微鏡のより詳細な構成の例は、後述する各実施形態において説明される。

図１は、シート照明顕微鏡１０の構成を示す図である。シート照明顕微鏡１０は構成として、レーザ光源１と、照明光学系１１と、固定装置５と、観察光学系６と、撮像面８を含む撮像素子７と、計算装置９とを備える。

レーザ光源１は、照明光としてレーザ光を射出する光源である。

照明光学系１１は、観察光学系６の光軸と直交する方向から照明光を標本Ｓへ向けて照射し、集光する光学系である。尚、照明光学系１１によって照射される標本Ｓ上の領域は、撮像面８と共役な面（以下、観察光学面とも記載する）を含むように照明光学系１１、及び、観察光学系６、撮像素子７が配置されている。照明光学系１１は、照明光強度変調素子２と、集光位置移動装置３と、集光光学系４とを備える。

集光位置移動装置３は、照明光学系１１によって照射される照明光の集光位置を観察光学面上で移動させる第１の集光位置移動装置である。集光位置移動装置３は、例えば、照明光学系１１の光軸方向へ集光位置を移動させる集光位置縦移動装置、または、照明光学系１１の光軸と垂直な方向へ集光位置を移動させる集光位置横移動装置、若しくはその両方を含む装置である。

集光位置縦移動装置には、焦点距離を変更することで集光位置を移動させる可変焦点レンズ等が用いられる。集光位置横移動装置には、照明光学系１１の光路中において、照明光の進行方向を変更することで、標本Ｓ上での集光位置を移動させるガルバノミラー等が用いられる。例えば、集光位置移動装置３が集光位置縦移動装置であるとき、図１に示すように、集光位置移動装置３によって照明光の集光位置が異なる集光位置（第１の集光位置Ａ、第２の集光位置Ｂ、第３の集光位置Ｃ）に移動し得る。

照明光強度変調素子２は、集光位置移動装置３による集光位置の移動速度に応じて照明光の強度を変調する。詳細な構成については後述するが、照明光強度変調素子２は、集光位置移動装置３（集光位置縦移動装置、集光位置横移動装置）の駆動と同期して動作する構成であり、集光位置移動装置３による集光位置の移動速度の変更に連動して、照明光強度変調素子２によるレーザ光源１からの照明光の強度変調が行われるように機能する。好ましくは、照明光強度変調素子２は、集光位置移動装置３による集光位置の移動速度に比例させるように照明光の強度を変調する。

集光光学系４は、照明光強度変調素子２、集光位置移動装置３を経た照明光を標本Ｓへ集光する。集光光学系４は、一枚のレンズから構成されるものであっても、複数のレンズを含むレンズ群であってもよい。

固定装置５は、標本Ｓを固定する。また、固定装置５は、観察光学系６の光軸方向に移動するような手段を有することで、照明光学系１１による照明光の標本Ｓ内の集光位置を観察光学系６の光軸方向に相対的に移動させるような第２の集光位置移動装置を含むように構成されていてもよい。固定装置５が第２の集光位置移動装置を含むことで、標本Ｓの観察光学面の位置が変更され、標本Ｓの観察光学系６の光軸方向の異なる箇所での観察が可能となる。即ち、第１の集光位置移動装置と第２の集光位置移動装置とにより、標本Ｓの３次元による観察が可能となる。

観察光学系６は、標本Ｓの観察光学面上からの光を取り込む光学系である。撮像素子７は、観察光学系６によって取り込まれた光により撮像面８上に結像した、２次元の画像を取得する。撮像素子７としては、ＣＣＤ等が用いられる。

撮像素子７で取得した画像は、計算装置９へ出力され、計算装置９によってストレージ、画像処理、他媒体への画像出力等が行われる。例えば、計算装置９は、コンピュータである。

図２は、計算装置９の機能構成を示す図である。計算装置９は、その機能構成として、画像信号入出力部１２と、記憶部１３と、３次元画像構築部１４と、を備える。

画像信号入出力部１２は、撮像素子７からの画像を受信し、また、計算装置９に記憶されている画像や計算装置９で生成した画像を、表示媒体１５へ出力する。記憶部１３は、画像信号入出力部１２が受信した画像や３次元画像構築部１４が生成した３次元画像を保存する。３次元画像構築部１４は、記憶部１３に記憶されている複数の画像（撮像素子７が取得した複数の２次元画像である）を用いて３次元画像の生成を行う。

以上の構成を有するシート照明顕微鏡１０を用いて、照明光を標本Ｓに照射するときの動作を説明する。尚、以下に記載の制御動作は、例えば、シート照明顕微鏡１０を制御するコンピュータにより実行されるものであり、計算装置９がシート照明顕微鏡１０を制御するコンピュータの役割を担うように構成されていてもよい。また、外付けの別の制御用のコンピュータを設ける構成としてもよい。

