JP2018072098A - Corium stain prevention/improvement agent and/or screening method of macrophage attractant - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤のスクリーニング方法に関し、更に詳しくは、マクロファージによる貪食を促進する、真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a screening method for a dermal spot prevention / amelioration agent and / or a macrophage attractant, and more particularly to a screening method for a dermal spot prevention / amelioration agent and / or a macrophage attractant that promotes phagocytosis by macrophages.
私たちの肌は常に外的環境から様々なストレスを受けている。特に紫外線による皮膚への傷害は、シミ、そばかす、日焼けの大きな原因になっている。その対策としては、従来、メラニン産生に影響を及ぼす酵素であるチロシナーゼを阻害する物質や、培養したメラノサイトに有効成分を添加して、メラノサイトのメラニン産生を抑制する物質を有効成分として配合する化粧料が利用されてきた。コウジ酸、ハイドロキノン誘導体および、桑白皮、甘草等種々植物抽出物はメラノサイトのメラニン産生を抑制することにより、美白作用を期待するものである。これらの物質はメラノサイトに直接働きかけ、その作用によりメラニン産生を抑制することにより美白効果を期待するものであった。 Our skin is always subjected to various stresses from the external environment. In particular, skin damage caused by ultraviolet rays is a major cause of spots, freckles, and sunburn. As countermeasures, cosmetics that conventionally contain substances that inhibit tyrosinase, an enzyme that affects melanin production, or substances that inhibit melanin production of melanocytes by adding active ingredients to cultured melanocytes as active ingredients Has been used. Kojic acid, hydroquinone derivatives, and various plant extracts such as mulberry bark and licorice are expected to have a whitening effect by suppressing melanin production of melanocytes. These substances acted directly on melanocytes, and expected to have a whitening effect by suppressing melanin production.
紫外線照射などにより、基底層で産生されたメラニンは、表皮細胞に移行して角層に到達し、垢となって排出される。しかし、産生されたメラニンの一部は真皮で検出され、長期間にわたって存在し外見上、青味がかったシミとなって残ってしまう。これら真皮に存在するメラニンによるシミに対しては、従来の美白剤では、その効果が十分ではなかった。したがって、真皮に存在するメラニンによるシミに対しても美白効果の高い化粧料の開発が望まれていた。 Melanin produced in the basal layer by UV irradiation or the like moves to epidermal cells, reaches the stratum corneum, and is discharged as dirt. However, a part of the produced melanin is detected in the dermis and remains for a long period of time, and remains as a bluish stain. The effect of the conventional whitening agent on the melanin stains present in the dermis has not been sufficient. Therefore, it has been desired to develop a cosmetic material having a high whitening effect against stains caused by melanin present in the dermis.
マクロファージは貪食能が高い細胞と定義され、体に生じた廃棄物の処理が主な役割であり、古くなった細胞や死滅した細胞の処理を行っていることが知られている。この性質を利用して、マクロファージ活性化剤の提案がされている（特許文献１）。しかしながら、本マクロファージ活性化剤は、真皮に存在するメラニン（メラノソーム含む。以下同じ。）の貪食を促進するものであり、真皮に存在するメラニンを取り込んだ線維芽細胞の貪食を想定しているものではない。 Macrophages are defined as cells with high phagocytic ability, and the main role is processing of waste generated in the body, and it is known that they are processing old and dead cells. Utilizing this property, a macrophage activator has been proposed (Patent Document 1). However, this macrophage activator promotes phagocytosis of melanin (including melanosomes, the same applies hereinafter) present in the dermis, and assumes phagocytosis of fibroblasts incorporating melanin present in the dermis. is not.
マクロファージは遊走因子、例えば ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）によって標的の場所まで移動して貪食することが知られている（非特許文献１、２）。
また、線維芽細胞がメラニン顆粒を含むメラノソームを貪食する機能を持つことが確認されたが、線維芽細胞のメラノソーム貪食が真皮のシミにどのように関与しているのかは明らかにされていない（非特許文献３）。
Macrophages are known to migrate to phagocytosis by migratory factors such as MCP-1 (CCL2) (Non-patent Documents 1 and 2).
In addition, it has been confirmed that fibroblasts have a function of phagocytosing melanosomes including melanin granules, but it is not clear how melanosome phagocytosis of fibroblasts is involved in dermal spots ( Non-patent document 3).
本発明は、真皮に存在するメラニンによるシミ（以下、「真皮シミ」という場合がある。）の予防・改善剤及び／又はマクロファージを誘引する剤をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for screening a preventive / ameliorating agent and / or an agent that induces macrophages due to melanin present in the dermis (hereinafter sometimes referred to as “dermal spot”).
本発明者らは、上記背景に鑑み、線維芽細胞のメラノソーム貪食と真皮シミに関する研究を進めたところ、線維芽細胞がメラノソームを貪食すると、細胞の情報伝達物質であるサイトカインのうち、白血球などの遊走を引き起こし、炎症の形成に関与することが知られているケモカインの発現を大きく増加させることを突き止めた。更に詳しく調べたところ、これらのケモカインにはマクロファージおよび単球のケモタキシスを誘発することが知られているＭＣＰ−１や、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４等のＭＣＰｓが含まれていることを発見した。 In light of the above background, the present inventors have conducted research on melanosome phagocytosis and dermal spots of fibroblasts, and when fibroblasts phagocytose melanosomes, among the cytokines that are cell signaling substances, such as leukocytes It was found that the expression of chemokines known to cause migration and participate in the formation of inflammation is greatly increased. Upon further examination, these chemokines include MCP-1, which is known to induce chemotaxis of macrophages and monocytes, and MCPs such as MCP-2, MCP-3, and MCP-4. I discovered that.
興味深いことに、線維芽細胞にメラノソームを添加すると、一旦メラノソームを貪食した後、近傍の特定の線維芽細胞にメラノソームを集める（移送する）現象が生じ、当該メラノソームが集められた線維芽細胞に優先的にマクロファージが集まってくることを突き止めた。 Interestingly, once melanosomes are added to fibroblasts, the melanosomes are phagocytosed, and then the melanosomes are collected (transferred) to specific fibroblasts in the vicinity. I found that macrophages gathered.
他方、図２に示すように、線維芽細胞にメラノソームを添加すると、添加量に比例してＭＣＰ−１量の増加が確認されたことから、真皮にメラノソームが存在した場合、線維芽細胞がメラノソームを貪食すると、ＭＣＰｓの発現を高め、マクロファージのケモタキシスを誘発し、メラノソームを貪食した線維芽細胞の貪食を促しているものと考えられた。
更に具体的には、メラノソームを貪食した線維芽細胞が、その後、近傍の特定の線維芽細胞にメラノソームを移送することで、特定の線維芽細胞におけるＭＣＰｓの発現が更に高まることになる結果、メラノソームをより多く含んだ線維芽細胞に対し特異的にマクロファージを呼び寄せることができ、メラノソームを貪食した線維芽細胞の貪食を優先的に行っているものと考えられた。
発明者らは、以上の知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
On the other hand, as shown in FIG. 2, when melanosomes were added to the fibroblasts, the increase in the amount of MCP-1 was confirmed in proportion to the amount added, so that when melanosomes were present in the dermis, the fibroblasts became melanosomes. Phagocytosis was thought to increase MCPs expression, induce chemotaxis of macrophages, and promote phagocytosis of fibroblasts phagocytosed by melanosomes.
More specifically, fibroblasts that have phagocytosed melanosomes then transfer melanosomes to specific fibroblasts in the vicinity, thereby further increasing the expression of MCPs in specific fibroblasts. It was thought that macrophages could be specifically attracted to fibroblasts containing more and thus preferentially phagocytosed fibroblasts that phagocytosed melanosomes.
Based on the above findings, the inventors have completed the present invention.
すなわち本発明は、真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤のスクリーニング方法であって、線維芽細胞にメラノソームを添加する工程を含み、線維芽細胞のメラノソーム貪食により変化する遺伝子及び／又はタンパク質の発現量、或いは、線維芽細胞間でのメラノソームの移送度を指標とする工程を含むことで、上記課題を解決した。 That is, the present invention is a screening method for an agent for preventing / ameliorating dermal spots and / or a macrophage attractant, comprising a step of adding melanosomes to fibroblasts, and a gene and / or protein that changes by phagocytosis of fibroblasts The above-mentioned problems have been solved by including a step using as an index the expression level of phenotype or the transfer rate of melanosomes between fibroblasts.
本発明によれば、これまで難しいと考えられてきた真皮シミを改善する成分の提供が可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a component that improves dermal spots, which have been considered difficult until now.
本発明は、真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤のスクリーニング方法であって、線維芽細胞にメラノソームを添加した際、線維芽細胞がメラノソームを貪食することによって、線維芽細胞中の特定の遺伝子及び／又はタンパク質の発現量が変化していることを発見し、更には、メラノソームを貪食した線維芽細胞がメラノソームを特定の線維芽細胞に移送し、メラノソームの移送を受けた特定の線維芽細胞にマクロファージが特異的に集まるという知見に基づくものである。 The present invention is a screening method for a dermal spot prevention / amelioration agent and / or a macrophage attractant, and when melanosomes are added to fibroblasts, the fibroblasts phagocytose the melanosomes, thereby identifying the fibroblasts. In addition, the fibroblasts that phagocytosed melanosomes transferred melanosomes to specific fibroblasts, and the specific fibers that received melanosome transfer This is based on the finding that macrophages specifically gather in blast cells.
第１には、真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤をスクリーニングする方法において用いることのできる指標の決定方法を提供する。
第２には、第１発明で選択した指標を用いた真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤をスクリーニングする方法を提供する。
第３には、特定の遺伝子及び／又はタンパク質を指標とする真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤のスクリーニング方法を提供する。
第４には、メラノソームを線維芽細胞に添加する工程を含み、被験物質を評価する際に、線維芽細胞間におけるメラノソームの移送度を指標として真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤をスクリーニングする方法を提供する。
First, the present invention provides a method for determining an index that can be used in a method for screening an agent for preventing / ameliorating dermal spots and / or a macrophage attractant.
Second, the present invention provides a method of screening for a dermal spot preventing / ameliorating agent and / or a macrophage attracting agent using the index selected in the first invention.
Thirdly, the present invention provides a screening method for an agent for preventing / ameliorating dermal spots and / or a macrophage attractant using a specific gene and / or protein as an index.
Fourth, the method includes a step of adding melanosomes to fibroblasts, and when evaluating a test substance, an agent for preventing or improving dermal spots and / or a macrophage attractant is used as an index of melanosome transport between fibroblasts. Provide a method of screening.
＜線維芽細胞＞
本発明に用いる線維芽細胞は、理化学研究所のＣＥＬＬ ＢＡＮＫやＪＣＲＢ細胞バンク等で購入することができる。例えば、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞を使用することができ、培養に用いる培地も各社がそれぞれ細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。試験に用いるこれらの細胞は、細胞活動が正常に行えるという点で、継代数が１〜８までが好ましいが、それ以降のものでも増殖性などが著しく低下せず、細胞形態が異常でなければ使用できる。本発明では、培養線維芽細胞を単に線維芽細胞と称する場合がある。
<Fibroblast>
Fibroblasts used in the present invention can be purchased from CELL BANK, JCRB cell bank, etc. of RIKEN. For example, normal human skin-derived fibroblasts can be used, and the medium used for the culture may be a medium recommended by each company for the cell type. These cells used in the test preferably have a passage number of 1 to 8 in that cell activity can be normally performed. However, even if the cells after that are not abnormally proliferative, the cell morphology is not abnormal. Can be used. In the present invention, the cultured fibroblasts are sometimes simply referred to as fibroblasts.
＜メラノソーム＞
メラノソームは、線維芽細胞が貪食することができれば特に限定されないが、本発明ではメラニンも含む概念で用いる。
メラノソームとしては、特に限定されないが、ヒト、マウスなどのメラノサイトもしくはメラノーマより抽出、精製したもの、チロシン等から合成したもの等が使用できる。
<Melanosomes>
Melanosome is not particularly limited as long as fibroblasts can phagocytose, but in the present invention, it is used in a concept including melanin.
The melanosomes are not particularly limited, and those extracted and purified from human or mouse melanocytes or melanoma, those synthesized from tyrosine, and the like can be used.
＜線維芽細胞のメラノソーム取り込み＞
線維芽細胞にメラノソームを取り込ませるには、培地にメラノソームを添加するだけで良い。メラノソームを適量添加すると、線維芽細胞は容易にメラノソームの取り込みを行う。
線維芽細胞がメラノソームを取り込んだか否かの確認は、任意の方法で行うことができるが、例えば、フォンタナマッソン染色によりメラニンを染色する方法を用いて確認することができる。また、染色しなくとも、十分な量のメラノソームが添加されている場合、明視野での顕微鏡観察でも細胞内にメラノソームが取り込まれている様子が確認できる。細胞の状態、添加するメラノソームの量にもよるが、線維芽細胞への取り込みが顕微鏡ではっきり確認できるのは、メラノソーム添加後概ね１日程度である。
もっとも、発明者らは、線維芽細胞にメラノソームを添加後、遅くとも１時間後には取り込みがされていることをタイムラプス動画撮影にて確認しているので、上記確認作業を行わなくても、メラノソームを添加すれば、線維芽細胞はメラノソームを取り込んでいると判断しても差し支えない。
本願のスクリーニング方法において、線維芽細胞にメラノソームを取り込ませる場合には、用いた線維芽細胞の一部がメラノソームを取り込んでいれば良く、すべての線維芽細胞がメラノソームを取り込んでいる必要はない。
<Melanosome uptake of fibroblasts>
To incorporate melanosomes into fibroblasts, it is only necessary to add melanosomes to the medium. When an appropriate amount of melanosomes is added, fibroblasts easily take up melanosomes.
Whether or not the fibroblasts have taken up melanosomes can be confirmed by any method, for example, it can be confirmed by using a method of staining melanin by Fontanamasson staining. Moreover, even if it is not dye | stained, when sufficient amount of melanosome is added, the mode that the melanosome is taken in in the cell can be confirmed also by the microscope observation in a bright field. Although it depends on the state of the cells and the amount of melanosomes added, the uptake into fibroblasts can be clearly confirmed with a microscope in about one day after the addition of melanosomes.
However, since the inventors have confirmed by time-lapse movie shooting that the uptake has been made at least one hour after adding melanosomes to fibroblasts, the melanosomes can be obtained without performing the above confirmation work. If added, it may be determined that the fibroblasts have taken up melanosomes.
In the screening method of the present application, when melanosomes are incorporated into fibroblasts, it is only necessary that some of the fibroblasts used incorporate melanosomes, and it is not necessary that all fibroblasts incorporate melanosomes.