まず、レーザ光源１から照明光の発光を開始させ、集光位置移動装置３により観察光学面上の集光位置を移動させるように、照明光の走査を開始する。そしてこのとき、照明光強度変調素子２は、集光位置移動装置３による集光位置の移動速度に応じて照明光の強度を変調する。好ましくは、照明光強度変調素子２は、集光位置移動装置３による集光位置の移動速度に比例するように照明光の強度を変調する。この動作中に撮像素子７により標本Ｓからの光を取得することで、観察光学面中の上記走査を行う範囲の画像を取得することができる。そして、このときに取得される画像は、標本Ｓ上の照明光による走査を行う範囲である走査範囲内において照明光の積算照度が均一となる。尚、同一の観察光学面上における照明光の一度の走査中での、照明光の照射位置における累積の照度値のことを積算照度として記載する。

一般に、従来普及されているシート照明顕微鏡において、標本の観察光学面上で照明光の走査が高速に実行されるとき、照明光の非等速な走査が実行されることになる。より具体的には、観察光学面の走査範囲の端部において、中心付近よりも走査速度が遅くなる。特にこのような走査が行われるとき、走査速度は、時間の正弦波に依存している。

照明光の非等速な走査が実行されると、走査範囲において積算照度にばらつきが生じることとなる。例えば、走査範囲の中心付近よりも走査速度が遅くなる端部において、より照明光が照射されている時間が長くなることから、中心付近と比べて端部の積算照度が過剰となる。

一方で、シート照明顕微鏡１０によれば、照明光強度変調素子２が、集光位置移動装置３による集光位置の移動速度に応じて照明光の強度を変調する。このとき、例えば、照明光強度変調素子２が、集光位置移動装置３による集光位置の移動速度に比例するように照明光の強度を変調することで、走査範囲内において照明光の積算照度が均一となるように強度変調を行うことが可能である。

尚、照明光強度変調素子２は、集光位置移動装置３による集光位置の移動速度に比例するように強度変調を行うような動作に限らず、例えば、走査速度が走査範囲の中心付近に比べて遅い端部の一定領域では、照明光強度を下げ、走査範囲の中心付近では、照明光強度を上げるように動作させてもよい。このような動作によっても、走査範囲内において照明光の積算照度をある程度均一にすることができる。

従って、シート照明顕微鏡１０によれば、照明光による非等速な走査が行われる場合であっても、照明範囲において均一な積算照度を得ることができる。

以下、第２の実施形態におけるシート照明顕微鏡２０について、図面を用いて説明する。第２の実施形態は、第１の実施形態で説明した発明の特徴を含む、より詳細なシート照明顕微鏡の構成の例を説明するものである。

図３は、第２の実施形態のシート照明顕微鏡２０の構成を示す図である。シート照明顕微鏡２０は、レーザ光源２１と、照明光学系３６と、標本Ｓを封入した観察容器２８を固定するステージ２７と、観察光学系３７と、撮像素子３２と、計算装置３５とを備えている。尚、標本Ｓは、上面と側面に観察窓を有する観察容器２８の中に封入されている。また、標本Ｓは、標本Ｓと略等しい屈折率の浸液２９中に浸されている。

また、図３では、シート照明顕微鏡２０をＸ軸（照明光学系３６の光軸）とＺ軸（観察光学系３７の光軸）とからなる平面であるＸＺ平面に直交するＹ軸方向から見た様子と、シート照明顕微鏡２０をＺ軸方向から見た様子とがそれぞれ示されている。

レーザ光源２１は、照明光としてレーザ光を射出する光源である。

照明光学系３６は、シート照明顕微鏡１０の照明光学系１１に相当し、照明光学系１１と同様の機能を有するものである。照明光学系３６は、音響光学フィルタ(ＡＯＴＦ)２２と、ビームエキスパンダ２３と、円筒レンズ２４と、可変焦点レンズ２５と、集光レンズ２６とを備えている。また、可変焦点レンズ２５は、信号発生器３３と電気的に接続されており、ＡＯＴＦ２２は、信号変換機３４と電気的に接続されている。また、信号発生器３３は、信号変換機３４と電気的に接続されている。

ここで、ビームエキスパンダ２３と、円筒レンズ２４と、可変焦点レンズ２５と、集光レンズ２６は、図３のＸＺ平面においてＸ軸方向に収束し、Ｙ軸方向に幅をもつようなシート状の照明光（以下、シート光とも記載する）を形成するための手段である。ビームエキスパンダ２３は、レーザ光源２１から射出される照明光の外径を適切なサイズとなるように大きくし、コリメートする。円筒レンズ２４は、ＸＹ平面においてＸ軸方向に照明光を収束させるような屈折力をもつ。可変焦点レンズ２５は、ＸＺ平面においてＸ軸方向に照明光を収束または発散させるような屈折力をもつ。集光レンズ２６は、Ｘ軸方向に照明光を収束させるような屈折力をもつ。