＜線維芽細胞におけるメラノソームの移送＞
本願発明者らは、前述の方法で、線維芽細胞にメラノソームを取り込ませると、一定時間後に近傍の他の線維芽細胞にメラノソームを受け渡す現象が生じることを発見した。本願では本現象をメラノソームの移送と呼ぶ。このメラノソームの移送は、どの細胞がどの細胞に移送するのかは定まっていないが、どの細胞にも均等に移送されるのではなく、いくつかの特定の細胞に対してメラノソームが受け渡される様子が観察される（図１参照）。移送が開始される時間は、培養細胞の状態、メラノソームの添加量等により当然変動するが、本発明者らは、線維芽細胞にメラノソーム添加後、概ね７２時間後には当該移送が終了されることをタイムラプス動画撮影にて確認している。
<Transport of melanosomes in fibroblasts>
The inventors of the present application have discovered that when melanosomes are incorporated into fibroblasts by the above-described method, a phenomenon occurs in which melanosomes are delivered to other fibroblasts in the vicinity after a certain time. In the present application, this phenomenon is called melanosome transport. This melanosome transfer does not determine which cells are transferred to which cells, but it is not evenly transferred to any cells, but it seems that melanosomes are delivered to some specific cells. Observed (see FIG. 1). The transfer start time naturally varies depending on the state of the cultured cells, the amount of melanosomes added, etc., but the present inventors indicate that the transfer is completed approximately 72 hours after the addition of melanosomes to fibroblasts. Is confirmed by time-lapse movie shooting.
＜マクロファージ＞
本発明に用いるマクロファージは、ＪＣＲＢ細胞バンクなどで購入することができる。例えば、ＴＨＰ−１（ヒト由来単球細胞）を使用することができ、培養に用いる培地も各社がそれぞれ細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。ＴＨＰ−１のマクロファージへの分化にはホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）を用いる。和光純薬のものを用いてもよいし、他の会社の他の物質でもＴＨＰ−１をマクロファージに分化できれば何を用いてもよい。
<Macrophages>
Macrophages used in the present invention can be purchased from a JCRB cell bank or the like. For example, THP-1 (human-derived monocyte cells) can be used, and the medium used for the culture may be a medium recommended by each company for the cell type. For differentiation of THP-1 into macrophages, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) is used. Wako Pure Chemicals may be used, and other substances from other companies may be used as long as they can differentiate THP-1 into macrophages.
＜被験物質＞
被験物質は特に限定されないが、植物乾燥物より抽出したエキスや、市場にある製品化されたエキス等を用いることができる。エキスの抽出の方法は、特に限定されない。又、被験物質は植物エキスに限らず、線維芽細胞に添加出来るものであれば特に限定はなく、動物由来エキス、菌類の培養物、又はこれらの酵素等処理物、化合物又はその誘導体等であっても被験物質として用いることが出来、液状の他、粉末状、ジェル状等であっても差し支えない。また、そのままでは培地に溶解しない場合は、界面活性剤等の可溶化剤を適宜使用することにより溶解させることで被験物質として用いることができる。
添加濃度については、被験物質添加から２４時間後に明らかに細胞が死滅していなければ、どの濃度でも問題ない。なお、被験物質に、抽出溶媒や可溶化剤が含まれている場合は、抽出溶媒や可溶化剤のみを同濃度になるように細胞に添加したサンプルも用意し、その影響を考慮することが好ましい。
線維芽細胞に被験物質を添加するタイミングは特に問わない。線維芽細胞、メラノソーム、被験物質が並存するタイミングがあれば良く、線維芽細胞にメラノソームを添加した後に被験物質を添加しても良いし、メラノソームと被験物質を同時に添加しても良いし、メラノソームを添加する前に添加しても良い。
<Test substance>
The test substance is not particularly limited, and an extract extracted from a dried plant product, a commercialized extract, or the like on the market can be used. The method for extracting the extract is not particularly limited. The test substance is not limited to a plant extract and is not particularly limited as long as it can be added to fibroblasts, and may be an animal-derived extract, a fungal culture, or a processed product such as an enzyme, a compound or a derivative thereof. However, it can be used as a test substance, and it may be liquid, powder, gel, or the like. Moreover, when it does not dissolve in the medium as it is, it can be used as a test substance by dissolving it by appropriately using a solubilizing agent such as a surfactant.
As for the addition concentration, any concentration is acceptable as long as the cells are clearly not dead 24 hours after the addition of the test substance. If the test substance contains an extraction solvent or solubilizer, prepare a sample in which only the extraction solvent or solubilizer is added to the cells so that the concentration is the same. preferable.
The timing for adding the test substance to the fibroblasts is not particularly limited. It is only necessary that the fibroblasts, melanosomes, and the test substance coexist, and the test substance may be added after adding the melanosomes to the fibroblasts, or the melanosomes and the test substance may be added simultaneously, or the melanosomes. You may add before adding.
＜指標の決定＞
真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤を選別する際に用いる指標は、線維芽細胞にメラノソームを添加し、線維芽細胞がメラノソームを取り込むことで、遺伝子発現量及び／又はタンパク質発現量が変化しているものを指標にすることができる。これらの発現量は、添加するメラノソームの量にも依存するので、単に線維芽細胞がメラノソームを取り込むことで、コントロールと比較してその発現量が増加しているものを選択すれば良い。所望する効果の程度に応じて、１．５倍以上、２倍以上を選択することができ、より好ましくは４倍以上増加している遺伝子を選択することである。中でも、マクロファージのケモタキシス促進効果が既知である遺伝子及び／又はタンパク質を指標とすることが好ましい。
<Determination of indicators>
The index used when selecting an agent for preventing / ameliorating dermal spots and / or a macrophage attractant is that melanosomes are added to fibroblasts, and the fibroblasts take up melanosomes so that the gene expression level and / or protein expression level is increased. What is changing can be used as an indicator. Since these expression levels also depend on the amount of melanosomes to be added, it is only necessary to select those whose expression levels are increased compared to the control by simply taking melanosomes into the fibroblasts. Depending on the degree of the desired effect, 1.5 times or more, 2 times or more can be selected, and more preferably 4 times or more of the gene is selected. Among them, it is preferable to use a gene and / or protein whose macrophage chemotaxis promoting effect is known as an index.
＜遺伝子発現量及び / 又はタンパク質量の測定＞
遺伝子発現量は、回収した培養細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、このＴｏｔａｌ ＲＮＡ中に含まれる標的遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することによって定量することができる。
<Measurement of gene expression level and / or protein level>
The gene expression level can be quantified by extracting Total RNA from the collected cultured cells and measuring the mRNA expression level of the target gene contained in the Total RNA.
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出方法は特に限定されず、たとえば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， １６２， １５６−１５９，１９８７.）等を採用することができる。例えば、市販品であるＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）などが使用できる。抽出されたＴｏｔａｌ ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いてもよい。 The extraction method of the total RNA is not particularly limited. For example, guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation method, guanidine thiocyanate / hot phenol method, guanidine hydrochloride method, acidic guanidine thiocyanate / phenol / chloroform method (Chomczynski P et al. Anal. Biochem, 162, 156-159, 1987.) and the like can be employed. For example, commercially available RNeasy Mini Kit (QIAGEN) can be used. The extracted total RNA may be further purified to mRNA alone if necessary.
遺伝子の発現量は、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法など公知の方法を用いて測定することができる。 The gene expression level is determined by nucleic acid hybridization method using RT-PCR sample such as gene chip or array, RT-PCR method, real-time PCR method, subtraction method, differential display method, differential hybridization method, and cross-hybridization method. It can be measured using a known method such as a hybridization method.