また、可変焦点レンズ２５は、屈折力を変更することで焦点距離を変更可能である。可変焦点レンズ２５として、例えば、屈折力を高速に変更可能である、ＴＡＧレンズ（Tunable Acoustic Gradient Lens）が用いられる。可変焦点レンズ２５は、屈折力を変更することで照明光を照明光学系３６の光軸方向に走査し、集光位置を照明光学系３６の光軸方向に移動させる。即ち、可変焦点レンズ２５は、集光位置移動装置３（第１の集光位置移動装置）に相当するとともに、照明光学系３６の光軸方向へ集光位置を移動させる集光位置縦移動装置として機能するものである。

可変焦点レンズ２５が屈折力を変更すると、図３のように、第１の集光位置Ａ、第２の集光位置Ｂ、第３の集光位置ＣのようにＸ軸方向へ集光位置が変更される。このとき、Ｙ軸方向の照明光の幅には、目立った変化はない。また、可変焦点レンズ２５は、信号発生器３３が発生する駆動信号により屈折力を変更するように動作する。

ＴＡＧレンズ等である可変焦点レンズ２５は、照明光を高速に走査することができるため観察時間の短縮に寄与するものの、高速な走査を実行した場合、走査範囲内で非等速に照明光の走査が実行される。

ＡＯＴＦ２２は、レーザ光源２１から射出された照明光の光強度を変調する。また、ＡＯＴＦ２２は、信号変換機３４からの制御信号によって制御される。

信号発生装置３３は、可変焦点レンズ２５における屈折力の変更を制御するための駆動信号を生成する。即ち、駆動信号は、照明光の集光位置の移動に同期した信号であるとともに、集光位置の移動速度の情報を有する信号である。信号発生装置３３で発生させた駆動信号は、信号変換装置３４へも伝送される。信号発生装置３３は、可変焦点レンズ２５としてＴＡＧレンズを用いる場合、ＲＦ信号発生器を用いることが望ましい。

信号変換機３４では、信号発生装置３３から伝送された駆動信号をもとに、ＡＯＴＦ２２を制御するための信号に変換する。このとき、信号発生装置３３から伝送された駆動信号が有する集光位置の移動速度の情報を元に、信号変換機３４は、集光位置の移動速度に応じてＡＯＴＦ２２が照明光の強度を変調するような制御信号を生成する。より好ましくは、可変焦点レンズ２５による集光位置の移動速度に比例するように照明光の強度を変調するような制御信号を生成する。ＡＯＴＦ２２は、信号変換機３４による、可変焦点レンズ２５の屈折力の変更を制御するための信号発生装置３３が発生する駆動信号の変換を介して、シート照明顕微鏡１０の照明光強度変調素子２に相当する動作を行うものである。即ち、本実施形態では、ＡＯＴＦ２２は照明光強度変調素子である。

従って、ＡＯＴＦ２２と、信号発生装置３３と、信号変換機３４によっても、第１の実施形態と同様に、走査範囲内において照明光の積算照度が均一となるように、換言するならば、走査範囲内の各位置において照明光の積算照度が略一定となるように、集光位置の移動速度に応じて照明光の強度を変調させることが可能である。

特に、可変焦点レンズ２５による集光位置の移動速度に比例するようにＡＯＴＦ２２において照明光の強度の変調を行うことで、照明光の非等速な走査が行われる場合であっても、照明範囲において均一な積算照度を得ることができる。例えば、集光位置の移動速度が速くなるとき、ＡＯＴＦ２２によってその移動速度に比例して照明強度が強くなるように変調される。また、集光位置の移動速度が遅くなるときには、ＡＯＴＦ２２によってその移動速度に比例して照明強度が弱まるように変調される。

ステージ２７は、標本Ｓを設置して固定するものであり、第１の実施形態のシート照明顕微鏡１０の固定装置５に相当する。ステージ２７は、観察光学系３７の光軸方向に移動することで、照明光学系３６による照明光の標本Ｓ上の集光位置を観察光学系３７の光軸方向に移動させるような第２の集光位置移動装置としても機能する。即ち、シート照明顕微鏡２０では、第１の集光位置移動装置（集光位置縦移動装置である可変焦点レンズ２５）と第２の集光位置移動装置（ステージ２７）とにより、標本Ｓの３次元による観察が可能となる。

観察光学系３７は、対物レンズ３０、光を撮像素子３２の撮像面へ結像するレンズ群３１を含む。対物レンズ３０は、浸液２９の屈折率に適合した液浸対物レンズであって長い作動距離を有する。撮像素子３２は、計算装置３５と接続されている。ここで、撮像素子３２は、シート照明顕微鏡１０の撮像素子７に相当し、計算装置３５は計算装置９に相当するコンピュータである。計算装置３５の機能構成についても、計算装置９の機能構成と同様である。また、本実施形態では、計算装置３５は、シート照明顕微鏡２０の各構成の動作を制御するものとする。

以上の構成を有するシート照明顕微鏡２０によって、標本Ｓを撮像し、観察を行う手順を説明する。図４は、シート照明顕微鏡２０で行われる処理の手順を説明するフローチャートである。図５は、シート照明顕微鏡２０で行われる撮像処理の手順を説明するフローチャートである。以下では、まず図４を用いて、シート照明顕微鏡２０で行われる一連の処理について説明する。

ステップＳ１では、コンピュータである計算装置３５によって各種パラメータが設定される。ここでいうパラメータとは、対物レンズ３０の開口数（ＮＡ）、レーザ光源２１からの照明光の波長、標本Ｓの屈折率、撮像素子３２の画素サイズなどである。

ステップＳ２では、標本Ｓの位置の初期化を行う。その後、ステップＳ３により観察光学面上にある標本Ｓの撮像を行い、撮像素子３２によって標本Ｓの２次元画像を取得する。ステップＳ３の撮像処理については、後述する。尚、撮像素子３２によって取得された２次元画像は一時的に計算装置３５内に格納される。

撮像処理の完了を検知したら（ステップＳ４）、ステージ２７が観察光学系３７の光軸方向に移動することにより標本Ｓの高さ位置を変更する（ステップＳ５）。ここで変更する高さ位置は、少なくともシート光である照明光の広がりをカバーする範囲で変更されることが望ましい。以降、撮像を行う全ての標本Ｓの領域での撮像処理を終えるまで、ステップＳ３からステップＳ５を繰り返す。ステップＳ４において、撮像処理の完了を検知すると共に、撮像を行う全ての標本Ｓの領域での撮像処理の完了が検知されたならば、ステップＳ６へ移行する。

ステップＳ６では、ステップＳ３で取得した複数の２次元画像を用いて３次元画像の生成を行う。ステップＳ６を完了し、生成された３次元画像はコンピュータ内に表示用の画像データとして格納される（ステップＳ７）。この３次元画像が、表示媒体１５等に表示されることで使用者は標本Ｓを観察することができる。

以下、図５を参照しつつシート照明顕微鏡２０で行われる撮像処理（ステップＳ３）の手順を説明する。

ステップＳ１１、Ｓ１２では、レーザ光源２１の発光を開始するとともに、可変焦点レンズ２５による観察光学面上にある標本Ｓ上で照明光の走査、すなわち集光位置の移動を開始する。ステップＳ１３では、ステップＳ１１、Ｓ１２の処理と同期して、撮像素子３２が撮像を開始する。

このとき、可変焦点レンズ２５による集光位置の移動に同期して、ＡＯＴＦ２２による照明光の強度変調が実行される。例えば、上述したように、ＡＯＴＦ２２は、集光位置の移動速度に比例するように照明光の強度を変調する。このような制御により、可変焦点レンズ２５として、ＴＡＧレンズ等を用い、高速な照明光の走査を行うことで標本Ｓ上での集光位置の移動が非等速に行われる場合であっても、走査範囲端部等の移動速度が遅くなる領域で、速度に比例して照明強度が弱まり、積算照度が過剰となるような事態を防ぐことができる。即ち、走査範囲の各位置において積算照度を均一とすることができる。

走査範囲中での撮像が完了したら、レーザ光源２１をＯＦＦとして照明光の照射を終了し（ステップＳ１４）、可変焦点レンズ２５による集光位置の移動を停止させて（ステップＳ１５）、撮像処理を完了する。

以上のように、シート照明顕微鏡２０によれば、照明光による非等速な走査が行われる場合であっても、照明範囲において均一な積算照度を得ることができる。

また、本実施形態では、照明光学系３６の光軸方向へ集光位置を移動させる集光位置縦移動装置として可変焦点レンズ２５を含むものとしたが、この構成に限らない。例えば、可変焦点レンズ２５の代わりに、レンズと、そのレンズの位置を変更するレンズ位置変更素子を含む構成であってもよい。このような構成によっても、レンズの位置を変更することで照明光学系３６の光軸方向へ集光位置を移動させることができるため、レンズ及びレンズ位置変更素子は、集光位置縦移動装置として機能する。尚、レンズ位置変更素子は、例えば、ボイスコイルである。

また、集光位置縦移動装置として可変焦点レンズ２５を有する構成の代わりに図６のような構成としてもよい。図６は、第２の実施形態の変形例であるシート照明顕微鏡４０の構成の一部を示す図である。