タンパク質量は、培養細胞の細胞内タンパク質もしくは、細胞培養上清に放出された細胞外タンパク質中に存在するタンパク質量を測定することによって定量する。細胞内タンパク質は、市販の細胞抽出液を用いた方法や、物理的に細胞膜を破壊する超音波破砕法などを用いて抽出することができるが、特に限定されない。細胞外タンパク質に関しては、細胞培養上清をそのまま用いても良いが、タンパク質の濃縮、脱塩などの精製を行うことが好ましい。
上述の方法で抽出したタンパク質より、標的タンパク質量を検出、定量するためには、ウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡなどの抗体を用いた方法にて実施することが一般的であるが質量分析計などその他技術を用いても測定することができ、特に限定されない。
The amount of protein is quantified by measuring the amount of protein present in intracellular protein of cultured cells or extracellular protein released into the cell culture supernatant. Intracellular proteins can be extracted by a method using a commercially available cell extract or an ultrasonic disruption method that physically destroys a cell membrane, but is not particularly limited. Regarding the extracellular protein, the cell culture supernatant may be used as it is, but it is preferable to perform purification such as protein concentration and desalting.
In order to detect and quantify the amount of target protein from the protein extracted by the above-mentioned method, it is common to carry out by a method using an antibody such as Western blotting or ELISA, but other techniques such as mass spectrometry are used. Even if it uses, it can measure and it does not specifically limit.
本願発明において、「発現量が増加するタンパク質」とは、線維芽細胞がメラノソームを貪食することに起因して結果として増加するタンパク質を全般指す。例えば、ある遺伝子がタンパク質を糖鎖で修飾する酵素をコードするものであった場合には、該当する酵素の他、当該酵素によって修飾されてできる糖タンパク質も含まれる概念である。 In the present invention, “a protein whose expression level increases” generally refers to a protein that increases as a result of engulfing melanosomes by fibroblasts. For example, when a gene encodes an enzyme that modifies a protein with a sugar chain, the concept includes a glycoprotein that is modified by the enzyme in addition to the corresponding enzyme.
＜線維芽細胞のメラノソーム移送度＞
本願発明者らは、メラノソームを貪食した線維芽細胞が、一定時間後近傍の特定の線維芽細胞にメラノソームの移送を始めることを発見した。メラノソームの移送を受けた線維芽細胞は、他の周辺の線維芽細胞よりメラノソームの含有量が多くなるので、他の周辺の線維芽細胞よりＭＣＰｓ発現量が高くなることが推測された。本発明では、この関係をスクリーニングにおける指標の一つとして使用する。
本発明で言う移送度は、２つの意味合いで用いる。以下、代表してＭＣＰ−１を例に説明する。
一つ目は、メラノソームを貪食した線維芽細胞が移送を始めるまでの時間（速度）をさす場合である。
メラノソームを線維芽細胞に添加した後、被験物質を添加しない場合にメラノソームの移送が始まるまでの時間をコントロールとし、被験物質添加によりコントロールと比べてメラノソームの移送が始まる時間、或いは移送が終了する時間が短い場合、短時間で特定の線維芽細胞にメラノソームが集められ、移送を受けない他の線維芽細胞に比べてＭＣＰ−１の発現量が高くなるので、結果として短時間にマクロファージを呼び寄せ、マクロファージがメラノソームの移送を受けた線維芽細胞を貪食することを誘発させることが期待できる。
もっとも、この場合において、一度の実験においてコントロールと被験物質添加群とを同時に観察することもできるし、予め、線維芽細胞に一定量のメラノソームを添加してからメラノソームの移送が開始する平均的な時間及び完了する平均的な時間を調べておき、別の実験において、予め確認したコントロールの移送開始又は終了時間を基準として、それよりも短時間で移送が開始又は終了する被験物質を効果物質として選択することは、言うまでもない。
移送の開始、終了を確認する方法は特に限定されないが、例えば、顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ、位相差１０倍レンズ）で観察した際に、少なくとも１視野、好ましくは２〜３視野で確認することが好ましい。移送が開始・終了したか否かは、厳密に確認する必要はない。１視野中で移送が観察された時点で移送が開始、観察されなくなった時点で移送が終了したとして判断して良い。又、線維芽細胞は常に細胞遊走しているが、移送が終了に近づくと、メラノソームが移送された線維芽細胞の細胞遊走が盛んでなくなる。その時点を移送の終了と見なしても良い。
二つ目は、メラノソームを貪食した線維芽細胞が移送をさせた量を指す場合である。一旦メラノソームを貪食した線維芽細胞は、一定時間後近傍の他の線維芽細胞にメラノソームを移送する。メラノソームを線維芽細胞に添加後一定時間後に、被験物質を添加しない場合に移送されるメラノソームの平均量をコントロールとし、被験物質添加によりコントロールと比べてより多くの量のメラノソームの移送が促されれば、移送を受けない他の線維芽細胞と比べて、メラノソームの移送を受けた特定の線維芽細胞においてＭＣＰ−１の発現量が高くなるので、結果として短時間にマクロファージを呼び寄せ、マクロファージがメラノソームの移送を受けた線維芽細胞を貪食することを誘発させることが期待できる。
この場合におけるメラノソームの平均量は、具体的にメラノソームの量を比較する他、目視比較、顕微鏡写真の画像等を利用して、例えば二値化等の手法により細胞中に占めるメラノソームの画像上の面積を比較する方法等を用いて判断することもできる。この場合においても、同一実験で対比することもできるし、予め平均的なメラノソームの移送量、或いは画像面積等の情報を入手しておき、それと比較することで判定することができることは、言うまでもない。
<Melanosome transport of fibroblasts>
The inventors of the present application have discovered that fibroblasts phagocytosed by melanosomes begin to transfer melanosomes to specific fibroblasts in the vicinity after a certain time. Fibroblasts that have been transferred from melanosomes have a higher melanosome content than other peripheral fibroblasts, and it was thus presumed that the expression level of MCPs is higher than that of other peripheral fibroblasts. In the present invention, this relationship is used as one of indicators in screening.
The degree of transport referred to in the present invention is used in two ways. Hereinafter, MCP-1 will be described as an example.
The first is the case where the time (rate) until the fibroblasts phagocytosing melanosomes begin to transfer is shown.
After adding melanosomes to fibroblasts, when no test substance is added, the time until the start of melanosome transfer is taken as the control, and when the test substance is added, the melanosome transfer starts compared to the control, or the transfer finishes Is short, the melanosomes are collected in specific fibroblasts in a short time, and the expression level of MCP-1 is higher than other fibroblasts that are not transported. It can be expected to induce macrophages to phagocytose fibroblasts that have undergone melanosome transport.
However, in this case, the control and the test substance addition group can be observed at the same time in one experiment, and the average of the melanosome transfer starting after adding a certain amount of melanosomes to the fibroblasts in advance. Check the time and the average time to complete, and in another experiment, the test substance that starts or finishes transfer in a shorter time than the control transfer start or end time confirmed in advance as the effect substance Needless to say, make a choice.
The method for confirming the start and end of transfer is not particularly limited. For example, when observing with a microscope (BZ-X700, KEYENCE, phase difference 10 × lens), confirmation is made with at least one field, preferably 2-3 fields. It is preferable. It is not necessary to strictly check whether the transfer has started or ended. It may be determined that the transfer is started when the transfer is observed in one field of view and the transfer is ended when the transfer is not observed. In addition, fibroblasts are always migrating, but when the transfer approaches the end, the cell migration of the fibroblasts to which the melanosomes have been transferred becomes less active. You may consider that time as the end of the transfer.
The second case refers to the amount transferred by fibroblasts phagocytosed by melanosomes. Fibroblasts that have phagocytosed melanosomes transfer melanosomes to other fibroblasts in the vicinity after a certain time. After a certain period of time after adding melanosomes to fibroblasts, the average amount of melanosomes transferred when no test substance is added is used as a control, and the addition of the test substance promotes the transfer of a larger amount of melanosomes than the control. For example, the expression level of MCP-1 is higher in specific fibroblasts that have undergone melanosome transfer compared to other fibroblasts that do not undergo transfer, and as a result, macrophages are called for in a short time, and the macrophages become melanosomes. It can be expected to induce phagocytosis of the fibroblasts that have been transferred.
In this case, the average amount of melanosomes is compared with the amount of melanosomes in the cells by comparing with the amount of melanosomes, using visual comparison, micrograph images, etc. It can also be determined using a method of comparing the areas. Even in this case, it can be compared in the same experiment, and it goes without saying that it can be determined by obtaining information such as an average melanosome transport amount or an image area in advance and comparing it. .
＜真皮シミ予防・改善剤、マクロファージ誘引剤の選別＞
本願発明は、真皮に存在するメラニンを線維芽細胞が貪食することに起因して、線維芽細胞がマクロファージ誘引物質を放出することを発見したことに基づくものであるから、線維芽細胞がメラノソームを貪食しＭＣＰ−１等のマクロファージ誘引物質を十分放出させる有効成分を選択出来れば良い。その意味においては、移送度を指標とする工程は、必ずしも必要ではない。
真皮シミ予防・改善剤、マクロファージ誘引剤の選別をするには、指標が遺伝子及び／又はタンパク質の発現量である場合は、その発現量を高めるものを選択すれば良く、指標がメラノソームの移送度である場合は、その移送速度を速くさせるものや、メラノソームの移送量を多くするものを選択すれば良い。効果成分の選別は、希望する効果の程度に応じて各発現量の促進の程度を調整すればよい。
<Selection of dermal spot prevention / amelioration agent and macrophage attractant>
The present invention is based on the discovery that fibroblasts release macrophage attractants due to the engulfment of melanin present in the dermis by fibroblasts. It is only necessary to select an active ingredient that phagocytoses and sufficiently releases macrophage attractant such as MCP-1. In that sense, a process using the degree of transport as an index is not always necessary.
In order to select a dermal spot preventive / ameliorating agent or macrophage attractant, if the index is the expression level of a gene and / or protein, it is sufficient to select one that increases the expression level, and the index is the melanosome transport rate. In such a case, one that increases the transfer speed or one that increases the transfer amount of melanosomes may be selected. The selection of effect components may be performed by adjusting the degree of promotion of each expression level according to the desired degree of effect.
以下、本発明を実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited by these Examples.
−メラニンを貪食した線維芽細胞のメラニンの移送−
＜メラノソームの調製＞
ヒト由来メラノーマ細胞ＨＭ３ＫＯを５％ＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で、５％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養した。
１００％コンフルエント近くになり、メラニン産生が進んだ細胞を、トリプシンを用いて７．０×１０６ｃｅｌｌｓ/ ｔｕｂｅになるようにエッペンドルフチューブに回収、遠心（１０００ｇ、４℃、３分）によって細胞ペレットを作成した。その後ペレットをＰＢＳ（−）にて洗浄した。
-Transfer of melanin in fibroblasts phagocytosed by melanin-
<Preparation of melanosomes>
Human-derived melanoma cells HM3KO were cultured in a 37 ° C. incubator under 5% CO 2 using D-MEM medium (Gibco manufactured by Invitrogen) containing 5% FBS.
Cells that have become nearly 100% confluent and have advanced melanin production are collected in an Eppendorf tube to 7.0 × 10 6 cells / tube using trypsin, and centrifuged (1000 g, 4 ° C., 3 minutes) to obtain a cell pellet. It was created. Thereafter, the pellet was washed with PBS (−).
細胞ペレットに対し、１ｍＬのｃｏｌｄ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１％ ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ ｐｏｌｙ （ｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙ）ｅｔｈａｎｏｌ（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０ ）、０．０１％ ＳＤＳ含有０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液ｐＨ７．５）を添加した。これを１０分ごとに攪拌しながら、２０分室温にて静置した。この分散溶液を遠心分離（１０００ｇ、４℃、３分）、不要物を沈殿させ、メラノソームを含む上清を回収した。回収した上清を再度、遠心分離し（１０００ｇ、４℃、３分）、上清を回収した。この上清を遠心分離し（２００００ｇ、４℃、３分）、得られた沈殿をメラノソームリッチ画分とした。上清を吸引除去し、メラノソームのペレットをＰＢＳにて２度洗浄した。（２００００ｇ、４℃、３分）これにＰＢＳを添加し、５０回以上ピペッティングすることによってメラノソームを分散させた。このメラノソーム懸濁液をメラノソームとした。 To the cell pellet, 1 mL of a cold lysis buffer (1% octylphenoxy poly (ethyleneoxy) ethanol (IGEPAL CA-630), 0.1% Tris-HCl solution pH 7.5 containing 0.01% SDS) was added. While stirring this every 10 minutes, it was allowed to stand at room temperature for 20 minutes. This dispersion solution was centrifuged (1000 g, 4 ° C., 3 minutes) to precipitate unwanted matter, and the supernatant containing melanosomes was collected. The collected supernatant was centrifuged again (1000 g, 4 ° C., 3 minutes), and the supernatant was collected. The supernatant was centrifuged (20000 g, 4 ° C., 3 minutes), and the resulting precipitate was used as a melanosome-rich fraction. The supernatant was removed by aspiration, and the melanosome pellet was washed twice with PBS. (20000 g, 4 ° C., 3 minutes) PBS was added thereto, and the melanosomes were dispersed by pipetting 50 times or more. This melanosome suspension was designated as melanosome.
＜メラノソームの移送＞
ヒト由来正常真皮線維芽細胞を、２．０×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、２４ウェル細胞培養プレートに５００μＬを播種した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で２４時間培養した。培養後、新しい培地に交換し、メラノソームを５０μL添加した。なお、用いたメラノソームを５倍希釈した溶液１００μLのＡｂｓ４０５ｎｍは０．０９４であった。メラノソーム添加後、顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ、位相差１０倍レンズ）を用いてタイムラプス動画撮影（３０分毎に撮影）を行った。
図１中の番号は、時間の経過を示している。上段の写真と下段の写真はそれぞれ対応しており、写真の理解を助けるため、上段の写真に線維芽細胞の輪郭を補助線として記載したのが下段の写真である。各写真中、向かって左側の線維芽細胞（メラノソームを貪食した細胞）から右側の線維芽細胞（近傍の線維芽細胞）にメラノソームの移送がされていることが分かる。この挙動は、線維芽細胞にメラノソームを添加してから、約７２時間後には線維芽細胞の遊走が盛んではなくなり、移送が終了したことをタイムラプス動画によって確認した。
<Transport of melanosomes>
Human-derived normal dermal fibroblasts are suspended in D-MEM medium (Gibco manufactured by Invitrogen) containing 10% FBS so as to be 2.0 × 10 4 cells / mL, and 500 μL is seeded on a 24-well cell culture plate. did. The cells were cultured for 24 hours in a 37 ° C. incubator under 5% CO 2 . After the culture, the medium was replaced with a new medium, and 50 μL of melanosomes was added. In addition, Abs405nm of 100 microliters of solutions which diluted the used melanosome 5 times was 0.094. After the addition of melanosomes, time-lapse movie shooting (taken every 30 minutes) was performed using a microscope (BZ-X700, KEYENCE, phase difference 10 × lens).
The numbers in FIG. 1 indicate the passage of time. The upper photo and the lower photo correspond to each other, and the lower photo shows the outline of the fibroblast as an auxiliary line in the upper photo in order to help understanding of the photo. In each photograph, it can be seen that the melanosomes are transferred from the left fibroblasts (cells phagocytosing melanosomes) to the right fibroblasts (neighboring fibroblasts). This behavior was confirmed by a time-lapse movie that the migration of fibroblasts did not flourish about 72 hours after the addition of melanosomes to the fibroblasts and the transfer was completed.