シート照明顕微鏡４０は、照明光学系４７中において、可変焦点レンズ２５の代わりに、ミラー４２、４３、４４、４６を含む。また、ミラー４３、４４を二つ合わせて図６の矢印の方向に移動させるミラー位置変更素子４５を含む。尚、ミラー位置変更素子４５は、例えば、ボイスコイルやピエゾ素子である。

信号発生装置３３は、駆動信号を発生させることでミラー位置変更素子４５によるミラー４３、４４の移動を制御する。また、信号発生装置３３は、その駆動信号を信号変換機３４へ伝送する。シート照明顕微鏡４０のそれ以外の構成については、シート照明顕微鏡１０と等しい。

このような構成では、ミラー４３、４４が図６の矢印の方向に移動することで照明光学系４７中の光路長が変更され、標本Ｓの観察光学面上での集光位置がＸ軸方向に移動する。即ち、ミラー（ミラー４２、４３、４４、４６）及びミラー位置変更素子４５は、集光位置縦移動装置として機能する。

このような構成によっても、シート照明顕微鏡２０と同様に、照明光による非等速な走査が行われる場合であっても、照明範囲において均一な積算照度を得ることができる。

また、照明光強度変調素子として、ＡＯＴＦ２２を有する構成の代わりに図７のような構成としてもよい。図７は、第２の実施形態の別の変形例であるシート照明顕微鏡５０の構成の一部を示す図である。

シート照明顕微鏡５０は、ＡＯＴＦ２２の代わりに、ハーフミラー５１と、ガルバノミラー５２と、反射率分布型ミラー５３とを含む。ガルバノミラー５２は、図７の矢印の方向に回転駆動することで、照明光の反射方向を変更する。反射率分布型ミラー５３は、湾曲したミラーであり、反射面の各位置によって反射率が異なるような表面処理がなされている。尚、ガルバノミラー５２と反射率分布型ミラー５３の反射面との間の光路長は、ガルバノミラー５２を回転駆動させた各状態において変わらない。

例えば、ガルバノミラー５２が異なるそれぞれの角度で反射率分布型ミラー５３に照明光を反射させたとき、反射率分布型ミラー５３における照明光の照射位置が位置ａ、位置ｂのように切り替わる。従って、例えば、ガルバノミラー５２の角度が大きくなるにつれて、反射率分布型ミラー５３における反射率が大きくなるように表面処理がなされていることで、ガルバノミラー５２の回転駆動に伴い、照明光の強度を変調することができる。即ち、このような構成では、ガルバノミラー５２の回転駆動に伴い、照明光の強度が変調されるため、ガルバノミラー５２と反射率分布型ミラー５３は、照明光強度変調素子として機能する。

また、ガルバノミラー５２は、信号変換機３４と電気的に接続されており、信号変換機３４が変換したガルバノミラー制御用の信号によって制御される。その他のシート照明顕微鏡５０の構成については、シート照明顕微鏡２０と同様である。

このような構成によっても、シート照明顕微鏡２０と同様に、照明光による非等速な走査が行われる場合であっても、照明範囲において均一な積算照度を得ることができる。

以下、第３の実施形態におけるシート照明顕微鏡６０について、図面を用いて説明する。

図８は、シート照明顕微鏡６０の構成を示す図である。図８において、図３で示した第２の実施形態のシート照明顕微鏡２０の構成と同一の構成については、同じ番号を付している。シート照明顕微鏡６０は、シート照明顕微鏡２０と異なる構成として、照明光学系６３を備えている。

照明光学系６３は、信号発生装置３３と電気的に接続された偏向素子６１と、円筒レンズ６２を新たに備えている点において、シート照明顕微鏡２０の照明光学系３６と異なる。

偏向素子６１は、信号発生器３３が発生させる可変焦点レンズ２５を制御する駆動信号（以降、第１の駆動信号と記す）とは別の駆動信号（以降、第２の駆動信号と記す）により、照明光学系６３中の照明光を偏向する。具体的には、偏向素子６１は、照明光の進行方向をＸ軸上からＹ軸方向に角度を有するように変更する。

即ち、偏向素子６１は、集光レンズ２６によって集光する照明光の集光位置を、照明光学系６３の照明光軸と垂直な方向（Ｙ軸方向）に移動させる集光位置横移動装置として機能する。偏向素子６１としては、共振式のガルバノミラー等が用いられる。また、第２の駆動信号は、偏向素子６１による集光位置の移動速度の情報を有する情報であるといえる。

信号発生装置３３は、第２の実施形態で述べたように第１の駆動信号と同様に、第２の駆動信号についても信号変換機３４へ伝送する。信号変換機３４は、集光位置の移動速度の情報をもとに、第２の駆動信号を変換し制御信号（第２の制御信号）を生成し、ＡＯＴＦへ伝送する。ＡＯＴＦ２２は、第２の制御信号によって制御を受け、動作する。より具体的には、ＡＯＴＦ２２は、偏向素子６１の集光位置の移動速度に応じて照明光の強度を変調するように動作する。より好ましくは、ＡＯＴＦ２２は、偏向素子６１の集光位置の移動速度に比例するように、照明光の強度を変調する。

円筒レンズ６２は、ＸＹ平面においてＸ軸方向に照明光を収束させるような屈折力をもつ。即ち、照明光学系６３は、円筒レンズ６２を有することで、ＸＺ平面においてＸ軸方向に収束し、ＸＹ平面においてもＸ軸方向に収束するようなシート光を形成する。

以上の構成を有するシート照明顕微鏡６０によれば、照明光の集光位置について、照明光学系６３の光軸方向であるＸ軸方向だけでなく、照明光学系６３の光軸と直交する方向であるＹ軸方向についても、移動させることができる。また、偏向素子６１によって非等速に集光位置の移動が行われる場合であっても、走査範囲端部等の移動速度が遅くなる領域で、速度に比例して照明強度が弱まり、積算照度が過剰となるような事態を防ぐことができる。即ち、走査範囲の各位置において積算照度を均一とすることができる。

従って、標本Ｓの観察光学面の走査範囲（本実施形態ではＸＹ平面である）内で均一な積算照度を得ることができる。即ち、シート照明顕微鏡６０によれば、走査範囲内で、Ｘ軸方向、Ｙ軸方向の照明光の走査（集光位置の移動）が非等速に行われるものであっても、走査範囲内で均一な積算照度を得ることができる。

また、円筒レンズ６２がＸＹ平面においてもＸ軸方向に収束するようなシート光を形成していることで、Ｙ軸方向の照明光の走査に応じて、走査範囲内でシート光を万遍なく照射することができる。例えば、仮にシート照明顕微鏡６０が円筒レンズ６２のような構成を有さず、ＸＹ平面においてＸ軸方向に収束しない照明光が照射される場合、標本Ｓの走査範囲内に照明光を吸収または反射するような異物が存在した場合、その異物より後側（Ｘ軸方向側）には照明光が当たらない領域が出来てしまう。一方で、シート照明顕微鏡６０のように、円筒レンズ６２によってＸＹ平面においてＸ軸方向に収束するようなシート光を形成し、偏向素子６１によって照明光のＹ軸方向の走査を行うことで、走査範囲内に異物が存在する場合であっても異物より後側（Ｘ軸方向側）に照明光を照射することができる。

以下、第４の実施形態におけるシート照明顕微鏡８０について、図面を用いて説明する。シート照明顕微鏡８０は、計算装置９の代わりに計算装置７０を備える点で、第１の実施形態におけるシート照明顕微鏡１０と異なっているが、それ以外の構成についてはシート照明顕微鏡１０と同様である。また、シート照明顕微鏡８０は、計算装置７０が実行する画像処理のプロセスが他の実施形態と異なるものの、それ以外の顕微鏡の構成や作用については、等しいものである。即ち、撮像素子が画像を取得するまでの構成については、第１の実施形態から第３の実施形態で説明したいずれのシート照明顕微鏡の構成を組み合わせても構わない。以下、計算装置７０の機能構成と、計算装置７０で実行される処理について詳細に説明する。

図９は、計算装置７０の機能構成を示す図である。計算装置７０は、その機能構成として、画像信号入出力部１２と、記憶部１３と、３次元画像構築部１４と、フィルタ処理部７１と、を備える。画像信号入出力部１２と、記憶部１３と、３次元画像構築部１４については、図２で説明したものと同様の機能構成である。

フィルタ処理部７１は、３次元画像構築部１４が生成した３次元画像データに対してシート照明顕微鏡８０の光学伝達特性に応じて、その３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う。

光学伝達特性とは、情報が光学的にどの程度伝達されるかを示す特性のことである。光学系の光学伝達特性とは、その光学系の結像特性のことであり、点像分布関数（ＰＳＦ：Point Spread Function）や光学伝達関数（ＯＴＦ：Optical Transfer Function）などがその代表例である。顕微鏡装置の光学伝達特性とは、顕微鏡装置で行われる照明を考慮した特性であり、顕微鏡装置が備える観察光学系の光学伝達特性と、照明状態（即ち、撮像素子の露光期間内における照明光量分布）とによって決定される。例えば、ある照明状態における顕微鏡装置の光学伝達特性とは、観察光学系の光学伝達特性とその照明状態とにより決定される光学伝達特性のことである。画像が有する空間周波数特性とは、画像に含まれる空間周波数成分の強度および位相の分布状態のことである。空間周波数特性を変更するとは、空間周波数成分の強度および位相の分布状態を変更することである。