−線維芽細胞のメラノソーム貪食による遺伝子発現及びタンパク質量の変化−
＜線維芽細胞の培養＞
ヒト由来正常真皮線維芽細胞を、１．２５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、１２ウェル細胞培養プレートに播種した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で培養した。
-Changes in gene expression and protein content by melanosome phagocytosis of fibroblasts-
<Culture of fibroblasts>
Human-derived normal dermal fibroblasts were suspended in D-MEM medium (Gibco manufactured by Invitrogen) containing 10% FBS so as to be 1.25 × 10 4 cells / mL, and seeded in a 12-well cell culture plate. The cells were cultured in an incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 .
７２時間経過後、細胞が３０−５０％コンフルエントに達していることを確認し、新しい培地に交換した後、前記メラノソームを培地に５０μＬ添加した。なお、用いたメラノソームを５倍希釈した溶液１００μＬのＡｂｓ４０５ｎｍは０．１１０であった。この時、線維芽細胞にメラノソームを添加していないサンプルをコントロールとした。さらに５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で２４時間培養することで、線維芽細胞にメラノソームを取り込ませた。 After 72 hours, it was confirmed that the cells had reached 30-50% confluence, and after replacing with a new medium, 50 μL of the melanosome was added to the medium. In addition, Abs405nm of 100 microliters of solutions which diluted the used melanosome 5 times was 0.110. At this time, a sample in which melanosomes were not added to fibroblasts was used as a control. Furthermore, the melanosomes were taken up into the fibroblasts by culturing in a 37 ° C. incubator under 5% CO 2 for 24 hours.
＜遺伝子発現量の変化確認＞
培養後、メラノソームを添加した線維芽細胞及びメラノソームを添加していない線維芽細胞（コントロール）から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＴｏｔａｌ ＲＮＡに対してＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ＲＣＲ Ｋｉｔ （ＴａＫａＲａ） を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡにおけるmRNAの発現を次世代シーケンサー（Ｉｏｎ ＰｒｏｔｏｎＴＭシステム Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて網羅的に解析した。得られたデータは、ＥｄｇｅＲを用いて解析を行い、メラノソーム添加後の遺伝子発現のＲＰＭ値（各遺伝子に対するリード数を遺伝子発現量として換算した値）が５０以上かつＦＤＲ値が０．０５以上かつコントロールに対して、メラノソーム添加時の遺伝子発現量の変化が４倍以上の遺伝子を抽出した（表１）。
<Confirmation of gene expression change>
After culturing, total RNA was extracted from fibroblasts added with melanosomes and fibroblasts not added with melanosomes (control) using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). This total RNA was reverse-transcribed using Prime Script RT RCR Kit (TaKaRa) to synthesize cDNA. The expression of mRNA in the obtained cDNA was comprehensively analyzed with a next-generation sequencer (Ion Proton ™ System Thermofisher Scientific). The obtained data was analyzed using EdgeR, and the RPM value of gene expression after addition of melanosomes (value obtained by converting the number of reads for each gene as a gene expression level) was 50 or more, and the FDR value was 0.05 or more. Genes with a change in gene expression level of 4 times or more when melanosomes were added to the control were extracted (Table 1).
その結果、５３個の遺伝子が選択された。その中にはマクロファージの誘引作用を有するＭＣＰ−１，２，３，４等が含まれていた（表１）。
一方、線維芽細胞において産生されることが知られており、かつマクロファージの誘引作用も既知であるＣＣＬ１、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）等はコントロールおよびメラノソーム添加時ともにＲＰＭ値がほぼ０であったため、発現していなかった（表２）。このことは、線維芽細胞がメラノソームを取り込んだ場合、すべてのマクロファージ誘引促進の遺伝子発現を増加させるのではなく、特定の因子にのみ影響を与えていることを示している。
表１、表２の結果から、線維芽細胞がメラノソームを貪食した際にマクロファージの誘引を促進するのは、マクロファージの誘引作用を有する既知の遺伝子の中でも、ＭＣＰ−１，２，３，４が特に重要であると言える。
As a result, 53 genes were selected. Among them, MCP-1, 2, 3, 4 etc. having a macrophage attracting action were included (Table 1).
On the other hand, CCL1, CCL3 (MIP-1α) and the like, which are known to be produced in fibroblasts and have known macrophage attracting action, had an RPM value of almost 0 when both control and melanosomes were added. It was not expressed (Table 2). This indicates that when fibroblasts take up melanosomes, they do not increase all macrophage-induced gene expression but only affect certain factors.
From the results shown in Tables 1 and 2, MCP-1, 2, 3, 4 promotes macrophage attraction when fibroblasts phagocytose melanosomes among known genes having macrophage attraction. This is especially important.
―貪食したメラノソーム量とタンパク質発現量との関係―
＜線維芽細胞の培養＞
培養は〔００３５〕〔００３６〕と同様の実験を行い（ただし、ＥＬＩＳＡでのバックグラウンド低減のため、培地中の血清は抜いた状態で培養した）、メラノソーム添加から９６時間培養した。なお、今回の実験ではメラノソームをそれぞれ１２．５、２５、５０μＬ添加した細胞を用意した。培養後、上清に存在するＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡ（ＲａｙＢｉｏ Ｈｕｍａｎ ＭＣＰ−１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ）にて測定した。
―Relationship between phagocytosed melanosomes and protein expression―
<Culture of fibroblasts>
The culture was conducted in the same manner as in [0035] and [0036] (however, in order to reduce the background in ELISA, the culture medium was cultured with the serum in the medium removed) and cultured for 96 hours from the addition of melanosomes. In this experiment, cells with 12.5, 25, and 50 μL of melanosomes were prepared. After the culture, MCP-1 present in the supernatant was measured by ELISA (RayBio Human MCP-1 ELISA kit).
その結果、与えたメラノソームの濃度依存的に、線維芽細胞が放出するＭＣＰ−１の量が増加した（図２）。この結果から、貪食或いは移送によりメラノソームを多く蓄積した線維芽細胞からはＭＣＰ−１が多く放出されると考えられ、それによりマクロファージが多く（或いは早く）誘引され、結果としてメラノソームを多く蓄積した線維芽細胞が優先的に貪食されることが期待できると考えられた。 As a result, the amount of MCP-1 released by fibroblasts increased depending on the concentration of the given melanosomes (FIG. 2). From this result, it is considered that a large amount of MCP-1 is released from fibroblasts that have accumulated a large amount of melanosomes by phagocytosis or transport, thereby attracting a large amount (or sooner) of macrophages, resulting in fibers that have accumulated a large amount of melanosomes. It was considered that blast cells can be expected to be preferentially phagocytosed.
−メラノソームを貪食した線維芽細胞とマクロファージの共培養−
線維芽細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬおよびＴＨＰ−１を１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬになるように５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、それぞれの細胞を７０μLずつｃulture-Insert in μ-Dish 35 mm, high, ibiTreat（ｉｂｉｄｉ）のウェルに播種した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で２４時間培養した。培養後線維芽細胞のウェルにはメラノソーム１０μLを添加し、ＴＨＰ−１のウェルには、ＴＨＰ−１をマクロファージに分化させるために、３．２ｍＭ ＰＭＡをそれぞれ添加した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で７２時間培養した。その後、インサートを除去して共培養を開始した。なお、７２時間培養後に共培養を開始したのは、メラノソームを添加した線維芽細胞が特定の線維芽細胞にメラノソームを移送終了するのが概ね７２時間後であることからである。
-Co-culture of fibroblasts and macrophages phagocytosed by melanosomes-
Fibroblasts were suspended in RPMI1640 medium (Gibco manufactured by Invitrogen) containing 5% FBS so that 1.0 × 10 5 cells / mL and THP-1 were 1.0 × 10 6 cells / mL. 70 μL of cells were seeded in wells of culture-Insert in μ-Dish 35 mm, high, ibiTreat (ibidi). The cells were cultured for 24 hours in a 37 ° C. incubator under 5% CO 2 . After culture, 10 μL of melanosomes were added to the fibroblast wells, and 3.2 mM PMA was added to the THP-1 wells to differentiate THP-1 into macrophages. The cells were cultured for 72 hours in a 37 ° C. incubator under 5% CO 2 . Thereafter, the insert was removed and co-culture was started. The reason why the co-culture was started after 72 hours of culturing is that the transfer of melanosomes to specific fibroblasts by the fibroblasts added with melanosomes is almost 72 hours later.
図３は、左側が共培養開始直後（０時間）の写真、右側が共培養から９６時間後の写真、上段はメラノソームを貪食した線維芽細胞とマクロファージの共培養写真、下段はメラノソームを貪食していない線維芽細胞とマクロファージの共培養写真である（ＢＺ−Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ、位相差１０倍レンズ）。メラノソームを貪食してない線維芽細胞は明視野では見にくいため、位相差顕微鏡画像を使用しており、マクロファージは白っぽく光って見えている。メラノソームを貪食した線維芽細胞には多くのマクロファージが誘引されている様子が観察された。一方、メラノソームを貪食していない線維芽細胞にはマクロファージの誘引は観察されなかった。
これは、貪食又は移送によって多くのメラノソームを細胞内に蓄積している線維芽細胞がＭＣＰ−１等を放出し、マクロファージを呼び寄せているからであると考えられる。
Fig. 3 shows a photograph immediately after the start of co-culture (0 hours) on the left side, a photograph after 96 hours after co-culture, the upper row is a co-culture photo of fibroblasts and macrophages that have phagocytosed melanosomes, and the lower row is phagocytosed by melanosomes. It is a co-culture photograph of non-fibroblasts and macrophages (BZ-X700, KEYENCE, phase difference 10 × lens). Since fibroblasts that have not phagocytosed melanosomes are difficult to see in bright field, phase contrast microscopic images are used, and macrophages appear whitish. Many macrophages were attracted to fibroblasts that phagocytosed melanosomes. On the other hand, no macrophage attraction was observed in fibroblasts that did not phagocytose melanosomes.
This is considered to be because fibroblasts that accumulate many melanosomes in the cells by phagocytosis or transport release MCP-1 and the like and attract macrophages.
以上より、メラノソームを多く蓄積した線維芽細胞はＭＣＰ−１を放出し、多くのマクロファージを呼び寄せることによって、メラノソームを多く蓄積した線維芽細胞が貪食されることが分かる。そのため、メラノソームを取り込んだ線維芽細胞のＭＣＰ−１等のマクロファージの誘引に関連する遺伝子及び／又はタンパク質の発現量を調べることによって、真皮シミの予防・改善度を測ることができるものと期待できる。 From the above, it can be seen that fibroblasts that accumulated a large amount of melanosomes release MCP-1 and attract many macrophages to engulf fibroblasts that accumulate a large amount of melanosomes. Therefore, it can be expected that the degree of prevention and improvement of dermal spots can be measured by examining the expression level of genes and / or proteins related to the attraction of macrophages such as MCP-1 in fibroblasts incorporating melanosomes. .
＜ＭＣＰ-1を指標としたスクリーニング方法＞
線維芽細胞を、５．０×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、２４ウェルプレートに５００μＬずつ播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。新しい培地に交換し、メラノソームを培地に１００μＬ添加した。なお、用いたメラノソームを５倍希釈した溶液１００μＬのＡｂｓ４０５ｎｍは０．１１２であった。さらに、メラノソームを添加したウェルと添加していないウェルのそれぞれに被験物質を添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で７２時間培養後、線維芽細胞のＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
<Screening method using MCP-1 as an index>
Fibroblasts were suspended in RPMI 1640 medium (Gibco manufactured by Invitrogen) containing 5% FBS so as to be 5.0 × 10 4 cells / mL, and 500 μL each was seeded in a 24-well plate. Thereafter, 37 ° C., and cultured for 24 hours under 5% CO 2. The medium was changed to a new medium, and 100 μL of melanosomes was added to the medium. In addition, Abs405nm of 100 microliters of solutions which diluted the used melanosome 5 times was 0.112. Furthermore, the test substance was added to each of the wells to which melanosomes had been added and the wells to which melanosomes had not been added. After culturing at 37 ° C. under 5% CO 2 for 72 hours, total RNA of fibroblasts was extracted.
培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＴｏｔａｌ ＲＮＡに対してＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ＲＣＲ Ｋｉｔ （ＴａＫａＲａ） を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＭＣＰ−１、ＧＡＰＤＨの発現量を以下のプライマー及び酵素を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ 、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて測定した。 After culturing, total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). This total RNA was reverse-transcribed using Prime Script RT RCR Kit (TaKaRa) to synthesize cDNA. Using the obtained cDNA as a template, the expression levels of MCP-1 and GAPDH were measured by real-time PCR (7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems) using the following primers and enzymes.
プライマーは、ＭＣＰ−１用センスプライマー（５‘−ＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＴＧＣ−３’）、アンチセンスプライマー（５‘−ＧＣＡＣＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡ−３’）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸 デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）用センスプライマー（５‘−ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ−３’）、アンチセンスプライマー（５‘−ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡ−３’）を用いた。ＰＣＲの反応にはＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。比較Ｃｔ法ではコントロールとして被験物質およびメラノソームを添加していない線維芽細胞のＭＣＰ−１遺伝子発現量（〔被験物質（―）メラノソーム（―）〕）および被験物質を添加せず、メラノソームを添加した線維芽細胞のＭＣＰ−１遺伝子発現量（〔被験物質（―）メラノソーム（＋）〕）を用い、被験物質およびメラノソームを添加した線維芽細胞のＭＣＰ−１遺伝子発現量（〔被験物質（＋）メラノソーム（＋）〕）、ならびに被験物質を添加し、メラノソームを添加していない線維芽細胞のＭＣＰ−１遺伝子発現量（〔被験物質（＋）メラノソーム（―）〕）を計算し、〔被験物質（＋）メラノソーム（＋）〕の値が〔被験物質（―）メラノソーム（＋）〕よりも増加し、〔被験物質（＋）メラノソーム（―）〕の値が〔被験物質（―）メラノソーム（―）〕と同程度の被験物質を真皮シミ改善成分として選択するのが好ましいが、〔被験物質（―）メラノソーム（＋）〕の値に対する〔被験物質（＋）メラノソーム（＋）〕の値の増加が、〔被験物質（―）メラノソーム（―）〕の値に対する〔被験物質（＋）メラノソーム（―）〕の値の増加よりも、はるかに高い被験物質を選別することもできる。これによって、メラノソームを貪食していないにも関わらず、被験物質の作用により、ＭＣＰ−１の発現が増加してしまう物質ではなく、メラノソームを貪食した線維芽細胞に対して特異的に被験物質が作用することにより、ＭＣＰ−１の発現が増加する物質のスクリーニングが可能となる。
尚、本段落中「メラノソーム（＋）」は、メラノソーム添加を意味し、「メラノソーム（−）」はメラノソーム不添加を意味し、被験物質における（＋）、（−）も同様の意味で用いている。
Primers are for MCP-1 sense primer (5'-CAGCCAGATGGCATCAATGC-3 '), antisense primer (5'-GCACTGAGATCTTCCTTTGGTGAA-3'), GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; used as housekeeping gene) A sense primer (5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 ′) and an antisense primer (5′-TGACCAGGCGCCACATA-3 ′) were used. SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems) was used for the PCR reaction, and gene expression analysis was performed by the comparative Ct method. In the comparative Ct method, the MCP-1 gene expression level ([test substance (-) melanosomes (-)]) of the fibroblasts to which the test substance and melanosomes were not added and the test substance were not added and the melanosomes were added as controls Using the expression level of MCP-1 gene in fibroblasts ([test substance (-) melanosomes (+)]), the expression level of MCP-1 gene in fibroblasts to which test substances and melanosomes were added ([test substance (+) Melanosomes (+)]), as well as the test substance added, and the amount of MCP-1 gene expression ([test substance (+) melanosomes (-)]) in fibroblasts not containing melanosomes is calculated, The value of (+) melanosomes (+) is greater than that of [test substance (-) melanosomes (+)], and the value of [test substance (+) melanosomes (-)] It is preferable to select a test substance having the same degree as that of the substance (-) melanosome (-)] as a component for improving dermal spots, but the [test substance (+) melanosome (+) relative to the value of [test substance (-) melanosome (+)] Select a test substance whose increase in the value of (+)] is much higher than the increase in the value of [Test substance (+) melanosomes (-)] relative to the value of [Test substance (-) melanosomes (-)] You can also. Thus, although the melanosome is not phagocytosed, the test substance is not a substance that increases the expression of MCP-1 due to the action of the test substance, but the test substance is specifically directed to the fibroblasts that phagocytose the melanosome. By acting, it becomes possible to screen for substances that increase the expression of MCP-1.