図１に示されるように、本発明の実施形態に係るシート照明顕微鏡は、観察光学系の光軸方向に広がりを有するシート光を標本Ｓに照射する。例えば、照明光学系からの照明光の集光位置が位置Ｂである場合、位置Ｂにおける照明光の強度分布が最も強く、集光位置から離れるほど、強度分布が弱くなるとともに、広がりが大きくなる。従って、シート光の集光位置を固定した照明では、蛍光物質の励起に十分で且つ照明光学系の光軸方向におよそ均質な照明強度を有する領域（以降、照明領域と記す）は、集光位置の近傍に限られることになる。

これに対して、照明光の集光位置が照明方向に移動する場合、観察方向の強度分布は、照明方向に異なる複数の集光位置での強度分布の積算によって得られる。従って、照明方向に平均化されることになるため、観察方向の強度分布は照明方向の位置によらずおよそ同じ形状を有し、その結果、照明方向の広い領域に照明領域が形成される。

一方、そのような照明状態では、非集光位置の照明光が寄与することで、照明光量分布が観察方向に全体的に広がってしまう。即ち、集光位置の照明光が有する高い空間周波数成分の強度が非集光位置の照明光の影響により相対的に低下するため、シート照明顕微鏡８０の光学伝達特性（特に観察光学系の光軸方向についての光学伝達特性）が劣化してしまう。

そのため、露光期間中に集光位置を照明光学系の照明方向に移動する照明状態（以降、第１の照明状態と記す）と、露光期間中に集光位置を固定した照明状態（以降、第２の照明状態と記す）とでは、第１の照明状態におけるシート照明顕微鏡８０の光学伝達特性（第１の光学伝達特性）が、第２の照明状態におけるシート照明顕微鏡８０の光学伝達特性（第２の光学伝達特性）よりも劣化する。即ち、第１の照明状態で取得した画像は、第２の照明状態で取得した画像よりも観察光学系の光軸方向の分解能（以降、ｚ分解能と記す）が低下する。

フィルタ処理部７１が実行する空間周波数フィルタ処理は、第２の照明状態で取得される画像のｚ分解能と比較して劣化した第１の照明状態で取得される画像のｚ分解能を、第２の照明状態で取得される画像のｚ分解能程度に回復する処理である。

空間周波数フィルタ処理は、例えば、空間周波数領域で特定のフーリエフィルタを、第１の照明状態におけるシート照明顕微鏡の点像分布関数（第１の光学伝達特性である）に対してかけるような処理である。特定のフーリエフィルタは、第１の光学伝達特性、第２の光学伝達特性に基づいて算出されるものである。より具体的には、特定のフーリエフィルタは、第２の照明状態におけるシート照明顕微鏡の点像分布関数（第２の光学伝達特性である）を第１の照明状態におけるシート照明顕微鏡の点像分布関数（第１の光学伝達特性である）で割ることで得られる。

このような空間周波数フィルタ処理を実行することで、第１の照明状態で画像が取得された場合であっても、その画像のｚ分解能について、第２の照明状態で取得した画像のｚ分解能程度の分解能まで補償することができる。

以上の構成を有するシート照明顕微鏡８０によって、標本Ｓを撮像し、観察を行う手順を説明する。図１０は、シート照明顕微鏡８０で行われる処理の手順を説明するフローチャートである。図１１は、シート照明顕微鏡８０で行われるフィルタ処理の手順を説明するフローチャートである。以下では、まず図１０を用いて、シート照明顕微鏡８０で行われる一連の処理について説明する。

図１０の処理では、ステップＳ２１、ステップＳ２２以外の処理は、図４で説明した処理と同様である。

ステップＳ２１では、フーリエフィルタを設定する。ここでは、計算装置７０は、ステップＳ１で設定された情報からシート照明顕微鏡８０の光学伝達特性を算出し、算出した光学伝達特性に基づいてフーリエフィルタを算出して設定する。具体的には、シート照明顕微鏡８０の第１の光学伝達特性と第２の光学伝達特性とに基づいて上述したような特定のフーリエフィルタを算出する。

ステップＳ６で３次元画像データが構築されると、ステップＳ２２へ移行する。以下、図１１を用いてステップＳ２２の処理を説明する。

ステップＳ２２では、計算装置７０がステップＳ６で構築された３次元画像データをフーリエ変換する（ステップＳ２３）。そして、変換後の画像データに対してステップＳ２１で設定したフーリエフィルタを用いてフーリエフィルタ処理を行う（ステップＳ２４）。最後に、計算装置７０は逆フーリエ変換を行って（ステップＳ２５）、３次元画像を再生し、フィルタ処理を終了する。