In this paragraph, “melanosome (+)” means addition of melanosome, “melanosome (−)” means no addition of melanosome, and (+) and (−) in the test substance are also used in the same meaning. Yes.
＜メラノソームの移送度を指標としたスクリーニング方法１＞
線維芽細胞を、２．０×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、２４ウェル細胞培養プレートに５００μＬを播種した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で２４時間培養した。培養後、新しい培地に交換し、メラノソームを５０μL添加した。なお、用いたメラノソームを５倍希釈した溶液１００μLのＡｂｓ４０５ｎｍは０．０９４であった。メラノソーム添加後、被験物質を添加するウェル（被験物質群）と、被験物質無添加のウェル（コントロール）を用意した。その後、顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ）を用いてタイムラプス動画撮影を行い、メラノソームの移送が開始される時間と移送終了時間を観察した。コントロールよりメラノソームの移送開始時間が早いもの及び移送終了時間が早いものを効果物質として選択した。
<Screening method 1 using melanosome transport as an index>
Fibroblasts were suspended in RPMI 1640 medium (Gibco manufactured by Invitrogen) containing 5% FBS so as to be 2.0 × 10 4 cells / mL, and 500 μL was seeded in a 24-well cell culture plate. The cells were cultured for 24 hours in a 37 ° C. incubator under 5% CO 2 . After the culture, the medium was replaced with a new medium, and 50 μL of melanosomes was added. In addition, Abs405nm of 100 microliters of solutions which diluted the used melanosome 5 times was 0.094. After adding melanosomes, a well to which a test substance was added (test substance group) and a well without a test substance (control) were prepared. Thereafter, a time-lapse movie was taken using a microscope (BZ-X700, KEYENCE), and the time when the transfer of melanosomes was started and the end time of the transfer were observed. Those whose melanosome transfer start time and transfer end time were earlier than those of the control were selected as effect substances.
＜メラノソームの移送度を指標としたスクリーニング方法２＞
実施例１と同様の方法で、被験物質群とコントロールを用意した。線維芽細胞にメラノソームを添加してから72時間後に、顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ）を用いて写真を撮影した。撮影した写真を目視により、被験物質群とコントロールを比較し、コントロールよりメラノソームの移送量が多いものを、効果物質として選択した。
<Screening method 2 using melanosome transport as an index>
A test substance group and a control were prepared in the same manner as in Example 1. 72 hours after adding melanosomes to fibroblasts, photographs were taken using a microscope (BZ-X700, KEYENCE). The photographed photograph was visually compared with the test substance group and the control, and those having a larger amount of melanosome transfer than the control were selected as the effective substances.
本発明によれば、メラノソームを貪食した線維芽細胞を標的にマクロファージを誘引させることができる効果物質が選別でき、マクロファージの貪食によって、優先的にクリアランスできる真皮シミ予防・改善剤を選別することが可能となる。これにより、真皮シミの改善が期待できる化粧料の提供に利用できる。
According to the present invention, an effective substance capable of attracting macrophages can be selected by targeting fibroblasts phagocytosed by melanosomes, and an agent for preventing and improving dermal spots that can be preferentially cleared by phagocytosis of macrophages can be selected. It becomes possible. Thereby, it can utilize for provision of cosmetics which can expect improvement of a dermal spot.
Claims (4)
（１）メラノソームを線維芽細胞に添加する工程
（２）前記線維芽細胞がメラノソームを取り込むことに起因して、当該細胞中の発現量が増加する遺伝子及び／又はタンパク質を選択する工程
（３）（２）の工程で選択されたものの内、マクロファージの誘引が既知である遺伝子及び／又はタンパク質を選択する工程
を含んでなる指標の決定方法。 An index used for a screening method for an agent for preventing / ameliorating dermal spots and / or a macrophage attractant,
(1) Step of adding melanosomes to fibroblasts (2) Step of selecting genes and / or proteins whose expression level in the cells increases due to the fibroblasts taking up melanosomes (3) A method for determining an index comprising a step of selecting a gene and / or protein that is known to be attracted to macrophages among those selected in the step (2).
（１）メラノソームを線維芽細胞に添加する工程
（２）前記線維芽細胞がメラノソームを取り込むことに起因して、当該細胞中の発現量が増加する遺伝子及び／又はタンパク質を選択する工程
（３）（２）の工程で選択されたものの内、マクロファージの誘引が既知である遺伝子及び／又はタンパク質を選択する工程
（４）（３）の工程で選択した遺伝子及び／又はタンパク質の発現量を指標として、発現促進効果のある被験物質を選定する工程を含んでなるスクリーニング方法。 A screening method for a dermal spot prevention / amelioration agent and / or a macrophage attractant,
(1) Step of adding melanosomes to fibroblasts (2) Step of selecting genes and / or proteins whose expression level in the cells increases due to the fibroblasts taking up melanosomes (3) Among the genes selected in the step (2), a gene and / or protein that is known to attract macrophages is selected. (4) The expression level of the gene and / or protein selected in the step (3) is used as an index. A screening method comprising a step of selecting a test substance having an expression promoting effect.
（１）メラノソームを線維芽細胞に添加する工程
（２）被験物質を添加する工程
（３）ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、ＭＣＰ−２（ＣＣＬ８）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７）、ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３）から選択される１種以上の遺伝子及び/又はそのタンパク質の発現量を指標として、発現促進効果のある被験物質を選定する工程を含んでなるスクリーニング方法。 A screening method for a dermal spot prevention / amelioration agent and / or a macrophage attractant,
(1) Step of adding melanosomes to fibroblasts (2) Step of adding test substance (3) MCP-1 (CCL2), MCP-2 (CCL8), MCP-3 (CCL7), MCP-4 (CCL13) A screening method comprising a step of selecting a test substance having an expression promoting effect using as an index the expression level of one or more genes selected from (1) and / or protein thereof.
（１）メラノソームを線維芽細胞に添加する工程
（２）被験物質を添加する工程
を含み、線維芽細胞間におけるメラノソームの移送度を指標として被験物質を選定する工程を含んでなるスクリーニング方法。
A screening method for a dermal spot prevention / amelioration agent and / or a macrophage attractant,
(1) A screening method comprising a step of adding melanosomes to fibroblasts, (2) a step of adding a test substance, and a step of selecting a test substance using the degree of melanosome transport between fibroblasts as an index.
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