シート照明顕微鏡８０によれば、計算装置７０がシート照明顕微鏡８０の光学伝達特性に基づいて標本Ｓの３次元画像の画像データに対して空間周波数フィルタ処理を行うことで、照明領域全体にわたって高いｚ分解能を有する画像を得ることができる。

また、第１の実施形態から第３の実施形態の各シート照明顕微鏡と同様に、照明光による非等速な走査が行われる場合であっても、照明範囲において均一な積算照度を得ることができる。

上述した実施形態は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。シート照明顕微鏡は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

１０、２０、４０、５０、６０、８０ シート照明顕微鏡
１、２１ レーザ光源
２ 照明光強度変調素子
３ 集光位置移動装置
４ 集光光学系
５ 固定装置
６、３７ 観察光学系
１１、３６、４７、６３ 照明光学系
７、３２ 撮像素子
８ 撮像面
９、３５、７０ 計算装置
２２ ＡＯＴＦ
２３ ビームエキスパンダ
２４、６２ 円筒レンズ
２５ 可変焦点レンズ
２６、４１ 集光レンズ
２７ ステージ
２８ 観察容器
２９ 浸液
３０ 対物レンズ
３１ レンズ群
３３ 信号発生装置
３４ 信号変換機
４２、４３、４４、４６ ミラー
４５ ミラー位置変更素子
５１ ハーフミラー
５２ ガルバノミラー
５３ 反射率分布型ミラー
６１ 偏向素子
１２ 画像信号入出力部
１３ 記憶部
１４ ３次元画像構築部
１５ 表示媒体
７１ フィルタ処理部
Ｓ 標本Ｓ
Ａ、Ｂ、Ｃ、ａ、ｂ 位置

Claims (14)

1. 撮像面と共役な観察光学面上からの光を取り込む観察光学系と、
   前記観察光学系の光軸と直交する方向から照明光を照射し、前記照明光を標本に集光する照明光学系と、を備え、
   前記照明光学系は、
   前記観察光学面上で前記照明光の集光位置を移動させる第１の集光位置移動装置と、
   前記第１の集光位置移動装置による前記集光位置の移動速度に応じて前記照明光の強度を変調する照明光強度変調素子と、を含む
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
2. 請求項１に記載のシート照明顕微鏡であって、
   前記第１の集光位置移動装置は、前記集光位置を前記照明光学系の照明光軸方向に移動させる集光位置縦移動装置を含む
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
3. 請求項２に記載のシート照明顕微鏡であって、
   前記集光位置縦移動装置は、可変焦点レンズを含む
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
4. 請求項３に記載のシート照明顕微鏡であって、
   前記可変焦点レンズは、ＴＡＧレンズである
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
5. 請求項２に記載のシート照明顕微鏡であって、
   前記集光位置縦移動装置は、レンズ及びレンズ位置変更素子を含む
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
6. 請求項５に記載のシート照明顕微鏡であって、
   前記レンズ位置変更素子は、ボイスコイルである
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
7. 請求項２に記載のシート照明顕微鏡であって、
   前記集光位置縦移動装置は、ミラー及びミラー位置変更素子を含む
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
8. 請求項７に記載のシート照明顕微鏡であって、
   前記ミラー位置変更素子は、ボイスコイルである
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
9. 請求項７に記載のシート照明顕微鏡であって、
   前記ミラー位置変更素子は、ピエゾ素子である
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
10. 請求項１乃至請求項９のいずれかに記載のシート照明顕微鏡であって、
    前記第１の集光位置移動装置は、前記集光位置を前記照明光軸と垂直な方向に移動させる集光位置横移動装置を含む
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
11. 請求項１０に記載のシート照明顕微鏡であって、
    前記集光位置横移動装置は、共振式ガルバノミラーである
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
12. 請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載のシート照明顕微鏡であって、
    前記照明光強度変調素子は、音響光学フィルタである
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
13. 請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載のシート照明顕微鏡であって、
    前記照明光強度変調素子は、ガルバノミラーと反射率分布型ミラーである
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
14. 請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載のシート照明顕微鏡であって、さらに、
    前記集光位置を前記観察光学系の光軸方向に移動させる第２の集光位置移動装置と、
    前記観察光学系が取り込んだ光から画像信号を取得する撮像素子と、
    前記撮像素子が取得する前記画像信号を用いて３次元画像データを生成する計算装置と、を備え、
    前記計算装置は、前記第２の集光位置移動装置によって前記観察光学系の光軸方向の前記集光位置がそれぞれ異なる位置に移動された状態で、前記撮像装置が取得した複数の画像信号から生成される３次元画像データに対して、前記シート照明顕微鏡の光学伝達特性に応じて、前記３次元画像データが有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡。

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